JP6257771B2 - ピルビン酸濃度の定量のための遺伝的にコードされたプローブ、およびその使用方法。 - Google Patents
ピルビン酸濃度の定量のための遺伝的にコードされたプローブ、およびその使用方法。 Download PDFInfo
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Description
本発明は、試料、組織、細胞区画および細胞レベル下の(subcellular)区画において、高い空間分解能および高い時間分解能で、ピルビン酸を検出および定量するための、新規の光学ツールに関する。これは、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)に基づいたピルビン酸センサーであり、当該センサーは、任意の適切なドナー蛍光タンパク質部分およびアクセプター蛍光タンパク質部分の間に、細菌のPdhR転写因子を含んでいる。本発明はまた、ピルビン酸輸送体の活性の定量のための、細胞のピルビン酸生産速度およびピルビン酸消費速度の定量のための、ならびに無傷な細胞におけるミトコンドリアのピルビン酸消費速度の直接の定量のための、この新規の光学ツールの使用方法に関する。
〔本発明の背景〕
ピルビン酸は有機化合物であり、原核生物および真核生物を含む、すべての細胞の代謝に関係する。ピルビン酸は代謝の中心であり、解糖およびミトコンドリアの代謝の交差点に位置しており、そして多数の細胞の生合成経路のための開始代謝産物である。ピルビン酸は、現今、食糧補完物として、体重管理用サプリメントおよび抗酸化剤として製造されるように、または化学産業、製薬産業および農芸化学産業において広く適用される開始物質の様に使用されているように、際立って産業上関心がある分子である。ピルビン酸は、抗酸化特性を有しており、そしてミトコンドリアの酸化還元容量を調節すると考えられている。ピルビン酸の代謝は、糖尿病、神経変性状態、および癌を含む病気の状態において変化するため、ピルビン酸は高い生物医学的関心がある。
解決されるための技術的課題
本発明の主題は、遺伝的にコードされたプローブ(genetically encoded probe)を提供することであり、これは、高い感度で、低侵襲的にピルビン酸の測定を可能とし、測定の間にピルビン酸を消費しない。さらに上記プローブは、先行技術に関して最も関連性のある貢献の部分として、改良された空間時間的分解能で、試料において、細胞において、および細胞レベル下の区画において、ピルビン酸を測定するために使用されることが可能である。さらに、本発明の主題は、遺伝的にコードされたプローブを使用するピルビン酸の測定方法、ピルビン酸輸送体の活性を測定するための方法、細胞のピルビン酸生産およびピルビン酸消費の速度を測定するための方法、ならびに無傷な細胞においてミトコンドリアによるピルビン酸消費速度を測定するための方法、を提供することである。
本発明の第一の実施形態において、発明者らは、ピルビン酸レベルの効率的な測定のために、遺伝的にコードされたプローブ(本明細書において、「ピロニック」とも言われる)を作製した。このプローブはピルビン酸のために特別に設計された。さらに、ピロニックは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に基づいたセンサーであり、蛍光タンパク質mTFPおよびVenusの間に挟まれた細菌のPdhR転写因子から構成される。ピロニックは、107±13μMのピルビン酸に対するみかけの解離定数を伴う単相の用量反応曲線を示し、当該ピロニックは10μMと1mMとの間のピルビン酸の正確な定量を可能にする。この濃度は、正常細胞および病気の細胞において見出されたピルビン酸の濃度範囲に及んでいる。この発明はまた、ピルビン酸輸送体活性の測定方法、ならびに二つの代謝速度の測定方法、ピルビン酸生産/消費速度の測定方法、および無傷な細胞におけるミトコンドリアによるピルビン酸消費速度の測定方法を含む。これらの方法は、単一の細胞もしくは細胞集団に対して、浮遊状態の細胞もしくは接着細胞に対して、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片に対して適用されることが可能であるか、または当該方法はまた、インビボの動物組織に対して適用されることが可能である。上述した方法は、個々の原核細胞または個々の真核細胞におけるピロニックの発現を含み、そしてまた、溶液中における自由分子として、または基質に付着した自由分子としての当該ピロニックの使用を含む。
−ピルビン酸の、および/またはピルビン酸生産速度もしくはピルビン酸消費速度の、および/またはミトコンドリアのピルビン酸消費速度の、測定のためのシステムを供給するステップ。上記システムは、単一の細胞もしくは細胞集団において、浮遊状態の細胞もしくは接着細胞において、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片において、またはインビボの動物組織において使用されることが可能である。上記センサーはまた、溶液中における自由分子として、または基質に付着した自由分子として、使用されることが可能である;
−個々の細胞において、および/またはミトコンドリアのような細胞レベル下の区画において、または自由分子もしくは基質に付着した自由分子として、ピルビン酸センサー、ピロニックを発現させるステップ;
−制御された条件においてセンサーを較正するステップ;
−種々の濃度の細胞外のピルビン酸に細胞を曝すことによって、ピルビン酸輸送体の活性を測定するステップ;
−ピルビン酸の定常状態を下記の方法によって崩壊させることによって、代謝速度を測定するステップ:
−ミトコンドリアによるピルビン酸消費の瞬間速度を測定するための、ミトコンドリアピルビン酸輸送体の遮断薬の添加、および/または
−ミトコンドリアのピルビン酸消費速度の長期にわたる測定を授けるための、唯一、ピルビン酸の存在における、MCT阻害剤の添加;
−センサーからの出力を記録し、異なる時間において対応するピルビン酸濃度を算出するステップ;および
−輸送速度および代謝速度を決定するステップ。
本発明は、添付されている図面によって説明され、当該図面は下記のとおりである:
図1は、Escherichia coli(E.coli)からの転写制御因子PdhRの予測される三次元構造を示す。
図2は、E.coliからのPdhRのアミノ酸配列を示す。
図3は、ピルビン酸センサーの構築のための一般的な計画を概略的に説明する。
図4は、ピルビン酸センサーの4つの変異体のアミノ酸配列(A)およびDNA配列(B)を示す。
図5は、ピルビン酸センサーの4つの変異体の、ピルビン酸に対する応答を示し、最も反応するセンサーはピロニックと名付けられている。
図6は、ピロニックの蛍光発光のスペクトルに対するピルビン酸の影響を示す。
図7は、増加する濃度のピルビン酸に対する応答における、ピロニックの蛍光率の変化を提示する。
図8は、ピルビン酸へのピロニックの応答に対する、pHの影響を示す。
図9は、ピロニックの蛍光率に対する、種々の分子の影響を示す。
図10は、ピルビン酸へのピロニックの応答に対する、種々の分子の影響を示す。
図11は、ピルビン酸へのピロニックの応答に対する、種々の分子の影響を示す。
図12は、ピルビン酸へのピロニックの応答に対する、異なる濃度のクエン酸の影響を示す。
図13は、ピルビン酸へのピロニックの応答に対する、酸化還元電位の影響を示す。
図14は、E.coliの異なる二つの系統、DH5αおよびBL21において発現させたピロニックの蛍光率に対する、細胞外のピルビン酸の影響を示す。
図15は、HEK293細胞、培養された神経細胞、培養された星状細胞、および脳組織における星状細胞において発現されたピロニックを示す。
図16は、ピルビン酸なしに、または1mMピルビン酸と共に、それぞれ、細胞を培養することにより、ΔRo値、およびΔRmax値を得る方法を示す。
図17は、ピロニックを用いて、細胞内のピルビン酸の定量的推定のための、2点較正の手順を説明する。公式において、R0およびΔRmaxは表示される。
図18は、HEK293細胞によるピルビン酸取り込みの時間的経過、およびモノカルボン酸輸送体の公知の遮断薬によるピルビン酸取り込みの阻害を示す。
図19は、対照群のHEK293細胞、およびモノカルボン酸輸送体の公知の遮断薬と共に前処理された細胞における、ピルビン酸取り込み速度を要約する。
図20は、哺乳類細胞におけるピルビン酸のための主な生化学経路、およびいくつかの輸送体遮断薬を描写する。
図21は、HEK293細胞における細胞内ピルビン酸生産速度の測定を説明する。
図22は、時間依存的な様式において、グルコース欠乏がどのようにHEK293細胞によるピルビン酸生産速度を減少させるかを示す。
図23は、HEK293細胞において、細胞膜のモノカルボン酸輸送体の阻害剤を用いる、ミトコンドリアのピルビン酸消費速度の測定を説明する。
図24は、HEK293細胞において、ミトコンドリアのピルビン酸消費速度に対する、ミトコンドリアの呼吸作用の遮断薬の阻害効果を示す。
本発明は、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)に基づいたピルビン酸センサーに言及し、当該センサーは、共同してFRETにおけるドナー部分およびアクセプター部分としての機能を果たすことが可能である任意の適切なドナー蛍光タンパク質部分およびアクセプター蛍光タンパク質部分の間に、細菌のPdhR転写因子を含み、単一の細胞もしくは細胞集団において、接着細胞もしくは浮遊状態で、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片においてまたはインビボの動物組織において、発現され得る。また、本発明は、ピルビン酸の測定方法に関し、当該方法は、下記のステップを含む:
a.本発明のFRETに基づいたピルビン酸センサーを、所望の宿主において(例えば、単一の細胞もしくは細胞集団、接着細胞もしくは浮遊状態で、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片において、またはインビボの動物組織において)発現させるステップ;
b.上記宿主を細胞内、細胞外、細胞レベル下のピルビン酸濃度のあらかじめ定められた値を用いて較正し、ピルビン酸濃度を、時間に合わせて記録するステップ;
c.上記細胞におけるピルビン酸の定常状態を崩壊させるステップ;
d.異なる時間点における上記ピルビン酸濃度を算出している上記センサーからの出力を記録し、輸送速度を決定するステップ。
a.本発明のFRETに基づいたピルビン酸センサーを、所望の宿主において(例えば、単一の細胞もしくは細胞集団、接着細胞もしくは浮遊状態で、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片において、またはインビボの動物組織において)発現させるステップ;
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c.上記細胞におけるピルビン酸の定常状態を崩壊させるステップ;
d.異なる時間点における上記ピルビン酸濃度を算出している上記センサーからの出力を記録し、輸送速度を決定するステップ。
a.本発明のFRETに基づいたピルビン酸センサーを、所望の宿主において(例えば、単一の細胞もしくは細胞集団、接着細胞もしくは浮遊状態で、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片において、またはインビボの動物組織において)発現させるステップ;
b.上記宿主を細胞内、細胞外、細胞レベル下のピルビン酸濃度のあらかじめ定められた値を用いて較正し、ピルビン酸濃度を、時間に合わせて記録するステップ;
c.上記細胞におけるピルビン酸の定常状態を崩壊させるステップ;
d.異なる時間点における上記ピルビン酸濃度を算出している上記センサーからの出力を記録し、輸送速度を決定するステップ。
1. N末端に位置したmTFP(ドナー)、続いて、リンカー1、PdhR、リンカー2、およびC末端に位置したVenus(アクセプター)(アミノ酸配列、配列番号1;核酸配列、配列番号5);
2. N末端に位置したmTFP(ドナー)、続いて、PdhR、リンカー2、およびC末端に位置したVenus(アクセプター)(アミノ酸配列、配列番号2;核酸配列、配列番号6);
3. N末端に位置したmTFP(ドナー)、続いて、リンカー1、PdhR、およびC末端に位置したVenus(アクセプター)(アミノ酸配列、配列番号3;核酸配列、配列番号7);
4. N末端に位置したmTFP(ドナー)、続いて、PdhRおよびC末端に位置したVenus(アクセプター)(アミノ酸配列、配列番号4;核酸配列、配列番号8)。
a) 本発明のセンサーを、所望の宿主において(例えば、単一の細胞もしくは細胞集団、接着細胞もしくは浮遊状態で、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片において、またはインビボの動物組織において)、発現させるステップ;
b) 上記宿主を細胞内、細胞外、細胞レベル下のピルビン酸濃度のあらかじめ定められた値を用いて較正し、ピルビン酸濃度を、時間に合わせて記録するステップ;
c) 上記細胞に入り込んでいるピルビン酸の定常状態を崩壊させるステップ;
d) 異なる時間点における上記ピルビン酸濃度を算出している上記センサーからの出力を記録するステップ。
本発明の理解を助けるために、本発明は、具体的な実施例を参照して説明されるだろう。
細胞と間隙空間との間のピルビン酸の交換を制御することによって、MCTは、組織代謝の節点である。MCTは、ピルビン酸およびプロトンの化学量論的な移動を触媒し、その活性は、BCECFのような色素を用いて細胞内のpHを観測することによって、単一細胞の解像度にて、測定することが可能である。しかし、99.9%のプロトンは、タンパク質、リン脂質および他の部位に結合されており、且つ、当該プロトンは、MCT以外の多くの輸送体を通じて交換されて、pHを、ピルビン酸のための不十分な代理とする。星状細胞において発現させたとき、本発明のピルビン酸センサーは細胞外のピルビン酸に良好に応答し、このことはピルビン酸の流入および流出の実時間の観測を可能にする(図16〜17)。MCTによって仲介された過程と一致して、1mMのピルビン酸の星状細胞の取り込みの初速度は、特異的MCT遮断薬AR−C155858(1μM)の存在下で、および広く特異的なMCT遮断薬フロレチン(50μM)の存在下で、強く阻害された(図18および図19)。したがって、ピルビン酸センサーを、MCT活性を測定するために使用することが可能である。ピルビン酸はまた、ギャップ結合を通って(Rouach et al., 2008)、そして、おそらくは、コネキシンヘミチャネル、パネキシンチャネルおよび他のチャネルならびにpH測定によって不可視であり且つ本発明のセンサーを用いて現在では測定することができる流動によって、プロトンとは無関係に輸送される場合がある。また、MCT活性を、現在の乳酸センサー(San Martin et al., 2013)を用いて、乳酸の流量を測定することによって調査してもよい。しかし、MCTの異なるアイソフォームは、乳酸およびピルビン酸に対する相対的な特異性が異なるため、乳酸測定は、ピルビン酸輸送の流量に関しては不明瞭である場合がある。例えば、MCT1およびMCT2は、乳酸よりもピルビン酸の輸送においてすぐれており、MCT4は、乳酸の輸送においてすぐれている。ところが、MCTアイソフォームの発現は、細胞型間および異なる生理学的状態中の細胞型の中において、変化する(Halestrap and Price, 1999)。
図20における略図は、ピルビン酸の細胞内の濃度が、解糖によるピルビン酸の生産、LDHおよびミトコンドリアによるピルビン酸の消費、ならびにMCTを通したピルビン酸の排出の間の動的平衡によって、どのように決定されているかを説明する。ピルビン酸を排出している細胞において、MCTの遮断薬の添加による定常状態の混乱は、ピルビン酸の蓄積を引き起こすことが予想される。原理の証明として、HEK293細胞におけるピルビン酸の排出は、AR−C155858(1μM)を用いて遮断され、ピルビン酸生産を示す、細胞内のピルビン酸における予想された増加を引き起こした(図21)。図22は、細胞外のグルコースの非存在下において、細胞のピルビン酸生産速度における重大な減少があることを示す;これは、ピルビン酸はグルコースから生産されるという十分に確立された概念と一致する。
ピルビン酸は、主なミトコンドリアの基質である。無傷の細胞において、または単一の細胞において、または実時間において、高い空間時間分解能でミトコンドリアによるピルビン酸消費速度を測定するための現在利用可能な方法はない(Brand and Nicholls, 2011)。無傷の細胞において、単一の細胞において、および実時間において、ピルビン酸センサーを用いてミトコンドリアのピルビン酸消費を測定するために;細胞をグルコースの欠乏状態とし、そして高い細胞外濃度のピルビン酸の存在下で細胞を培養し、乳酸の細胞内濃度が無視できる条件とした(San Martin et al., 2013)。そのような条件下では、細胞の中へのピルビン酸の流入とミトコンドリアのピルビン酸消費とが同等になるため、定常状態は、ピルビン酸の細胞質基質の濃度が一定にとどまる状態になる。表面のMCT遮断薬AR−C155858を用いた、定常状態の遮断は、ミトコンドリアのピルビン酸消費速度と同等である速度での細胞質基質のピルビン酸濃度における降下を結果として引き起こし(図23)、これは、ミトコンドリアの呼吸の可逆的な遮断薬であるアジ化ナトリウムによって効果的に阻害されることが可能である(図24)。
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Claims (12)
- フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)において共同してドナー部分およびアクセプター部分としての機能を果たすことが可能である任意の適切なドナー蛍光タンパク質部分およびアクセプター蛍光タンパク質部分の間に、細菌のPdhR転写因子を含んでいる、FRETに基づいたピルビン酸センサーであり、単一の細胞もしくは細胞集団において、接着細胞もしくは浮遊状態で、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片においてまたはインビボの動物組織において、発現され得て、次の配列番号に示すアミノ酸配列のいずれかと少なくとも90%の配列同一性を有している、FRETに基づいたピルビン酸センサー;
配列番号1、配列番号2、配列番号3、および配列番号4。 - フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)において共同してドナー部分およびアクセプター部分としての機能を果たすことが可能である任意の適切なドナー蛍光タンパク質部分およびアクセプター蛍光タンパク質部分の間に、細菌のPdhR転写因子を含んでいる、FRETに基づいたピルビン酸センサーであり、単一の細胞もしくは細胞集団において、接着細胞もしくは浮遊状態で、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片においてまたはインビボの動物組織において、発現され得て、次の配列番号に示す核酸配列のいずれかと少なくとも90%の配列同一性を有している核酸配列によってコードされている、FRETに基づいたピルビン酸センサー;
配列番号5、配列番号6、配列番号7、および配列番号8。 - 上記蛍光タンパク質部分は、mTFPおよびVenusである、請求項1または2に記載のFRETに基づいたピルビン酸センサー。
- ピルビン酸の測定方法であり、下記のステップを含む方法:
a.請求項1から3の何れか1項に記載のFRETに基づいたピルビン酸センサーを、所望の宿主において(例えば、単一の細胞もしくは細胞集団、接着細胞もしくは浮遊状態で、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片において、またはインビボの動物組織において)発現させるステップ;
b.上記宿主を細胞内、細胞外、及び細胞レベル下のピルビン酸濃度のあらかじめ定められた値を用いて較正し、ピルビン酸濃度を、時間に合わせて記録するステップ;
c.上記細胞におけるピルビン酸の定常状態を崩壊させるステップ;
d.異なる時間点における上記ピルビン酸濃度を算出している上記センサーからの出力を記録し、輸送速度を決定するステップ。 - ステップb)において、上記FRETに基づいたピルビン酸センサーは、細胞において、ピルビン酸およびグルコースの非存在下において得られた蛍光率の最小値、飽和濃度のピルビン酸に上記細胞を曝すことによって得られた蛍光率の最大値、およびインビトロで得られた上記センサーの親和定数KD、を用いて較正される、請求項4に記載のピルビン酸の測定方法。
- ステップc)において、上記細胞に入り込んでいるピルビン酸の定常状態の崩壊は、ピルビン酸の上記細胞外濃度を変更することによって、すなわち上記細胞をピルビン酸に曝すことによって実行される、請求項5に記載のピルビン酸の測定方法。
- ピルビン酸生産速度または消費速度の測定方法であり、下記のステップを含む方法:
a.請求項1から3の何れか1項のFRETに基づいたピルビン酸センサーを、所望の宿主において(例えば、単一の細胞もしくは細胞集団、接着細胞もしくは浮遊状態で、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片において、またはインビボの動物組織において)発現させるステップ;
b.上記宿主を細胞内、細胞外、及び細胞レベル下のピルビン酸濃度のあらかじめ定められた値を用いて較正し、ピルビン酸濃度を、時間に合わせて記録するステップ;
c.上記細胞におけるピルビン酸の定常状態を崩壊させるステップ;
d.異なる時間点における上記ピルビン酸濃度を算出している上記センサーからの出力を記録し、輸送速度を決定するステップ。 - ステップb)において、上記FRETに基づいたピルビン酸センサーは、細胞において、ピルビン酸およびグルコースの非存在下において得られた蛍光率の最小値、飽和濃度のピルビン酸に上記細胞を曝すことによって得られた蛍光率の最大値、およびインビトロで得られた上記センサーの親和定数KD、を用いて較正される、請求項7に記載のピルビン酸生産速度または消費速度の測定方法。
- ステップc)において、上記ピルビン酸の定常状態は、ピルビン酸輸送体の遮断薬の添加によって崩壊させられ、当該遮断薬の添加は、細胞内のピルビン酸の濃度の度合の増加を引き起こし、当該増加の初速度は、上記定常状態における細胞のピルビン酸の生産速度と同等であり;または細胞内のピルビン酸濃度の減退を引き起こし、当該減退の初速度は、上記定常状態における細胞のピルビン酸の消費速度と同等である、請求項7に記載のピルビン酸生産速度または消費速度の測定方法。
- ミトコンドリアのピルビン酸消費速度の測定方法であり、下記のステップを含む方法:
a.請求項1から3の何れか1項のFRETに基づいたピルビン酸センサーを、所望の宿主において(例えば、単一の細胞もしくは細胞集団、接着細胞もしくは浮遊状態で、細胞培養物、組織培養物、混合細胞培養物、組織外植片において、またはインビボの動物組織において)発現させるステップ;
b.上記宿主を細胞内、細胞外、及び細胞レベル下のピルビン酸濃度のあらかじめ定められた値を用いて較正し、ピルビン酸濃度を、時間に合わせて記録するステップ;
c.上記細胞におけるピルビン酸の定常状態を崩壊させるステップ;
d.異なる時間点における上記ピルビン酸濃度を算出している上記センサーからの出力を記録し、輸送速度を決定するステップ。 - ステップb)において、上記FRETに基づいたピルビン酸センサーは、細胞において、ピルビン酸およびグルコースの非存在下において得られた蛍光率の最小値、飽和濃度のピルビン酸に上記細胞を曝すことによって得られた蛍光率の最大値、およびインビトロで得られた上記センサーの親和定数KD、を用いて較正される、請求項10に記載のミトコンドリアのピルビン酸消費速度の測定方法。
- ステップc)において、ピルビン酸定常状態の崩壊は、上記ミトコンドリアのピルビン酸輸送体の遮断薬の添加によるものであり、ミトコンドリアによるピルビン酸の消費速度と同等である細胞内のピルビン酸の濃度の減少を引き起こす、請求項10に記載のミトコンドリアのピルビン酸消費速度の測定方法。
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