CN104120164A - 一类人羧酸酯酶2的特异性荧光探针底物及其应用 - Google Patents
一类人羧酸酯酶2的特异性荧光探针底物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种羧酸酯酶CES2的特异性荧光探针底物及其应用，该特异性探针底物是C-4羟基萘二甲酰亚胺的苯甲酰酯类化合物，其可用于测定生物体系中CES2的酶活。CES2酶活测定的流程如下：选择C-4羟基萘二甲酰亚胺的苯甲酰酯水解脱苯甲酰反应为探针反应，通过定量检测单位时间内其水解代谢产物的生成量来测定各生物样品、细胞、在体及整体器官中CES2酶的活性。本发明可用于不同种属、不同个体来源生物样本中CES2酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中CES2酶活的定量测定，以期实现对重要药物代谢酶CES2处置药物能力的评估。此外，借助该探针反应还可用于体外快速筛选CES2的抑制剂。
Description
技术领域
本发明属医药技术领域，具体涉及一类人羧酸酯酶2（CES2）的特异性荧光探针底物及其应用。
背景技术
羧酸酯酶（Carboxylesterase，CES）是机体内重要的Ⅰ相水解代谢酶，催化化合物发生酯键断裂，暴露极性的羟基或羧基，进而被体内CYP450或UGTs等其他代谢酶继续催化代谢，使其更有效地排出体外。多种外源性物质，如伊立替康（CPT-11）、奥司他韦（达菲）等酯类结构前体药物以及结构中含有酯键的其他化合物均需要经羧酸酯酶催化途径进行活化或代谢消除。
人体内介导药物代谢的羧酸酯酶目前主要有2个家族：CES1和CES2，其中CES1又可继续被分为CES1b和CES1c两种亚型。CES1和CES2具有不同的组织分布特异性及底物选择性，肝脏中主要表达CES1，同时表达少来CES2，而小肠中则以CES2亚型为主，只有少量的CES1分布(Life Sci.2007,81(11):924-932)。近年来还发现多种肿瘤细胞高表达CES2，可借助此特征设计CES2水解的抗肿瘤前体药物实现选择性杀伤肿瘤细胞的效果(Clin Cancer Res.2002,8(8):2605-2611)。由于多数口服前药或酯类药物分子需先经过肠道才能被吸收进入血液循环，因此肠道CES2酶对酯类药物的代谢被认为是酯类化合物首过代谢的主要组成部分，CES2酶活的差异对于前体药物的生物利用度具有较重要的影响。此外，有些经静脉给药的前体药物，如伊立替康，会经过胆汁排泄分泌到肠道中，继而被肠道中的CES2催化水解释放活性代谢产物，可能会在局部产生毒副作用。可通过筛选CES2的高效抑制剂将其应用于减缓伊立替康导致的迟发型腹泻(Cancer Res.2000,60(17):4725-4728;Mol Cancer Ther.2004,3(8):903-909)。
本发明中提供了一类C-4羟基萘二甲酰亚胺的酯类衍生化合物及其作为CES2酶探针底物的应用，其经羧酸酯酶CES2水解后可生成荧光发射波谱不同于原型的水解产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活及抑制活性评价快速省时等特点。
发明内容
本发明提供了一类羧酸酯酶CES2的特异性荧光探针底物及其应用，该类特异性探针底物是C-4羟基萘二甲酰亚胺的酯类衍生物，其结构见式（1），其原型和水解产物的荧光发射波长具有明显差异，且产物更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中CES2的分布和功能进行定量评价。
本发明还提供了一种利用所述特异性探针底物定量测定生物体系中CES2酶活的方法，采用上述式（1）化合物作为底物，通过定量检测单位时间内的底物消除量或其水解产物的生成量来测定酶或细胞制备液等生物样品及细胞中CES2酶的活性；具体测定方法为：
——体系中以C-4羟基萘二甲酰亚胺的酯类化合物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；单点测定时底物浓度优选Km。
——在PBS缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值。
——反应时间为5～120分钟，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20%时终止反应；
——测定单位时间内底物减少量或水解产物生成量作为羧酸酯酶CES2活性的评价指标。
本发明提供了所述特异性荧光探针底物的应用，该特异性探针底物用于重组羧酸酯酶、人及动物组织制备液及各类组织细胞中CES2酶活的定量测定，以及利用该探针反应快速筛选CES2酶的抑制剂。
采用重组羧酸酯酶CES2单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，特异性抑制实验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学几方面的证据，证明C-4羟基萘二甲酰亚胺的酯可特异性的经羧酸酯酶CES2代谢（如图2所示），生成C-4位酯键断裂的水解产物。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该代谢反应具有非常良好的特异性。
作为高特异性的羧酸酯酶CES2的荧光探针底物，该化合物可以用来检测羧酸酯酶CES2的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的羧酸酯酶CES2重组酶的酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等制备物中CES2的活性标定。
选用本发明所述羧酸酯酶CES2的特异性探针底物检测羧酸酯酶CES2酶体外活性具有以下突出优势：
(1)高特异性：C-4羟基萘二甲酰亚胺的酯类化合物可被羧酸酯酶CES2高特异性地代谢成一个代谢产物，即C-4位酯键断裂的水解产物。
(2)廉价易得：C-4羟基萘二甲酰亚胺的酯类化合物及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行。
(3)高灵敏度：具有萘二甲酰亚胺母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性（500～650nm），该底物及其水解代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征，能较好的进行区分检测，同时可经比率法通过绘制标准曲线进行定量测定。
附图说明
图1.C-4羟基萘二甲酰亚胺的苯甲酰酯类化合物的结构通式；
图2.C-4羟基萘二甲酰亚胺的苯甲酰酯的1H-NMR谱图；
图3.C-4羟基萘二甲酰亚胺的系列苯甲酰酯的人重组单酶筛选试验结果（A,苯甲酰酯;B,对甲基苯甲酰酯；C,对甲氧基苯甲酰酯；D,对溴苯甲酰酯；
图4.C-4羟基萘二甲酰亚胺的苯甲酰酯及其脱苯甲酰代谢产物的荧光发射光谱图（分别在340nm和450nm进行激发）；
图5.C-4羟基萘二甲酰亚胺的苯甲酰酯及其水解产物的紫外吸收光谱图；
图6.脱苯甲酰水解代谢产物的生成量随孵育时间变化的线性拟合；
图7.C-4羟基萘二甲酰亚胺的苯甲酰酯被CES2催化水解的代谢通路。
图8为C-4羟基萘二甲酰亚胺苯甲酰酯的化学合成示意图。
具体实施方式
本发明特异性探针底物是C-4羟基萘二甲酰亚胺的苯甲酰酯类化合物，其可用于测定生物体系中CES2的酶活。CES2酶活测定的流程如下：选择C-4羟基萘二甲酰亚胺的苯甲酰酯水解脱苯甲酰反应为探针反应，通过定量检测单位时间内其水解代谢产物的生成量来测定各生物样品、细胞、在体及整体器官中CES2酶的活性。本发明可用于不同种属、不同个体来源生物样本中CES2酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中CES2酶活的定量测定，以期实现对重要药物代谢酶CES2处置药物能力的评估。此外，借助该探针反应还可用于体外快速筛选CES2的抑制剂。
下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。
实施例1.C-4羟基萘二甲酰亚胺苯甲酰酯的化学合成
（1）向10mL含有0.5mmol的4-羟基-N-丁基-1,8-萘酰亚胺和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.6mmol的苯甲酰氯（溶于5mL的四氢呋喃中），控制温度在0℃；
（2）混匀1h后，加热反应溶液至室温，过夜反应（见图8）；
（3）反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷（1:3v/v）进行洗脱，得62mg白色固体粉末状纯品；
（4）采用高分辨质谱和核磁进行化合物结构的表征；
实施例2.体外定量测定重组单酶中CES2的酶活
（1）预先准备99μl CES2代谢反应体系，包括pH7.4的PBS缓冲液（10mM）、重组人CES2(2ug/ml)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
（2）向反应体系中加入1μl终浓度为25μM的C-4羟基萘二甲酰亚胺苯甲酰酯起始反应；
（3）30分钟后，加入100μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心5分钟后，取上清，进行荧光检测（Ex=450nm，Em=560nm）；计算重组人CES2酶的最大催化速率为2310±350nmol/min/mg。
实施例3.体外定量测定人肠微粒体中CES2的酶活
（1）预先准备99μl人小肠微粒体代谢反应体系，包括pH7.4的PBS缓冲液（10mM）、人小肠微粒体(20ug/ml)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
（2）向反应体系中加入1μl终浓度为25μM的C-4羟基萘二甲酰亚胺的甲基苯甲酰酯起始反应；
（3）30分钟后，加入100μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心5分钟后，取上清，进行荧光检测（Ex=450nm，Em=560nm）；计算人小肠中对该探针化合物的最大催化速率为642±34nmol/min/mg。
实施例4.定量测定人肺腺癌A549细胞中CES2的活性
（1）人肺腺癌A549细胞系培养于盖玻片上，采用的培养基是DMEM培养基（含10%小牛血清）以及100ug/ml的双抗，培养环境为37℃的5%二氧化碳培养箱中。
（2）使用之前，贴壁细胞采用不含血清的DMEM培养基冲洗3次，加入终浓度为10uM的C-4羟基萘二甲酰亚胺的对溴苯甲酰酯，于37℃温孵30分钟。
（3）之后，采用PBS缓冲液冲洗3次。在激光共聚焦显微镜下观察细胞，通过荧光分布位置与强度来显示细胞中CES2的分布及其相对含量多少。
Claims (7)
1.一类人羧酸酯酶2（Carboxylesterase2，CES2）的特异性荧光探针底物，其特征在于：该特异性探针底物是C-4羟基萘二甲酰亚胺的苯甲酰酯类化合物，其结构通式见式（1），其中R为-H或-CH3、-CF3、-C2H5、-C3H6等烷基或-OCH3、-OC2H5中的一种，或-Br、-Cl、-F等卤素取代基中的一种；
2.一种权利要求1所述特异性荧光探针底物在定量测定重组表达CES2单酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞等生物体系中CES2酶活中的应用，其特征在于：采用权利要求1所述式（1）化合物作为CES2亚酶的特异性底物，通过定量检测单位时间内的底物消除量或水解产物的生成量来定量测定上述生物体系中CES2的活性。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：在磷酸缓冲液中，底物浓度介于1/10～10Km之间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间；反应温度介于20～60℃之间。
4.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：上述反应体系中的产物生成率或底物转化率介于1%～20%之间。
5.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：底物及其水解产物均具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速、灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长450nm，在530～650nm进行荧光发射谱的检测。
6.按照权利要求2所述的应用，其特征还在于：该特异性探针底物及相应CES2活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组CES2、人或动物组织制备液、或各类组织细胞中CES2酶活的定量测定。
7.按照权利要求2所述的应用，其特征还在于：该方法还可用于人羧酸酯酶CES2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
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