JP5837926B2 - グルコースナノセンサーを用いて、高い空間時間分解能でもって細胞または組織の代謝速度またはグルコース消費速度を測定する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、グルコースナノセンサーを用いて、高い空間時間分解能でもって細胞または組織の代謝速度またはグルコース消費速度を測定する新規な方法である。この方法は、薬理学的な潜在性を有する分子のスクリーニング、癌細胞のグルコース速度の決定、組織生理学的および生化学的な研究のために利用され得る。
代謝速度は、身体が食糧を燃焼する速さであり、生理学的活性、ホルモン、ストレス、老化および癌化に対して感受性がある。組織の内部ではあらゆる細胞が特異的な代謝速度によって特徴づけられ、遅い皮膚の繊維芽細胞のような静止状態の細胞から、非常に速い上皮および筋肉におけるいくつかの細胞まで多岐にわたる。また、個々の細胞の代謝速度は、経時的に変化し得る:例えば、脂肪細胞はインスリンに対する応答においてグルコース吸収の速度を10倍に至るまで増加させ、一方、ニューロンは電気刺激に対する応答においてより大きなファクターよってエネルギー要求を増加させ得る。また、代謝速度は老化および疾病に影響される。例えば、癌細胞は、それらの周囲にある組織よりも速い代謝速度を示し、腫瘍進行に関係する現象を示し、この疾病の診断、段階付けおよび予後の目的に役立つ1、2。
本願発明は、代謝速度を決定するためのグルコースの測定に関する、定常状態によって強いられる制約から生じる問題点に、定常状態を阻害することによって取り組んでいる。分析物の測定を行うための定常状態の阻害は、先行技術を考慮しても明白ではない。なぜなら、現在通常の方法は全て、定常状態の前提に頼っており、それゆえ定常状態を阻害する代わりに、定常状態を維持するような条件が与えられるからである。方法、分析物、センサー、およびデータの適当な解釈が達成されれば、定常状態の阻害は有用な結果および情報のみを提供し得る。
−グルコース代謝速度の測定のためのシステムを用意すること。該システムは、単細胞または細胞集団、懸濁または接着した状態の細胞、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片、またはインビボの動物組織であり得る;
−個々の細胞において適当なグルコースセンサーを発現させること。遺伝子発現、細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片、またはインビボの動物組織における、単細胞または細胞集団、懸濁または接着した状態の細胞;
−制御条件において上記センサーを較正すること;
−上記細胞に入るグルコースの定常状態を以下の方法によって阻害すること:
−グルコースの濃度における変化に細胞外空間を曝すこと(ETM:平衡輸送法(Equilibrium Transport Method))または
−GLUT阻害剤を添加すること(ITM;阻害剤輸送法(Inhibitor Transport Method));
−上記センサーからの出力を記録することおよび異なる時間における対応するグルコース濃度を計算すること;
−グルコース代謝速度を決定すること。
本発明は添付の図面によって例証される。
前述のように、本願発明の方法は、種々のシステムにおける代謝速度の測定に関する。特には、本願発明の方法は、グルコースの定常状態の阻害に基づいている。
該システムは、単離状態、細胞培養、組織培養、混合細胞培養における細胞、組織外植片、または生きている動物の組織における細胞であり得る。非限定的で例証的な例において、該システムはアストロサイト、ニューロン、線維芽細胞、脂肪細胞または筋細胞の細胞培養であり得る。
グルコースセンサーはリアルタイムでグルコース濃度をモニターすることが可能であることが望ましい。適当なグルコースセンサーは、グルコース濃度に依存する方法において読み取り易いシグナルを与えることが望ましく、細胞内に通常存在する他の分子に対して感受性がないことが望ましい。センサーの発現、存在または分解は、細胞の代謝を著しくは阻害しないことが望ましい。非限定的で例証的な例において、グルコースセンサーはFLIPglu600μΔ11(特許出願第WO2007046786号に記載されている)であり得る。
まず、細胞を0.5mMのヨード酢酸で30分間前処理して糖分解を遮断することによってセンサーを較正する。糖分解の流れがない状態において、受動拡散型GLUTトランスポーターの存在によって、細胞の内側および外側におけるグルコース濃度が等しくなる。次いで、次第に増加する濃度のグルコースに細胞を曝し、センサーによって与えられるシグナルをモニターする。センサーのシグナルを濃度に対してプロットし、飽和パラメーターを見積もる。この手順は、異なる種類の細胞のそれぞれについて一回行われる。続く測定に関しては、グルコースの非存在下で細胞において瞬間的にシグナルを測定する。この「ゼロ」リーディングは、センサーのシグナルをグルコース濃度に変換するために、前述の飽和パラメーターと共に用いられる。
グルコースの定常状態の阻害は、細胞外空間をグルコースの濃度における変化に曝すことによって得られうる(ETM)。非限定的で例証的な例において、細胞外のグルコース濃度は、2mMから0.3mMに下げられる。この細胞外のグルコースにおける変化は、細胞内のグルコース濃度を1mMから0.1mMへ漸進的に減少させる(図2のb)。アッセイを複数回繰り返したところ、図2のcに示されるように、速度は前の測定に影響されず、アッセイ自体は糖分解を乱さないことが示唆された。この細胞内のグルコースにおける穏やかな減少に対する代謝の非感受性は、ヘキソキナーゼが飽和したままでいる間の代謝の流れの定常性と一致する。
定常状態を阻害するために用いた方法の実施形態に関係なく、センサーからの読み取りは、100ミリ秒〜1分の範囲の適当な時間の間隔(例えば、100ミリ秒毎、1秒毎、10秒毎、1分毎)を考慮した適切な時間で記録される。センサーの読み取りからの出力および較正曲線によって、各時点におけるグルコース濃度の計算が可能となる。
定常状態を阻害するために用いた方法の実施形態に関係なく、糖分解の速度は、減少の経時変化に単一指数関数を当てはめることによって見積もられる。一実施形態において、代謝速度は、細胞内の濃度が細胞外の濃度(例えば、0.3mM)と等しくなる時点におけるグルコース濃度の減少の速度から計算される(図2のbにおける破線)。第2の実施形態において、GLUT遮断剤の存在下、代謝速度は、任意のグルコース濃度におけるグルコース濃度の速度から計算される。
標準的な化学物質および組織培養の試薬は、Sigma(ミズーリ州セントルイス)から入手した。センサーであるFLIPglu170n、FLIPglu600μΔ11、FLII12Pglu600μΔ6をコードする構造物は、以前に記載されている4、6、7。プラスミドはwww.addgene.orgを介して利用可能である。アデノウイルスベクターであるAd FLIPglu600μΔ11およびAd FLII12Pglu600μΔ6は、Vector Biolabsによって特注で作製された。
用いた動物は、F1の雄のマウス(C57BL/6J x CBA/J)であり、20±2℃の室温、12/12時間の明暗条件において、自由に餌および水を入手できるSPF条件下の動物飼育室中で飼育されたものである。全ての実験は、Centro de Estudios Cientificos Animal Care and Use Committeeによって承認されたものである。N1-N2/MEMの代わりにB27-supplemented Neurobasal 培地(Gibco)を用いたことを以外はLoaiza et al. 19に記載されているとおりに、神経細胞およびグリア細胞の混合皮質培養物を、1〜3日齢の新生児マウスから用意した。37℃、5%CO2の加湿された雰囲気において培養物を維持した。5〜7日目において、35mmディッシュ中の培養物を、Lipofectamine 2000(Gibco)を用いて、5μg プラスミドDNAをトランスフェクトした。または、その代わりに、35mmディッシュ中の培養物を、5×106PFUのアデノウイルスベクターに曝露した。アデノウイルスベクターはニューロンよりもアストロサイトに対して非常に高い(>100の比率)選択性を示した。細胞株はATCCから入手した。3T3−L1繊維芽細胞を、10% ウシ胎児血清、2.5μg/ml アンホテリシンBおよび100U/ml ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)中に維持し、5μg/ml インスリンを用いて記載された25とおりに脂肪細胞に分化させた。C2C12筋芽細胞およびHeLa細胞を、10% ウシ胎児血清、2.5μg/ml アンホテリシンBおよび100U/ml ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったDMEM中に維持した。10cmディッシュ中で生育している3T3−L1繊維芽細胞および脂肪細胞に、BioRad Gene Pulser XCellを用いて、15μg プラスミドDNAをエレクトロポレートした。35mmディッシュ中のHeLa細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、5μg プラスミドDNAでトラスフェクトした。
実験を室温(22〜25℃)において行った。HEPESで緩衝された生理食塩水((mMにおいて)136 NaCl、3 KCl、1.25 CaCl2、1.25 MgSO4、1−2 グルコース、2 乳酸ナトリウム、10 HEPES、pH 7.4を含む)、または、95%O2/5%CO2ガスが供給された緩衝液((mMにおいて)112 NaCl、3 KCl、1.25 CaCl2、1.25 MgCl2、1−2 グルコース、2 乳酸ナトリウム、10 HEPES、24 NaHCO3、pH 7.4の成分を有する)の中で、培養細胞を画像化した。95%O2/5%CO2ガスが供給された緩衝液((mMにおいて)126 NaCl、3 KCl、1.25 NaH2PO4、1.25 CaCl2、1.25 MgCl2、2−3 グルコース、1 乳酸ナトリウム、26 NaHCO3、pH 7.4を含む)を用いて、脳のスライスを潅流した。より高いK+濃度を用いる場合、等浸透圧を保つようNaClを調整した。40×油浸対物レンズ、Optosplitを有するCairnモノクロメーター(Faversham, イギリス)、およびHamamatsu Orcaカメラ(浜松市、日本)を装備した、Kineticsソフトウェアによって制御されたOlympus IX70倒立顕微鏡を用いて、培養物およびスライスを画像化した。FRET測定に関しては、CFPを430nmにおいて400ミリ秒間励起させた。FLII12Pglu600μΔ6のFRET効率は非常に高く、低いCFPシグナルを招く7ため、我々は、対照におけるCFPシグナルを用いないことを選択した。その代わり、YFP/淡黄色を50ミリ秒間励起させて、FRET比についての糖非感受性の分母を与えた。FRETによって励起した(430nmにおける)YFP/淡黄色と直接励起した(512nmにおける)YFP/淡黄色との比を、糖分解の遮断剤であるヨード酢酸の存在下で、次第に増加する濃度のグルコースに、pHが固定された細胞を曝すことによって較正した。図8には、アストロサイト、線維芽細胞、筋芽細胞およびHeLa細胞についての較正曲線が記載されている。ニューロンおよび脂肪細胞(グルコース浸透性が低いため、較正が非常に困難である)については、我々は、それぞれ、アストロサイトおよび線維芽細胞において得られた較正曲線を用いた。0.5μMのカルセインを用いて30分間エステルがロードされた細胞において、Pascal 5 Zeisss共焦点顕微鏡(光学的な区画<2μm;488nm励起/505〜550nm発光)を用いて、相対的な細胞体積を測定した27。90%より多いカルセインの蛍光が体積に従うことが、非等浸透性の溶液へ曝すことによって示された。
培養したアストロサイトにおける代謝速度の決定
DNAにコード化されたFRETグルコースナノセンサー4、6、7(その場で較正した)を用いて、細胞内グルコースをリアルタイムで測定した(図7)。2mMの細胞外グルコースの存在下、培養したアストロサイトは、平均して0.63±0.30mM(22回の実験においてn=100細胞)の定常状態の細胞内グルコース濃度を維持した。細胞内グルコース濃度は細胞毎にかなり異なっており、0.2〜1.9mMに分布していた。これは、グルコース浸透性と糖分解とのバランスが固定されていないことを示す。
デオキシグルコースの吸収における典型的な吸収時間、デオキシグルコースのオートラジオグラフィーおよびFDG−PETスキャンは10分もより長いが、脳組織を特徴付ける代謝の変化は、秒を超えて発現する。例えば、ニューロンの活性化は、ミトコンドリアの酸化還元電位における秒以下のシフトを伴い3、次いで数秒以内に組織間腔の乳酸塩が増加する11が、それは神経血管および神経代謝の迅速な共役において重要な役割を果たすと考えられている12−14。乳酸糖の原因となる細胞の種類の同定(すなわち、ニューロン対アストロサイト)および電気的活性と代謝の活性化とを結び付ける局所的なシグナルの同定は何れも異論が多い13、15、16、9が、それは、デオキシグルコースが秒の範囲における事象をモニターすることができないということによって部分的に説明される。糖分解の活性化をリアルタイムで追うことができる本願発明の能力の利点を利用して、培養したアストロサイトをグルタミン酸塩およびK+(興奮性シナプスにおけるニューロンによって共に放出される伝達物質)に同時に曝した。図4に要約されているデータは、アストロサイトにおける糖分解の速度における強くて迅速な増加を、ニューロンのシグナルが引き起こすことを示す。注目すべきことに、活性化はミトコンドリアへの毒の投与によって達成される活性化よりもさらに強力である(図3のe)。グルタミン酸塩/K+に対する反応において観察されるグルコース濃度における迅速な減少を、細胞の膨張の間の糖の希釈によって説明することはできないということが、対照実験によって示された(図8)。アストロサイトの糖分解が秒の範囲におけるニューロンのシグナルによって達成され得ることを初めて示すことによって、これらの結果は、アストロサイトがニューロンの活性化の間に観察される乳酸糖の原因となっていることを示唆し、神経代謝と神経血管との共役において提案された役割に新たな支持を与える。このレベルの時間分解能は、現在の利用可能な方法またはセンサーの何れによっても得られないため、本願発明はそれらに対する大きな利点が与えられている。
脳組織は、解剖学的にも機能的にもかなり詳細に知られているが、そのエネルギー使用は高い空間分解能においてマッピングされたことはない。オートラジオグラフィーまたはPETスキャンのミリメートルサイズの各3D画素は、互いに異なるタイプであるニューロンおよびグリア(各細胞は、現時点では知見できない特定の速度で燃料を消費している)のスコアによって生成される。成功への道は、図5のaに説明されている2つの実験によって示唆される。図5のaはニューロンおよび近接するアストロサイトにおける糖分解速度の同時測定を示している。我々は、両細胞種における基礎代謝速度の大きな変動性を観察したが、平均においてより速い細胞はアストロサイトであった(図6も参照)。培養した細胞におけるこれらの結果は脳組織における状況を予測するものではないが、FRETナノセンサーがウイルスベクターまたは遺伝子転換の手段によって、インビボにおける特定の細胞種に対する標的とされ得ることを考慮すると、この種の測定はインビボの脳組織においてそのうち行われ得る。その方向における最初のステップとして、海馬スライスにおいて、アデノウイルスベクターを用いて、センサーを発現させた。図5のbはセンサーとグリアのタンパク質GFAPとの共局在化を示しており、これらのベクターによるグリア細胞の選択的なターゲティングと一致する。培養した細胞においてみられるのと同様に、図5のc〜dは、スライスにおける代謝速度が平均2.8±0.4μM/s(25スライスにおいてn=68細胞、0.02〜12μM/sに分布している)であり、高度に不均一であったことを示している。
他の細胞種においても代謝速度を測定することができ、該方法の普遍的な適用性を証明した(図6)。その結果は、高速について放射能による技術を用いた先行の測定と一致し、未分化細胞および腫瘍細胞(C2C12筋芽細胞およびHeLa細胞)においてみられた、3T3−L1繊維芽細胞の脂肪細胞への分化が代謝における顕著な減少を導いた。放射能による技術および現在の方法は同様の結果を与えるが、後者は、蛍光への依存に対する信頼性があるため、ハイスループット分析を目的として適合可能なはずである。さらに、図6に説明されているように、培養した細胞株は高度の代謝不均一性(おそらく細胞周期または変化の他の原因に関係する)を示したが、それは取り組みやすいものと現時点では思われる。
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Claims (14)
- 高い時間分解能でもってグルコース代謝速度を測定する方法であって、以下の工程を含んでいる方法:
a.細胞培養、組織培養、混合細胞培養、組織外植片、またはインビボの非ヒト動物組織における、単細胞または細胞集団、懸濁または接着した状態の細胞を、グルコース代謝速度の測定のために用意する工程;
b.個々の細胞においてFRETグルコースナノセンサーを発現させる工程;
c.上記細胞を0.5mMのヨード酢酸で30分間前処理して糖分解を妨げることによって、上記センサーを較正する工程;
d.(i)初期の定常状態の間に、細胞外のグルコースを細胞内の濃度より低い濃度まで減少させることによって、または、(ii)グルコーストランスポーター阻害剤を細胞外空間に添加することによって、上記細胞に入るグルコースの定常状態を阻害する工程;
e.上記センサーからの出力を記録することおよび異なる時間における対応するグルコース濃度を計算することを含む、上記センサーを用いてリアルタイムで細胞内グルコースを測定する工程;および
f.グルコース代謝速度を決定する工程。 - 工程(b)の上記センサーは蛍光性センサーである、請求項1に記載の方法。
- 上記センサーはFLIPglu600μΔ11である、請求項2に記載の方法。
- 次第に増加する濃度のグルコースに上記細胞を曝すことおよび上記センサーによって与えられるシグナルをモニターすること:ならびに
異なる細胞型のそれぞれについての飽和パラメーターを見積もるために、上記センサーのシグナル対グルコース濃度をプロットすること:
をさらに含んでいる、請求項1に記載の方法。 - ゼロリーディングを作るためにグルコース非存在下で細胞におけるシグナルを一過的に測定すること;および
上記センサーのシグナルを、上記ゼロリーディングおよび飽和パラメーターを用いて、グルコース濃度に変換すること:
をさらに含んでいる、請求項4に記載の方法。 - 上記グルコーストランスポーター阻害剤は、サイトカラシンB、フロレチン、ゲニステイン、パラクロロ水銀ベンゾエート、または抗GLUT抗血清を含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 上記グルコーストランスポーター阻害剤はサイトカラシンBであり、かつ5μM〜20μMの最終濃度において上記細胞外空間に添加される、請求項1に記載の方法。
- 上記センサーの出力は、100ミリ秒〜1分の時間の間隔において記録される、請求項1に記載の方法。
- 上記グルコース代謝速度の決定は、減少の経時変化に単一指数関数を当てはめることおよび瞬間の傾きを算出することを含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 上記細胞または組織は癌組織に由来し、上記工程(f)は癌の決定または癌のステージの決定のために実施される、請求項1に記載の方法。
- 上記癌組織は、乳癌、膀胱癌、大腸癌、グリア芽腫、肺癌、肝細胞癌、胃癌、黒色腫、甲状腺癌、子宮体癌、腎臓癌、子宮頸癌、膵癌、食道癌、前立腺癌、脳癌、卵巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部癌、中皮腫、肉腫、小児悪性腫瘍、胆管癌である、請求項10に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法に従って、潜在的薬物に曝されたモデル細胞培養物のグルコース代謝速度を決定することを含んでいる、潜在的薬物をスクリーニングする方法。
- 上記モデル細胞培養物は、3T3−L1繊維芽細胞および脂肪細胞、C2C12筋芽細胞およびミオサイトである、請求項12に記載の方法。
- 上記モデル細胞培養物は、HeLa細胞、Neuro 2A、Caco2、C6、A549、MCF7、PC−3、およびAGSである、請求項12に記載の方法。
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