细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针反应及其应用。
背景技术
细胞色素P450酶系(cytochromeP450,P450酶)超家族是机体内最重要的药物代谢酶,大约60%的药物(包括绝大部分临床药物和杀虫剂)的主要清除是由CYP介导的。细胞色素P450酶系是一个蛋白质超家族,是一大类含血红素的蛋白质,在还原态时与CO形成的复合物于450nm处有最大吸收峰。因其催化的I相反应是化合物在体内代谢的关键步骤,因为这一步反应通常是药物从体内清除的限速步骤,可影响化合物的半衰期、清除率等动力学特征,且P450酶活性常随遗传因素、年龄、疾病状态或其它药物相互作用的影响而发生改变。药物对机体P450酶的影响,能造成临床上显著的药物相互作用。
CYP1A是重要的I相代谢酶,主要包括两种亚型:CYP1A1和CYP1A2,其中CYP1A1主要在人肺中表达,而CYP1A2则主要在人肝中表达,且占人肝中CYP总量的13%。CYP1A也参与多种药物例如茶碱、咖啡因、安替比林等,以及环境毒素和内源性底物的代谢,并在多种前致癌物被激活成具有遗传毒性中间体或最终致癌物的过程中起到了重要作用,例如在一定程度上激活咖啡因诱使肝硬化的发生(MOLASPECTSMED.1999.20:1-137)。除此之外,CYP1A的活性在不同人种中也有很大的个体差异,人口研究发现CYP1A在不同人种中可能会呈现单峰、双峰甚至三峰的分布(EurJClinPharmacol.1995.47:423-430)。因此,开展CYP1A酶活的个体差异研究对于临床个性化安全用药有着重要意义。目前国内外制药巨头在药物开发过程中,需要在体外评估各候选新药抑制CYP1A的能力。因此,开发高效、灵敏的特异性CYP1A探针底物对于高效筛选CYP1A抑制剂,及定量测定生物体系内CYP1A的活性至关重要。
由于CYP1A亚家族中的各亚型具有相似的氨基酸序列,其底物通常相互交叠,因此各亚型酶鲜有特异性的底物。目前,已报道的CYP1A的荧光探针底物有3个,分别是3-氰基-7-乙氧基香豆素,乙氧基试卤灵和荧光素-ME-EGE。这些已知的荧光底物均属于off-on型探针,单酶选择性并不高且易受生物基质的干扰,定量误差较大。而比率型探针发射光谱的蓝移/红移则可用于比率检测,且此时探针分子原型可作为内部校准来减小光照强度、探针浓度、样品不均匀、仪器参数等对定量分析的影响。因此,开发高选择性的CYP1A比率型荧光探针反应及其配套的高通量检测方法具有重要的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物及其应用,该比率型荧光探针底物和去甲基化产物的荧光发射波长具有明显差异,且产物的荧光量子产率更高更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中CYP1A的分布和功能进行定量评价。
本发明提供了一种细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物,该探针底物可被CYP1A特异性催化生成相应的O-去甲基化产物,该底物具有1,8-萘酰亚胺类结构,其结构式如下:
其中,R为-COOH、苯甲酸、-SO3H中的任意一种,n为2~10。
本发明还提供一种细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物的应用,采用该CYP1A亚酶的特异性底物,与含CYP1A的生物样品混合后进行酶促反应,通过定量检测单位时间内的底物消除率或其去甲基化产物的生成率来定量测定不同生物体系中CYP1A的活性,具体测定方法及条件如下:
A.体系中以1,8-萘酰亚胺类化合物作为比率型探针底物;底物浓度选择1/10~10Km;单点测定时底物浓度优选Km;
B.在PBS缓冲液中,反应温度为20℃至60℃之间,优选37℃为最优反应时间;孵育体系pH介于5.5~10.5之间,优选pH7.4为最优反应pH值;
C.反应时间为5~120分钟,确保以上底物相应的O-去甲基化产物达到定量限且底物转化率不超过20%时终止反应;
D.测定单位时间内底物减少量或O-去甲基化产物生成量作为CYP1A活性的评价指标。
所述的细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针底物应用,其特征还在于所述的生物体系为重组表达CYP1A单酶、人或动物组织制备液、各类哺乳动物组织细胞及其制备物中的任意一种。
该探针底物及其去甲基化产物的荧光信号需采用不同检测波长去检测,去甲基化产物及底物的荧光检测条件分别为:激发波长450,372nm,最大发射波长分别为564,452nm。
该探针底物还可用于CYP1A抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
该探针底物也可作为实验动物在体及整体CYP1A的探针底物,评估代谢酶CYP1A的个体及种属差异。
本发明提供的细胞色素氧化酶CYP1A的比率型荧光探针反应的应用,该探针底物及其O-去甲基化产物均具有荧光属性,且两者具有不同的光学属性,可采用荧光检测器同时实现底物及产物的快速、灵敏检测;O-去甲基化产物及底物荧光检测条件分别为:激发波长372,450nm,最大发射波长为450,564nm如图3所示。
该特异性探针底物为比率型荧光探针,其在CYP1A活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰,可用于各种重组CYP1A、人及动物组织制备液及各类组织细胞中CYP1A酶活的定量测定;同时也可作为在体及动物整体CYP1A的探针底物,评估代谢酶CYP1A的个体及种属差异。该探针底物及O-去甲基化代谢产物的荧光检测方法还可用于CYP1A抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
采用重组细胞色素氧化酶CYP1A单酶,肝微粒体孵育体系进行考察,通过相关性分析(如图5所示),重组单酶代谢反应(如图6所示),特异性抑制实验(如图7所示),以及酶反应动力学几方面的证据,证明1,8-萘酰亚胺类化合物可特异性的经细胞色素氧化酶CYP1A代谢(如图8所示),生成O-去甲基化氧化产物。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等代谢评价体系进行考察,发现该代谢反应具有非常良好的特异性。
作为高特异性的细胞色素氧化酶CYP1A单酶的荧光探针底物,该化合物可以用来检测CYP1A的活性,尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的CYP1A的酶活测定,以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等制备物中CYP1A的活性标定。
选用本发明所述细胞色素氧化酶CYP1A单酶的比率型荧光探针反应检细胞色素氧化酶CYP1A单酶体外活性具有以下突出优势:
(1)高特异性:1,8-萘酰亚胺类化合物可被细胞色素氧化酶CYP1A单酶高特异性地代谢成一个代谢产物,即O-去甲基化产物。
(2)廉价易得:1,8-萘酰亚胺类化合物可经化学合成获得,合成工艺简单易行,荧光方法检测成本低。
(3)高灵敏度:具有1,8-萘酰亚胺母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性(450~700nm),且该底物及其O-去甲基化代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征,能较好的进行区分检测,同时可通过比率型标准曲线的建立进行定量测定CYP1A单酶的检测下限为0.2nM/ml。
附图说明
图1.1,8-萘酰亚胺类化合物的结构通式;
图2.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的1H-NMR谱图;
图3.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺及其O-去甲基化代谢产物的紫外吸收光谱图(分别在372nm和450nm有最大吸收);
图4.14例HLM对N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的代谢图;
图5.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺及其O-去甲基化代谢速率与非那西汀的O-脱乙基代谢速率的相关性分析实验;
图6.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的人CYP重组单酶筛选试验结果;
图7.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺在人肝中的化学抑制实验结果;
图8.CYP1A介导N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的代谢通路;
图9.N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的合成路线。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明,但并不因此而限制本发明。
本发明所采用的设备及其型号为:荧光发射/激发光谱是由SynergyH1全功能微孔板检测仪检测完成;1H-NMR谱图是由核磁共振波谱仪(AvanceII400MHz)检测完成。
实施例1
N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的合成路线
(1)化合物1的合成
将4.2mmol4-氨基丁酸加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1,8萘酐的50ml乙醇溶液中,70-80℃反应过夜后,加入200ml水,析出大量固体,过滤,真空干燥得到米黄色固体N-(3-羧丙基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺,产率80-90%。
(2)化合物2的合成
将800mg化合物1与2.54g碳酸钾置于100ml单口瓶中,加入30ml甲醇,60-70℃反应过夜后,冷却,用1M的盐酸将pH调至酸性,析出大量黄色固体,过滤,大量水洗,真空干燥得到黄色固体N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺,产率80-90%。
化合物1、2的结构如图9所示,N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺及其O-去甲基化代谢产物的紫外吸收光谱图如图3所示,分别在372nm和450nm有最大吸收;制备的化合物2的核磁共振波谱分析图2所示,具体如下:
1HNMR(400MHz,DMSO)δ=12.05(s,1H),8.49(ddd,J=8.4,7.8,1.1,2H),8.43(d,J=8.3,1H),7.80(dd,J=8.3,7.4,1H),7.31(d,J=8.4,1H),4.13(s,3H),4.06(t,J=7.0,2H),2.30(t,J=7.4,2H),1.88(p,J=7.2,2H).13CNMR(100MHz,DMSO)23.59,31.82,39.33,56.99,116.36,114.39,122.01,122.86,126.45,131.15,133.39,160.48,163.27,163.93,174.45.HRMS[M+H]+313.0950,found314.1025.
实施例2
N-(羧戊基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的合成
(1)化合物N-(3-羧戊基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成
将4.2mmol6-氨基己酸加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1,8萘酐的50ml乙醇溶液中,70-80℃反应过夜后,加入200ml水,析出大量固体,过滤,真空干燥得到米黄色固体N-(3-羧戊基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺,产率80-90%。
(2)化合物N-(3-羧戊基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的合成
将800mg化合物N-(3-羧戊基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺与2.54g碳酸钾置于100ml单口瓶中,加入30ml甲醇,60-70℃反应过夜后,冷却,用1M的盐酸将pH调至酸性,析出大量黄色固体,过滤,大量水洗,真空干燥得到黄色固体N-(3-羧戊基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺,产率80-90%。
制备的产物的核磁共振波谱具体如下:
1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.99(s,1H),8.55–8.38(m,3H),7.83–7.74(m,1H),7.30(d,J=8.4Hz,1H),4.12(s,3H),4.05–3.94(m,2H),2.22(t,J=7.3Hz,2H),1.67–1.48(m,4H),1.40–1.25(m,2H).13CNMR(100MHz,DMSO)δ174.87,163.63,162.96,160.34,133.18,130.97,128.47,128.17,126.25,122.72,121.84,114.27,106.17,56.80,33.96,27.70,26.54,24.68.HRMS[M+H]+341.1236,found342.1335.
实施例3
N-(4-羧基苯基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的合成
(1)化合物N-(4-羧基苯基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺的合成
将4.2mmol4-氨基苯甲酸加入到含有1g(3.61mmol)4-溴-1,8萘酐的50ml乙酸溶液中,100-110℃反应过夜后,趁热过滤,用乙酸洗涤滤饼,真空干燥得到米黄色固体N-(4-羧基苯基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺,产率30-40%。
(2)化合物N-(4-羧基苯基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的合成
将800毫克化合物N-(4-羧基苯基)-4-溴-1,8-萘酰亚胺与2.54g碳酸钾置于100ml单口瓶中,加入30ml甲醇,60-70℃反应过夜后,冷却,用1M的盐酸将pH调至酸性,析出大量黄色固体,过滤,大量水洗,真空干燥得到黄色固体N-(4-羧基苯基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺,产率60-70%。
制备的产物的核磁共振波谱具体如下:
1HNMR(400MHz,DMSO)δ13.05(s,1H),8.62(d,J=7.9Hz,1H),8.51(dd,J=12.4,7.5Hz,2H),8.12–8.03(m,2H),7.87(t,J=7.9Hz,1H),7.52(d,J=8.3Hz,2H),7.38(d,J=8.4Hz,1H),4.16(s,3H).
实施例4
体外测定人重组CYP单酶的选择性
(1)预先准备90μlCYP代谢反应体系,包括pH7.4的PBS缓冲液(100mM)、重组人CYP各单酶(0.75nm/ml),N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μM,于37℃条件下震荡预孵3分钟;
(2)向反应体系中加入10μl浓度为10mM的NADP+起始反应;
(3)40分钟后,加入50μl冰乙腈,剧烈震荡后,终止反应;
(4)用高速冷冻离心机在4℃,20,000×g的条件下,高速离心20分钟后,取上清,进行荧光检测(Ex=372nm,Em=450nm);重组人CYP1A(1A1和1A2)酶的选择性最高约是其它单酶的10倍左右(图6)。
实施例5
不同个体来源肝微粒体中CYP1A2的活性定量评估
(1)选取14例人肝微粒体(HLM)稀释至2.5mg/ml,准备CYP1A代谢反应体系,包括pH7.4的PBS缓冲液(100mM)、人肝微粒体(0.25mg/ml)、NADP+10mM,6-磷酸葡萄糖100mM,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml,MgCl240mM,N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺终浓度为10μM,于37℃条件下震荡预孵3分钟;
(2)向反应体系中加入10μl浓度为10mM的NADP+起始反应;
(3)30分钟后,加入10μl冰乙腈,剧烈震荡后,终止反应;
(4)用高速冷冻离心机在4℃,20,000×g的条件下,高速离心20分钟后,取上清,进行荧光检测(Ex=372nm,Em=450nm),将所获荧光强度代入标准曲线后得到14例人肝微粒体(HLM)对N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺的代谢速率(图4)。
实施例6
体外测定CYP1A的检测下限测定
实验在酶标仪上使用96孔板进行测定,N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺10μM,NADP+10mM,6-磷酸葡萄糖100mM,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml,MgCl240mM,CYP1A2单酶0.1nM/ml~2nM/ml,pH7.4的PBS缓冲液50mM,总体积为100μL,37℃下孵育1h后通过酶标仪分析,每组的平均值与不加CYP1A的对照组比较,结果表明0.2nM/ml的CYP1A具有统计学意义(P<0.05),因此确定CYP1A的检测下限为0.2nM/ml。
实施例7
CYP1A时间标准曲线测定
实验在酶标仪上使用96孔板进行测定,N-(3-羧丙基)-4-甲氧基-1,8-萘酰亚胺10μM,NADP+10mM,6-磷酸葡萄糖100mM,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1unit/ml,MgCl240mM,CYP1A2单酶0.1nM/ml~2nM/ml,pH7.4的PBS缓冲液50mM,总体积为100μL,37℃下孵育60min,每隔5分钟酶标仪分析,产物的荧光强度比底物的荧光强度的比值与孵育时间做标准曲线,每条标准曲线的R2>0.99,表明标准曲线线性范围宽广,可准确定量CYP1A的含量。