KR101929222B1 - L-글루타민 검출용 fret 센서 및 이를 이용하는 l-글루타민 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

L-글루타민 검출용 FRET 센서, 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서를 이용한 L-글루타민 검출 방법, 및 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서를 포함하는 L-글루타민 검출용 조성물에 관한 것이다.

Description

L-글루타민 검출용 FRET 센서 및 이를 이용하는 L-글루타민 검출 방법{FRET SENSOR FOR DETECTING L-GLUTAMINE AND DETECTING METHOD OF L-GLUTAMINE USING THE SAME}
본원은, L-글루타민 검출용 FRET 센서, 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서를 이용한 L-글루타민 검출 방법, 및 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서를 포함하는 L-글루타민 검출용 조성물에 관한 것이다.
형광 공명 에너지 전달 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)은 그들의 거리에 대한 특유한 의존성으로 인하여 형광-기반 어플리케이션에 널리 사용되어 왔다. FRET은 하나의 형광단 (fluorophore)의 방출 스펙트럼과 다른 하나의 흡수 스펙트럼 사이에 상당한 중첩 (overlap)이 존재하는 경우, 그리고 상기 형광단 사이의 거리가 일반적으로 10 nm 미만일 때 두 형광단 사이에서 발생한다. FRET 효율성이 이격 거리 (separation distance)의 여섯 번째 파워 (power)에 반비례하는 것을 감안하면, 상기 FRET은 분자의 상호 작용 및 공간적 변화를 검출하기에 매우 적절하다. FRET-기반 센서는 다양한 색상의 형광 단백질의 개발에 따라 더욱 대중적으로 사용되고 있다. 재조합 형광 단백질 FRET 쌍은 서로 독립적으로 발현되거나, 또는 융합된 형태가 될 수 있다. 이러한 FRET 쌍은 다양한 생체분자 및 이온을 감지하고, 또한 효소의 활성을 측정하는 데에 사용되어 왔다. 형광 단백질에 기반한 다양한 FRET 센서가 개발되었고, 또한 다양한 어플리케이션에 성공적으로 적용되었음에도 불구하고, FRET 센서 방법은 본질적인 한계로서 형광 단백질들의 큰 크기, 및 통상 N- 또는 C-말단 융합의 필요성을 포함한다. 이러한 제약으로 인하여, 많은 FRET 센서는 FRET 신호에 있어서 노이즈를 간신히 넘는 정도의 변화를 나타낼 뿐이다.
지난 10 년 동안, 직각의 (orthogonal) 아미노아실-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 [aminoacyl-tRNA (aatRNA)/aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS]를 이용하여 여러가지 형광 아미노산을 세포의 단백질에 유전적으로 혼입하였다. 이러한 아미노산은 단백질-폴딩 (protein-folding) 상태, 단백질 및 리간드 사이의 상호 작용, 다양한 단백질의 세포 지역화 (cellular localization), 및 단백질 융합을 조사하기 위해 사용되어왔다. 최근, 형광 아미노산 중 하나를 FRET에 의한 단백질-핵산 상호작용을 분석하기 위해 사용하였으며, 해리 상수 (dissociation constant)는 전기영동 이동성 변화 분석 (electrophoretic mobility shift assay)과 같은, 다른 방법을 이용하여 수득된 것과 일치하도록 결정하였다.
형광 아미노산의 유전적 도입은 FRET-기반 생화학적 연구에 비하여 두 가지 중요한 장점을 가지고 있다:
(1) 상기 형광 단백질의 도입이 N-말단 또는 C-말단에 한정되는 반면, 상기 아미노산은 단백질의 어떠한 자리에도 혼입될 수 있다.
(2) 이러한 아미노산의 혼입은 아미노산 돌연변이로 달성되며, 따라서 단백질에 최소 섭동 (minimal perturbation)을 일으킨다.
대한민국 공개특허 제2010-0117877호는, FRET 바이오센서를 이용한 리간드의 검출방법에 대해 개시하고 있다.
본원은, L-글루타민 검출용 FRET 센서, 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서를 이용한 L-글루타민 검출 방법, 및 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서를 포함하는 L-글루타민 검출용 조성물을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 형광 공여체가 도입된 L-글루타민-결합 단백질; 및 형광 수용체 단백질을 포함하는, L-글루타민 검출용 FRET 센서를 제공한다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른-글루타민 검출용 FRET 센서를 이용하는, L-글루타민의 검출 방법을 제공한다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른-글루타민 검출용 FRET 센서를 포함하는, L-글루타민의 검출용 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 형광 비천연 아미노산을 L-글루타민-결합 단백질에 유전자 도입하고, 상기 L-글루타민-결합 단백질을 녹색 형광 단백질과 함께 융합하여 FRET 쌍 (FRET pair)을 형성함으로써, L-글루타민을 선택적으로 검출할 수 있는 FRET 센서를 제조할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따른 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서는, L-글루타민을 제외한 나머지 19 개의 천연 아미노산 또는 D-글루타민에 대해서는 변화를 나타내지 않으며, L-글루타민에 대해서 선택적으로 작용한다.
본원의 일 구현예에 따른 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서는, 형광 비천연 아미노산이 상기 표적 단백질의 임의의 자리에 위치될 수 있으며, FRET 수용체로서 하나의 형광 단백질이 사용된다는 장점을 갖는다. 이는 두 개의 형광 단백질을 요구하는 기존의 FRET 센서가 가지는 단점인, 큰 크기와 융합에 대한 제한적 위치를 개선하는 것이다.
본원의 일 구현예에 따르면, 단백질 생합성을 위한 빌딩 블록 및 TCA 사이클에 대한 기재를 공급하기 위한 탄소 공급원으로서 사용되며, 당뇨병 및 암을 포함하는 인간 질병과 관련이 있는 조절 장애인 라파마이신 복합체 1 (mTORC1)의 조절에 관련된 L-글루타민을 선택적으로 검출함으로써, 생체분자 또는 살아있는 세포에서의 세포 이미징을 가능하게 할 수 있다.
도 1은, 본원의 일 실시예에 있어서, L-글루타민 검출용 FRET 센서의 개략도이다.
도 2는, 본원의 일 실시예에 있어서, CouA 및 EGFP의 정규화된 흡수 및 방출 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 3a는, 본원의 일 실시예에 있어서, L-글루타민 검출용 FRET 센서의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 이미지이다.
도 3b는, 본원의 일 실시예에 있어서, L-글루타민 검출용 FRET 센서 EGFP-GlnBP-F136CouA 의 형광 스펙트럼이다.
도 3c는, 본원의 일 실시예에 있어서, L-글루타민 검출용 FRET 센서 EGFP-GlnBP-N138CouA 의 형광 스펙트럼이다.
도 4의 (a) 내지 (f)는, 본원의 일 실시예에 있어서, 트립신-분해된 EGFP-GlnBP-WT, 및 CouA를 포함하는 EGFP-GlnBP 돌연변이 단백질의 MALDI-TOF MS 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5의 (a) 및 (b)는, 본원의 일 실시예에 있어서, L-글루타민 검출용 FRET 센서의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은, 본원의 일 실시예에 있어서, L-Gln 결합에 따른 L-글루타민 검출용 FRET 센서의 FRET 비율 (IEGFP/ICouA) 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7의 (a) 및 (b)는, 본원의 일 실시예에 있어서, pH 및 염 농도에 대한 L-글루타민 검출용 FRET 센서의 FRET 비율 변화의 의존성을 나타낸 그래프이다.
도 8의 (a) 및 (b)는, 본원의 일 실시예에 있어서, 최적의 조건 하에서 L-글루타민 검출용 FRET 센서 EGFP-10-GlnBP-N138CouA의 형광 스펙트럼 (a) 및 FRET 비율 변화 (b)를 나타낸 그래프이다.
도 9는, 본원의 일 실시예에 있어서, L-글루타민 검출용 FRET 센서 EGFP-10-GlnBP-N138CouA 의 천연 아미노산 및 D-Gln에 대한 선택성 분석을 나타낸 그래프이다.
도 10의 (a) 및 (b)는, 본원의 일 실시예에 있어서, FBS로 적정된 L-글루타민 검출용 FRET 센서 EGFP-10-GlnBP-N138CouA 의 형광 스펙트럼 (a) 및 FRET 비율 변화 (b)를 나타낸 그래프이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 “전기적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "비천연 아미노산" 은 20 가지 통상의 아미노산, 파이로리신 또는 셀레노시스테인이 아닌 아미노산을 지칭하며; 용어 "비천연 아미노산" 과 유사한 의미로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비천연적으로 코딩된 아미노산", "자연적으로 존재하지 않는 아미노산" 등이 있다. "비천연 아미노산" 은 천연적으로 코딩된 아미노산의 변형에 의해 자연적으로 발생하나, 그 자체가 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩티드 내로 도입되지는 않는 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 천연적으로 코딩된 아미노산이란, 20 가지 통상의 아미노산 또는 파이로리신 또는 셀레노시스테인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, "핵산" 은 단일-또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오시드, 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 달리 구체적으로 제한하지 않는 한, 상기 용어는 참고 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 천연 발생의 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 구체적으로 제한하지 않는 한, 상기 용어는 또한 PNA(펩티도핵산), 안티센스 기술에 사용되는 DNA 유사체(포스포로티오에이트, 포르포로아미데이트 등)를 비롯한 올리고뉴클레오티드도 지칭한다. 달리 명시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체 및 상보적 서열뿐만 아니라, 명확히 특정된 서열을 포함한다.
본원 명세서 전체에서, "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질" 은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 즉, 단백질에 대한 기술 사항은 동등하게 펩티드의 기술 사항 및 폴리펩티드의 기술 사항에도 적용되며, 반대의 경우도 마찬가지이다. 상기 용어는 자연적으로 존재하는 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 아미노산 중합체에도 적용된다. 본원에서 사용되는 바, 상기 용어는 전체 길이의 단백질을 비롯한, 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 연결되어 있는 임의 길이의 아미노산 쇄를 포함한다.
본원 명세서 전체에서, FRET (형광공명에너지전이, fluorescence resonance energy transfer)의 기재는, 단파장 형광 단백질인 공여체 (donor)가 외부에서 에너지를 흡수하면, 상기 공여체의 여기 에너지가 빛 에너지로 방출되는 대신, 소정의 거리 안에 위치한 장파장 형광 단백질인 수용체 (acceptor)가 발광 없이 전달되어, 수용체의 장파장 형광만이 방출되는 현상을 의미한다. FRET에 의한 수용체 형광의 발생 또는 공여체 방출광의 소멸현상 (photobleaching)이 나타나려면 상기 공여체와 수용체가 매우 짧은 거리 (10 nm 미만)에 위치해야한다. 특정 파장의 빛을 내는 형광 단백질인 상기 공여체와 이 발광 에너지와 공명을 일으켜 에너지를 흡수할 수 있는 형광 단백질인 상기 수용체가 소정의 거리 이내로 가까워지면, 외부에서 상기 공여체를 여기시키기 위해 조사된 빛 에너지가 상기 공여체로부터 상기 수용체로 발광 없이 전달되어 공여체의 고유한 파장의 발광이 감소하고, 공여체로부터 에너지를 전달받은 수용체가 자신의 고유한 파장대의 빛을 발광하는 FRET 현상이 일어난다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면은, 형광 공여체가 도입된 L-글루타민-결합 단백질; 및 형광 수용체 단백질을 포함하는, L-글루타민 검출용 FRET 센서를 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서는, 상기 형광 수용체 단백질과 상기 L-글루타민-결합 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터를 준비하는 단계; 상기 발현 벡터의 핵산 서열 중 일부를 종결 코돈으로 치환하는 단계; 상기 발현 벡터에 상기 형광 공여체를 도입하는 단계; 상기 발현 벡터를 숙주세포에 의해 공동-형질전환시켜 FRET 센서를 수득하는 단계에 의해 제조되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서는 L-글루타민을 제외한 나머지 19 개의 천연 아미노산 또는 D-글루타민에 대해서는 변화를 나타내지 않으며, L-글루타민에 대해서만 선택적으로 작용하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서는 L-글루타민에 의해 구조적 변화가 야기됨과 동시에 FRET 비율이 증가함으로써, L-글루타민과 구조적으로 유사한 아미노산인 L-아스파라긴산 (L-Asn), D-글루타민을 포함하는 다른 아미노산에 대해서 L-글루타민만을 선택적으로 검출할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 서열은 당업계에서 공지된 방법에 따라 선택적으로 또는 비선택적으로 변형될 수 있으며, 예를 들어, TAG, TGA, TAA, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 종결 코돈에 의하여 치환되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 서열의 치환은 위치-특이적 돌연변이에 의해 수행되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균일 수 있다. 예를 들어, 상기 종결 코돈으로 치환된 코돈을 가지는 단백질의 유전자를 포함하는 플라스미드, 적합한 tRNA 유전자를 포함하는 플라스미드, 및 적합한 아미노아실 tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 플라스미드를 숙주세포, 예를 들어, 대장균 내로 도입하여 형질전환 대장균을 제조하고, 상기 형질전환 대장균을 상기 형광 공여체가 포함된 배지에서 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 공여체는 비천연 아미노산일 수 있으며, 예를 들어, 상기 비천연 아미노산은 L-(7-하이드록시쿠마린-4-yl)에틸글리신 [L-(7-hydroxycoumarin-4-yl)ethylglycine], 3-(6-아세틸나프탈렌-2-yl아미노)-2-아미노프로피온산 [3-(6-acetylnaphthalen-2-ylamino)-2-aminopropanoic acid], 아리코돈-2-yl알라닌 [acridon-2-ylalanine], 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 비천연 아미노산은 상기 아미노아실 tRNA 합성효소에 의하여 tRNA에 결합할 수 있고, 상기 비천연 아미노산과 결합된 상기 tRNA는 상기 치환된 핵산 서열을 인식하여 코딩되는 단백질에 상기 비천연 아미노산을 코딩하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비천연 아미노산은 단백질의 임의 말단 위치 또는 임의의 내부 위치를 비롯한, 단백질 상의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 상기 비천연 아미노산이 도입된 단백질은 생합성적으로 생산될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 "생합성적으로" 라는 기재는 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA, 및 리보솜 중 1 개 이상을 사용하는 것을 포함하여, 세포성 번역 시스템을 사용한 방법을 의미하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
종래의 FRET 센서의 경우 형광 단백질의 도입이 N-말단 또는 C-말단에 한정되는 것인 반면, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 공여체로서 형광 비천연 아미노산은 상기 L-글루타민-결합 단백질의 어떠한 자리에도 혼입될 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 공여체로서 형광 비천연 아미노산은 상기 L-글루타민-결합 단백질의 F136 또는 N138 위치에 유전자 융합을 통해 도입될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 L-글루타민-결합 단백질은 서열번호 2를 포함하는 것이고, 상기 형광 공여체는 상기 서열번호 2의 L-글루타민-결합 단백질 내 F136 또는 N138 위치에 도입된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 공여체의 도입은 아미노산 돌연변이에 의해 달성되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 수용체 단백질은 녹색 형광체 단백질 (GFP), 변형된 녹색 형광체 단백질 (mGFP), 증강된 녹색 형광체 단백질 (eGFP), 적색 형광체 단백질 (RFP), 변형된 적색 형광체 단백질 (mRFP), 증강된 적색 형광체 단백질 (eRFP), 청색 형광체 단백질 (BFP), 변형된 청색 형광체 단백질 (mBFP), 증강된 청색 형광체 단백질 (eBFP), 황색 형광체 단백질 (YFP), 변형된 황색 형광체 단백질 (mYFP), 증강된 황색 형광체 단백질 (eYFP), 남색 형광체 단백질 (CFP), 변형된 남색 형광체 단백질 (mCFP), 증강된 남색 형광체 단백질 (eCFP), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 수용체 단백질은 상기 L-글루타민-결합 단백질의 N-말단에 연결된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 수용체 단백질은 구체적으로 증강된 녹색 형광체 단백질일 수 있으며, 상기 증강된 녹색 형광체 단백질이 상기 L-글루타민-결합 단백질의 N-말단에 융합되어 FRET 쌍 (FRET pair)를 형성하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 L-글루타민용 검출용 FRET 센서는 pH 및/또는 염 농도에 의하여 영향을 받을 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 L-글루타민용 검출용 FRET 센서는 pH 및/또는 염 농도에 따라 의존성을 나타내어 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서의 FRET 비율이 변화하는 것일 수 있다. 예를 들어, pH가 약 9까지 증가함에 따라 상기 FRET 비율이 증가하며, pH가 약 9를 초과할 경우 상기 L-글루타민의 α-아미노 그룹의 탈양성자화에 따라 상기 FRET 비율의 변화가 감소하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 L-글루타민 검출용 FRET 센서를 이용하는, L-글루타민의 검출 방법을 제공한다. 본원의 제 2 측면에 따른 L-글루타민의 검출 방법에 대하여, 본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 2 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서는, 형광 공여체가 도입된 L-글루타민-결합 단백질; 및 형광 수용체 단백질을 포함하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서를 이용하여 L-글루타민을 검출하는 방법은, 상기 형광 수용체 단백질과 상기 L-글루타민-결합 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터를 준비하는 단계; 상기 발현 벡터의 핵산 서열 중 일부를 종결 코돈으로 치환하는 단계; 상기 발현 벡터에 상기 형광 공여체를 도입하는 단계; 상기 발현 벡터를 숙주세포에 의해 공동-형질전환시켜 FRET 센서를 수득하는 단계; 및 상기 수득된 FRET 센서와 L-글루타민과의 반응을 통하여 L-글루타민을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 L-글루타민을 검출하는 것은, L-글루타민의 농도에 따른 상기 FRET 센서의 FRET 비율의 변화를 측정함으로써 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 FRET 비율의 변화는, L-글루타민의 농도가 0 일 때의 FRET 비율 (R0)에 대한 L-글루타민의 농도가 x일 때의 FRET 비율 (Rx)을 측정함으로써 다음과 같은 식에 의하여 계산되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다:
Figure 112016124359645-pat00001
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서는 L-글루타민을 제외한 나머지 19 개의 천연 아미노산 또는 D-글루타민에 대해서는 변화를 나타내지 않으며, L-글루타민에 대해서만 선택적으로 작용하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서는 L-글루타민에 의해 구조적 변화가 야기됨과 동시에 FRET 비율이 증가함으로써, L-글루타민과 구조적으로 유사한 아미노산인 L-아스파라긴산 (L-Asn), D-글루타민을 포함하는 다른 아미노산에 대해서 L-글루타민만을 선택적으로 검출할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 서열은 당업계에서 공지된 방법에 따라 선택적으로 또는 비선택적으로 변형될 수 있으며, 예를 들어, TAG, TGA, TAA, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 종결 코돈에 의하여 치환되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 서열의 치환은 위치-특이적 돌연변이에 의해 수행되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균일 수 있다. 예를 들어, 상기 종결 코돈으로 치환된 코돈을 가지는 단백질의 유전자를 포함하는 플라스미드, 적합한 tRNA 유전자를 포함하는 플라스미드, 및 적합한 아미노아실 tRNA 합성효소 유전자를 포함하는 플라스미드를 숙주세포, 예를 들어, 대장균 내로 도입하여 형질전환 대장균을 제조하고, 상기 형질전환 대장균을 상기 형광 공여체가 포함된 배지에서 배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 공여체는 비천연 아미노산일 수 있으며, 예를 들어, 상기 비천연 아미노산은 L-(7-하이드록시쿠마린-4-yl)에틸글리신 [L-(7-hydroxycoumarin-4-yl)ethylglycine], 3-(6-아세틸나프탈렌-2-yl아미노)-2-아미노프로피온산 [3-(6-acetylnaphthalen-2-ylamino)-2-aminopropanoic acid], 아리코돈-2-yl알라닌[acridon-2-ylalanine], 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 비천연 아미노산은 상기 아미노아실 tRNA 합성효소에 의하여 tRNA에 결합할 수 있고, 상기 비천연 아미노산과 결합된 상기 tRNA는 상기 치환된 핵산 서열을 인식하여 코딩되는 단백질에 상기 비천연 아미노산을 코딩하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비천연 아미노산은 단백질의 임의 말단 위치 또는 임의의 내부 위치를 비롯한, 단백질 상의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 상기 비천연 아미노산이 도입된 단백질은 생합성적으로 생산될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 "생합성적으로" 라는 기재는 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA, 및 리보솜 중 1 개 이상을 사용하는 것을 포함하여, 세포성 번역 시스템을 사용한 방법을 의미하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
종래의 FRET 센서의 경우 형광 단백질의 도입이 N-말단 또는 C-말단에 한정되는 것인 반면, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 공여체로서 형광 비천연 아미노산은 상기 L-글루타민-결합 단백질의 어떠한 자리에도 혼입될 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 공여체로서 형광 비천연 아미노산은 상기 L-글루타민-결합 단백질의 F136 또는 N138 위치에 유전자 융합을 통해 도입될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 L-글루타민-결합 단백질은 서열번호 2를 포함하는 것이고, 상기 형광 공여체는 상기 서열번호 2의 L-글루타민-결합 단백질 내 F136 또는 N138 위치에 도입된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 공여체의 도입은 아미노산 돌연변이에 의해 달성되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 수용체 단백질은 녹색 형광체 단백질 (GFP), 변형된 녹색 형광체 단백질 (mGFP), 증강된 녹색 형광체 단백질(eGFP), 적색 형광체 단백질 (RFP), 변형된 적색 형광체 단백질 (mRFP), 증강된 적색 형광체 단백질 (eRFP), 청색 형광체 단백질 (BFP), 변형된 청색 형광체 단백질 (mBFP), 증강된 청색 형광체 단백질 (eBFP), 황색 형광체 단백질 (YFP), 변형된 황색 형광체 단백질(mYFP), 증강된 황색 형광체 단백질 (eYFP), 남색 형광체 단백질 (CFP), 변형된 남색 형광체 단백질 (mCFP), 증강된 남색 형광체 단백질 (eCFP), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 형광 수용체 단백질은 상기 L-글루타민-결합 단백질의 N-말단에 연결된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 수용체 단백질은 구체적으로 증강된 녹색 형광체 단백질일 수 있으며, 상기 증강된 녹색 형광체 단백질이 상기 L-글루타민-결합 단백질의 N-말단에 융합되어 FRET 쌍 (FRET pair)를 형성하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 L-글루타민의 검출은, pH 및/또는 염 농도에 의하여 영향을 받을 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 L-글루타민용 검출용 FRET 센서는 pH 및/또는 염 농도에 따라 의존성을 나타내어 상기 L-글루타민 검출용 FRET 센서의 FRET 비율이 변화하는 것일 수 있으며, 예를 들어, pH가 약 9까지 증가함에 따라 상기 FRET 비율이 증가하며, pH가 약 9를 초과할 경우 상기 L-글루타민의 α-아미노 그룹의 탈양성자화에 따라 상기 FRET 비율의 변화가 감소하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른-글루타민 검출용 FRET 센서를 포함하는, L-글루타민의 검출용 조성물을 제공한다.
본원의 제 3 측면에 따른 L-글루타민의 검출용 조성물에 대하여, 본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 3 측면에 동일하게 적용될 수 있다.
이하, 본원의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것 일뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
모든 화학물질 및 DNA 올리고머로는 상업적인으로 입수 가능한 것을 추가적인 정제 없이 사용하였다. MALDI-TOF MS는 Bruker Autoflex 스피드 시리즈 질량분석계 (Bruker Daltonics, Leipzig, Germany)를 이용하여 수득하였다.
모든 UV-가시 흡수 스펙트럼은 Jasco V-660 분광광도계에 의해 측정되었으며, 형광 스펙트럼은 Hitachi F-7000 형광 분광광도계에 의해 촬영되었다.
FRET 센서의 발현 및 정제
GlnBP 유전자는 E. coli 게놈 DNA로부터 증폭되었으며, EGFP 유전자는 유전자 합성에 의하여 상업적으로 입수 가능한 것으로 수득되었다. 상이한 링커 길이를 갖는 EGFP-GlnBP 융합 유전자는 중첩 확장 PCR에 의해 합성되었으며, pBAD-EGFP-GlnBP-WT를 생성하기 위해 pBAD/Myc-His (Invitrogen)로 삽입되었다. 앰버 코돈 (amber codon, TAG)은 위치-특이적 변이에 의하여 GlnBP의 136 또는 138 위치에 도입되었다. CouA를 포함하는 EGFP-GlnBP 융합 단백질을 발현하기 위해, 앰버 코돈을 갖는 pBAD-EGFP-GlnBP를 pEvol-CouRS26과 함께 E. coli C321.A 균주 (Addgene)로 공동-형질전환 (cotransform) 시켰다. 세포는 암피실린 (100 μg/mL) 및 클로람페니콜 (35 μg/mL)이 보충된 LB 배지 (lysogeny broth)에서 증폭되었으며, 종균 배양 (2 mL)은 암피실린 (100 μg/mL), 클로람페니콜 (35 μg/mL), 및 1 mM CouA이 보충된 100 mL LB 배지로 이동되었다. 단백질 발현은 광학 밀도가 0.8에 도달할 때 0.2% L-아라비노스를 첨가함으로써 유도되었으며, 상기 배양은 37℃에서 밤새 성장되었다. 세포는 원심분리에 의해 수확되었으며, 용해 버퍼 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸 및 pH 8.0)에서 재현탁 되었으며, 초음파 처리 되었다. 표적 단백질은 제조사의 프로토콜 (Qiagen)에 따른 자연적 조건 하에서 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 정제된 FRET 센서는 추가적인 실험을 위하여 인산염 버퍼 (50 mM NaH2PO4, pH 8.0)에 대해 투석되었다.
FRET 센서의 설계
본원에서 사용된 FRET 센서는 에머랄드 GFP (emerald GFP, EGFP)을 유전자 혼입으로 L-글루타민-결합 단백질에 도입하고, 형광 아미노산을 유전자 융합으로 도입함으로써 설계되었다 (도 1). 도 1 은 상기 설계된 FRET 센서를 나타낸 개략도로서, EGFP는 GlnBP의 N-말단에 융합되며, CouA는 리간드 결합에 따라 가장 큰 CouA 및 EGFP 사이의 거리 차이가 발생하는 위치에 혼입되었다. 상기 유전자 혼입에 의하여 단백질로 성공적으로 혼입된 상기 형광 아미노산 중에서, L-(7-하이드록시쿠마린-4-yl)에틸글리신 [L-(7-hydroxycoumarin-4-yl)ethylglycine, CouA]은 이러한 아미노산의 방출 스펙트럼이 EGFP의 흡수 스펙트럼과 함께 상당한 중첩을 나타냈기 때문에, 본원에 대해 선택되었다 (도 2). 도 2 는 상기 CouA와 EGFP에 대한 정구화된 흡수 및 방출 스펙트럼을 나타낸다.
또한, CouA에 대한 상기 aatRNA/aaRS 쌍은 박테리아 세포에서 단백질 발현과 일치하며, 또한 상기 아미노산은 두 합성 단계에서 용이하게 제조될 수 있었다. 센서 단백질로서, 대장균 (E. coli)으로부터의 상기 L-글루타민 결합 단백질 (GlnBP)은 이러한 단백질이 구조적으로 잘 특성화되어 있으며, L-Gln에 대해 형광 센서로서 사용되어 왔기 때문에 선택되었다. GlnBP는 226 개의 아미노산 잔기를 갖는 작은 세포질 결합 단백질 (small periplasmic binding protein)이며, 1:1 몰 비율에서 서브-마이크로몰의 해리 상수를 가지며 L-Gln과 결합한다. L-Gln는 단백질 생합성을 위한 빌딩 블록으로서 그리고 TCA 사이클에 대한 기재를 공급하기 위한 탄소 공급원으로서 사용된다. 또한, 상기 L-Gln는 당뇨병 및 암을 포함하는, 인간 질병과 관련이 있는 조절 장애인, 라파마이신 복합체 1 (mTORC1)의 조절에 관련된다. 그러므로, 상기 L-Gln의 검출은 상기 L-Gln의 생화학적 기능을 연구하는 것에 있어 중요하다.
GlnBP의 결정 구조는 리간드-프리 및 리간드-결합의 두 가지 형태로 보고되어 있으며, 이는 상기 L-Gln가 리간드 결합에 따라 상당한 구조적 변화를 일으키는 것을 나타낸다. 이러한 상기 L-Gln의 구조에 기반하여, GFP 융합 및 CouA의 혼입을 위한 상기 최적의 위치는, 상기 리간드의 결합에 따라 상기 FRET 변화를 극대화하기 위하여 조사되었다. GlnBP는 두 개의 힌지 (hinge)에 의해 연결된 두 개의 도메인을 포함한다. 상기 힌지의 위치는 Y86, K87 및 Q183, Q184이다. 상기 N- 및 C-말단은 동일한 도메인 상에 있으며, 이것은 독특한 형광 단백질이 FRET 쌍으로써, 각 말단으로의 융합이 상당한 FRET 변화를 야기할 가능성이 낮음을 시사한다 (도 1). 상기 N-말단은 전체 단백질 구조의 가장자리 한 군데에 위치하며, 상기 C-말단은 상기 힌지 영역의 근처에 위치한다. 상기 C-말단이 상기 두 도메인의 경계에 위치되기 때문에, 이러한 상기 C-말단의 위치는 구조적인 변화에 민감하지 않으므로 GFP 융합에 대해 부적절한 위치가 될 것이다. 따라서, 상기 GFP는 상기 FRET 변화를 최대화하기 위해 N-말단에 융합하였다.
그 다음으로, CouA 혼입을 위한 위치를 GlnBP의 두 구조적 형태를 비교함으로써 탐색하였다. 상기 구조의 합성 (superimposition)은 리간드 결합에 의하여 발생한 상기 구조적 변화가 V104 내지 L155 잔기의 움직임에 의한 것임이 드러났다. 리간드 결합에 따라 상기 N-말단으로부터 가장 큰 변위을 나타내는 이러한 잔기를 확인하기 위해, 상기 구조에서 가시적인 첫 번째 N-말단 잔기인, Leu5의 α-탄소와, 상기 아포-형태 (apo-form) 및 상기 리간드-결합 (ligand-bound) 형태 두 가지 중 104 내지 155 잔기의 α-탄소 사이의 거리를 측정하였다. 상기 두 가지 형태 사이에서의 상기 거리 차이를 계산하였다 (표 1). 하기 표 1은, GlnBP 중 Leu5로부터 V104 및 L155의 거리의 측정, 및 리간드 결합에 따른 상기 거리에서 % 변화 계산을 나타낸 것이다. 상기 α-탄소 사이의 거리는 PyMOL을 이용하여 측정되었으며, 가장 큰 거리 변화를 나타내는 5 개의 잔기 (S116, G117, F136, P137, 및 N138)는 굵게 표시되었다. 상기 측정에 사용된 PDB ID는 1GGG (아포-형태) 및 1WDN (리간드-결합 형태)이다.
가장 두드러진 거리 변화를 나타내는 5 개의 잔기 (S116, G117, F136, P137, 및 N138)가 잠재적 couA 혼입 위치로서 간주되었다. 상기 잔기 중에서, S116 및 G117은 상기 리간드-결합된 형태 중 상기 리간드 위치 근처의 두 도메인의 계면에 위치되었으며, 이것은 그들이 CouA에 의해 대체될 때 상기 단백질의 결합 친화도에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있었다; 따라서, 그들은 더욱 고려되지 않았다. 상기 나머지 세 개의 잔기들은 β-스트랜드 (β-strand) 및 α-헬릭스 (α-helix) 사이의 루프에 위치되었다. Pro137가 상기 루프에서 구조적으로 중요한 것으로 예상되었기 때문에 배제된 반면에, F136 및 N138는 CouA 혼입을 위한 위치로서 선택되었다.
Figure 112016124359645-pat00002
CouA를 포함하는 FRET 센서의 발현 및 정제
설계된 FRET 센서 단백질을 제조하기 위해, C-말단 His6-tag된 GlnBP을 인코딩하는 유전자와 EGFP을 인코딩하는 유전자를, 수득된 단백질이 EGFP에 C-말단 융합될 수 있도록 연결하였다. 또한, GlnBP 중 F136 또는 N138 중 하나에 대한 코돈은 앰버 종결 코돈 (TAG)에 의해 대체되었다. CouA는 N-Cbz-L-글루탐산 벤질 에스테르 (N-Cbz-L-glutamic acid benzyl ester)로부터 보고된 방법 [J. Wang, J. Xie and P. G. Schultz, J. Am. Chem . Soc ., 2006, 128, 8738-8739.]으로 합성하였다. CouA을 포함하는 상기 EGFP-GlnBP 구조체는 CouA 및 상기 발달된 aatRNA/aaRS (CouRS) 쌍의 존재 하에서 발현되었다. 상기 발현을 위해, E. coli MG1655으로부터 유래된, E. coli 균주 C321.A를 사용하였다. 상기 돌연변이 단백질인 EGFP-GlnBP-F136CouA 및 EGFP-GlnBP-N138CouA은 상응하는 발달된 tRNA/aaRS 쌍 및 1 mM CouA의 존재 하에 발현되었으며, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 두 단백질 모두에 대한 수율은 각각 8 내지 10 mg/L이었다. 비교를 위해, 야생형 GlnBP 서열 (CouA 제외)을 갖는 상기 EGFP-GlnBP 융합 단백질의 수율은 15 내지 20 mg/L이었다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴 젤 전기영동 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 분석은 총-길이 (full-length) 단백질에 상응하는 크기를 갖는 밴드를 나타냈다. 쿠마시-염색 (도 3a의 좌측) 및 형광 (도 3a의 우측)에 의해 가시화된 형광 이미지로 상기 형광 아미노산의 도입을 확인하였다. EGFP GlnBP WT 는 대조군으로서 또한 분석되었다.
정제된 FRET 센서의 MALDI-TOF MS 분석
트립신 분해 이후에, MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric) 분석으로 CouA의 혼입을 확인하였다. FRET 센서 (200 μg, 최종 농도 0.5 mg/mL)는 37℃에서 12 시간 동안 50 mM Tris 및 0.1% SDS을 포함하는 반응 버퍼에서 트립신 (20 μM) 에 의하여 분해되었으며, 상기 분해된 펩타이드는 C-18 스핀 컬럼을 이용하여 탈염되었다. 상기 탈염된 트립신 분해물 (tryptic digests)은 1:1 (v/v)로 α-시아노-4-하이드록시신남산 (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA) 매트릭스 (50% 아세토니트릴 및 1% 트리플루오로 아세트산을 함유하는 물 중 10 mg/mL)에서 혼합되었으며 MALDI-TOF MS 분석을 위해 실험되었다. 펩티드 X (QFPNIDNAYMELGTNR)는 F136 및 N138를 포함한다; 각 잔기는 Peptide X-136CouA 또는 X-138CouA에서 CouA에 의해 치환되었다. 도 4의 (a) 내지 (f)는, 각각 EGFP-GlnBP-WT (a), EGFP GlnBP F136CouA (b), EGFP-GlnBP-N138CouA (c), EGFP-4-GlnBP-N138CouA (d), EGFP-7GlnBP-N138CouA (e), 및 EGFP-10-GlnBP-N138CouA (f) 의 펩티드 생성물에 대한 MALDI TOF MS 분석 데이터를 나타내는 것으로, 분석 결과 CouA의 혼입을 확인하였으며, 이러한 위치에 도입된 아미노산이 없었다는 것을 입증하였다.
L-Gln 적정 실험 및 아미노산 선택성 테스트
FRET 센서 단백질 샘플 (100 nM)은 상응하는 인산염 버퍼 (50 mM NaH2PO4, 0-500 mM NaCl, pH 7.5-10.5)에서 L-Gln (0, 50, 100, 200, 500, 1000, 5000, 10000, 50000 및 100000 nM)으로 적정되었다. 형광은 360 nm에서의 여기와 함께 각각의 농도에서 420 nm 내지 580 nm에서 스캔되었다. FRET 비율 (R, I468 nm/I518 nm)은 각각의 형광 스펙트럼으로부터 계산되었으며, FRET 비율 변화는 다음과 같은 식 1에 의해 계산되었다:
Figure 112016124359645-pat00003
여기서 R0는 [L-Gln] = 0에서의 FRET 비율이며, Rx는 [L-Gln] = x에서의 FRET 비율이다. 최적화 실험에서, 형광은 상이한 pH 또는 염 농도에서 L-Gln (0 또는 50 μM)의 고정된 농도로 360 nm에서의 여기와 함께 측정되었으며, FRET 비율 변화가 계산되었다. 아미노산 선택성 테스트에 관하여, FRET 센로서 EGFP-10-GlnBP-N138CouA (100 nM)에 대한 FRET 비율 변화가 50 mM NaCl을 포함하는 50 mM NaH2PO4 (pH 9.0) 에서 각각의 아미노산의 존재 (50 μM) 및 부재 하에 360 nm에서의 여기와 함께 측정되었다. 모든 측정은 독립적으로 3 회 수행되었으며, 데이터는 평균화되었다. 상기 FRET 센서의 해리 상수는 DynaFit을 이용하여 계산되었다.
FRET 센서의 평가
CouA를 포함하는 상기 FRET 센서는 리간드 결합에 따른 그들의 FRET 변화에 대해 조사되었다. 도 3b 및 도 3c는 각각 EGFP-GlnBP-F136CouA (b) 및 EGFP-GlnBP-N138CouA (c)에 대한 형광 스펙트럼을 나타내는 것으로, 상기 단백질 (100 nM)은 L-Gln로 적정되었으며, 상기 형광 강도는 400 nm 내지 580 nm로부터, 360 nm에서의 여기와 함께 측정되었다 [분석 조건: 100 nM EGFP-GlnBP 돌연변이 단백질, 50 mM 인산염 버퍼 (pH 8.0), 300 mM NaCl, 및 L-Gln (제시된 농도)]. 도 3b 및 도 3c에 나타낸 바와 같이, FRET에 의한 EGFP 방출이 두 돌연변이 모두에 대해 관찰되었다. 그러나, L-Gln의 증가하는 농도와 함께, EGFP-GlnBP-N138CouA의 상기 FRET 비율 (IEGFP, 518 nm/ICouA , 468 nm) 만이 증가하였다. 상기 비율은 상기 단백질이 L-Gln로 포화되었을 때 1.4 배 증가하였다. 상기 F136 돌연변이의 경우, CouA의 형광 최댓값은 450 nm 내지 420 nm로부터 시프트되었으며, 이러한 시프트는 EGFP의 흡수 스펙트럼과의 스펙트럼 중첩을 감소시켰으며, 감소된 FRET 신호를 야기하였다. 8 하이드록시쿠마린 (8-hydroxycoumarin)의 상기 형광 스펙트럼은 상기 형광단이 단백질에서 극성 잔기 (수소 결합 공여체 또는 수용체)와 상호 작용할 때 청색-시트프되었음이 보고되었다. 따라서, EGFP-GlnBP-F136CouA 중 CouA는 F136 근처의 잔기와 복합체를 형성하며, 상기 복합체는 L-Gln의 결합에 의해 안정화될 것으로 본원의 연구자들은 예상한다. 이러한 복합화는 더 짧은 파장으로 CouA의 형광 스펙트럼을 시프트시켰으며 EGFP의 상기 흡수 스펙트럼과의 스펙트럼 중첩을 감소시켰다.
FRET 센서의 재설계
EGFP-GlnBP-N138CouA가 리간드 결합에 따른 상기 FRET 비율에서 상당한 증가를 나타냄에도 불구하고, 상기 센서는 상기 FRET 비율 변화를 더욱 증가시키도록 설계될 수 있는 것으로 예상되었다. 상기 GlnBP의 결정 구조에 기반하여, N138은 상기 기재된 바와 같이, CouA와의 교체를 위한 최적의 잔기가 될 수 있을 것으로 예상되었다. 따라서, 본원의 연구자들은 EGFP 및 GlnBP 사이의 상기 아미노산 서열을 조작하였다. 상기 GFP의 결정 구조에서, 아마도 C-말단 잔기가 유연하기 때문에, 일부 C-말단 잔기가 부재하며, 이것은 그들의 모델링을 배제한다. 이러한 잔기를 제거하는 것은 상기 링커 영역을 견고하게 하며/또는 CouA 및 EGFP 사이의 상기 거리를 감소시키며, 이것은 상기 FRET 비율 변화를 증가시키는 것으로 예상되었다. 상기 FRET 센서 단백질은 이러한 구조적 고려에 기반하여 재설계되었다; 4 개의 돌연변이 유전자는 상이한 링커 길이를 갖도록 하기 표 2와 같이 구축하였으며, N138에 대한 상기 코돈은 CouA의 혼입을 가능하게 하는 앰머 코돈으로 대체하였다.
Figure 112016124359645-pat00004
도 5는 상기 기재된 바와 같이 발현되었으며 정제된 FRET 센서 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것으로서, 상이한 길이의 링커를 갖는 EGFP-GlnBP 돌연변이 단백질은 1 mM CouA 및 상기 요구된 발달된 tRNA/aaRS 쌍의 존재 하에서 발현된 후, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 상기 정제된 FRET 센서 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분석되었으며, 쿠마시-염색 [도 5의 (a)] 및 형광 [도 5의 (b)]에 의해 시각화되었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 그들의 수율 및 순도는 초기에 설계된 FRET 센서 단백질의 수율 및 순도와 일치하였다.
트립신 분해 후, CouA의 혼입은 MALDI-TOF MS에 의하여 입증되었다 (도 4). 상기 재설계된 FRET 센서 단백질은 상이한 농도의 L-Gln에서 형광을 측정함으로써 평가되었다. 상기 형광 스펙트럼으로부터, FRET 비율 (IEGFP/ICouA) 변화 (ΔR/R0)가 계산되었으며 L-Gln 농도에 대해 플롯되었다 (도 6). ICouA 및 IEGFP는 360 nm에서의 여기 후에, 468 nm 및 518 nm에서 측정되었으며, 각각의 데이터-포인트는 3 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다 [분석 조건: 100 nM EGFP-GlnBP 돌연변이 단백질, 50 mM 인산염 버퍼 (pH 8.0), 300 mM NaCl, 및 L-Gln (제시된 농도)]. 상기 FRET 비율은 재설계된 모든 FRET 센서 단백질에 대하여 L-Gln의 증가하는 농도에 따라 증가하였으며, 상기 증가는 상기 링커 길이가 감소함에 따라 상승되었다. 최상의 FRET 센서 단백질은 EGFP-10-GlnBP-N138CouA였다; 이것의 FRET 비율은 L-Gln 결합에 따라 1.8 배 증가하였다. 본원의 연구자들은 EGFP중 상기 A226, A227, 및 G228 잔기가 정의된 구조 내에 있었기 때문에 상기 링커 길이를 더 짧게 하지 않았으며, 이러한 잔기를 제거하는 것은 상기 FRET 센서 단백질의 구조 및 기능에 영향을 미칠 것으로 예상되었다.
염 농도 및 pH에서 FRET 센서의 의존성
상기 FRET 센서가 염 농도 또는 pH에 대한 의존성을 가지고 있는지를 테스트하기 위해, L-Gln의 존재 (50 μM) 및 부재 하에서 상이한 pH [도 7의 (a)] 및 염 농도 [도 7의 (b)] 값에서 형광을 측정하였으며, 수득된 FRET 비율 변화를 산출하였다. FRET 비율은 360 nm에서의 여기에 따라, L-Gln의 존재 (50 μM) 또는 부재에서, ICouA , 468 nm 및 IEGFP , 518 nm로부터 계산되었다. 도 7의 (a)의 조건은 100 nM EGFP-10-GlnBP-N138CouA, 50 mM 인산염 버퍼 (제시된 pH에서), 300 mM NaCl이며, 도 7의 (b)의 조건은 100 nM EGFP-10-GlnBP-N138CouA, 50 mM 인산염 버퍼 (pH 9.0), 제시된 농도에서의 NaCl이다. 각각의 데이터-포인트는 3 개의 독립적인 실험의 평균을 나타내었다.
0 mM 내지 50 mM로 증가하는 농도에 따라 미미한 증가가 관찰되었음에도 불구하고, 0 내지 500 mM의 범위에서 소듐 클로라이드 농도는 FRET 비율 변화에 상당한 영향을 미치지 않았다. 그러나, 상기 pH 의존성은 상당하였다: pH 9까지 pH 증가에 따라, 상기 FRET 비율 변화가 증가하였다. 이것은 7-하이드록시쿠마린에서 상기 하이드록시 그룹이 대략 8의 pka를 갖고, 상기 하이드록시 그룹의 탈양성자화가 460 nm에서 형광 강도를 증가시키기 때문이다. 더 높은 pH (9.5 초과)에서 상기 FRET 비율 변화에서의 감소는 L-Gln 의 α-아미노 그룹 (pKa = 9.1)의 탈양성자화 및 상기 센서 단백질에 대한 그들의 결합 친화도에서 수득된 감소에 의한 것이다.
최적의 조건 하에서의 FRET 센서의 평가
최적의 조건 (pH 9 및 50 mM 소듐 클로라이드) 하에서, EGFP-10-GlnBP-N138CouA 가 L-Gln으로 적정되었으며, 이것의 형광 스펙트럼이 360 nm에서의 여기 후에 L-Gln의 증가하는 농도에서 수득되었다 [도 8의 (a)].
도 8의 (b)는 FRET 비율 변화를 나타낸 것으로, FRET 비율 변화는 360 nm에서의 여기 후에 ICouA , 468 nm 및 IEGFP , 518 nm로부터 계산되었다. 분석 조건: 100 nM EGFP-10-GlnBP-N138CouA, 50 mM 인산염 버퍼 (pH 9.0), 50 mM NaCl, 및 L-Gln (제시된 농도). 각각의 데이터-포인트는 3 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 도 8의 (b)에 나타낸 바와 같이, 최대 FRET 비율 변화는 0.9였으며, 상기 센서 단백질로부터 L-Gln의 상기 해리 상수는 396 ± 77 nM이었고, 이것은 보고된 값 (300 nM)과 비슷하였다.
그 후, 다른 아미노산에 대한 상기 센서 단백질의 선택성을 평가하였다. 모든 20 개의 아미노산, 및 D-Gln에 대해, 각각의 아미노산 50 μM을 첨가함으로써 FRET 비율을 측정하였다. FRET 비율은 360 nm에서의 여기 후에 L-Gln의 존재 (50 μM) 또는 부재 하에서, ICouA , 468 nm 및 IEGFP , 518 nm로부터 계산되었다 [분석 조건: 100 nM EGFP-10-GlnBP-N138CouA, 50 mM 인산염 버퍼 (pH 9.0), 50 mM NaCl, 및 각 아미노산의 50 μM]. 각각의 데이터-포인트는 3 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, L-Gln을 제외하고는 모든 아미노산에 대해 상기 FRET 비율에서 변화가 관찰되지 않거나, 또는 최소한의 변화만이 관찰되었다. 이러한 결과는 상기 설계된 센서인 EGFP-10-GlnBP-N138CouA이, 1.9 배 FRET 비율 증가와 함께 L-Gln에 의해 야기되는 구조적 변화에 대응하며, 구조적으로 유사한 아미노산 (L-Asn, L-Glu, 및 D-Gln)을 포함하는 다른 아미노산에 대해 우수한 선택성을 가진다는 것을 입증한다.
다음으로, 본원의 연구자들은 생물학적 샘플에서 L-Gln 농도를 측정하기 위해 상기 센서 단백질 (EGFP-10-GlnBP-N138CouA)을 적용하였다. 도 10의 (a) 및 (b)는 각각 EGFP-10-GlnBP-N138CouA의 형광 스펙트럼 및 FRET 비율 변화를 나타낸다. 형광 스펙트럼은 360 nm에서 여기 후에, FBS의 증가하는 농도에서 측정되었으며, FRET 비율 변화는 360 nm에서의 여기 후에, ICouA , 468 nm 및 IEGFP , 518 nm로부터 계산되었다. FBS 농도는 로그 스케일에 대해 표준화되었다 [분석 조건: 100 nM EGFP-10-GlnBP-N138CouA, 50 mM 인산염 버퍼 (pH 9.0), 50 mM NaCl, 및 FBS (제시된 농도, 상업용 FBS에 대한 상대적인 농도)]. 각각의 데이터-포인트는 3 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 소태아혈청 (FBS)은 진핵 세포 배양을 위해 널리 사용되는 보충제이다. L-Gln은 혈청에서 가장 풍부한 아미노산이며 상기 농도는 500 μM 내지 1200 μM의 범위 내에 있는 것으로 알려졌다. 상기 FRET 센서 단백질의 이러한 적정 실험으로부터 상기 형광 스펙트럼은 L-Gln으로 적정된 것과 유사하였다. 이러한 측정으로부터, FBS 중 L-Gln의 농도가 추정되었으며, 이것은 대략 500 μM이었다. 이러한 결과는 상기 설계된 FRET 센서 단백질이 생물학적 샘플 복합체에서 L-Gln 농도를 측정하는 데에 사용될 수 있음을 나타냈다.
상기 형광단 사이의 이격 거리
CouA와 상기 EGFP의 형광단 사이의 이격 거리를 EGFP-10-GlnBP-N138CouA에 대하여 계산하였다. CouA의 발광 스펙트럼 및 상기 EGFP의 흡수 스펙트럼에 기반하여, 상기 형광 거리를 계산하였다 (R0 = 49.2 Å). L-Gln의 존재 및 부재 하에 상기 FRET 센서 단백질의 FRET 효율성이 또한 계산되었으며, 각각 0.284 및 0.153로 나타났다. 이러한 값으로부터, 상기 형광단 사이의 이격 거리가 계산되었다; 아포-형태에 대해 65.5 Å 및 상기 리간드-결합Å에 대해 57.4 Å이며, 이것은 상기 아포-형태에서의 이격 거리와 비교하여 12.4% 변화이다. 상기 FRET 변화는 두 형광단 사이의 거리가 R0로 접근할 때 최대화 되는 것으로 알려져있다. 따라서, FRET 센서를 디자인 할 때 표적 물질에 결합하기 전 후의 거리의 변화가 R0 근처에서 일어나도록 CouA를 배치함으로써 FRET 비율의 변화를 최대화할 수 있다.
상기 기재한 바와 같이, 종래에 사용되던 두 형광 단백질을 기반으로 한 FRET 센서들은, 단백질-단백질 상호작용 및 단백질 내의 구조적 변화를 조사하는 데에 유용한 도구였음에도 불구하고, 상기 FRET 센서들은 고유의 단점으로 그들의 큰 크기와 융합에 대한 제한적 위치 (N- 또는 C-말단)를 포함한다.
본원의 FRET-기반 센서는 형광 비천연 아미노산을 GFP에 대한 FRET 파트너로서 GlnBP에 혼입시킴으로써 개발되었다. GFP는 GlnBP의 N-말단에 융합되었으며, 상기 형광 비천연 아미노산인 CouA는, GlnBP 중 N138에 대한 위치에 도입되었다. CouA 도입을 위한 최적의 위치는 구조적 정보, 거리 계산, 및 실험 평가를 이용하여 확인되었다. FRET 센서 단백질은 pH, 염 농도, 및 GFP와 GlnBP 사이의 상기 링커의 길이를 변화시킴으로써 더욱 최적화되었다. 최적의 조건 하에서, 상기 최상의 FRET 센서는 상기 다른 19 개의 천연 아미노산 또는 D-Gln에 대해 약간의 변화 또는 변화가 나타나지 않은 반면, L-Gln 결합에 따라 상기 FRET 비율에서 1.9 배의 증가를 나타내었다. 본원에 따른 신규한 FRET 센서는 두 형광 단백질에 의존하는 현재의 FRET 센서에서의 한계를 극복할 수 있다. 상기 신규한 FRET 센서에서 하나의 형광 단백질이 FRET 수용체로서 여전히 요구되며, 또한 이것이 표적 단백질의 N- 또는 C-말단 중 하나에 위치 되어야 함에도 불구하고, FRET 공여체로서 사용된 상기 형광 아미노산은 상기 FRET 변화를 극대화하는 상기 단백질에서 임의의 위치에 위치될 수 있다. 상기 CouA의 혼입은 기술적으로 간단하며, 또한 여러 위치가 상기 최적의 위치를 식별하기 위해 간단히 테스트 될 수 있다. 또한, 구조적 정보가 위치의 선택에 대해 안내될 수 있으며, 실험 평가에 대한 잠재적인 위치의 수를 상당히 감소시킨다. 그러므로, 이러한 방법은 FRET 센서 설계에 대해 도움이 될 것이며, 세포 이미징에 대한 이러한 방법의 어플리케이션은 중요한 생체분자 및 살아있는 세포에서의 생체분자적 상호작용을 조사하기 위한 방법으로 확장될 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> FRET SENSOR FOR DETECTING L-GLUTAMINE AND DETECTING METHOD OF L-GLUTAMINE USING THE SAME <130> DP20160518KR <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial GlnBP DNA seqeunce <400> 1 gcggataaaa aattagttgt cgcgacggat accgccttcg ttccgtttga atttaaacag 60 ggcgataaat atgtgggctt tgacgttgat ctgtgggctg ccatcgctaa agagctgaag 120 ctggattacg aactgaagcc gatggatttc agtgggatca ttccggcact gcaaaccaaa 180 aacgtcgatc tggcgctggc gggcattacc atcaccgacg agcgtaaaaa agcgatcgat 240 ttctctgacg gctactacaa aagcggcctg ttagtgatgg tgaaagctaa caataacgat 300 gtgaaaagcg tgaaagatct cgacgggaaa gtggttgctg tgaagagcgg tactggctcc 360 gttgattacg cgaaagcaaa catcaaaact aaagatctgc gtcagttccc gaacatcgat 420 aacgcctata tggaactggg caccaaccgc gcagacgccg ttctgcacga tacgccaaac 480 attctgtact tcatcaaaac cgccggtaac ggtcagttca aagcggtagg tgactctctg 540 gaagcgcagc aatacggtat tgcgttcccg aaaggtagcg acgagctgcg 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Gly Asn Gly Gln Phe Lys Ala Val 165 170 175 Gly Asp Ser Leu Glu Ala Gln Gln Tyr Gly Ile Ala Phe Pro Lys Gly 180 185 190 Ser Asp Glu Leu Arg Asp Lys Val Asn Gly Ala Leu Lys Thr Leu Arg 195 200 205 Glu Asn Gly Thr Tyr Asn Glu Ile Tyr Lys Lys Trp Phe Gly Thr Glu 210 215 220 Pro Lys 225 <210> 3 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial EGFP DNA seqeunce <400> 3 atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60 gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120 aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180 gtcactactt tcacctatgg tgttcaatgc tttgcgcgtt atccggatca catgaaacgg 240 catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300 aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360 aatcgtatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct cggccataag 420 ctggaatata actacaacag ccacaaggtg tatatcaccg cggataagca gaagaatggc 480 atcaaggcca acttcaaaac ccgccacaac attgaagatg gatccgttca 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Asn Ser His Lys Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial EGFP-GlnBP overlap Forward primer seqeunce <400> 5 ggcatggatg agctctacaa aggtaaatta gttgtcgcga cgg 43 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial EGFP-GlnBP overlap Reverse primer seqeunce <400> 6 ccgtcgcgac aactaattta cctttgtaga gctcatccat gcc 43 <210> 7 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial EGFP-4-GlnBP overlap Forward primer seqeunce <400> 7 gctgggatta cacatggcat ggatggtaaa ttagttgtcg cgacgg 46 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial EGFP-4-GlnBP overlap Reverse primer seqeunce <400> 8 ccgtcgcgac aactaattta ccatccatgc catgtgtaat cccagc 46 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial EGFP-7-GlnBP overlap Forward primer seqeunce <400> 9 gtaactgctg ctgggattac acatggtaaa ttagttgtcg cgacgg 46 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial EGFP-7-GlnBP overlap Reverse primer seqeunce <400> 10 ccgtcgcgac aactaattta ccatgtgtaa tcccagcagc agttac 46 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial EGFP-10-GlnBP overlap Forward primer seqeunce <400> 11 ccttcttgag tttgtaactg ctgctggggg taaattagtt gtcgcgacgg 50 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial EGFP-10-GlnBP overlap Reverse primer seqeunce <400> 12 ccgtcgcgac aactaattta cccccagcag cagttacaaa ctcaagaagg 50

Claims (9)

  1. 형광 공여체가 도입된 L-글루타민-결합 단백질; 및 형광 수용체 단백질을 포함하는, L-글루타민 검출용 FRET 센서로서,
    상기 형광 공여체는 L-(7-하이드록시쿠마린-4-yl)에틸글리신, 3-(6-아세틸나프탈렌-2-yl아미노)-2-아미노프로피온산, 아리코돈-2-yl알라닌, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 비천연 아미노산을 포함하며,
    상기 형광 수용체 단백질은 녹색 형광체 단백질 (GFP), 변형된 녹색 형광체 단백질 (mGFP), 증강된 녹색 형광체 단백질 (eGFP), 적색 형광체 단백질 (RFP), 변형된 적색 형광체 단백질 (mRFP), 증강된 적색 형광체 단백질 (eRFP), 청색 형광체 단백질 (BFP), 변형된 청색 형광체 단백질 (mBFP), 증강된 청색 형광체 단백질 (eBFP), 황색 형광체 단백질 (YFP), 변형된 황색 형광체 단백질 (mYFP), 증강된 황색 형광체 단백질 (eYFP), 남색 형광체 단백질 (CFP), 변형된 남색 형광체 단백질 (mCFP), 증강된 남색 형광체 단백질 (eCFP), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것이며,
    상기 L-글루타민-결합 단백질은 서열번호 2를 포함하는 것이고, 상기 형광 공여체는 상기 서열번호 2의 L-글루타민-결합 단백질 내 F136 또는 N138 위치에 도입된 것인,
    L-글루타민 검출용 FRET 센서.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 형광 수용체 단백질은 상기 L-글루타민-결합 단백질의 N-말단에 연결된 것인, L-글루타민 검출용 FRET 센서.
  7. 제 1 항 또는 제 6 항에 따른 L-글루타민 검출용 FRET 센서를 이용하는, L-글루타민의 검출 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    L-글루타민의 농도에 따른 상기 FRET 센서의 FRET 비율의 변화를 측정함으로써 L-글루타민을 검출하는 것인, L-글루타민의 검출 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 6 항에 따른 L-글루타민 검출용 FRET 센서를 포함하는, L-글루타민 검출용 조성물.
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Amanda Mitchell, ‘Development of a Novel Genetically Encoded FRET System Using the Unnatural Amino Acid Anap, Boston College Morrissey College of Arts and Sciences Graduate School, 2016.08.*
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