CN104592985B - 一种人羧酸酯酶hCE2的高特异性荧光探针及其应用 - Google Patents
一种人羧酸酯酶hCE2的高特异性荧光探针及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种人羧酸酯酶hCE2的高特异性荧光探针及其应用，该特异性探针底物是4‑三氟甲基‑7‑羟基香豆素类化合物酯类衍生物，可用于检测不同生物样品中hCE2的存在与否及其活力的定量测定。酶活性具体测定流程如下：选择4‑三氟甲基‑7‑羟基香豆素酯类衍生物水解反应为探针反应，选择适宜底物浓度在线性反应区间内通过定量检测单位时间内水解代谢产物4‑三氟甲基‑7‑羟基香豆素的生成量来测定各生物样品、细胞、载体及整体器官中hCE2酶的实际活性。本发明不仅可用于不同来源生物样本中hCE2酶活性的定量评估，此外借助该探针反应还可用于体外快速筛选hCE2的抑制剂。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及人羧酸酯酶亚型2(hES2)的特异性荧光探针及其应用。
背景技术
羧酸酯酶(Carboxylesterase，CES)是机体内重要的Ⅰ相水解代谢酶，催化多种内源性和外源性化合物发生酯键断裂，释放出极性的醇和羧酸分子片段，后者进而被体内CYP450或UGTs等其他代谢酶继续催化代谢，使药物分子更有效地被排出体外。多种结构中含有酯键的药物分子，如盐酸伊立替康(irinotecan，CPT-11)、奥司他韦(达菲)、氯吡格雷等均被羧酸酯酶催化进行活化或代谢消除。
人体内介导药物代谢的羧酸酯酶主要分布在2个家族：hCE1和hCE2，其中hCE1又可继续被分为hCE1b和hCE1c两种亚型。hCE1和hCE2具有不同的组织分布特异性及底物选择性，人的肝脏中主要分布表达hCE1，同时表达一定量的hCE2，而小肠中则基本以hCE2亚型为主，只有极少量的hCE1分布。近年来发现多种肿瘤细胞中hCE2的表达水平上调，可借助此特征设计经hCE2特异性水解的抗肿瘤前体药物实现靶向选择性杀伤肿瘤细胞的目的。此外，多数口服前药需先经过肠道才能被吸收进入血液循环，因此肠道中hCE2酶对酯类药物的代谢被认为是其首次代谢的重要组成部分，hCE2酶活性的差异对于前体药物的生物利用度具有十分重要的影响。此外，有些经静脉给药的前体药物，如盐酸伊立替康，会经过胆汁排泄被分泌到肠道中，继而被肠道中的hCE2催化水解释放出毒性代谢产物SN-38，后者被认为是导致伊立替康迟发型腹泻副作用的主要原因。因而，建立基于探针的高通量技术手段，对于筛选hCE2的高效抑制剂并将其应用于减缓伊立替康导致的迟发型腹泻，以及对hCE2功能的定量检测都十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人羧酸酯酶hCE2的特异性荧光探针及其应用，该底物原型和水解产物的荧光属性具有明显差异，且产物更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中hCE2的分布和功能进行定量评价。
本发明提供了一种人羧酸酯酶亚型2(hCE2)的特异性荧光探针底物，该底物的酯键在人源组织或细胞中可被hCE2特异性水解为相应水解产物并显示与底物不同的发射波谱；该底物是以4-三氟甲基-7-羟基香豆素类化合物为原料，通过酯化反应获得相应7-羟基酯类衍生物，其结构通式如式(1)所示，其中，R为苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基苯基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、(4-苯基)苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一种。
如当R为氢时，该底物为4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素。
本发明还提供了hCE2的特异性荧光探针底物的应用，该底物作为hCE2的特异性底物，发生水解反应，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定酶或细胞制备液等生物样品及细胞中hCE2的活性；具体测定方法为：
——体系中以4-三氟甲基-7-羟基香豆素类化合物7-羟基的酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；单点测定时底物浓度优选Km。
——在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH 7.4为最优反应pH值；
——反应时间为5～120分钟，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；
——测定单位时间内水解产物生成量作为羧酸酯酶hCE2活性的评价指标。
本发明提供的人羧酸酯酶2特异性荧光探针底物的应用，所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1％～20％之间。
本发明提供的人羧酸酯酶2特异性荧光探针底物的应用，探针底物及其水解产物均具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长380nm，在420～660nm进行荧光发射谱的检测。此外，该特异性探针底物及相应hCE2活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中hCE2酶活性的定量测定。
该特异性探针反应可用于重组羧酸酯酶、人及动物组织制备液及各类组织细胞中hCE2酶活性的定量测定，还可用于快速筛选hCE2酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。
采用重组羧酸酯酶hCE2单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析、特异性抑制实验、重组单酶代谢反应以及酶反应动力学等多方面的证据，证明4-三氟甲基-7-羟基香豆素类化合物7-羟基的酯类衍生物可特异性的经羧酸酯酶hCE2代谢，生成相应的水解产物。
作为高特异性的羧酸酯酶hCE2的荧光探针底物，该化合物可以用来检测羧酸酯酶hCE2的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系产生的羧酸酯酶hCE2重组酶的酶活性测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的组织微粒体、S-9等制备物中hCE2的活性标定。
本发明提供了一类4-三氟甲基-7-羟基香豆素类化合物的酯类衍生物及其作为hCE2酶荧光探针底物的应用，其经羧酸酯酶hCE2水解后可生成荧光发射波谱不同于原型的水解产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活性及抑制活性评价快速高效等特点。
选用本发明所述羧酸酯酶hCE2的特异性探针底物检测羧酸酯酶hCE2酶体外活性具有以下突出优势：
(1)高特异性：4-三氟甲基-7-羟基香豆素类化合物7-羟基的酯类衍生物可被羧酸酯酶hCE2高特异性地代谢成一个代谢产物，即7位酯键断裂的水解产物。
(2)廉价易得：4-三氟甲基-7-羟基香豆素类化合物7-羟基的酯类衍生物及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行。
(3)高灵敏度：具有4-三氟甲基-7-羟基香豆素母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性(420～660nm)，该底物及其水解代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征，能较好的进行区分检测，同时可通过绘制标准曲线进行定量测定。
附图说明
图1 4-三氟甲基-7-羟基香豆素酯类衍生物的结构通式；
图2 4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素的人重组单酶筛选试验结果；
图3 4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素随hCE2蛋白浓度增大的荧光谱图；
图4 4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素水解产物生成量与孵育时间的关系；
图5 4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素细胞成像图。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，并不因此而限制本实施例。
实施例1 4-三氟甲基-7-羟基香豆素4-乙基苯甲酰酯的化学合成
(1)向10mL含有0.5mmol的4-三氟甲基-7-羟基香豆素和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.6mmol的对乙基苯甲酰氯(溶于5mL的四氢呋喃中)，控制温度在0℃；
(2)冰浴搅拌1h后，溶液恢复至室温，搅拌过夜；
(3)反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷(1:3v/v)进行洗脱，得135mg白色固体粉末状纯品。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23–8.18(m,2H)，7.80(dt,J＝8.8,1.8Hz,1H)，7.69(ddd,J＝7.0,4.1,1.3Hz,1H)，7.59–7.49(m,2H)，7.37(d,J＝2.3Hz,1H)，7.29(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H)，6.80(s,1H)。
实施例2 4-三氟甲基-7-羟基香豆素4-氯苯甲酰酯的化学合成
(1)向10mL含有0.5mmol的4-三氟甲基-7-羟基香豆素和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.6mmol的对氯苯甲酰氯(溶于5mL的四氢呋喃中)，控制温度在0℃；
(2)冰浴搅拌1h后，溶液恢复至室温，搅拌过夜；
(3)反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷(1:3v/v)进行洗脱，得132mg白色固体粉末状纯品。
实施例3 4-三氟甲基-7-羟基香豆素4-甲基苯甲酰酯的化学合成
(1)向10mL含有0.5mmol的4-三氟甲基-7-羟基香豆素和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.6mmol的对甲基苯甲酰氯(溶于5mL的四氢呋喃中)，控制温度在0℃；
(2)冰浴搅拌1h后，溶液恢复至室温，搅拌过夜；
(3)反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷(1:3v/v)进行洗脱，得131mg白色固体粉末状纯品。
实施例4 4-三氟甲基-7-羟基香豆素4-丙基苯甲酰酯的化学合成
(1)向10mL含有0.5mmol的4-三氟甲基-7-羟基香豆素和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.6mmol的对丙基苯甲酰氯(溶于5mL的四氢呋喃中)，控制温度在0℃；
(2)冰浴搅拌1h后，溶液恢复至室温，搅拌过夜；
(3)反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷(1:3v/v)进行洗脱，得148mg白色固体粉末状纯品。
实施例5 4-三氟甲基-7-羟基香豆素4-硝基苯甲酰酯的化学合成
(1)向10mL含有0.5mmol的4-三氟甲基-7-羟基香豆素和0.625mmol三乙胺的四氢呋喃溶液中，缓慢滴加0.6mmol的对硝基苯甲酰氯(溶于5mL的四氢呋喃中)，控制温度在0℃；
(2)冰浴搅拌1h后，溶液恢复至室温，搅拌过夜；
(3)反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷(1:3v/v)进行洗脱，得155mg白色固体粉末状纯品。
实施例6重组表达的人单酶中的选择性
(1)预先准备99μL代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液(10mM)、重组表达的人hCE2(5μg/mL)/血清白蛋白(500μg/mL)/血浆(1％)/丁酰胆碱酯酶(25U/L)/磷酸缓冲液，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
(2)向反应体系中加入1μL终浓度为25μM的4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素起始反应；
(3)40分钟后，加入100μL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)进行荧光检测(Ex＝380nm，Em＝420～660nm)，计算各体系中荧光强度(见图2)；
实施例7重组单酶中hCE2催化线性反应的蛋白浓度
(1)预先准备99μL hCE2代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液(10mM)、重组人hCE2(0-100ug/mL)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
(2)向反应体系中加入1μL终浓度为25μM的4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素起始反应；
(3)40分钟后，加入100μL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)进行荧光检测(Ex＝380nm，Em＝420～660nm)，计算重组人hCE2酶的线性蛋白浓度(见图3)。线性曲线方程为Y＝3629*X+903.9，其中Y代表荧光强度，X代表羧酸酯酶2浓度。
实施例8重组单酶hCE2中的线性孵育时间
(1)预先准备99μL hCE2代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液(10mM)、重组人hCE2(8ug/mL)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
(2)向反应体系中加入1μL终浓度为25μM的4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素起始反应；
(3)每隔0.5分钟进行一次荧光扫描检测(Ex＝380nm，Em＝420～660nm)，计算重组人hCE2酶的线性反应时间(见图4)。
实施例9体外定量测定重组单酶中hCE2的酶活性
(1)预先准备99μL hCE2代谢反应体系，包括pH 7.4的PBS缓冲液(10mM)、重组人hCE2(2ug/mL)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
(2)向反应体系中加入1μL终浓度为25μM的4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素起始反应；
(3)40分钟后，加入100μL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)进行荧光检测(Ex＝Ex＝380nm，Em＝420～660nm)，计算重组人hCE2酶的最大催化速率为1801±310nmol/min/mg。
实施例10体外定量测定人肠微粒体中hCE2的酶活性
(1)预先准备99μL人小肠微粒体代谢反应体系，包括pH 7.4的Tris-HCl缓冲液(50mM)、人小肠微粒体(20ug/mL)，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
(2)向反应体系中加入1μL终浓度为25μM的4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素起始反应；
(3)40分钟后，加入100μL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)进行荧光检测(Ex＝380nm，Em＝420～660nm)，计算人小肠中对该探针化合物的最大催化速率为742±53nmol/min/mg。
实施例11定量测定人肺腺癌A549细胞中hCE2的活性
(1)人肺腺癌A549细胞系培养于盖玻片上，采用的培养基是DMEM培养基(含10％小牛血清)以及100ug/mL的双抗，培养环境为37℃的5％二氧化碳培养箱中。
(2)使用之前，贴壁细胞采用不含血清的DMEM培养基冲洗3次，加入终浓度为10uM的4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素，于37℃温孵40分钟。
(3)之后，采用PBS缓冲液冲洗3次。在激光共聚焦显微镜下观察细胞，通过荧光分布位置与强度来显示细胞中hCE2的分布及其相对含量多少。(见图5)
实施例12定量测定人血中hCE2的定量限
(1)向380μL的经PBS稀释的10％正常人血浆中加入hCE2重组表达单酶(100μg/mL)20μL，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
(2)向反应体系中加入1μL终浓度为25μM的4-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素起始反应；
(3)40分钟后，加入400μL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)进行荧光检测(Ex＝380nm，Em＝420～660nm)，计算信噪比S/N>10，血浆中hCE2的定量限为25μg/mL。
实施例13体外快速筛选hCE2的抑制剂
(1)hCE2重组表达单酶(5μg/mL)196μL，于37℃条件下震荡预孵10分钟；
(2)向反应体系中加入2μL中药95％乙醇提取液，继续孵育10分钟；
(3)加入2μL终浓度为10μM的-三氟甲基-7-苯甲酰氧基香豆素起始反应；
(3)40分钟后，加入200μL冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)进行荧光检测(Ex＝Ex＝380nm，Em＝420～660nm)，计算荧光强度，根据中药提取液组荧光强度值与DMSO组的荧光强度值计算hCE2的抑制强度。
Claims (4)
1.一种人羧酸酯酶hCE2的高特异性荧光探针，其特征在于：该探针的底物的酯键可被hCE2特异性水解为相应水解产物并产生产物对应的荧光；
该底物为4-三氟甲基-7-羟基香豆素酯类衍生物，其结构通式如式(1)所示，其中，R为氯原子、乙基、丙基、硝基取代基中的一种；
该探针底物作为hCE2的特异性底物，可利用其水解反应活性，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定不同酶源中hCE2的活性；
所述水解反应体系pH介于5.5～10.5之间；探针底物的浓度介于1/10～10Km之间；孵育体系反应温度介于20～60℃之间，同时水解产物的转化率应介于0.1％～20％之间。
2.根据权利要求1所述人羧酸酯酶hCE2的高特异性荧光探针的应用，其特征在于：所述酶源为重组表达的hCE2单酶、人或动物组织制备液或各类组织细胞生物样品。
3.根据权利要求1所述人羧酸酯酶hCE2的高特异性荧光探针的应用，其特征在于：该探针底物不具备荧光而其水解产物具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长330～400nm，在420～660nm进行荧光发射谱的检测。
4.根据权利要求1所述人羧酸酯酶hCE2的高特异性荧光探针的应用，其特征在于：该特异性探针底物及其水解反应可用于hCE2抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
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