CN106590628A - 胆红素代谢酶ugt1a1的特异性荧光探针底物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
一种胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针及其制备和应用，该特异性探针底物具有4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺结构，其可用于定量测定生物体系中UGT1A1的酶活。该探针底物用于酶活测定的流程如下：选择4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺类化合物作为探针底物，在UGT1A1及辅因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸存在的体系下发生结合反应，通过定量检测单位时间内其葡萄糖醛酸化代谢产物的生成量来测定不同生物样品中UGT1A1的活性。此外，借助该探针反应还可用于体外快速筛选UGT1A1的诱导剂及抑制剂，并对其诱导/抑制能力进行评估。本发明所述胆红素代谢酶UGT1A1的特异性探针检测UTG1A1酶活具有高特异性，廉价易得，高灵敏度等突出优势。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，一种胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物及其制备和应用。
背景技术
胆红素代谢酶UGT1A1是位于细胞内质网上的膜蛋白，主要介导药物或外来物与机体内源性物质尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)发生葡萄糖醛酸结合反应。UGT1A1在代谢防御体系中和内源性物质稳态中都扮演着非常重要的角色，代谢许多临床“高频”药物(如，依托泊带，伊力替康等)和机体“高危”内源性物质(如，胆红素，雌二醇等)。UGT1A1的活性缺失已被证实和抗癌药物伊力替康的严重腹泻等毒性息息相关。而FDA也已经明确规定，病人服用伊力替康之前检测外周血液中的UGT1A1基因型，从而合理使用药物剂量。
UGT1A1是唯一参与机体胆红素(内源性毒性物质)代谢清除的代谢酶，它介导的葡萄糖醛酸化反应是胆红素排出体外的必须步骤。无论是先天的遗传因素(如基因型突变)还是后天的环境影响(如疾病状态或者UGT1A1活性的抑制)都会导致UGT1A1功能紊乱，进而引起胆红素在人体内代谢紊乱，造成血清中的水平升高，引发高胆红素血症的发生或加剧克里格勒纳吉尔综合症(Crigler-Najjar)和吉尔伯特综合症(Gilbert's)。事实上，治疗药物通过对UGT1A1的抑制引发血清中非结合型胆红素水平上升的临床相关案例比比皆是。比如，茚地那韦，尼罗替尼及索拉菲尼等诱导的临床病人高胆红素血症的发生，机理为直接竞争性或混合型的抑制UGT1A1酶的活性，从而抑制UGT1A1介导的胆红素葡萄糖醛酸活性，血清中非结合胆红素上升。
而UGT1A1又是一个个体活性差异非常高的药物代谢酶(变异系数高达92％)，因此也被称为二相代谢里面的“CYP2D6”。众所周知，UGT1A1是基因多态性非常多的代谢酶，事实上，多达42％的非洲人和南亚人口携带UGT1A1启动子区域TA-重复的序列(如UGT1A1*28)，表现出受损的胆红素结合能力，在肝脏损伤或者胆红素结合能力降低的情况下尤为显著。因此，无论是临床个体化用药的需求，还是作为药物研发过程中的工具分子，都迫切需要UGT1A1特异性的探针分子的出现，探针分子能够快速定量评估不同种属、不同个体来源生物样本中UGT1A1酶活及筛选外源性物质对UGT1A1的抑制作用。
过去的几十年中，胆红素-O-葡萄糖醛酸化和雌二醇-3-O-葡萄糖醛酸化一直被作为特异性探针反应，广泛应用于评估人组织中UGT1A1的活性及其介导的药物/中草药-药物之间的相互作用。然而，胆红素和雌二醇探测UGT1A1真实活性存在若干的问题，包括的灵敏度和低通量，这些妨碍了它们应用于快速评估大量生物样本中UGT1A1活性及筛选成千上万的中草药提取物和它们的成分对UGT1A1的抑制作用。而小分子荧光探针具有一系列的优势特征包括操作简便，高灵敏性及生物成像等优点引起国内外学者广泛关注。而UGT1A1小分子荧光探针的研发非常具有应用前景及商业价值，然而许多连有荧光药效基团的化合物在发生葡萄糖醛酸化代谢后没有荧光或者荧光波长蓝移的现象。面对该存瓶颈，迫切需要开发一个准确，灵敏的UGT1A1荧光探针，该探针与葡萄糖醛酸结合后出现荧光或者荧光波长红移，用于检测生物酶催化体系及活细胞中的UGT1A1活性，避免临床上不良的药物-药物相互作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胆红素代谢酶的特异性荧光探针及其制备方法，该特异性荧光探针没有荧光，而其葡萄糖醛酸化产物具有较好的荧光属性，产物具有较高的荧光量子产率，生成的荧光强度较强易于检测。基于这种从没有荧光到荧光出现的属性，该探针反应可对多种生物体系中UGT1A1的功能和分布进行实时定量评估。
一种胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物，该探针底物可被胆红素代谢酶特异性催化生成相应的氧葡萄糖醛酸苷产物，该底物具有1,8-萘酰亚胺类结构，其结构通式如下所示：
其中R为苯基、-H中的一种，n为1～10。
一种胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物的制备方法,以N原子上连接不同取代基的4-溴-1,8-萘酰亚胺，对羟基苯硼酸为原料，醋酸钯为催化剂,水和异丙醇作为溶剂，氩气保护下加热，以N原子上连接不同取代基的4-溴-1,8-萘酰亚胺，采用柱层析法提纯，得到淡黄色固体，具体为：
体系中以1eq N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺和1-1.5eq对羟基苯硼酸作为原料,0.02-0.05eq醋酸钯和1-2eq碳酸钾为催化剂开始反应，水和异丙醇作为溶剂，氩气保护下，反应温度为30-50℃,搅拌，反应时间为8-12h，采用柱层析法提纯，得到淡黄色固体。
一种胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物用于酶活检测的方法，采用该特异性底物，在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)存在的缓冲体系中进行葡萄糖醛酸化结合反应，通过定量检测单位时间内的底物消除量或其葡萄糖醛酸化产物的生成量来测定不同生物体系中UGT1A1的活性，具体为：
——体系中以4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺类化合物作为特异性探针底物；底物浓度选择范围在1/2～20Km之间；。
——在Tris-HCl缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，
——反应时间为0～140分钟，确保以上底物相应的葡萄糖醛酸化产物的生成量达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；
——测定单位时间内底物减少量或葡萄糖醛酸化产物生成量作为UTG1A1活性的评价指标。
单点测定时底物浓度优选5-10Km
pH值优选pH7.4。
反应温度优选37℃。
所述底物消除率或产物的生成率应低于20％。
其可用于不同生物体系中目标酶的定量检测，所述生物体系包括重组表达的人或哺乳动物的UGT1A1单酶、含有UGT1A1的人或哺乳动物的细胞或细胞制备物、含有UGT1A1的人或哺乳动物的组织或组织制备物。该方法还可用于快速筛选UGT1A1的诱导剂和抑制剂，以及定量评价其诱导或抑制能力。
一种胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物没有荧光，而其葡萄糖醛酸化产物具有较好的荧光属性，为典型的OFF-ON型荧光探针，可采用多功能酶标仪或者液相荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测；葡萄糖醛酸化产物的荧光检测条件为：激发波长370nm，最大发射波长为520nm。
该特异性OFF-ON荧光探针葡萄糖醛酸化产物发射绿色荧光，其在UGT1A1活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种人及动物的重组UGT1A1单酶、各种组织细胞及组织制备液中UGT1A1酶活的实时定量测定；该探针葡萄糖醛酸化代谢产物的荧光检测方法还可用于快速筛选UGT1A1的抑制剂及定量评价其抑制能力。
采用重组葡萄糖醛酸单酶及肝微粒体孵育体系对其选择性进行评价，通过重组单酶反应表征，特异性抑制实验，相关性分析，以及酶反应动力学几方面的证据，证明4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺类化合物可特异性的经葡萄糖醛酸UTG1A1代谢，生成氧葡萄糖醛酸苷产物，该代谢反应具有非常良好的特异性。
作为高特异性的UTG1A1单酶的荧光探针底物，该化合物可以用来检测UTG1A1的活性，尤其适合用于昆虫细胞和哺乳动物细胞克隆体系表达的UTG1A1酶活的测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的S-9、微粒体等制备物中UTG1A1的活性标定。
本发明中4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺类化合物具有代谢产物具有荧光属性(发射波长520～600nm)、代谢产物单一(仅生成一个单葡萄糖醛酸化产物)、代谢酶选择性高(主要由UGT1A1代谢)、底物及代谢产物易于检测且灵敏度高等特点。
选用本发明所述胆红素代谢酶UGT1A1的特异性探针检测UTG1A1酶活具有以下突出优势：
(1)高特异性：4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺类化合物可被葡萄糖醛酸UTG1A1单酶高特异性地代谢成一个代谢产物，即氧葡萄糖醛酸苷产物。
(2)廉价易得：4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺类化合物可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。
(3)高灵敏度：具有4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺母核结构的化合物葡萄糖醛酸化代谢产物具有良好的荧光发射光谱特性(450～700nm)及较高的荧光量子产率，对UGT1A1酶活能实现高灵敏度的检测，同时可通过建立代谢产物的标准曲线进行定量测定，UGT1A1单酶的最低检测限为5μg。
附图说明
图1.4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺类化合物的结构通式；
图2.N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺的13C-NMR谱图；
图3.N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺-葡萄糖醛酸苷的13C-NMR谱图；
图4.N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺葡萄糖醛酸化代谢产物的荧光发射光谱图(在520nm有最大发射)；
图5.N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺人UGT重组单酶筛选试验结果；
图6.葡萄糖醛酸化代谢产物的生成量随孵育时间变化的线性拟合；
图7.葡萄糖醛酸化代谢产物的生成量随孵育蛋白变化的线性拟合；
图8.14例个体HLM对N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺的代谢图；
图9.N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺被UGT1A1葡萄糖醛酸化的代谢通路；
图10.N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺的合成路线。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺类化合物的结构通式如图1所示。
实施例1.
N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺的合成路线
在25mL两口瓶中加入331mg的N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺,207mg对羟基苯硼酸，11.2mg醋酸钯以及276mg碳酸钾，然后加入5mL水和5mL异丙醇，氩气保护下加热至50摄氏度，搅拌12h。冷却至室温，加入30mL乙酸乙酯，用等体积的饱和氯化钠溶液洗涤三次，无水硫酸镁干燥，除去溶剂，剩余固体采用柱层析法提纯，展开剂为乙酸乙酯：正己烷＝1:4(体积比)，得到162mg淡黄色固体。
得到的产物N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺的13C-NMR谱图如图2所示；.N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺-葡萄糖醛酸苷的13C-NMR谱图如图3所示；化合物的合成路线如图10所示。
δ1H(400MHz,DMSO)9.84(1H,s),8.52(2H,t,J 6.9),8.32(1H,d,J 7.8),7.84(1H,dd,J 8.4,7.4),7.74(1H,d,J 7.6),7.39(2H,d,J 8.5),6.98(2H,d,J 8.5),4.15-4.01(2H,t),1.72-1.56(2H,m),1.42-1.29(2H,m),0.93(3H,t,J 7.4).δ13C(100MHz,DMSO)163.97,163.75,158.42,146.88,131.65,131.18,130.97,129.88,129.24,128.20,127.70,122.88,121.04,116.13,40.39,30.13,20.26,14.19
实施例2.
葡萄糖醛酸苷产物发射光谱测定
(1)预先准备200μl UGT代谢反应体系，包括pH 7.4的Tris-HCl缓冲液(50mM)、HLM(0.5mg/mL)，N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺终浓度为200μM，于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入10μl浓度为40mM(终浓度2mM)的UDPGA起始反应；
(3)120分钟后，加入200μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光全波长波谱扫描(Ex＝370nm，Em＝390～800nm)；N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺葡萄糖醛酸苷最大发射波长为520nm(图4)。
实施例3.
体外测定人重组UGT单酶的选择性
(1)预先准备95μl UGT代谢反应体系，包括pH 7.4的Tris-HCl缓冲液(50mM)、重组人UGT各单酶(0.1mg/ml)，N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺终浓度为20和200μM，于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入5μl浓度为40mM(终浓度2mM)的UDPGA起始反应；
(3)120分钟后，加入100μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(Ex＝370nm，Em＝520nm)；重组人UGT1A1酶的选择性最高约是其它单酶的16倍左右(图5)。N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺被UGT1A1葡萄糖醛酸化的代谢通路示意图如图9所示。
实施例3.
UGT1A1时间标准曲线测定
N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺5μM，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸2mM，十二烷基聚乙二醇醚1mg/ml，MgCl2 5mM，UGT1A1单酶0.05mg/ml，pH 7.4的Tris-HCl缓冲液50mM，总体积为100μL，37℃下孵育0，10,30,50,70,90,110,130min，产物的荧光强度孵育时间做标准曲线，标准曲线的回归系数r＞0.99，表明标准曲线线性范围宽广如图6，可准确定量UGT1A1的含量。
实施例4.
UGT1A1蛋白浓度标准曲线测定
N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺5μM，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸2mM，十二烷基聚乙二醇醚1mg/mL，MgCl2 5mM，UGT1A1单酶0～0.2mg/ml，pH 7.4的Tris-HCl缓冲液50mM，总体积为200μL，37℃下孵育60min，产物的荧光强度与反应体系中的UGT1A1蛋白浓度线性回归，拟合得到的回归系数R2＞0.95，表明标准曲线线性范围宽广如图7，可准确定量UGT1A1的含量。
实施例5.
不同个体来源肝微粒体中UGT1A1的活性定量评估
(1)选取14例人肝微粒体(HLM)稀释至10mg/ml，准备UGT1A1体外代谢孵育体系，包括pH 7.4的Tris-HCl缓冲液(50mM)、人肝微粒体(0.1mg/mL)、N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺终浓度为5μM，于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入10μl浓度为40mM的UDPGA起始反应；
(3)50分钟后，加入200μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(Ex＝370nm，Em＝520nm)，将所获荧光强度代入标准曲线后得到14例人肝微粒体(HLM)对N-(正丁基)-4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺的代谢速率(图8)。
Claims (10)
1.一种胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物，其特征在于：该探针底物可被胆红素代谢酶特异性催化生成相应的氧葡萄糖醛酸苷产物，该底物具有1,8-萘酰亚胺类结构，其结构通式如下所示：
其中R为苯基、-H中的一种，n为1～10。
2.一种如权利要求1所述胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物的制备方法,其特征在于：以N原子上连接不同取代基的4-溴-1,8-萘酰亚胺，对羟基苯硼酸为原料，醋酸钯为催化剂,水和异丙醇作为溶剂，氩气保护下加热，以N原子上连接不同取代基的4-溴-1,8-萘酰亚胺，采用柱层析法提纯，得到淡黄色固体，具体为：
体系中以1eq N-正丁基-4-溴-1,8-萘酰亚胺和1-1.5eq对羟基苯硼酸作为原料,0.02-0.05eq醋酸钯和1-2eq碳酸钾为催化剂开始反应，水和异丙醇作为溶剂，氩气保护下，反应温度为30-50℃,搅拌，反应时间为8-12h，采用柱层析法提纯，得到淡黄色固体。
3.一种如权利要求1所述胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物用于酶活检测的方法，其特征在于：采用该特异性底物，在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸存在的缓冲体系中进行葡萄糖醛酸化结合反应，通过定量检测单位时间内的底物消除量或其葡萄糖醛酸化产物的生成量来测定不同生物体系中UGT1A1的活性，具体为：
——体系中以4-苯酚基-1,8-萘酰亚胺类化合物作为特异性探针底物；底物浓度选择范围在1/2～20Km之间；
——在Tris-HCl缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，；孵育体系pH介于5.5～10.5之间；
——反应时间为0～140分钟，确保以上底物相应的葡萄糖醛酸化产物的生成量达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；
——测定单位时间内底物减少量或葡萄糖醛酸化产物生成量作为UTG1A1活性的评价指标。
4.按照权利要求3所述胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物于酶活检测的方法，其特征在于单点测定时底物浓度优选5-10Km。
5.按照权利要求3所述胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物于酶活检测的方法，其特征在于pH值优选pH7.4。
6.按照权利要求3所述胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物于酶活检测的方法，其特征在于反应温度优选37℃。
7.按照权利要求3所述所述胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物于酶活检测的方法，其特征还在于：所述底物消除率或产物的生成率应低于20％。
8.按照权利要求3所述所述胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物于酶活检测的方法，其特征在于：其可用于不同生物体系中目标酶的定量检测，所述生物体系包括重组表达的人或哺乳动物的UGT1A1单酶、含有UGT1A1的人或哺乳动物的细胞或细胞制备物、含有UGT1A1的人或哺乳动物的组织或组织制备物。
9.按照权利要求3所述所述胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物于酶活检测的方法，其特征在于：该探针底物不具有荧光属性，但其被胆红素代谢酶催化生成的葡萄糖醛酸化产物具有较好的荧光属性，可采用荧光酶标仪及液相-荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测；葡萄糖醛酸化底物荧光检测条件为：激发波长370nm，最大发射波长为520nm。
10.权利要求3所所述胆红素代谢酶UGT1A1的特异性荧光探针底物于酶活检测的方法，其特征在于：该方法还可用于快速筛选UGT1A1的诱导剂和抑制剂，以及定量评价其诱导或抑制能力。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170426 |
|
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