CN103805170B - 一种用于识别硫化氢的特异性荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种用于识别硫化氢的特异性荧光探针及其应用，属于精细化工领域。该荧光探针为试卤灵衍生物；按照比例将试卤灵钠盐与碳酸钾、2,4-二硝基溴苯混合在乙腈溶液中加热，最后采用硅胶色谱法进行纯化，得荧光探针。该荧光探针及相应硫化氢含量检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中硫化氢含量的定量测定。这种应该探针具有高特异性，可以与硫化氢特异性环化后水解，即醚键断裂的水解产物；廉价易得，可经化学合成获得，合成工艺简单易行；灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（600～650nm），该波长范围内，生物样品背景荧光微弱，适合对细胞中硫化氢含量进行检测，通过绘制标准曲线进行硫化氢定量测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于识别硫化氢的特异性荧光探针及其应用，其属于精细化工领域。
背景技术
几个世纪以来,硫化氢(H2S)被认为是由地质活动或微生物作用产生的一种有毒物质。这种无色、可燃的气体具有令人恶心的臭鸡蛋气味,并可对哺乳动物的眼睛及呼吸系统产生强烈的刺激作用。吸入过量的硫化氢气体则可导致意识丧失、呼吸衰竭、心跳停止等生理反应,吸收量过大时可导致死亡。另一方面,现在越来越多研究己经开始挑战这种传统的观念:哺乳动物自身可以在受控的条件下产生硫化氢,并认为硫化氧对于维持正常的生理功能具有重要作用。在哺乳动物体内硫化氢可由非酶作用产生,包括体内硫库的释放及聚硫化合物的代谢等。也可由多种酶参与催化合成,包括胱硫醚-聚合酶(CBS)、胱硫醚-裂解酶(CSE)、半胱氨酸转移酶及疏基丙酮酸转硫酶。这些酶可通过不同的反应催化含硫的生物分子如半胱氨酸、高半光氨酸等产生硫化氢。这几种酶出现在心脏、脉管系统、脑、肾脏、肺及胰腺等多种器官的组织中,说明了硫化氧在哺乳动物体内的分布很广泛。
在哺乳动物体内,硫化氢可与下游蛋白质通过转译后的半胱氨酸发生巯基化反应并连接在血红素的铁中心上。这一过程将控制多种生理反应,包括局部缺血再灌注引起的损伤、血管舒张、细胞死亡、血管生成、神经调节、炎症治疗、胰岛素信号传导和氧气应激等。此外,硫化氢也作为活性氧的抗氧化剂或清除剂而发挥作用。但是H2S的浓度水平不正常己被证实与很多疾病有关。这些开创性的实验已经表明硫化氢是一种重要的生理调控气体而不单单是一种污染物。硫化氢复杂的生理角色及潜在的治疗应用促使科研工作者提出新的方法用于监测硫化氢的产生、流通和在不同细胞、组织及器官内的消耗过程。
传统用于检测硫化氢的方法包括比色测定法、极谱传感法和气相色谱法通常会引起待测样品的损伤,或是根本不能实现对生物体内硫化物的检测。荧光分子探针提供了一个引人注的方法,由于其具有细胞膜通透性和高选择性,因而可实现在生物体系中对硫化氢及其他生物小分子的检测。荧光光分析法将为研宄硫化氢的生理功能提供重要要的生物信息。设近两年来,有关硫化氢光检测的报道受到研究工作者的高度关注。
本发明提供了一类试卤灵衍生物用于特异性识别硫化氢（H2S）的探针，其与硫化氢水解后可生成具有荧光属性的水解产物。该反应具有高选择性、高灵敏度、反应迅速的特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种识别硫化氢的特异性荧光探针，该探针本身具有微弱的荧光，与硫化氢反应后产物具有极强的荧光属性。利用该探针反应可对多种生物样本中硫化氢含量进行定量评价。
本发明的技术方案为：一种用于识别硫化氢的特异性荧光探针，所述荧光探针为试卤灵衍生物，其结构式如下：
所述荧光探针的制备方法包括如下步骤：
（1）按照试卤灵钠盐：2,4-二硝基溴苯：碳酸钾摩尔比为1:1~2：2~3的比例加入到反应瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺，控制反应温度在40~80℃，搅拌8-12h；
（2）将上述反应液经过减压除去溶剂，残留的固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯：正己烷体积比为1:1进行洗脱，得荧光探针。
所述荧光探针应用于生物样本中硫化氢含量的定量评价。该探针作为硫化氢的特异性探针，发生水解反应，通过定量检测水解产物的荧光强度来测定细胞中硫化氢的含量；具体测定方法为：
体系中以试卤灵衍生物作为特异性探针；探针浓度选择1/~10μM；在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液：乙醇混合溶液（体积比9:1）中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；反应体系pH介于5.5~10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值；反应时间为5~120分钟；测定水解产物荧光强度作为硫化氢含量的评价指标。
探针本身具有微弱荧光，其水解产物均具有极强的荧光，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长550~590nm，在600~650nm进行荧光发射谱的检测。
本发明的有益效果为：这种荧光探针为试卤灵衍生物；按照比例将试卤灵钠盐与碳酸钾、2,4-二硝基溴苯混合，加入N，N-二甲基甲酰胺，加热，最后采用硅胶色谱法进行纯化，得荧光探针。该荧光探针及相应硫化氢含量检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中硫化氢含量的定量测定。这种应该探针具有高特异性，可以与硫化氢特异性环化后水解，即醚键断裂的水解产物；廉价易得，可经化学合成获得，合成工艺简单易行；灵敏度高，具有具有良好的荧光发射光谱特性（600～650nm），通过绘制标准曲线进行硫化氢定量测定。
附图说明
图17-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮的1H-NMR谱图。
图27-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮的13C-NMR谱图。
图37-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮的高分辨质谱。
图47-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮为探针与硫化氢反应后荧光强度变化结果。
图57-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮为探针与硫化氢反应后紫外吸收变化结果。
图67-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮为探针与不同物质反应后荧光变化结果。
图77-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮为探针与不同浓度硫化氢反应后荧光强度变化曲线。
图87-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮为探针与硫化氢反应荧光强度变化与时间的关系。
图97-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮细胞成像图片，图中由左到右分别为探针、探针和硫氢化钠、亮场。
图107-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮合成路线。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例17-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮的化学合成
图10中示出了7-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮合成路线，其合成步骤如下：
（1）将0.5mmol的试卤灵钠盐和0.625mmol碳酸钾、0.5mmol2,4-二硝基溴苯溶于10mLN，N-二甲基甲酰胺，在80℃反应4h；
（2）将反应液倒入冰水中，析出大量固体，过滤；
（3）固体采用硅胶色谱法进行纯化，采用乙酸乙酯-正己烷（1:1v/v）进行洗脱，得159.6mg橘黄色固体粉末；
实施例27-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮对于不同物质的选择性
（1）预先准备99μl代谢反应体系，包括pH7.4的PBS缓冲液（10mM）：乙醇（体积比9:1），氟离子（100μM）、氯离子（50μM）、溴离子（100μM）、L-碘离子（100μM）、钠离子（100μM）、钾离子（100μM）、钙离子（100μM）、镁离子（100μM）、硝酸根离子（100μM）、硫氢化钠（100μM）
（2）向反应体系中加入1μl终浓度为10μM7-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮起始反应；
（3）60min后，进行荧光检测（λEx=550nm，λEm=590nm）；计算各体系中荧光强度（见图6）；
实施例37-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮与硫化氢浓度线性关系
（1）预先准备99μl代谢反应体系，包括pH7.4的PBS缓冲液（10mM）：乙醇（体积比9:1），硫氢化钠(0-200μM)，于37℃条件下反应30分钟；
（2向反应体系中加入1μl终浓度为10μM7-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮起始反应；
（3）60min后，进行荧光检测（λEx=550nm，λEm=590nm）；计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与硫化氢浓度标准曲线，标准曲线为y=243.72x-2422.7，其中，y代表荧光强度，x代表硫化氢浓度（见图7）；
实施例47-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮为探针与硫化氢反应荧光强度变化与时间的关系
（1）预先准备99μl代谢反应体系，包括pH7.4的PBS缓冲液（10mM）：乙醇（体积比9:1），硫化氢(50μM)，于37℃条件下反应30分钟；
（2向反应体系中加入1μl终浓度为10μM7-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮起始反应；
（3）60min后，进行荧光检测（λEx=550nm，λEm=590nm）；计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与硫化氢反应时间线性关系曲线（见图8）；
实施例5定量测定人肺腺癌A549细胞中硫化氢含量
（1）人肺腺癌A549细胞系培养于盖玻片上，采用的培养基是DMEM培养基（含10%小牛血清）以及100μg/ml的双抗，培养环境为37℃的5%二氧化碳培养箱中。
（2）使用之前，贴壁细胞采用不含血清的DMEM培养基冲洗3次，加入终浓度为10μM的7-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮，于37℃温孵40分钟。
（3）之后，采用PBS缓冲液冲洗3次。在激光共聚焦显微镜下观察细胞，通过荧光分布位置与强度来显示细胞中含量。（见图9）
实施例6定量测定人血中硫化氢含量
（1）向380μl的经PBS：乙醇溶液（体积比9:1）稀释的10%正常人血浆中加入20μl最终硫化氢浓度分别为0μM、50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM硫化氢溶液；
（2）向反应体系中加入1μl终浓度为10μM7-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮起始反应；
（3）进行荧光检测（λEx=530nm，λEm=590nm）；计算信噪比S/N>10，检测不同硫化氢含量血浆中荧光强度信号。
Claims (1)
1.一种用于识别硫化氢的特异性荧光探针的应用，其特征在于：该荧光探针的结构式如下：
所述荧光探针的荧光强度与硫化氢浓度的标准曲线为y=243.72x-2422.7，其中，y代表荧光强度，x代表硫化氢浓度；
（1）预先准备99μl代谢反应体系，包括pH7.4的浓度为10mM的PBS缓冲液：乙醇的体积比9:1，硫氢化钠的浓度为0-200μM，于37℃条件下反应30分钟；
（2）向反应体系中加入1μl终浓度为10μM7-(2,4-二硝基苯氧基)-3H-吩恶嗪-3-酮起始反应；
（3）60min后，进行荧光检测，荧光激发波长λEx=550nm，荧光发射波长λEm=590nm；计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与硫化氢浓度标准曲线。
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