CN107022349B - 细胞色素氧化酶cyp1a1特异性荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

细胞色素氧化酶cyp1a1特异性荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

一类细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针及其制备方法与应用，该特异性探针底物具有4‑羟基萘二甲酰亚胺结构，其可用于测定生物体系中CYP1A1的酶活。CYP1A1酶活测定的流程如下：选择4‑羟基萘二甲酰亚胺类去氯乙基化反应为探针反应，通过定量检测单位时间内其去氯乙基化代谢产物的生成量来测定各类生物样品中CYP1A1酶的活性。本发明可用于不同种属、不同个体来源生物样本中CYP1A1酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中CYP1A1酶活的定量测定，以期实现对重要药物代谢酶CYP1A1处置药物能力的评估。此外，借助该探针反应还可用于体外快速筛选CYP1A1的抑制剂和诱导剂并评估其抑制能力。

Description

细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一类细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
细胞色素P450(cytochrome P450,P450)酶，又称混合功能氧化酶或微粒体单加氧酶，是机体内最重要的药物代谢酶。P450参与了人体胆固醇，激素，脂肪酸，维生素等内源性物质的合成和代谢，对维持人体正常生理功能起到重要作用，同时也参与了多数外来物的生物转化，大约70％的药物(包括绝大部分临床药物和杀虫剂)的主要清除是由P450介导的。细胞色素P450酶催化的I相反应是化合物在体内代谢的关键步骤，因为这一步反应通常是药物从体内清除的限速步骤，可影响化合物的半衰期、清除率等动力学特征，且P450酶活性常随遗传因素、年龄、疾病状态或其它药物相互作用的影响而发生改变。药物对机体P450酶的影响，能造成临床上显著的药物相互作用。
CYP1A1是重要的I相代谢酶，主要在人肝外组织中表达，例如人肺、皮肤、小肠中表达。CYP1A1参与多种环境毒素和内源性底物的代谢，并在多种前致癌物被激活成具有遗传毒性中间体或最终致癌物的过程中起到了重要作用,例如在一定程度上激活咖啡因诱使肝硬化的发生(MOL ASPECTS MED.1999.20：1‐137)。除此之外，CYP1A1的分布存在很大的个体差异，CYP1A1酶的表达受遗传、年龄、疾病、性别、环境和共服药物等多种因素的影响。因此，CYP1A1在不同个体中的肝脏含量也有很大差别，其含量范围分别为：CYP1A1:0‐3pmol/mg(Pharmacology&Therapeutics 2013；138:103)。因此，开展CYP1A1酶活的个体差异研究对于临床个性化安全用药有着重要意义。目前国内外制药巨头在药物开发过程中，需要在体外评估各候选新药抑制CYP1A1的能力。因此，开发高效、灵敏的特异性CYP1A1探针底物对于高效筛选CYP1A1抑制剂，及定量测定生物体系内CYP1A1的活性至关重要。
由于CYP1A1亚家族中的各亚型具有相似的氨基酸序列，其底物通常相互交叠，因此各亚型酶鲜有特异性的底物。目前，已报道的CYP1A1的荧光探针底物有3个，分别是乙氧基试卤灵，荧光素-CEE和荧光素-ME-EGE。这些已知的荧光底物均属于off-on型探针，单酶选择性并不高且易受生物基质的干扰，定量误差较大。而比率型探针发射光谱的蓝移/红移则可用于比率检测，且此时探针分子原型可作为内部校准来减小光照强度、探针浓度、样品不均匀、仪器参数等对定量分析的影响。因此，开发高选择性的CYP1A1比率型荧光探针反应及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一类细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针底物及其应用，该荧光探针底物和去氯乙基化产物的荧光发射波长具有明显差异，且产物的荧光量子产率更高更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中CYP1A1的分布和功能进行定量评价。
本发明提供了一类细胞色素氧化酶CYP1A1特异性的荧光探针，该探针可被CYP1A1特异性催化生成相应的O-去氯乙基化产物，其结构通式如式式(Ⅰ)所示，该底物具有1,8-萘酰亚胺类结构，
其中R为-CH3、苯基、-OH等基团中的一种，n为1～10。
一种CYP1A1特异性荧光探针的制备方法，该方法包括下列步骤：
步骤一：4-溴-1,8-萘二甲酸酐与氨基化合物在醇中反应得到4-溴-1,8-萘酰亚胺；
步骤二：式(Ⅲ)所示化合物与碳酸钾在有机溶剂中反应得到式(Ⅱ)所示4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺；
步骤三：在氩气保护下，约200-500mg式(Ⅱ)所示化合物与约5-20ml 50-60％氢碘酸水溶液反应,120-130℃搅拌12-24h后，加大量水稀释，过滤，用水洗涤至滤液为中性，真空干燥得到式(Ⅲ)所示4-羟基-1,8-萘酰亚胺；
步骤四：将约式(Ⅲ)所示化合物与碘代氯乙烷，碳酸钾，在乙腈中80-90℃反应12h-24h后，旋蒸除去溶剂，残余固体用柱层析法提纯，真空干燥得到式(Ⅰ)所示化合物；
所述反应中化合物Ⅲ与碘代氯乙烷及碳酸钾摩尔比例为1:1.25-1.75:1.5-2.5。
本发明还提供了所述细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针的应用，采用上述式(Ⅰ)化合物作为CYP1A1亚酶的特异性底物，进行O-去氯乙基化结合反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其O-去氯乙基化产物的生成率来定量测定不同生物体系(包括重组表达CYP1A1单酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞等生物体系)中CYP1A1的活性；具体测定方法为：
——体系中以1,8-萘酰亚胺类化合物作为比率型探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；单点测定时底物浓度优选Km。
——在PBS缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值；
——反应时间为5～60分钟，确保以上底物相应的O-去氯乙基化产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；
——测定单位时间内底物减少量或O-去氯乙基化产物生成量作为CYP1A1活性的评价指标。
该探针底物及其去氯乙基化产物的荧光信号需采用不同检测波长去检测，特异性底物的荧光检测条件为：激发波长372nm，最大发射波长452nm；去氯乙基化产物的荧光检测条件为：激发波长450nm最大发射波长分别为562nm。
一种细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针的应用，该探针底物还可用于CYP1A1抑制剂和诱导剂的快速筛选及抑制和诱导能力的定量评价。
一种细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光底物的应用，该探针底物还可用于活细胞及活组织中CYP1A1功能的实时动态监测。
本发明提供的细胞色素氧化酶CYP1A1特异性比率型荧光探针的应用，该探针底物及其O-去氯乙基化产物均具有荧光属性，且两者具有不同的光学属性，可采用荧光检测器同时实现底物及产物的快速、灵敏检测；O-去氯乙基化产物及底物荧光检测条件分别为：激发波长372，450nm，最大发射波长为452，562nm(如图3所示)。
该特异性探针底物为比率型荧光探针，其在CYP1A1活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组CYP1A1、人及动物组织制备液及各类组织细胞中CYP1A1酶活的定量测定；同时也可作为在体及动物整体CYP1A1的探针底物，评估代谢酶CYP1A1的个体及种属差异。该探针底物及O-去氯乙基化代谢产物的荧光检测方法还可用于CYP1A1诱导剂和抑制剂的快速筛选及诱导和抑制能力的定量评价。
采用重组细胞色素氧化酶CYP1A1单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析(如图5所示)，重组单酶代谢反应(如图6所示)，以及酶反应动力学几方面的证据，证明1,8-萘酰亚胺类化合物可特异性的经细胞色素氧化酶CYP1A1代谢，生成O-去氯乙基化氧化产物。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该代谢反应具有非常良好的特异性。
作为高特异性的细胞色素氧化酶CYP1A1单酶的荧光探针底物，该化合物可以用来检测CYP1A1的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的CYP1A1的酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等制备物中CYP1A1的活性标定。
本发明中1,8-萘酰亚胺类化合物具有代谢产物单一(仅生成一个O-去氯乙基化产物)、代谢酶高选择性(主要由CYP1A1代谢)、底物及代谢产物易于检测且灵敏度高等特点。
选用本发明所述细胞色素氧化酶CYP1A1单酶的比率型荧光探针反应检细胞色素氧化酶CYP1A1单酶体外活性具有以下突出优势：
(1)高特异性：1,8-萘酰亚胺类化合物可被细胞色素氧化酶CYP1A1单酶高特异性地代谢成一个代谢产物，即O-去氯乙基化产物。
(2)廉价易得：1,8-萘酰亚胺类化合物可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。(3)高灵敏度：具有1,8-萘酰亚胺母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性(450～700nm)，且该底物及其O-去氯乙基化代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征，能较好的进行区分检测，同时可通过比率型标准曲线的建立进行定量测定CYP1A1单酶的检测下限为0.005nM/mL(荧光发射/激发光谱是由SynergyH1全功能微孔板检测仪或岛津高效液相色谱-荧光检测仪LC-FD-30A检测完成完成)。
附图说明
图1.CYP1A1特异性探针底物的结构通式；
图2.N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的1H-NMR谱图；
图3.N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺及其O-去氯乙基化代谢产物的归一化紫外吸收光谱图(分别在372nm和450nm有最大吸收)；
图4.12例HLM对N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的代谢图；
图5.N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺及其O-去氯乙基化代谢速率与乙氧基试卤灵的O-脱乙基代谢速率的相关性分析实验；
图6.N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的人CYP重组单酶筛选试验结果；
图7.N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的合成路线。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。CYP1A1特异性探针底物的结构通式如图1所示。
实施例1.N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的合成
(1)化合物N-正丁基-4-溴-1，8-萘酰亚胺的合成
将4.2mmol正丁胺加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1，8萘酐的50ml乙醇溶液中，70-80℃反应过夜后，加入200ml水，析出大量固体，过滤，真空干燥得到米黄色固体N-正丁基-4-溴-1，8-萘酰亚胺，产率80-90％。
(2)化合物N-正丁基-4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺的合成
将800mg N-正丁基-4-溴-1，8-萘酰亚胺与2.54g碳酸钾置于100ml单口瓶中，加入30ml甲醇，60-70℃反应过夜后，冷却，析出大量黄色固体，过滤，大量水洗，真空干燥得到黄色固体N-正丁基-4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺，产率80-90％。
(3)N-正丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺的合成
将300mg N-正丁基-4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺置于25ml两口瓶中，氩气保护下加入10ml 55-58％氢碘酸水溶液，120-130℃搅拌过夜后，加大量水稀释，过滤，用水洗涤至滤液为中性，真空干燥得到黄色固体，产率60-70％。
(4)化合物N-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亚胺的合成
将1mmol N-正丁基-4-羟基-1，8-萘酰亚胺与1.5mmol碘代氯乙烷，2mmol碳酸钾置于50ml单口瓶中，加入20ml乙腈，80-90℃反应过夜后，旋蒸除去溶剂，残余固体用柱层析法提纯，展开剂为乙酸乙酯：正己烷＝1：:4(体积比)，真空干燥得到黄色固体N-正丁基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亚胺，产率40-50％。N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的合成路线如图7所示。
注：化合物1、2的结构如图7所示，且其1H-NMR谱图如图2所示，1H-NMR谱图和13C-NMR谱图是由核磁共振波谱仪(Avance II 400MHz)检测完成。
实施例2.N-乙基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的合成
(1)化合物N-乙基-4-溴-1，8-萘酰亚胺的合成
将4.2mmol乙胺加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1，8萘酐的50ml乙醇溶液中，70-80℃反应过夜后，加入200ml水，析出大量固体，过滤，真空干燥得到米黄色固体N-乙基-4-溴-1，8-萘酰亚胺，产率80-90％。
(2)化合物N-乙基-4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺的合成
将800mg N-乙基-4-溴-1，8-萘酰亚胺与2.54g碳酸钾置于100ml单口瓶中，加入30ml甲醇，60-70℃反应过夜后，冷却，析出大量黄色固体，过滤，大量水洗，真空干燥得到黄色固体N-乙基-4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺，产率80-90％。
(3)N-乙基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺的合成
将300mg N-乙基-4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺置于25ml两口瓶中，氩气保护下加入10ml 55-58％氢碘酸水溶液，120-130℃搅拌过夜后，加大量水稀释，过滤，用水洗涤至滤液为中性，真空干燥得到黄色固体，产率60-70％。
(4)化合物N-乙基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亚胺的合成
将1mmol N-乙基-4-羟基-1，8-萘酰亚胺与1.5mmol碘代氯乙烷，2mmol碳酸钾置于50ml单口瓶中，加入20ml乙腈，80-90℃反应过夜后，旋蒸除去溶剂，残余固体用柱层析法提纯，展开剂为乙酸乙酯：正己烷＝1：:4(体积比)，真空干燥得到黄色固体N-乙基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亚胺，产率40-50％。
实施例3.N-己基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺的合成
(1)化合物N-己基-4-溴-1，8-萘酰亚胺的合成
将4.2mmol己胺加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1，8萘酐的50ml乙醇溶液中，70-80℃反应过夜后，加入200ml水，析出大量固体，过滤，真空干燥得到米黄色固体N-己基-4-溴-1，8-萘酰亚胺，产率80-90％。
(2)化合物N-己基-4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺的合成
将800mg N-己基-4-溴-1，8-萘酰亚胺与2.54g碳酸钾置于100ml单口瓶中，加入30ml甲醇，60-70℃反应过夜后，冷却，析出大量黄色固体，过滤，大量水洗，真空干燥得到黄色固体N-己基-4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺，产率80-90％。
(3)N-己基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺的合成
将300mg N-己基-4-甲氧基-1，8-萘酰亚胺置于25ml两口瓶中，氩气保护下加入10ml 55-58％氢碘酸水溶液，120-130℃搅拌过夜后，加大量水稀释，过滤，用水洗涤至滤液为中性，真空干燥得到黄色固体，产率60-70％。
(4)化合物N-己基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亚胺的合成
将1mmol N-己基-4-羟基-1，8-萘酰亚胺与1.5mmol碘代氯乙烷，2mmol碳酸钾置于50ml单口瓶中，加入20ml乙腈，80-90℃反应过夜后，旋蒸除去溶剂，残余固体用柱层析法提纯，展开剂为乙酸乙酯：正己烷＝1：:4(体积比)，真空干燥得到黄色固体N-己基-4-氯乙氧基-1，8-萘酰亚胺，产率40-50％。
实施例4.体外测定人重组CYP单酶的选择性
(1)预先准备90μl CYP代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液(100mM)、重组人CYP各单酶(0.075nm/ml)，N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μM，于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入10μl浓度为10mM的NADP+起始反应；
(3)30分钟后，加入100μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(Ex＝372nm，Em＝450nm)；重组人CYP1A1酶的选择性最高约是其它单酶的10倍左右(图6)。
实施例5.不同个体来源肝微粒体中CYP1A1的活性定量评估
(1)选取12例人肝微粒体(HLM)稀释至2.5mg/ml，准备CYP1A1代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液(100mM)、人肝微粒体(0.25mg/ml)、NADP+10mM，6-磷酸葡萄糖100mM，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml，MgCl240mM，N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μM，于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入20μl浓度为10mM的NADP+起始反应；
(3)30分钟后，加入200μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(Ex＝372nm，Em＝450nm)，将所获荧光强度代入标准曲线后得到12例人肝微粒体(HLM)对N-正丁基-4-甲氯乙基-1,8-萘酰亚胺的代谢速率(图4)。
实施例6.体外测定CYP1A1的检测下限测定
实验在酶标仪上使用96孔板进行测定，N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺10μM，NADP+10mM，6-磷酸葡萄糖100mM，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml，MgCl240mM，CYP1A1单酶0.0025nM/ml～0.2nM/ml，pH 7.4的PBS缓冲液50mM，总体积为100μL，37℃下孵育1h后通过酶标仪分析，每组的平均值与不加CYP1A1的对照组比较，结果表明0.005nM/ml的CYP1A具有统计学意义(P＜0.05)，因此确定CYP1A1的检测下限为0.005nM/ml。
实施例7.CYP1A1酶浓度标准曲线测定
在酶标仪上使用96孔板进行测定，N-正丁基-4-氯乙氧基-1,8-萘酰亚胺10μM，NADP+10mM，6-磷酸葡萄糖100mM，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml，MgCl240mM，CYP1A1单酶0.01nM/ml～0.2nM/ml，pH 7.4的PBS缓冲液50mM，总体积为100μL，37℃下孵育30min，酶标仪分析，产物的荧光强度比底物的荧光强度的比值与酶浓度做标准曲线，每条标准曲线的R2＞0.99，表明标准曲线线性范围宽广，可准确定量CYP1A1的含量。

Claims (8)

1.一类细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针，其特征在于：在生理条件下该探针底物可被CYP1A1特异性催化生成相应的去氯乙基化产物，其结构通式如下：
其中，R为-CH3、苯基、-OH中的任意一种，n为1～10。
2.一种如权利要求1所述CYP1A1特异性荧光探针的制备方法，其特征在于,该方法包括下列步骤：
步骤一：4-溴-1,8-萘二甲酸酐与氨基化合物在醇中反应得到4-溴-1,8-萘酰亚胺；
步骤二：4-溴-1,8-萘酰亚胺与碳酸钾在有机溶剂中反应得到式(Ⅱ)所示4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺；
步骤三：在氩气保护下，200-500mg式(Ⅱ)所示化合物与5-20ml 50-60％氢碘酸水溶液反应,120-130℃搅拌12-24h后，加大量水稀释，过滤，用水洗涤至滤液为中性，真空干燥得到式(Ⅲ)所示4-羟基-1,8-萘酰亚胺；
步骤四：将式(Ⅲ)所示化合物与碘代氯乙烷，碳酸钾，在乙腈中80-90℃反应12h-24h后，旋蒸除去溶剂，残余固体用柱层析法提纯，真空干燥得到式(Ⅰ)所示化合物；
所述反应中化合物Ⅲ与碘代氯乙烷及碳酸钾摩尔比例为1:1.25-1.75:1.5-2.5。
3.一种如权利要求1所述细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针的应用，其特征在于：采用该CYP1A1亚酶的特异性底物，与含CYP1A1的生物样品混合后进行酶促反应，通过定量检测单位时间内的底物消除率或其去氯乙基化产物的生成率来定量测定不同生物体系中CYP1A1的活性，该应用为非疾病诊断治疗目的，具体测定方法及条件如下：
A.体系中以1,8-萘酰亚胺类化合物作为比率型探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；
B.在PBS缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，孵育体系pH介于5.5～10.5之间，
C.反应时间为5～120分钟，确保以上底物相应的O-去氯乙基化产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；
D.测定单位时间内底物减少量或O-去氯乙基化产物生成量作为CYP1A1活性的评价指标。
4.按照权利要求3所述的细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针的应用，其特征还在于所述的生物体系为重组表达CYP1A1单酶、哺乳动物的细胞或组织制备物中的任意一种。
5.按照权利要求3所述的细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针的应用，其特征还在于单点测定时底物浓度Km为1Km；反应温度37℃；pH7.4为反应pH值。
6.按照权利要求3所述的细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针的应用，其特征还在于：该探针底物及其去氯乙基化产物的荧光信号需采用不同检测波长去检测，特异性底物的荧光检测条件为：激发波长372nm，最大发射波长452nm；去氯乙基化产物的荧光检测条件为：激发波长450nm最大发射波长为562nm。
7.一种如权利要求1所述的细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光探针的应用，其特征在于：该探针底物还可用于CYP1A1抑制剂和诱导剂的快速筛选及抑制和诱导能力的定量评价。
8.一种如权利要求1所述的细胞色素氧化酶CYP1A1特异性荧光底物的应用，其特征在于：该探针底物还可用于活细胞及活组织中CYP1A1功能的实时动态监测，所述应用为非疾病诊断治疗目的。
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