CN103146804B - 葡萄糖醛酸转移酶ugt1a1的特异性探针底物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异性探针底物及其应用，该特异性探针底物是具有C-4'羟基的二氢黄酮类化合物，其酶活测定的流程如下：选择补骨脂二氢黄酮甲醚的C-4’羟基-O-葡萄糖醛酸化代谢为探针反应，通过定量检测单位时间内补骨脂二氢黄酮甲醚的消除量或其葡萄糖醛酸化代谢产物的生成量来测定各生物样品、细胞、在体及整体器官中UGT1A1酶的活性。本发明可用于不同种属、不同个体来源生物样本中UGT1A1酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中UGT1A1酶活的定量测定，以期实现对重要药物代谢酶UGT1A1处置药物能力的评估。

Description

葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异性探针底物及应用
技术领域
本发明属医药技术领域，具体涉及一种葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异性探针底物及其应用。
背景技术
葡萄糖醛酸转移酶（Uridine diphosphate-glucuronosyltransferase,UGT）超家族是机体内重要的Ⅱ相代谢酶，催化化合物与辅因子尿苷二磷酸葡糖醛酸（UDPGA）结合，从而增加底物的亲水性，使其能更有效地从尿或胆汁中排出体外，这是机体的一个重要的解毒过程。多种外源性物质，如SN-38和亚硝胺类化合物，以及内源性物质，如胆红素和雌二醇的脱毒都通过葡萄糖醛酸化途径来实现。
人UGT可以分为4个家族：UGT1,UGT2,UGT3和UGT8。其中最重要的参与药物结合反应的酶属于UGT1和UGT2家族。目前，已被鉴定的UGT亚型有25个，包括UGT1A中的16个以及UGT2B中的7个亚型。UGT2B在人肝脏中的表达量比UGT1A更丰富。其中，UGT2B4的含量最高，UGT2B15次之。值得注意的是，UGT1A1，1A4，1A6，1A9在人肝脏中都有中等程度的表达，但UGT1A3在人肝脏中表达量极低，同时UGT1A7，UGT1A8及UGT1A10仅在人肠道中表达。
在UGT1A中，UGT1A1和人体健康的关系最为密切。它的基因缺失会影响胆红素的代谢，从而导致严重的高胆红素血症如Crigler-Najjar综合症和Gilbert's综合症。此外，UGT1A1也是SN-38，一种广泛使用的抗癌药物伊立替康的活性代谢产物的主要代谢酶，UGT1A1的活性缺失被证明和伊立替康的毒性相关。因此，在患者用药前，用1A1探针底物对其体内的1A1酶活性进行探测，对于临床安全用药有着重要意义。
目前，已经报道的最有可能成为UGT1A1的探针底物有3个，分别是胆红素，雌二醇和依托泊甙，但是，由于胆红素和雌二醇属于内源性化合物，不能作为体内探针使用，而依托泊甙又具有细胞毒性，也限制了它成为体内1A1探针底物。因此，UGT1A1的特异性探针药物的开发具有重要的临床意义。
本发明中补骨脂二氢黄酮甲醚具有代谢产物单一（仅生成一个单葡萄糖醛酸化产物）、代谢酶高选择性（肝脏主要由UGT1A1代谢，少量1A3参与极少部分代谢）、代谢产物易检测等特点。此外，补骨脂二氢黄酮甲醚作为一种天然的黄酮类化合物，具有毒性低的特点，因此其作为体内UGT1A1的探针更加安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异性探针底物及其应用，该特异性探针底物是B环4'位具有羟基的黄酮类化合物补骨脂二氢黄酮甲醚，与目前已报道的探针/标准底物雌二醇相比，补骨脂二氢黄酮甲醚的代谢产物单一，更易于检测；与已报道的探针/标准底物依托泊甙相比，具有安全性更高的优点。因此，用补骨脂二氢黄酮甲醚作为探针底物评估人肝等生物样品中UGT1A1的酶活性，具有显著的优势。
本发明提供了一种葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异性探针底物，该特异性探针底物是B环4'位具有羟基的黄酮类化合物补骨脂二氢黄酮甲醚，其结构式见式（1）。
式（1）
本发明还提供了一种利用所述特异性探针底物定量测定生物体系中UGT1A1酶活的方法，采用上述式（1）化合物作为底物，通过定量检测单位时间内的底物消除量或其葡萄糖醛酸产物的生成量来测定各生物样品及细胞中UGT1A1酶的活性；具体测定方法为：
——体系中以4′位具有羟基的黄酮类化合物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10Km；
——在具有辅因子UDPGA中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5~10.5之间。
——反应时间为10-120分钟，在确保以上底物相应的4'位葡萄糖醛酸结合产物达到定量限且底物转化率低于10%时终止反应；
——测定单位时间内底物减少量或葡萄糖醛酸结合产物生成量作为萄糖醛酸转移酶酶活性的评价指标。
本发明提供了所述特异性探针底物的应用，该特异性探针底物用于各种重组UGT1A1、人及动物组织制备液及各类组织细胞中UGT1A1酶活的定量测定；也用于体内探针，评估胆红素代谢酶UGT1A1的个体及种属差异。
其中检测底物减少量或其对应葡萄糖醛酸结合产物生成量的定量检测方法为紫外吸收光谱、质谱、放射性同位素示踪技术、荧光激发光谱、蒸发光散射或电化学光谱中的一种或联合检测。所用检测器包括紫外吸收光谱检测器、质谱、放射性同位素示踪技术、蒸发光散射或电化学光谱检测器中的一种或多种串联。
采用重组葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1单酶，肝微粒体孵育体系进行考察，通过相关性分析，特异性抑制实验，重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学几方面的证据，证明该C-4'羟基黄酮类化合物可特异性的经葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1酶代谢（如图2所示），生成4'位葡萄糖醛酸结合产物。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该代谢反应具有非常良好的特异性。
作为高特异性的葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的探针底物，该C-4'羟基黄酮类化合物可以用来检测葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1酶活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1重组酶的酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的微粒体、S-9等制备物中UGT1A1的活性标定。
选用本发明所述葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1酶的特异性探针底物检测葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1酶体外活性具有以下突出优势：
(1)高特异性，该C-4'羟基黄酮类化合物可被葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1高特异性地代谢成一个代谢产物，即其葡萄糖醛酸结合产物。
(2)该C-4'羟基黄酮类化合物来源于中药补骨脂，可直接提取分离也可化学合成。
(3)检测灵敏，具有黄酮类母核结构的化合物均具有良好的紫外吸收特性（270～320nm），该底物及其葡萄糖醛酸化代谢产物也具有良好的离子化效率，可通过LC-UV，LC-MS等常规分析手段方便对其定量测定。在临床应用中，无需另行购买昂贵的检测设备。
(4)高安全性，毒理学研究证实该C-4'羟基黄酮类化合物具有很好的安全性，其LD50>1g/kg。提示其可用于整体动物实验及临床研究。
附图说明
图1.补骨脂二氢黄酮甲醚的结构式；
图2.补骨脂二氢黄酮甲醚的人重组单酶筛选试验结果；
图3.补骨脂二氢黄酮甲醚及其葡萄糖醛酸结合产物在人肝微粒体中的代谢谱图；
图4.补骨脂二氢黄酮甲醚-4’-O-单葡萄糖醛酸化产物的质谱图；
图5.补骨脂二氢黄酮甲醚的UGT1A1介导的葡萄糖醛酸结合的代谢通路。
具体实施方式
下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。
实施例1.补骨脂二氢黄酮甲醚用于定量测定重组单酶中UGT1A1的酶活
（1）预先准备190μl UGT代谢反应体系，包括pH7.4的Tris-HCl缓冲液（50mM）、5mM MgCl2，重组人UGT1A1(0.05mg/ml)，补骨脂二氢黄酮甲醚终浓度为25μM，于37℃条件下预孵3分钟；
（2）向反应体系中加入10μl40mM UDPGA（终浓度2mM）起始反应；
（3）30分钟后，加入200μl冰冷乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
（4）用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行UFLC-UV检测；
（5）在320nm下对补骨脂二氢黄酮甲醚及其葡萄糖醛酸化产物进行定量检测。计算重组人UGT1A1酶的最大催化速率为8.7pmol/min/mg。
实施例2.补骨脂二氢黄酮甲醚用于定量测定人肝微粒体中UGT1A1的酶活
（1）反应体系同上。将体系中UGT1A1替换为人肝微粒体，微粒体的蛋白浓度为0.25mg/ml，反应时间为30分钟。
（2）4℃，20,000×g的条件下高速离心20分钟后，取上清，进行UFLC-UV检测；
（3）在320nm下对补骨脂二氢黄酮甲醚及其葡萄糖醛酸化产物进行定量检测。可测得在人肝微粒体中UGT1A1的最大催化速率为8.3pmol/min/mg。
实施例3.补骨脂二氢黄酮甲醚与胆红素代谢的相关性分析
以补骨脂二氢黄酮甲醚和胆红素为底物，分别在12例人肝个体样本中进行UGT代谢反应的孵育，反应孵育条件同实施例1及2。测定每例人肝微粒体孵育体系中补骨脂二氢黄酮甲醚/胆红素UGT代谢产物的生成速率，分别以补骨脂二氢黄酮甲醚/胆红素UGT代谢产物的生成速率为横、纵坐标作图，对所形成的散点进行线性回归分析，所得的r值为0.92，提示补骨脂二氢黄酮甲醚/胆红素具有相似的肝脏代谢酶及相近的UGT1A1代谢贡献率。
实施例4.在体实验评估大鼠肝ugt1a1的活性
选择体重200-250g的Wistar雄性大鼠，利用恒温灌流装置，建立大鼠肝脏体外再循环。肝脏进行10min的平衡后，将补骨脂二氢黄酮甲醚一次性加入200ml的灌流体系中，同时开始计时，分别于0,0.5,1,3,5,10,20,30,40,50,60min留取灌流液样品约0.5ml。采用岛津液质联用系统LC-MS 2010A，检测补骨脂二氢黄酮甲醚的相对丰度，根据在相同体系下做的标准曲线对灌流液中的含量进行测定；根据测得补骨脂二氢黄酮甲醚的药物浓度，得到时间-药物浓度曲线，分别获得各只大鼠的药物药浓度曲线下面积（AUC），药物消除半衰期等药代动力学参数，以此作为大鼠肝ugt1a1酶活性的评价指标。发现大鼠灌流给药1小时后的补骨脂二氢黄酮甲醚药物浓度，与AUC之间存在很好的相关性，可以作为肝ugt1a1酶活性的替代指标。

Claims (1)

1.一种利用葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异性探针底物定量测定UGT1A1酶活的方法，其特征在于：该特异性探针底物是具有C-4'羟基的二氢黄酮类化合物，其结构式见式(1)；
采用上述式(1)化合物作为底物，通过定量检测单位时间内的底物消除量或其葡萄糖醛酸产物的生成量来测定重组单酶中UGT1A1酶的活性；
所述方法条件为：底物浓度介于1/10～10Km之间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间；反应温度介于20～60℃之间；
所述产物生成率或底物转化率低于10％。
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