JP2023031725A - 一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー、及びＲａｂ３９Ｂの活性を制御する薬剤のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、Ｒａｂ３９ＢのＦＲＥＴバイオセンサーを提供することである。【解決手段】本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーであって、前記一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーが、アミノ末端より、アクセプター蛍光タンパク質領域及びドナー蛍光タンパク質の一方と、リガンド領域と、リンカー領域と、アクセプター蛍光タンパク質領域及びドナー蛍光タンパク質の他方と、センサー領域と、をこの順で含み、前記センサー領域に、Ｒａｂ３９Ｂが配置され、前記リガンド領域に、ＵＡＣＡのＣＣ４ドメインが配置された、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー、及びＲａｂ３９Ｂの活性を制御する薬剤のスクリーニング方法に関する。

製薬等の分野では、各種分子の認識機構を利用したバイオセンサーの利用が注目されている。

このようなバイオセンサーとして、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を利用した、ＦＲＥＴバイオセンサーが知られる（例えば、特許文献１）。
ＦＲＥＴとは、励起状態にあるドナー蛍光分子（エネルギー供与体）からアクセプター蛍光分子（エネルギー受容体）へ励起エネルギーが無放射的に共鳴移動する現象を意味する。
このような現象を利用することで、目的分子の構造変化等を高感度で検出でき得る。

国際公開第２０１２／０４３４７７号

他方で、目的分子に応じたＦＲＥＴバイオセンサーの構成の最適化には未だ困難が伴う。

例えば、知的発達障害を主徴とする脆弱Ｘ染色体症候群や、若年性パーキンソン病に関与し得るタンパク質である「Ｒａｂ３９Ｂ」のＦＲＥＴバイオセンサーに対するニーズがある。

本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、Ｒａｂ３９ＢのＦＲＥＴバイオセンサーの提供を目的とする。

本発明者らが検討した結果、一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを構成する各領域（所定のセンサー領域、蛍光タンパク質領域、リンカー領域、及び所定のリガンド領域）の順序を調整することにより、上記課題を解決できる点を見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下を提供する。

（１） 蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーであって、
前記一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーが、アミノ末端より、アクセプター蛍光タンパク質領域及びドナー蛍光タンパク質の一方と、リガンド領域と、リンカー領域と、アクセプター蛍光タンパク質領域及びドナー蛍光タンパク質の他方と、センサー領域と、をこの順で含み、
前記センサー領域に、Ｒａｂ３９Ｂが配置され、
前記リガンド領域に、ＵＡＣＡのＣＣ４ドメインが配置された、
一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー。

（２） 前記一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーが、アミノ末端より、アクセプター蛍光タンパク質領域と、リガンド領域と、リンカー領域と、ドナー蛍光タンパク質領域と、センサー領域と、をこの順で含み、
前記アクセプター蛍光タンパク質領域と前記リガンド領域との間、及び／又は、前記ドナー蛍光タンパク質領域と前記センサー領域との間に、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるグリシンリンカーを含む、（１）に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー。

（３） 前記一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーが、アミノ末端より、ドナー蛍光タンパク質領域と、リガンド領域と、リンカー領域と、アクセプター蛍光タンパク質領域と、センサー領域と、をこの順で含み、
前記ドナー蛍光タンパク質領域と前記リガンド領域との間、及び／又は、前記アクセプター蛍光タンパク質領域と前記センサー領域との間に、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるグリシンリンカーを含む、（１）に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー。

（４） （１）から（３）のいずれか１項に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを用いた、Ｒａｂ３９Ｂの活性を制御する薬剤のスクリーニング方法。

本発明によれば、Ｒａｂ３９ＢのＦＲＥＴバイオセンサーが提供される。

本発明のバイオセンサーの構造の概要を示す図である。 本発明のバイオセンサーの構造の概要を示す図である。 「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」のプラスミドの構造を示す図である。 「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４－ＧＬ」のプラスミドの構造を示す図である。 「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」及び「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４－ＧＬ」から得られるＦＲＥＴバイオセンサーの構造を示す図である。 実施例で作製したＦＲＥＴバイオセンサーによる蛍光スペクトルを示す図である。 実施例で作製したＦＲＥＴバイオセンサーによる蛍光スペクトルを示す図である。

以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されない。

＜一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー＞
本発明のバイオセンサーは、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーであって、該一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーが、アミノ末端より、アクセプター蛍光タンパク質領域及びドナー蛍光タンパク質の一方と、リガンド領域と、リンカー領域と、アクセプター蛍光タンパク質領域及びドナー蛍光タンパク質の他方と、センサー領域と、をこの順で含み、センサー領域に、Ｒａｂ３９Ｂが配置され、リガンド領域に、ＵＡＣＡのＣＣ４ドメインが配置されたものである。

本発明のバイオセンサーは、以下の２つの態様を包含する。
本発明の第１の態様に係る一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー（以下、「本発明の第１のバイオセンサー」ともいう。）は、アミノ末端より、アクセプター蛍光タンパク質領域と、リガンド領域と、リンカー領域と、ドナー蛍光タンパク質領域と、センサー領域と、をこの順で含む。
本発明の第２の態様に係る一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー（以下、「本発明の第２のバイオセンサー」ともいう。）は、アミノ末端より、ドナー蛍光タンパク質領域と、リガンド領域と、リンカー領域と、アクセプター蛍光タンパク質領域と、センサー領域と、をこの順で含む。

本発明の第１のバイオセンサーの構造の概要を図１（Ａ）に示す。本発明の第２のバイオセンサーの構造の概要を図１（Ｂ）に示す。

本発明において「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の原理に基づく」とは、励起状態にあるドナー蛍光分子（エネルギー供与体）から、近傍のアクセプター蛍光分子（エネルギー受容体）へ励起エネルギーが無放射的に共鳴移動する現象を利用することを意味する。

本発明において「一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー」とは、センサー領域の構造変化によるセンサー領域とリガンド領域との結合に伴い、ドナー蛍光タンパク質がアクセプター蛍光タンパク質に近接し、その結果生じたＦＲＥＴを利用したバイオセンサーを意味する。
生じたＦＲＥＴによりアクセプター蛍光タンパク質からの蛍光に基づき、目的分子（本発明においてはＲａｂ３９Ｂ）の構造変化等を検出できる。

本発明のバイオセンサーにおいて、各領域は１つずつ含まれていてもよく、複数含まれていてもよい。本発明の効果が奏されやすいという観点から、各領域は１つずつ含まれることが好ましい。

以下、本発明のバイオセンサーを構成する各領域について説明する。

（センサー領域）
本発明において「センサー領域」とは、様々な環境（ＧＴＰ加水分解促進因子の活性化、ＧＴＰ交換因子の活性化等）の変化に対応して構造が変化する部分を意味する。
本発明におけるセンサー領域は、Ｒａｂ３９Ｂが配置される領域である。

センサー領域を構成するＲａｂ３９Ｂは、全長配列であってもよく、部分配列であってもよい。本発明の効果が奏されやすいという観点から、センサー領域は、Ｒａｂ３９Ｂの全長配列からなることが好ましい。

Ｒａｂ３９Ｂの由来は特に限定されず、ヒト、非ヒト動物（マウス、ラット等）が挙げられる。
なお、配列番号１は、マウスＲａｂ３９Ｂをコードする塩基配列（全長）である。

（ドナー蛍光タンパク質領域）
ドナー蛍光タンパク質領域を構成するドナー蛍光タンパク質としては、ＦＲＥＴを生じさせるために通常用いられる蛍光タンパク質を採用できる。

例えば、ドナー蛍光タンパク質としては、ＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、及びそれらの変異体（ＣｙＰｅｔ、ＥＣＦＰ、ＳＥＣＦＰ、Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ）や円順列置換体（ｍＴＦＰ１－ｃｐ１０５、ｍＴＦＰ１－ｃｐ１５９、ｍＴＦＰ１－ｃｐ１７５、ｍＴＦＰ１－ｃｐ２２７等）等が挙げられる。

ドナー蛍光タンパク質は、ＦＲＥＴを生じさせることができれば、全長配列であってもよく、部分配列であってもよい。

（アクセプター蛍光タンパク質領域）
アクセプター蛍光タンパク質領域を構成するアクセプター蛍光タンパク質としては、ＦＲＥＴを生じさせるために通常用いられる蛍光タンパク質を採用できる。

例えば、アクセプター蛍光タンパク質としては、ＹＦＰ、及びその変異体（Ｙｐｅｔ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ等）や円順列置換体（Ｖｅｎｕｓ－ｃｐ１５９、Ｖｅｎｕｓ－ｃｐ１７３、Ｖｅｎｕｓ－ｃｐ１９５、Ｖｅｎｕｓ－ｃｐ２２９等）等が挙げられる。

アクセプター蛍光タンパク質は、ＦＲＥＴを生じさせることができれば、全長配列であってもよく、部分配列であってもよい。

（蛍光タンパク質の組み合わせ）
ドナー蛍光タンパク質及びアクセプター蛍光タンパク質の好ましい組み合わせは、ＳＥＣＦＰ及びＹＰｅｔ、ＥＣＦＰ及びＶｅｎｕｓ、ＥＣＦＰ及びＹＰｅｔ、Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ及びＶｅｎｕｓ、並びに、Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ及びＹＰｅｔ等である。

（リガンド領域）
本発明において「リガンド領域」とは、センサー領域の構造変化に対応してセンサー領域と結合する部分を意味する。
本発明におけるリガンド領域は、ＵＡＣＡのＣＣ４ドメインが配置される領域である。ＵＡＣＡのＣＣ４ドメインは、Ｒａｂ３９Ｂ結合領域として知られる（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４３５ （２０１３） １１３－１１９）。

リガンド領域を構成するＵＡＣＡのＣＣ４ドメインは、全長配列であってもよく、部分配列であってもよい。本発明の効果が奏されやすいという観点から、リガンド領域は、ＵＡＣＡのＣＣ４ドメインの全長配列からなることが好ましい。

ＵＡＣＡのＣＣ４ドメインの由来は特に限定されないが、本発明の効果が奏されやすいという観点から、センサー領域を構成するＲａｂ３９Ｂと同じ由来であることが好ましい。
ＵＡＣＡのＣＣ４ドメインの由来としては、ヒト、非ヒト動物（マウス、ラット等）が挙げられる。

なお、配列番号２は、マウスＵＡＣＡのＣＣ４ドメイン、すなわち、マウスＵＡＣＡ全長（ＮＭ＿００１３５７４０８．１（ＵＡＣＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｖａｒｉａｎｔ ４、４０７９塩基長）のＣＤＳに相当する。）に対して１０２９番目から１２１０番目のアミノ酸をコードする塩基配列である。

（リンカー領域）
本発明のバイオセンサーには、ドナー蛍光タンパク質領域と、リガンド領域との間に、これらの領域を繋ぐリンカー領域が介在する。

リンカー領域を構成するリンカーとしては、本発明の効果が奏されやすいという観点から、「ＥＶリンカー」（国際公開第２０１２／０４３４７７号）と呼ばれるリンカーが好ましい。
ＥＶリンカーは、５２アミノ酸残基以上４００アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、全アミノ酸残基数の少なくとも４５％がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかであり、アラニンを全アミノ酸残基数の少なくとも１０％含むリンカーである。

リンカー領域を構成するリンカーの好ましい例としては、配列番号３で表されるものが挙げられる。

（その他の構成）
本発明のバイオセンサーは、以下の構成を備えるものであってもよい。

本発明のバイオセンサーは、目的に応じて、上記領域以外の任意の領域を含んでいてもよい。このような領域としては、ペプチドタグ、細胞内局在シグナルに関連するタンパク質等が挙げられる。

本発明の効果が奏されやすいという観点から、本発明のバイオセンサーにおけるセンサー領域のカルボキシ末端側には、その他の領域が配置されないこと（すなわち、バイオセンサーのカルボキシ末端側の端部にセンサー領域が配置されること）が好ましい。

本発明の第１のバイオセンサーにおいて、応答範囲（ダイナミックレンジ）の広いＦＲＥＴバイオセンサーが得られやすいという観点から、配列番号４で表されるアミノ酸配列（ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ）からなるグリシンリンカーが、アクセプター蛍光タンパク質領域とリガンド領域との間、及びドナー蛍光タンパク質領域とセンサー領域との間のいずれかに介在することが好ましく、両方に介在することがより好ましい。

本発明の第２のバイオセンサーにおいて、応答範囲（ダイナミックレンジ）の広いＦＲＥＴバイオセンサーが得られやすいという観点から、配列番号４で表されるアミノ酸配列（ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ）からなるグリシンリンカーが、ドナー蛍光タンパク質領域とリガンド領域との間、及びアクセプター蛍光タンパク質領域とセンサー領域との間のいずれかに介在することが好ましく、両方に介在することがより好ましい。

本発明の第１のバイオセンサーは、アミノ末端より、アクセプター蛍光タンパク質領域と、グリシンリンカーと、リガンド領域と、リンカー領域と、ドナー蛍光タンパク質領域と、グリシンリンカーと、センサー領域と、をこの順で含み、かつ各領域の間には他の領域が介在しないことが最も好ましい。
かかる態様のバイオセンサーの概要を図２（Ａ）に示す。

本発明の第２のバイオセンサーは、アミノ末端より、ドナー蛍光タンパク質領域と、グリシンリンカーと、リガンド領域と、リンカー領域と、アクセプタータンパク質領域と、グリシンリンカーと、センサー領域と、をこの順で含み、かつ各領域の間には他の領域が介在しないことが最も好ましい。
かかる態様のバイオセンサーの概要を図２（Ｂ）に示す。

本発明は、本発明のバイオセンサーをコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクター、該発現ベクターを有するトランスジェニック非ヒト動物等を包含する。
これらの遺伝子、発現ベクター、非ヒト動物は、従来知られる方法によって作製できる。

＜一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーの評価＞
本発明のバイオセンサーが所望の機能を有するかどうかは、実施例に示した方法によって評価できる。

＜Ｒａｂ３９Ｂの活性を制御する薬剤のスクリーニング方法＞
本発明のバイオセンサーを用いてＦＲＥＴを検出することで、Ｒａｂ３９Ｂの活性を測定することができる。
したがって、本発明のバイオセンサーによれば、Ｒａｂ３９Ｂの活性を制御する薬剤のスクリーニングを行うことができる。

ＦＲＥＴの検出方法としては、ＦＲＥＴによる励起エネルギーの移動が検出できれば特に限定されないが、例えば、ＦＲＥＴバイオセンサーを発現した細胞やトランスジェニック非ヒト動物の顕微鏡観察、各種装置（フローサイトメーター、分光光度計、蛍光ＥＬＩＳＡリーダー等）を用いた方法が挙げられる。

以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜ＦＲＥＴバイオセンサーの作製＞
以下の方法で、ＦＲＥＴバイオセンサーを発現する２種類のプラスミド、すなわち、「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」及び「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４－ＧＬ」を作製した。
「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」及び「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４－ＧＬ」のプラスミドの構造をそれぞれ図３及び４に示す。「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」及び「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４－ＧＬ」から得られるＦＲＥＴバイオセンサーの構造を図５に示す。
なお、本例で作製したバイオセンサーは、いずれも、本発明の第１のバイオセンサーに相当する。

（プラスミド「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」の作製）
「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」は、松田道行教授（京都大学）より恵与されたプラスミド「３５５０ＮＥＳ」を出発材料として、一部領域を入れ替えることで作製した。
まず、「３５５０ＮＥＳ」は、Ｅｒｋリン酸化酵素（ＥＫＡＲＥＶ）の活性を可視化するＦＲＥＴセンサーを発現するプラスミドである（Ｋｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ． ２２， ４６４７－４６５６ （２０１１））。
本例では、「３５５０ＮＥＳ」の各ドメインを以下のように置き換えた。
「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」では、ＵＡＣＡのＣＣ４ドメインとＳＥＣＦＰの間に、ＥＫＡＲＥＶ由来のＥＶリンカーが存在する。
（１）ＳＥＣＦＰをコードする塩基配列を、マウスＲａｂ３９Ｂをコードする塩基配列（配列番号１）に置き換えた。
（２）ＷＷドメインをコードする塩基配列を、マウスＵＡＣＡのＣＣ４ドメインをコードする塩基配列（配列番号２）に置き換えた。
（３）ＥＫＡＲ＿ｓｕｂｓｔｒａｔｅ領域（Ｅｒｋリン酸化酵素でリン酸化される部位を含む領域）をコードする塩基配列を、ＳＥＣＦＰをコードする塩基配列（配列番号５）に置き換えた。

本例でプラスミドに挿入した各配列の詳細は表１に示すとおりである。

なお、マウスＲａｂ３９Ｂ及びＵＡＣＡのＣＣ４ドメインとしては、表２に示すプライマーを用いたＰＣＲ産物をプラスミドに挿入した。

（プラスミド「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４－ＧＬ」の作製）
「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４－ＧＬ」は、「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」において、１５アミノ酸からなるグリシンリンカー（ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ、配列番号４）を２箇所に挿入することで作製した。
具体的に、グリシンリンカーは、「Ｒａｂ３９Ｂ」と「ＳＥＣＦＰ」の間、及び「ＵＡＣＡのＣＣ４ドメイン」と「Ｙｐｅｔ」との間にそれぞれ挿入した。
グリシンリンカーとしては、化学合成によりこのリンカーをコードする塩基配列、及びその相補鎖を含むプライマーを得て、これらを用いたＰＣＲ産物をプラスミドに挿入した。

（対照プラスミドの作製）
「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」及び「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４－ＧＬ」のそれぞれについて、配列番号１の野生型Ｒａｂ３９Ｂの代わりに、恒常活性型又は優勢劣性型のＲａｂ３９Ｂを組み込んだプラスミドも作製した。
なお、以下、「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」及び「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４－ＧＬ」について、野生型を「ＷＴ型」、恒常活性型を「ＣＡ型」、優勢劣性型を「ＤＮ型」ともいう。

＜ＦＲＥＴバイオセンサーの評価－１＞
以下の方法で、各ＦＲＥＴバイオセンサーのダイナミックレンジを評価した。
なお、以下の方法は、「Ｎａｋａｍｕｒａ ａｎｄ Ｍａｔｓｕｄａ “Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｃａｓｃａｄｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｂｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｆｏｒｓｔｅｒ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ （ＦＲＥＴ）” ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｈａｐｔｅｒ １４， Ｕｎｉｔ １４．１０」を参考にした。

（遺伝子導入）
浮遊細胞用の６ウェルプレートに、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの哺乳類細胞（２９３Ｆ細胞）を、１ウェルあたり１．５ｍｌずつ播いた。
次いで、市販のキットを用いて、上記プラスミドを哺乳類細胞内に遺伝子導入し、ＦＲＥＴバイオセンサーを発現させた。

（ダイナミックレンジの評価）
以下の方法で、蛍光分光光度計により、遺伝子導入した各細胞を用いて、蛍光スペクトルを取得した。なお、蛍光分光光度計としては、「ＦＰ－７５０」（日本分光株式会社製）を用いた。

まず、各ＦＲＥＴバイオセンサーを発現させた細胞に、ドナー蛍光タンパク質（ＳＥＣＦＰ）を励起するために、４３３ｎｍの波長の光を照射した。
生じた蛍光のスペクトルを得るために、出てくる光について、４５０ｎｍから５５０ｎｍまで１ｎｍずつの刻みで強度を計測した。
その結果、図６及び図７のように、各ＦＲＥＴバイオセンサーの蛍光スペクトルが得られた。４９３ｎｍ付近のピークがドナー蛍光タンパク質（ＳＥＣＦＰ）由来の蛍光を示しり、５２４ｎｍ付近のピークがアクセプター蛍光タンパク質（ＹＰｅｔ）由来の蛍光を示す。

上記検出結果に基づき、ＳＥＣＦＰ（４９３ｎｍの蛍光）とＹＰｅｔ（５２４ｎｍの蛍光）との強度比（ＹＰｅｔ／ＳＥＣＦＰ）を算出した。
次いで、蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の値を、励起波長が５００ｎｍの点で規格化し、スペクトルのピーク値を比較し、各ＦＲＥＴバイオセンサーの応答範囲（ダイナミックレンジ）を算出した。その結果を表３に示す。

表３に示されるとおり、いずれのＦＲＥＴバイオセンサーも、イメージングに使用できるほどに充分なダイナミックレンジを有していた。特に、「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４－ＧＬ」は、顕著に高いダイナミックレンジを有していた。

＜ＦＲＥＴバイオセンサーの評価－２＞
以下の方法で、各ＦＲＥＴバイオセンサーの、Ｒａｂ３９Ｂの不活性化因子に対する応答性を評価した。

哺乳類細胞（２９３Ｆ細胞）に、「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４」又は「ｐＲａｉｃｈｕ－Ａ８０４－ＧＬ」と、「ＲａｂＧＡＰ－５」とを共発現させた。「ＲａｂＧＡＰ－５」は、Ｒａｂ３９Ｂの不活性化因子である（Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ （２００６） １１， １０２３－１０３７）。
次いで、上記＜ＦＲＥＴバイオセンサーの評価－１＞と同様に蛍光スペクトルを取得した。

その結果、いずれのプラスミドを用いた場合でも、「ＹＰｅｔ／ＳＥＣＦＰ」が顕著に低下した。この結果は、各ＦＲＥＴバイオセンサーが、Ｒａｂ３９Ｂの不活性化因子に応答したことを意味する。

Claims (4)

1. 蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーであって、
   前記一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーが、アミノ末端より、アクセプター蛍光タンパク質領域及びドナー蛍光タンパク質の一方と、リガンド領域と、リンカー領域と、アクセプター蛍光タンパク質領域及びドナー蛍光タンパク質の他方と、センサー領域と、をこの順で含み、
   前記センサー領域に、Ｒａｂ３９Ｂが配置され、
   前記リガンド領域に、ＵＡＣＡのＣＣ４ドメインが配置された、
   一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー。
2. 前記一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーが、アミノ末端より、アクセプター蛍光タンパク質領域と、リガンド領域と、リンカー領域と、ドナー蛍光タンパク質領域と、センサー領域と、をこの順で含み、
   前記アクセプター蛍光タンパク質領域と前記リガンド領域との間、及び／又は、前記ドナー蛍光タンパク質領域と前記センサー領域との間に、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるグリシンリンカーを含む、請求項１に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー。
3. 前記一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーが、アミノ末端より、ドナー蛍光タンパク質領域と、リガンド領域と、リンカー領域と、アクセプター蛍光タンパク質領域と、センサー領域と、をこの順で含み、
   前記ドナー蛍光タンパク質領域と前記リガンド領域との間、及び／又は、前記アクセプター蛍光タンパク質領域と前記センサー領域との間に、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるグリシンリンカーを含む、請求項１に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサー。
4. 請求項１から３のいずれか１項に記載の一分子型ＦＲＥＴバイオセンサーを用いた、Ｒａｂ３９Ｂの活性を制御する薬剤のスクリーニング方法。
   
   

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