CN103193746B - 一类儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性探针底物及其应用 - Google Patents
一类儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性探针底物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103193746B CN103193746B CN201310044369.8A CN201310044369A CN103193746B CN 103193746 B CN103193746 B CN 103193746B CN 201310044369 A CN201310044369 A CN 201310044369A CN 103193746 B CN103193746 B CN 103193746B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- comt
- specific probe
- enzyme
- activity
- probe substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一类儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性探针底物及其应用，该特异性探针底物为7,8-二羟基香豆素类化合物，其可用于不同来源哺乳动物组织及细胞中COMT酶活的测定，具体操作流程如下：选择具有7,8位羟基的香豆素类化合物作为高特异性探针底物，并借助COMT体外孵育体系开展特异性底物的COMT催化反应，通过定量检测单位时间内产物生成量来测定各生物样品及细胞中COMT酶的活性。本发明可用于不同种属、不同个体来源生物样本中COMT酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中COMT酶活的定量测定，以期实现对重要药物代谢酶COMT处置药物能力的评估。
Description
技术领域
本发明属医药技术领域，具体涉及一类儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性探针底物及其应用。
背景技术
儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）是哺乳动物体内广泛分布的一种甲基化转移酶，其主要生理功能是负责代谢内源性的神经递质（如肾上腺素，去甲肾上腺素以及多巴胺等）和外源性的儿茶酚内化合物。在人体中，COMT酶有两种存在形式，一种是溶解性的COMT(S-COMT)，另一种是膜结合型的COMT(MB-COMT)。COMT在人体的多种组织中都有分布，如肾脏，肝脏，肺等，在人体的大脑中，主要存在于突触后神经元。在人体的大多数组织中，而S-COMT的量是MB-COMT的3-4倍左右。在人脑中，COMT酶主要以MB-COMT的形式存在，占总量的70%，S-COMT占30%。
COMT酶的活性在人体中呈基因多态性，分别表现为低活性(COMTLL)，中等活性(COMTLH)和高活性(COMTHH)。有研究表明，人体中的低COMT活性和酒精中毒、抑郁症和乳腺癌都有相关性，因此，定量测定人体组织及细胞中的COMT活性对于多种疾病的临床诊断和治疗具有重要指导意义。另外，由于COMT还是帕金森病治疗的一个重要靶点，利用探针反应并借助体外代谢孵育体系可高通量的筛选和评价COMT抑制剂，对于帕金森病治疗药物的发现意义重大。
目前，最常用的COMT酶的探针底物有四个，包括原儿茶酸，左旋多巴，多巴胺以及肾上腺素。后三者由于是人体中的内源性物质，因此无法作为体内探针使用。此外，以上COMT酶的探针底物包括原儿茶酸在哺乳动物COMT酶的催化下分别生成两个单甲基化产物，而两个产物由于结构和理化性质相近，在液相色谱上通常难以分离，给其定量检测带来了不便。因此，急需寻找代谢产物单一，检测灵敏的COMT酶探针底物，同时安全性高，体内代谢路径明确的COMT酶探针底物一直未见报道，也亟待开发。
目前，COMT的体外评价体系主要包括哺乳动物的红细胞，以及亚细胞组分及等，其中亚细胞组分主要包括肝脏组织的S9、胞浆以及脑组织匀浆等成分。采用这些标准化的评价体系，结合相应的辅因子（SAM）和孵育条件，可通过检测探针底物的代谢清除或产物生成速率，对上述各种体系中表达的COMT酶活性进行表征。
发明内容
本发明的目的是提供一类儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性探针底物及其应用，该特异性探针底物是B环7,8位具有羟基的香豆素儿茶酚类化合物，与目前已报道的探针底物原儿茶酸相比，这类7,8-二羟基香豆素儿茶酚类化合物对COMT具有更高的选择性，在人肝等生物样品中也可用于COMT酶活性的评估与测定，对评估个体样本的酶活差异具有重要意义。
本发明提供了一类儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性探针底物，该特异性探针底物为7,8-二羟基香豆素类化合物，其结构式见式（1），其中R1为-CH3、-Ph中的一种，R2为-H、-OCH3中的一种。
式（1）
本发明还提供了一种利用所述特异性探针底物定量测定生物体系中COMT酶活的方法，采用上述式（1）化合物作为底物，该类底物在COMT酶的催化下仅选择性生成1个代谢产物（7-O-甲基化产物），通过定量检测单位时间内甲基化产物的生成量来测定各生物样品及细胞中COMT酶的活性；具体测定方法为：
——体系中以这类7,8-二羟基香豆素儿茶酚类化合物中的一种作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；
——在具有辅因子COMT中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间。
——反应时间为10-120分钟，在确保以上底物相应的7位甲基化产物达到定量限且底物转化率低于10%时终止反应；
——测定单位时间内甲基化产物的生成量作为COMT酶活性的评价指标。
本发明提供的所述特异性探针底物的应用，该特异性探针底物用于人及哺乳动物组织制备液及各类组织细胞中COMT酶活的定量测定。
其中检测甲基化产物的生成量的定量检测方法为紫外吸收光谱、质谱、放射性同位素示踪技术、荧光激发光谱、蒸发光散射或电化学光谱检测。所有检测器包括紫外吸收光谱检测器、质谱、放射性同位素示踪技术、蒸发光散射或电化学光谱检测器中的一种或多种串联。
采用人肝胞浆孵育体系进行考察，通过酶反应动力学的测定，证明这类7,8-二羟基香豆素儿茶酚类化合物均可特异性的经COMT代谢（如图2所示），生成7位甲基结合产物。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该代谢反应具有非常良好的特异性。
作为高特异性的COMT酶的探针底物，这类7,8-二羟基香豆素儿茶酚类化合物均可以用来检测COMT酶活性，尤其适合用于对哺乳动物组织器官来源的S9，胞浆等制备物中COMT的活性标定。
选用本发明所述COMT酶的特异性探针底物检测COMT酶体外活性具有以下突出优势：
(1)高特异性，这类7,8-二羟基香豆素儿茶酚类化合物可被目标酶COMT高特异性地代谢成为相应的甲基化产物。
(2)这类7,8-二羟基香豆素儿茶酚类化合物可来源于中药植物中，也可简单的化学合成来获得，来源简单，易于获得。
(3)检测灵敏，具有香豆素母核结构的化合物均具有良好的紫外吸收特性（290～320nm）以及离子化效果，可以通过常规分析手段方便对其定量。在临床应用中，无需另行购买昂贵的检测设备。
附图说明
图1.7,8-二羟基香豆素儿茶酚类化合物的基本结构式；
图2.秦皮素及其甲基化产物在人肝胞浆中的HPLC-UV图；
图3.4-甲基瑞香素及其甲基化产物在人肝胞浆中的HPLC-UV图；
图4.秦皮素在人肝胞浆中的动力学；
图5.4-甲基瑞香素在人肝胞浆中的动力学；
图6.7,8-二羟基香豆素儿茶酚类化合物的COMT介导的甲基化代谢通路。
具体实施方式
下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。
实施例1.秦皮素用于12例个体人肝胞浆中COMT酶活的测定
购买商业化的十二例来自不同个体的人肝胞浆样本，利用秦皮素测定人肝样品中COMT的酶活，具体操作流程如下：
（1）200微升体外代谢反应体系中，40mM DTT以及5mM MgCl2，人肝胞浆浓度为0.5mg/ml，秦皮素的终浓度为100μM，于37℃条件下预孵3分钟；
（2）于反应体系中加入10μl SAM（终浓度4mM）起始反应；
（3）10分钟后，加入200μl乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系20分钟后，取上清，进行HPLC-UV检测分析；
通过紫外吸收光谱在300nm下对葡萄糖醛酸结合产物的生成量进行定量检测，代表性HPLC-UV谱图如图2所示。测定结果表明，根据秦皮素代谢产物的生成速度在不同来源的人肝胞浆中具有较大差别，最高活性与最低活性差距达4.6倍。
实施例2.瑞香素用于检测人脑组织匀浆S9中的酶活
利用瑞香素检测人脑组织匀浆S9中的COMT催化活性，具体步骤如下：
（1）200微升体外代谢反应体系中，40mM DTT以及5mM MgCl2，人脑组织S9浓度为0.5mg/ml，瑞香素终浓度为10μM，于37℃条件下预孵10分钟；
（2）于反应体系中加入10μl SAM（终浓度4mM）起始反应；
（3）10分钟后，加入200μl乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系10分钟后，取上清，进行HPLC-UV检测分析；
通过紫外吸收光谱在338nm下对葡萄糖醛酸结合产物的生成量进行定量检测，代表性HPLC-UV谱图如图3所示。测定结果表明，根据秦皮素代谢产物的生成速度在人脑组织匀浆S9中存在微小差异，最高活性与最低活性差距只有0.2倍。
实施例3.4-甲基瑞香素用于人红细胞中COMT的酶活的测定
（1）用红细胞温孵液将细胞稀释，置于6孔培养板中，每孔4ml，放入金属浴振荡器中，80r/min，40℃连续振荡孵育120分钟；
（2）于培养板中加入4-甲基瑞香素，终浓度为50μM；
（3）30分钟后吸取温孵液200μl于-80℃超低温冰箱中止反应；
（4）样品加入200μl甲醇沉淀蛋白，并采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系20分钟后，取上清，进行HPLC-UV检测分析。
分别采用HPLC-UV检测秦皮素及其代谢产物，结果表明，利用HPLC-UV检测秦皮素及其代谢产物的灵敏度可达0.1ng，可以灵敏的定量测定哺乳动物红细胞中COMT酶的活性。
实施例4.在体实验评估大鼠肝COMT的活性
选择体重200-250g的Wistar雄性大鼠，利用恒温灌流装置，建立大鼠肝脏体外再循环。肝脏进行10min的平衡后，将秦皮素一次性加入200ml的灌流体系中，同时开始计时，分别于0,0.5,1,3,5,10,20,30,40,50,60min留取灌流液样品约0.5ml。采用岛津液质联用系统LC-MS2010A，检测秦皮素的相对丰度，根据在相同体系下做的标准曲线对灌流液中的含量进行测定；根据测得秦皮素的药物浓度，得到时间-药物浓度曲线，分别获得各只大鼠的药物药浓度曲线下面积（AUC），药物消除半衰期等药代动力学参数，以此作为大鼠肝COMT酶活性的评价指标。发现大鼠灌流给药1小时后的秦皮素药物浓度，与AUC之间存在很好的相关性，可以作为肝COMT酶活性的替代指标。
Claims (3)
1.一类非诊断目的的儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性探针底物用于定量测定生物体系中COMT酶活性的方法，其特征在于：该特异性探针底物为7,8-二羟基香豆素类化合物，其结构式见式(1)，其中R1为-CH3、-Ph中的一种，R2为-H、-OCH3中的一种；
采用上述式(1)化合物作为底物，该类底物在COMT酶的催化下仅选择性生成7-O-甲基化产物，通过定量检测单位时间内甲基化产物的生成量来测定各生物样品中COMT酶的活性；
所述方法条件为：底物浓度介于1/10～10Km之间；催化反应时孵育体系pH介于5.5～10.5之间；反应温度介于20～60℃之间；
所述产物生成率或底物转化率低于10％。
2.按照权利要求1所述利用特异性探针底物定量测定生物体系中COMT酶活性的方法，其特征在于：所述催化反应时孵育体系pH介于7.0～7.5之间。
3.按照权利要求1所述利用特异性探针底物定量测定生物体系中COMT酶活性的方法，其特征在于：所述反应温度介于35～40℃之间。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310044369.8A CN103193746B (zh) | 2013-02-04 | 2013-02-04 | 一类儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性探针底物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310044369.8A CN103193746B (zh) | 2013-02-04 | 2013-02-04 | 一类儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性探针底物及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103193746A CN103193746A (zh) | 2013-07-10 |
| CN103193746B true CN103193746B (zh) | 2015-04-22 |
Family
ID=48716582
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310044369.8A Active CN103193746B (zh) | 2013-02-04 | 2013-02-04 | 一类儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性探针底物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103193746B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015179999A1 (zh) * | 2014-05-30 | 2015-12-03 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 细胞色素氧化酶cyp1a的比率型荧光探针底物及其应用 |
| CN105315251A (zh) * | 2014-06-24 | 2016-02-10 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 千层纸素a及其前体药物作为儿茶酚类药物增效剂的应用 |
| CN105624268B (zh) * | 2014-11-05 | 2019-03-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种定量测定儿茶酚-o-甲基转移酶活性的方法及其应用 |
| CN106148430B (zh) * | 2015-04-02 | 2019-09-06 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种生物催化儿茶酚类化合物烃基化的方法 |
| CN106467739B (zh) * | 2015-08-18 | 2019-07-12 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性荧光探针及其应用 |
| CN105586386A (zh) * | 2016-03-10 | 2016-05-18 | 北京中科唯新生物医学研究所有限公司 | 一种儿茶酚-o-甲基转移酶酶活力检测方法 |
-
2013
- 2013-02-04 CN CN201310044369.8A patent/CN103193746B/zh active Active
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Crystal structures of rat catechol-O-methyltransferase complexed with coumarine-based inhibitor;Eiichi Tsuji et al;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20081203;第378卷(第3期);第494-497页 * |
| Novel Fe3+-Based 1H MRI β-Galactosidase Reporter Molecules;Jian-Xin Yu et al;《ChemPlusChem》;20120313;第77卷(第5期);第370-378页 * |
| Purification and Characterization of Streptomyces griseus Catechol O-Methyltransferase;KAJARI DHAR et al;《Applied And Environmental Microbiology》;20001130;第66卷(第11期);第4877-4882页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103193746A (zh) | 2013-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103193746B (zh) | 一类儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性探针底物及其应用 | |
| Tripathi et al. | Delineating metabolic signatures of head and neck squamous cell carcinoma: phospholipase A2, a potential therapeutic target | |
| Kang et al. | Recent advances in cancer metabolism: a technological perspective | |
| Ke et al. | Bioluminescence probe for detecting hydrogen sulfide in vivo | |
| Karlsson et al. | Imaging of branched chain amino acid metabolism in tumors with hyperpolarized 13C ketoisocaproate | |
| AU2016243147A1 (en) | Method and system for determining integrated metabolic baseline and potential of living cells | |
| JP6281727B2 (ja) | アルブミンの偽エステラーゼ加水分解反応に基づく特異的蛍光プローブおよび定量方法 | |
| CN105219374A (zh) | 细胞色素氧化酶cyp1a的比率型荧光探针底物及其应用 | |
| Wang et al. | Accurate monitoring and multiple evaluations of mitophagy by a versatile two-photon fluorescent probe | |
| Wang et al. | Leveraging and manufacturing in vitro multicellular spheroid-based tumor cell model as a preclinical tool for translating dysregulated tumor metabolism into clinical targets and biomarkers | |
| CN103146804B (zh) | 葡萄糖醛酸转移酶ugt1a1的特异性探针底物及应用 | |
| Chang et al. | A mitochondria-targeted fluorescent probe for monitoring NADPH overproduction during influenza virus infection | |
| Li et al. | Chiral analysis of lactate during direct contact coculture by single-cell on-probe enzymatic dehydrogenation derivatization: unraveling metabolic changes caused by d-Lactate | |
| Zhang et al. | Derivatization method for the quantification of lactic acid in cell culture media via gas chromatography and applications in the study of cell glycometabolism | |
| CN102993263B (zh) | 一类细胞色素p450 3a4酶的特异性探针底物及其应用 | |
| Yang et al. | High-throughput and real-time monitoring of single-cell extracellular pH based on polyaniline microarrays | |
| Zhu et al. | Single-cell metabolomics-based strategy for studying the mechanisms of drug action | |
| CN104975066B (zh) | 细胞色素p450_3a4酶的特异性探针底物及其应用 | |
| Muhammad et al. | Application of aptamer-SERS nanotags for unveiling the PD-L1 immunomarker progression correlated to the cell metabolic bioprocess | |
| CN106467739B (zh) | 儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性荧光探针及其应用 | |
| Cutshaw et al. | Monitoring metabolic changes in response to chemotherapies in cancer with Raman spectroscopy and metabolomics | |
| CN102898295B (zh) | 一种ugt1a9/1a8的特异性探针底物及其应用 | |
| Jimenez et al. | Longitudinal two-dimensional gas chromatography mass spectrometry as a non-destructive at-line monitoring tool during cell manufacturing identifies volatile features correlative to cell product quality | |
| CN105624268B (zh) | 一种定量测定儿茶酚-o-甲基转移酶活性的方法及其应用 | |
| Garrison et al. | Development, validation, and application of an LC-MS/MS method for the determination of the AXL/FLT3 inhibitor gilteritinib in mouse plasma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180301 Address after: 215600 A 207 room A building center of Zhangjiagang Free Trade Zone, Suzhou Free Trade Zone, Jiangsu Patentee after: Zhangjiagang Institute of industrial technology, Dalian Institute of Chemical Physics, China Academy of Sciences Address before: 116023 Zhongshan Road, Liaoning, No. 457, Patentee before: Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences |
|
| TR01 | Transfer of patent right |