KR100739529B1

KR100739529B1 - 세포내 맥아당의 정량적 측정을 위한 맥아당 바이오센서

Info

Publication number: KR100739529B1
Application number: KR1020050067353A
Authority: KR
Inventors: 이승구; 송재준; 하재석; 이영미
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-07-25
Filing date: 2005-07-25
Publication date: 2007-07-13
Also published as: US20070020714A1; JP4505439B2; GB2438194A; GB0614689D0; KR20070013024A; JP2007029095A; GB2438194B; US7432353B2

Abstract

본 발명은 CFP-MBP-YFP로 구성되는 세포내 맥아당 정량을 위한 바이오센서에 관한 것으로서, 맥아당의 인식부위인 말토오스 결합 단백질의 유전자를 변이시킴으로서 신호발생부인 형광단백질 사이의 FRET 변화를 증대된 것을 특징으로 하는 신규한 세포내 맥아당 정량을 위한 바이오센서에 관한 것이다.

또한 본 발명은 (1) 세포 내 대사물질과 결합하는 단백질의 양 말단에 FRET을 유발할 수 있는 형광에너지 공여체와 수여체가 각각 연결된 바이오센서의 기본 염기서열을 구성하는 단계; (2) 상기 기본 염기서열에서 대사물질과 결합하는 단백질 유전자와 형광단백질 유전자의 연결 부위의 염기서열을 다양화한 라이브러리를 구축하는 단계; (3) 상기 라이브러리를 클로닝하여 감지신호가 증가한 바이오센서를 고속탐색(high-throughput screening)하는 단계로 이루어지는 감지신호가 증가한 바이오센서를 개발하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해 얻어진 바이오센서는 살아있는 세포의 대사에 의해 변하는 맥아당의 농도를 형광의 변화를 비교하는 방식으로 보다 정확하게 정량적으로 측정할 수 있으며, 본 발명에 의한 상기 방법은 말토오스 결합 단백질과 유사한 기능을 수행하는 세포막간 결합 단백질군 (periplasmic binding protein family)들에도 이용될 수 있다.

녹색 형광 단백질 (GFP), 세포막간 단백질들(PBPs, periplasmic binding proteins), 형광공명 에너지 전이 (FRET), 맥아당 (maltose), 말토오스 결합 단백질 (MBP), 고속 탐색 (HTS, high throughput screening)

Description

세포내 맥아당의 정량적 측정을 위한 맥아당 바이오센서{Maltose Biosensor for quantitative measurement of maltose in the cell}

도 1은 맥아당 바이오센서의 기본적인 구성 및 작동 원리

도 2는 도면 1의 바이오센서를 발현하기 위한 기본 벡터

도 3은 맥아당으로 적정한 CMYB-II 바이오센서의 S자형태의 곡선 그래프

도 4는 CFP와 MBP의 연결 펩타이드를 다양화 한 벡터 라이브러리의 주요 부위 모식도

도 5는 1차 라이브러리 탐색을 마친 바이오센서 클론들의 최대 FRET변화 값(ΔE)의 분포 그래프

도 6은 탐색으로 얻어진 최대 FRET변화 값(ΔE)이 증가한 바이오센서들의 S자형태의 곡선 그래프

도 7은 결합 친화력을 달리한 CMYB-LH/W62L 바이오센서의 S자형태의 곡선 그래프

본 발명은 에너지 공여체와 에너지 수여체로 작용하는 형광 단백질들을 맥아당과 결합하는 단백질과 융합시킨 맥아당 바이오센서 및 그의 탐색방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 맥아당 결합 단백질과 에너지 공여체 단백질과의 연결부위 유전자(및 맥아당의 인식부위의 유전자)를 변이시킴으로서 감지신호를 증가시킨 맥아당 바이오센서 및 그의 탐색방법에 관한 것이다.

해파리에서 유래한 GFP(green fluorescence protein)의 다양한 유전자 변이들인 BFP(blue fluorescence protein)와 GFP 혹은 CFP(cyan fluorescence protein)와 YFP(yellow fluorescence protein) 사이의 '형광 공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer, 이하 FRET라 한다)' 현상을 이용한 바이오센서로 세포내 대사물질들을 정량적으로 측정한 연구는 1997년 Tsien 그룹에서 '칼모듈린 (calmodulin)'과 이와 상호 작용하는 'M13 펩타이드 (M13 peptide)'에 BFP와 GFP를 연결시킨 '카멜레온 (cameleon)'으로 명명한 융합단백질로 세포내 칼슘 (calcium) 농도를 측정하면서부터 본격적으로 시작되었다(Atsushi Miyawaki. et al, (1997) Nature. 388: 882-887). 또한 1997년 Hellinga 그룹에서는 리간드의 결합에 의해 구조가 바뀌는 미생물의 '세포막간 단백질들(periplasmic-binding proteins : 이하 PBPs라 한다)'의 일종인 말토오스 결합 단백질 (maltose binding protein, 이하 MBP라 한다)에 형광 염료를 결합하여 인공적인 조건(in vitro)에서 높은 감지 신호를 갖는 바이오센서를 구축하였으며, 최근까지도 다양한 종류의 단백질들에 적용한 사례가 보고 되어 있다(J. S. Marvin. et. al. (1997) PNAS. 94: 4366-4371, Robert M. De Lorimier. et. al. (2002) Protein Science 11: 2655-2675).

이러한 연구들을 바탕으로 2002년 Frommer 그룹에서는 MBP의 양 말단에 CFP 와 YFP를 결합시킨 융합 단백질을 살아있는 효모에서 안정적으로 발현시키고, CFP와 YFP의 형광 강도의 차이를 비교하는 방법으로 살아있는 효모 내에서 맥아당 농도의 변화를 정량적으로 측정한 결과를 발표하였다 (Marcus Fehr. et. al. (2002) PNAS 99: 9846-9851). 그 후 세포막간 단백질인 '라이보오스 결합 단백질 (ribose-binding protein)'과 '글루코스 결합 단백질 (glucose-binding protein)'로 동일 한 연구를 수행하여 동물세포 내에서 각각의 당을 정량적으로 분석한 연구 결과를 발표했다 (Ida Lager. et. al. (2003) FEBS Letter 553: 85-59, Marcus Fehr. et. al. (2003) JBC 278: 19127-19133).

뿐만 아니라 최근에는 세포내에 존재하는 다양한 물질들을 감지할 수 있는 형태의 바이오센서들이 개발되어지고 있는바, Champman 등은 최근에 보툴리눔(C. botulinum)의 신경독소 활성 (neurotoxin activity)을 측정할 수 있는 형광 바이오센서를 개발하여 발표하였고 (Min Dong. et. al. (2004) PNAS 101: 14701-14706), Tojyo 등은 inositol 1,4,5-trisphosphate를 측정할 수 있는 바이오센서의 개발로 단일세포 수준에서 형광을 관찰하는 방법으로 정량적으로 분석할 수 있는 방법을 발표한 바 있다(Akihiko Tanimura. et. al. (2004) JBC 279: 38095-38098).

그러나 초기에 개발되어졌던 상기 바이오센서들은 매우 미약한 수준의 감지력을 보이는 바, 보다 정확한 측정수단으로의 활용을 위해서는 그 감지 능력을 높이는 요구가 계속되어지고 있다.(Marcus. Fehr. et. al. (2004) Current Opinion in Plant Biology 7: 345-351). 따라서 최근에는 이러한 단점을 보완하고자 하는 시도가 있었으며, 그 중 하나로 Miyawaki 그룹에서는 'cameleon'의 EYFP 유전자를 순환치환(circular permutation)하는 방법으로 FRET 감지신호를 증가시킬 수 있다는 연구결과를 2001년부터 2004년까지 계속적으로 발표하였다(Takeharu Nagai. et. al. (2001) PNAS 98: 3197-3202, Takeharu Nagai. et. al. (2004) PNAS 101: 10554-10559). 그러나 유전자 조작의 어려움과 탐색 공정의 단순함이 다른 유사한 종류의 바이오센서에 적용하기 쉽지 않다는 점에서 보다 효율적인 방식의 접근이 요구된다.

따라서 세포 내에서 특정 물질의 농도를 정량적으로 측정할 수 있는 바이오센서는 바이오센서의 감지능도 높아야 하고, 감지능을 높이는 개발 과정도 보편적 유전자 조작 방법을 사용하여 다른 유사한 종류의 바이오센서에도 적용이 가능한 개발 방법을 제공하는 것이 필요하다.

본 고안은 전술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 감지능이 높아 세포내 맥아당의 농도에 민감하게 반응함으로서 단일 세포내 맥아당의 농도를 보다 정확하게 정량적으로 측정할 수 있는 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 보편적 유전자 조작 방법을 사용하여 다른 유사한 종류의 바이오센서의 개발에도 적용이 가능한 감지 능력이 증가한 바이오센서를 개량·탐색하고 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 CFP-MBP-YFP로 구성되는 세포내 맥아당 정량을 위한 바이오센서에 관한 것으로서, 맥아당의 인식부위인 말토오스 결합 단백질과 신호발생부인 형광단백질 사이의 유전자를 변이시킴으로서 FRET 변화를 증대된 것을 특징으로 하는 신규한 세포내 맥아당 정량을 위한 바이오센서에 관한 것이다. 상기의 바이오센서는 추가로 말토스 결합 단백질의 유전자를 변이시킬 수도 있다.

또한 본 발명은 (1) 세포 내 대사물질인 말토오스와 결합하는 단백질의 양 말단에 FRET을 유발할 수 있는 형광에너지 공여체와 수여체가 각각 연결된 기본적인 바이오센서의 기본 염기서열을 구성하는 단계; (2) 유전자 증폭법인 중합효소 연쇄반응 (polymerase-chain reaction : 이하 'PCR'로 약칭함)과, 특이 프라이머를 활용하여 상기 기본 염기서열에서 대사물질과 결합하는 단백질 유전자와 형광단백질 유전자의 연결 부위의 염기서열을 다양화한 라이브러리를 구축하는 단계; (3) 상기 라이브러리를 클로닝하여 감지신호가 증가한 바이오센서를 고속탐색(high- throughput screening)하는 단계로 이루어지는 감지신호가 증가한 바이오센서를 개발하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 바이오센서의 작동 원리는 도 1과 같이 맥아당의 결합에 의해 MBP의 구조가 바뀌면서 양 말단에 결합된 CFP와 YFP의 거리(distance)와 배향(orientation)이 변하게 되고, 이로 인해 발생하는 FRET의 정도차이로 발생하는 형광을 비교 측정함에 있다. FRET이 발생하기 위한 조건으로는 두 형광 발색체(fluorophore) 사이의 거리가 20-80Å 사이에 위치해야 하고, 에너지 공여체(donor)의 방사광(emission) 스펙트럼과 수여체(acceptor)의 흡수광(absorbtion) 스펙트럼이 서로 중첩되어야 하며, 공여체와 수여체의 전위쌍극자 상호배향(transition dipole orientation)이 평행이 되어야 유리한다. 상기의 바이오센서는 맥아당의 결합으로 MBP의 구조 변화를 유발하며, 결과적으로 MBP의 양 말단에 위치한 CFP와 YFP의 거리와 전위 쌍극자 상호배향을 변화시켜 FRET의 조건을 변화시킴으로 인해 발생하는 CFP와 YFP의 형광 차이를 비교 분석하는 방법으로 세포내 맥아당을 정량적으로 분석한다. 따라서, 맥아당의 결합 전의 FRET 효율을 최소화하고, 결합에 의한 FRET을 극대화 할 수 있다면 바이오센서의 감지능이 크게 향상될 것이며, 이는 MBP와 두 형광발색체를 연결하는 부위의 구조 또는 성질을 변화시킴으로써 조절이 가능할 것으로 기대된다.

이에 본 발명은 기본적으로 Frommer 그룹에서 개발한 'Flip_mal'과 같은 형태 의 바이오센서를 구성하여 특성을 규명하였다. 구체적으로는 실시예에 상세하게 설명된 방법에 따라 도 2로 표시되는 CFP-MBP-YFP로 구성되는 바이오센서 발현 벡터 pECMYB-II로부터 구성된 바이오센서 CMYB-II를 구축하여 특성을 규명하였다. CMYB-II의 정량적으로 측정 가능한 맥아당의 농도 범위는 0.2 μM - 25 μM로 기존의 연구 결과와 크게 다르지 않았으며(Marcus Fehr. et. al. (2002) PNAS 99: 9846- 9851, Robert M. De Lorimier. et. al. (2002) Protein Science 11: 2655-2675), 또한 최대의 FRET 변화 값 역시 0.19 정도로 기존에 보고 되었던 맥아당 바이오센서와 거의 동일한 결과를 확인할 수 있었다(Marcus Fehr. et. al. (2002) PNAS 99: 9846-9851).

상기의 기본 구조에서 적절한 프라이머를 사용하여 유전자 조작을 수행하여 발현벡터를 구축함으로써, MBP와 형광 발색체의 사이에 다양한 조합의 아미노산으로 구성된 링커가 삽입된 바이오센서의 라이브러리를 구축하였다. 즉, pECMYB-II와 동일한 방법에 의해 바이오센서의 발현벡터를 구축하되, CFP, MBP 또는 YFP 유전자의 증폭시에 사용하는 프라이머의 적절한 위치에 다양한 조합의 아미노산으로 연결된 짧은 펩타이드가 생성될 수 있는 임의의 염기 배열을 삽입하여 증폭함으로써 MBP와 형광 발색체 사이에 다양한 링커가 삽입된 바이오센서의 라이브러리를 형성할 수 있다. 본 실시 예에서는 CFP 유전자의 증폭시에 사용한 프라이머에 임의의 염기배열을 삽입하여 MBP의 N말단에 다양한 링커를 삽입하였으나, 마찬가지로 C말단에도 다양한 링커를 도입할 수 있다.

상기의 방법에 의해 구축한 바이오센서 발현 벡터의 라이브러리를 대장균에 형질전환하여 클로닝함으로써 바이오센서 라이브러리를 얻어 고속형광분석장비를 사용하여 감지능을 분석함으로써 감지능이 크게 향상된 서열번호 11의 바이오센서 CMYB-LH와 서열번호 12의 바이오센서 CMYB-QI를 선별하였다. 상기의 CMYB-LH와 CMYB-QI는 모두 CMYB-II에 비해 FRET값의 변화가 약 2.5배 증가하여 세포 내 맥아당을 보다 정확하게 정량할 수 있다.

한편 기존에 발표된 자료에 의하면 MBP의 62번째 아미노산인 tryptophan을 다른 아미노산으로 치환하였을 때 MBP의 해리상수(dissociation constant)인 K _d 를 변화시킬 수 있음을 확인 하였는바(Pierre Martineau. et. al. (1990) J. Mol. Biol. 214: 337-352), 본 연구에서는 MBP의 62번째 아미노산을 다른 종류의 아미노산으로 치환하기 위한 유전자 조작을 수행하였다. 즉, 실시예에서 상세히 설명한 것과 같이 62번째 아미노산인 tryptophan을 코딩하는 유전자 서열 TGG를 NNN으로 치환한 프라이머를 사용하여 MBP의 N말단 부위의 유전자를 증폭시킨 메가-프라이머(mega-primer)를 이용하여 MBP 유전자를 증폭하여 바이오센서 발현 벡터 라이브러리를 제조하였다.

상기 라이브러리를 CMYB-LH 또는 CMYB-QI와 동일한 방법에 의해 감지능이 높은 바이오센서를 검색한 결과 서열번호 13의 바이오센서 CMYB-LH/W62L을 선별하였다.

CMYB-LH/W62L은 Tryptophan을 Leucine으로 치환하였을 때, K_d 뿐만아니라 △E 도 동시에 감소하는 결과를 보여준 기존의 바이오센서와는 달리 K_d 값이 약 30배이상 감소하였음에도 불구하고 △E 값은 오히려 비약적으로 증가하는 결과를 보이는 바, 기존의 보고된 바가 없는 새로운 성질을 갖는 바이오 센서이다.

CMYB-LH/W62L에 대해서는 2005년 7월 14일에 균주 국제기탁기관인 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 10830BP로 기탁하였다. 그러나 본 발명에서 사용되거나 제작한 벡터는 하기 실시예에서 볼 수 있듯이, 상업적으로 구입이 가능한 벡터로부터 통상의 조작방법으로 제작할 수 있기 때문에 반드시 기탁을 요하는 것은 아니다. 따라서, 이외 다른 벡터들에 대하여는 기탁을 생략하였다.

전술한 방법에 의한 감지능이 높은 세포내 대사물질을 정량하기 위한 바이오센서의 개량방법은 본 발명에서는 맥아당의 정량을 위한 바이오센서에 대하여 적용하였지만, 세포 내 대사물질과 결합하는 단백질의 양 말단에 FRET을 유발할 수 있는 형광에너지 공여체와 수여체가 각각 연결된 다른 대사물질의 정량을 위한 바이오센서에 대해서도 감지능이 높아지도록 바이오센서를 개량하는 데 적용할 수 있음은 당연하다.

이하 본 발명을 실시 예를 통해 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시 예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 바이오센서 발현 벡터의 구축

도 2로 표시되는 CFP-MBP-YFP로 구성되는 바이오센서 발현 벡터를 구축하기 위해 아래와 같은 프라이머를 사용하여 클로닝을 수행하였다.

서열번호 1 : 5'-GATCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3'

서열번호 2 : 5'-GATCAAGCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'

서열번호 3 : 5'-GATCATATGGTGAGCAAGGGCGAG-3'

서열번호 4 : 5'-TTTACCTTCTTCGATTTTCATTCGCGACTTGTACAGCTCGT CCATGCC-3'

서열번호 5 : 5'-ATGAAAATCGAAGAAGGTAAAC-3'

서열번호 6 : 5'-GATCGGATCCCGAGCTCGAATTAGTCTG-3'

우선 YFP의 유전자는 Clontech사에서 구입한 pEYFP-N1 벡터를 주형으로 하고 각각 BamHI과 HindIII 절단 염기서열이 도입된 서열번호 1과 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 YFP 유전자는 BamHI과 HindIII 제한효소로 절단한 후 발현벡터인 pET21a(+) (Novagen)의 제한효소 인지부위에 삽입하여 YFP의 C 말단에 6×His-tag이 발현될 수 있는 벡터인 pEYFP-III를 구성하였다.

CFP 유전자는 Clontech 사에서 구입한 pECFP 벡터를 주형으로 하고 NdeI의 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 3과, MBP의 N말단 염기서열이 중첩되게 제작한 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 마찬가지로 MBP의 유전자는 NEB사에서 구입한 pMALc2x 벡터를 주형으로 하고 서열번호 5와, BamHI 제한효소 절단 염기서열이 도입된 서열번호 6의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.

이렇게 증폭된 각각의 CFP와 MBP의 유전자는 서로 중첩되게 제작된 프라이머에 의해 중복신장 중합효소 연쇄반응(overlap-extension PCR)이 가능하기 때문에 서열번호 3과 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 반응액에 동일한 양의 CFP와 MBP 유전자를 첨가한 후 PCR을 수행하여 CFP와 MBP가 합성·증폭된 유전자를 얻을 수 있었다. 상기 증폭된 합성유전자는 NdeI과 BamHI 제한효소로 절단하였고, MBP-YFP의 발현벡터인 pEYFP-III의 제한효소 인지부위에 부위에 클로닝하는 방법으로 바이오센서 발현벡터인 pECMYB-II 벡터를 구축하였으며, 상기와 같은 방법으로 구성되어진 말토오스 인식 바이오센서를 CMYB-II라 명명하였다 (도 2).

실시예 2 : 바이오센서 단백질의 형광 분석

CFP-MBP-YFP로 구성된 바이오센서 단백질의 형광 스펙트럼 분석은 형광분광장비인 Cary Eclipes(Varian)를 사용하여 측정하였으며, CFP의 입사광(excitation)을 436nm로 하였을 때 측정되는 480nm의 방사광(emission)값과 FRET에 의해 여기(excited)된 YFP의 방사광인 530nm의 비율을 편의상 아래의 수식 1에 대입하는 방법으로 FRET을 정의했다.

[E] _ratio : YFP와 CFP의 방사광 비율을 FRET 값으로 정의함.

530nm : FRET에 의해 측정되어 지는 YFP의 방사광 값.

480nm : 입사광을 436 nm로 하였을 때 측정되는 CFP의 방사광 값.

한편 CMYB-II 바이오센서 단백질의 맥아당에 대한 물질인식-신호발생 능력을 검정하기 위해 맥아당의 농도를 1nM - 1mM 까지 증가시키면서 형광 스펙트럼을 측 정하고, 수식 1에 대입하여 얻어진 FRET값의 변화를 S자 형태의 곡선 (Sigmoidal curve)으로 표현한 결과 도 3과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 도 3의 결과로부터 계산한 해리상수(dissociation constant)인 K _d 는 2.2μM로, 정량적으로 측정 가능한 맥아당의 농도 범위는 0.2-25μM로 기존의 연구 결과와 크게 다르지 않았다 (표 1). 또한 수식 2에 대입하여 최대의 FRET 변화 값을 측정한 결과 0.19정도로 기존에 보고 되었던 맥아당 바이오센서와 거의 동일한 결과를 확인할 수 있었다.

△E = [E] _max - [E] _min 수식 2

△E : 최대의 FRET 변화 값.

[E] _max : 포화 농도의 맥아당 첨가시 바이오센서의 [E] _ratio 값.

[E] _min : 맥아당을 첨가하지 않은 바이오센서의 [E] _ratio 값.

정량범위 ; 바이오센서로 측정 가능한 맥아당의 농도 범위로, S자형 곡선dp서 [E] _ratio 가 10%와 90%에 해당하는 맥아당의 농도.

실시예 3 : MBP의 N말단 연결 펩타이드를 다양화한 라이브러리의 구축

실시 예 1의 pECMYB-II 벡터의 구축과 동일한 방법으로 발현벡터인 pET21a(+)에 각각의 유전자를 삽입하되, MBP의 N말단에 다양한 조합의 아미노산으로 연결된 짧은 펩타이드가 생성될 수 있는 프라이머를 사용하여 유전자 조작을 수행하였다.

구체적으로 CFP 유전자는 서열번호 3과 서열번호 7(5'-GTTTACCTTCTTCGATTTTCATNNNNNNCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3')의 프라이머를 사용하여 증폭하였으며, MBP의 유전자를 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머로 증폭하여 중복신장 중합효소 연쇄반응(overlap-extension PCR)을 수행하여 NdeI과 BamHI 제한효소를 이용하여 기존에 구축되어진 pECMYB-II 벡터로부터 CFP-MBP를 제거한 후 증폭된 유전자를 삽입하여 도면 4와 같이 구성된 바이오센서 발현벡터 라이브러리를 구축하였다. 따라서 CFP-MBP의 유전자는 6개의 N 염기로 연결되어 결과적으로는 2개의 아미노산의 조합으로 연결된 다양한 펩타이드가 생성될 수 있는데, 계산적인 수치는 4⁶=4,096이다.

실시예 4 : MBP의 N말단 연결 펩타이드를 다양화한 라이브러리의 탐색 및 분석

실시예 3에서 구축된 바이오센서 발현 벡터의 라이브러리를 대장균인 DH5 α (Takara)에 형질 전환하여 벡터를 회수하는 방법으로 약 5,000여개의 발현벡터 라이브러리를 확보하였다. 확보된 벡터 라이브러리는 대장균인 JM109(DE3) (Promega)에 다시 형질전환 하였으며, 얻어진 각각의 클론들을 50 μg/ml의 ampicillin과 0.5 mM의 IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside)가 첨가된 LB 배지가 분주되어있는 96 deep-well plate에 접종하여 28℃에서 24시간동안 진탕배양 하였다. 그 후 3,000×g에서 20분 동안 원심분리하여 얻어진 대장균들을 1 unit의 DNA 분해효소 (DNase)와 20 μg/ml의 라이소자임 (lysozyme), 그리고 미생물 세포 용해액인 Cellytic B (SIGMA)를 50%가 되게 첨가한 PBS 완충액 (pH 7.4) 250 μl에 분산시켜 세포막을 파괴하고, 다시 3,000×g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액 200 μl를 새로운 96-well plate에 옮겨 분석에 사용하였다.

바이오센서 라이브러리의 분석은 필터방식의 고속형광분석장비인 Victor2 (Perkin-elmer)를 사용하였으며, 450/8nm의 입사필터(excitation filter)와 480/10nm 그리고 535/25nm의 방사필터 (emission filter)들을 사용하여 두 형광단백질의 방사광도(emission intensity)를 측정하였다. 개별 바이오센서들의 맥아당에 대한 물질인식-신호발생 능력은 편의상 수식 2에 대입하여 최대의 FRET변화 값을 측정하는 방식으로 구하였다.

상기와 같은 방식으로 약 4,000여개의 바이오센서 라이브러리를 탐색한 결과 대부분의 바이오센서들은 CMYB-II에 비하여 △E의 변화가 작은 것으로 확인되었으며(도 5), 그중에서 약 200여개의 CMYB-II 보다 △E가 큰 클론들을 획득했다. 이들을 대상으로 위와 동일한 과정으로 3회 반복 검정하는 2차 탐색을 통해 최대의 FRET변화 값이 큰 2 종류의 새로운 바이오센서들을 최종적으로 확보할 수 있었다.

이들 2종류의 바이오센서 발현벡터를 서열번호 8(5'-CTCTTCCCAGGTTTTTGGCG-3')의 프라이머를 이용하여 CFP와 MBP의 유전자 사이를 연결하는 염기서열을 확인한 결과, 아미노산의 조합이 각각 Leu-His와 Gln-Ile로 이루어져 있음을 알 수 있었다. 따라서 각각의 바이오센서를 발현하는 벡터를 순차적으로 pECMYB-LH와 pECMYB-QI로 명명하였고, 이들에 의해 발현되어지는 바이오센서는 각각 CMYB-LH(서열번호 11)와 CMYB-QI(서열번호 12)로 명명하였다.

실시예 5 : 감지 능력이 증가된 바이오센서들의 형광 분석

실시예 4에 의한 바이오센서 CMYB-LH와 CMYB-QI의 맥아당에 대한 물질인식-신호발생 능력을 검정하기 위해 실시 예 2의 방법으로 검정하여 도 6의 결과를 얻을 수 있었다. 또한 수식 2에 대입하여 △E값을 측정한 결과 상대적인 값은 CMYB-LH와 CMYB-QI 모두 CMYB-II에 비해 약 2.5배 증가했음을 확인할 수 있는 바 (표 1), 기존의 바이오센서 (Marcus Fehr. et. al. (2002) PNAS 99: 9846-9851) 보다 약 2.3배 정도 높은 신호발생 능력을 갖는다 하겠다.

실시예 6 : 맥아당과의 결합 능력을 저하시킨 변이 바이오센서의 구축 및 탐색

MBP의 62번째 아미노산을 다른 종류의 아미노산으로 치환하기 위하여 우선 62번째 아미노산인 tryptophan을 코딩하는 유전자 서열 TGG를 NNN으로 치환한 서열번호 9(5'-CAAAGCGGTCGTGTGCNNNGAAGATAATGTCAGGGCC-3')의 프라이머와 서열번호 5의 프라이머를 사용하여 MBP의 N말단 부위의 유전자를 증폭시킨 메가-프라이머 (mega-primer)를 제조하였다.

그 후 메가-프라이머와 서열번호 6번의 프라이머를 사용하여 완전한 길이의 변이 MBP 유전자를 증폭하였으며, 서열번호 3과 서열번호 10(5'-GTTTACCTTCTTCGATTTTCATGTGTAGCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3')의 프라이머를 사용하여 증폭한 CFP의 유전자를 이용하여 실시 예 1과 동일한 방법으로 증폭시킨 CFP-MBP 유전자를 pEYFP-III 벡터의 CFP-MBP의 부위에 삽입하여 MBP의 유전자만이 치환된 벡터를 구축하였다.

상기의 방법으로 구성된 라이브러리들은 실시 예 4의 방법으로 탐색을 하였으며, 가장 큰 △E의 변화를 보이는 바이오센서 벡터를 서열번호 8의 프라이머로 염기서열을 확인한 결과 62번 아미노산이 Leucine으로 치환되었음을 확인할 수 있었다. 상기의 벡터는 pECMYB-LH/W62L로 명명하였고, 마찬가지로 발현되어지는 바이오센서는 CMYB-LH/W62L(서열번호 13)로 명명하였다.

실시예 7 : 맥아당과의 결합능력을 저하시킨 변이 바이오센서의 형광 분석

실시 예 6에서 탐색된 CMYB-LH/W62L 바이오센서의 물질인식-신호발생 능력을 실시예 2의 방법으로 검정하여 도 7과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 도 7의 결과를 바탕으로 계산되어진 K _d 는 75μM로, 대략 8~0.5mM 사이의 맥아당의 농도를 정량적으로 측정할 수 있었다. 상기의 결과에서 △E는 CMYB-II를 기준으로 본다면 약 4.5배 정도 증가한 수치이며, MBP의 62번째 아미노산을 alanine으로 치환하였을 때 △E가 감소한 기존의 바이오센서 (Marcus Fehr. et. al. (2002) PNAS 99: 9846-9851)에 비하면 대략 8.5배 정도로 신호발생 능력이 매우 높은 바이오센서이다.

결론적으로 CMYB-LH/W62L은 Tryptophan을 Leucine으로 치환하였을 때, Kd 뿐만아니라 △E 도 동시에 감소하는 결과를 보여준 기존의 바이오센서와는 달리 Kd값이 약 30배이상 감소하였음에도 불구하고 △E 값은 오히려 비약적으로 증가하는 결과를 보이는 바, 기존의 보고된 바가 없는 새로운 발견이라 하겠다.

전술한 바와 같이, 본 고안에 의한 바이오센서들은 신호 발생 능력이 증가되어 세포내 대사에 의한 맥아당의 농도 변화를 보다 정확하게 측정하는 수단으로의 활용이 가능하다.

또한 단순화한 유전자조작 방법으로 신호 발생 능력을 증가시킨 바이오센서를 구축하고 탐색하는 방법은, MBP과 유사한 구조와 움직임을 보이는 다른 종류의 PBPs에도 그대로 적용시켜서 새로운 기능을 갖는 바이오센서의 제조에도 적용이 가능하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

다음의 구조를 가지고, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 가지는 맥아당 측정용 바이오센서 단백질:

[구조식 1]

CFP-L-MBP-YFP

(여기서, 상기 CFP(cyan fluorescent protein)는 청색 형광 단백질, L은 Leu-His 또는 Gln-Ile 링커 펩타이드(linker peptide), MBP(maltose binding protein)는 맥아당 결합 단백질, 및 YFP(yellow fluorescent protein)는 황색 형광 단백질).
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제1항의 맥아당 측정용 바이오센서 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합벡터.
제4항에 있어서, 상기 재조합벡터는 pECMYB-QI 또는 pECMYB-LH인 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
제1항에 있어서, 상기 L은 Leu-His이고, 상기 맥아당 측정용 바이오센서 단백질 아미노산 서열의 304번째 아미노산인 Trp가 Leu로 변이된 것을 특징으로 하는 맥아당 측정용 바이오센서 단백질.
제6항에 있어서, 상기 변이된 맥아당 측정용 바이오센서 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 맥아당 측정용 바이오센서 단백질.
제7항의 맥아당 측정용 바이오센서 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합벡터.
제8항에 있어서, 상기 재조합 백터는 pECMYB-LH/W62L인 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 맥아당 측정용 바이오센서 단백질을 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합벡터를 박테리아에 도입시켜 수득된 재조합박테리아.
다음의 단계를 포함하는 제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항의 맥아당 측정용 바이오센서 단백질을 제조하는 방법:

(a) 제10항의 재조합박테리아를 배양하여, 맥아당 측정용 바이오센서 단백질을 발현하는 단계; 및 (b) 상기 배양 박테리아로부터 상기 맥아당 측정용 바이오센서 단백질을 수득하는 단계.