KR102359333B1 - 디페닐보란 유도체를 포함하는 피루베이트 검출 센서, 이를 포함하는 피루베이트 검출용 형광 이미징 센서, 및 이를 이용한 피루베이트 검출 방법 - Google Patents

디페닐보란 유도체를 포함하는 피루베이트 검출 센서, 이를 포함하는 피루베이트 검출용 형광 이미징 센서, 및 이를 이용한 피루베이트 검출 방법 Download PDF

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이강봉
남윤식
윤수진
이소영
박하나
이연희
라잘락시미 카나가라즈
무수사미 셀바라즈
쉬 유안구오
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Abstract

본 명세서에서는 생체시료에서 피루베이트(Pyruvate)의 농도를 측정하기 위한, 디페닐보란 유도체를 포함하는 피루베이트 검출 센서, 이를 포함하는 피루베이트 검출용 형광 이미징 센서, 및 이를 이용한 피루베이트 검출 방법이 개시된다.

Description

디페닐보란 유도체를 포함하는 피루베이트 검출 센서, 이를 포함하는 피루베이트 검출용 형광 이미징 센서, 및 이를 이용한 피루베이트 검출 방법 {PYRUVATE DETECTION SENSOR INCLUDING DIPHENYLBORANE DERIVATIVES, FLUORESCENCE IMAGING SENSOR FOR PYRUVATE DETECTION INCLUDING THE SAME, AND PYRUVATE DETECTION METHOD USING THE SAME}
본 명세서는 디페닐보란 유도체를 포함하는 피루베이트 검출 센서, 이를 포함하는 피루베이트 검출용 형광 이미징 센서, 및 이를 이용한 피루베이트 검출 방법에 관한 것인다.
보다 상세하게는, 디페닐보란(Diphenylborane) 유도체를 기반으로 하여 혈액이나 뇨와 같은 생체 시료에서 피루베이트(Pyruvate)의 농도를 측정하기 위한 검출 센서, 이를 포함하는 피루베이트 검출용 형광 이미징 센서, 및 이를 이용한 피루베이트 검출 방법에 관한 것이다.
피루베이트는 모든 세포의 신진 대사 (Metabolism)에 참여하는 유기화합물로서, 다이어트 보조식품, 항산화제로서 제약 산업 등에 폭넓게 활용이 가능하다. 또한, 당뇨병, 신경퇴행성 질환, 간질환, 그리고 암 등에 걸렸을 경우에 오는 신진대사에 급격한 변화에 농도 변화가 오는 물질로 알려져 있다. 따라서, 피루베이트에 대한 농도 측정은 상기의 각종 질환 진단에 중요한 바이오 마커로 작용한다고 할 수 있다.
한편, 피루베이트 (Pyruvate) 는 세포간 및 세포와 세포 밖 공간 내에서의 동적 흐름 상태에 있다. 피루베이트는 살아있는 세포 내에 존재하므로, 세포를 파괴하지 않고 농도를 측정하기는 사실상 어렵다.
피루베이트를 측정하기 위한 방법으로 광학 측정법이나 전기화학적인 방법에 의한 효소 반응에 의한 방법이 제시되었는데, 이는 프로브가 생체 시료인 단백질 등을 대상으로 하기 때문에 온도, pH, 주변 환경 오염에 민감하므로 검출 시 주의 해야 한다.
따라서, 단백질과 달리 다루기 쉽고, 검출 한계가 낮은 피루베이트 검출 센서의 개발이 요구된다.
US 9095312 B2
본 발명의 일 측면에서, 디페닐보란(Diphenylborane) 유도체를 이용하여, 상기의 각종 질환에 대한 바이오 마커인 피루베이트(Pyruvate)를 빠르고 쉽게 검출하고자 한다.
본 발명의 또다른 일 측면에서, 검출 센서의 형광 변화를 이미지화 하여, 피루베이트의 존부 및 농도를 쉽게 알 수 있는 형광 이미징 센서를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 피루베이트 검출 센서를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112021027073949-pat00001
본 발명의 또다른 구현예에서, 전술한 피루베이트 검출 센서를 포함하는 농도 측정부; 및 농도 측정 결과를 형광 이미지로 나타내는 표시부;를 포함하는 피루베이트 검출용 형광 이미징 센서를 제공한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 전술한 피루베이트 검출 센서를 준비하는 단계; 상기 피루베이트 검출 센서와 분석 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 반응 이후, 상기 피루베이트 검출 센서의 형광 변화를 측정하여 피루베이트를 검출하는 단계;를 포함하는, 피루베이트 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 구현예들에 따르면, 살리실알데하이드에 아미노퀴놀린이 결합된 디페닐보란 유도체 화합물 (Aminoquionoline-conjugated salicyladehyde diphenylborane derivative, QSB)을 혈액이나 뇨중의 피루베이트와 반응시켜 형광 변화를 측정하는 프로브로 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 피루베이트 검출 센서는 루이스 산-염기 인지 메커니즘을 포함하는 비율 계량 형광을 통하여, 당뇨병, 퇴행성 신경질환, 간질환 및 암 관련 증상에 관한 바이오마커로 임상 연구에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 피루베이트(Pyruvate)와 QSB의 반응으로 QS 형성 경로의 개략적 메커니즘을 그린 그림이다.
도 2는 QSB의 1H NMR, 13C NMR, HR-mass 스펙트럼과 피루베이트와 반응한 HR-mass 스펙트럼이다.
도 3은 QSB의 합성 경로의 개략도이다.
도 4는 (A) 2 vol% DMSO를 포함하는 pH 7.2에서 0.2 M Hepes 완충액에서 50 μM의 QSB에 대해 얻은 각 3 μM 피루베이트 첨가로 인한 UV-Vis 스펙트라 및 (B) 여기 파장 (Excitation wavelength) (330 ~ 370 nm)에서 2 vol% DMSO를 포함하는 pH 7.2의 0.2 M Hepes 버퍼 용액에서 20 μM QSB에 대해 얻은 형광 스펙트라이다.
도 5는 1 μM의 피루베이트를 첨가할 때마다 2 vol% DMSO를 포함하는 pH 7.2에서 0.2M Hepes 버퍼 용액에서 20 μM QSB에 대해 얻은 형광 스펙트라이다.
도 6은 (A) QSB의 1H NMR 스펙트럼, (B) 피루베이트와 반응 후 QS 생성물의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 7은 QSB 및 QS의 Highest Occupied Molecular Orbital (HOMO) 및 Lowest Unoccupied Molecular Orbital (LUMO)의 분자 궤도 함수이다.
도 8은 (A) QSB 용액, 피루베이트와 6.5 mM의 포도당, 과산화수소, 구연산염, 글루타메이트, 아세테이트, 인산염, 질산염, 숙신산염, 아황산염, 푸마르산염, 벤조산염 및 과염소산염의 형광 스펙트럼과, (B) 13 μM의 피루베이트에 6.5 mM의 위에서 언급 한 카르복실산 염을 첨가한 스펙트럼이다. (C) 피루베이트 검출에 대한 QSB의 선택성 및 간섭 막대 차트 표현과, 이의 (D) 선택성 및 (E) 간섭 분석에 대해 얻은 해당 사진 이미지이다.
도 9a-9c은 (9a) pH 3~10에서 2 vol% DMSO를 포함하는 0.2 M Hepes 버퍼 용액에서 20 μM의 QSB에 대해 485 nm (검은 색 선), 715 nm (빨간색 선)에서 관찰된 방출 강도, (9b) 다른 농도 (2, 5, 8, 10 및 13)와 함께 2 vol% DMSO를 포함하는 pH 7.2에서 0.2 M Hepes 버퍼 용액에서 20 μM의 QSB에 대해 관찰 된 형광 방출 강도 비율의 시간 경과 실험 결과 도표와 (9c) 2 vol% DMSO을 포함하는 pH 7.2의 0.2 M Hepes 버퍼 용액에서 프로브 QSB의 다른 농도 (0, 10, 20, 30, 50, 70, 100 및 130 μM-도 9c 그래프 가로축에서 순서대로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8로 표시됨)에서 프로브 QSB의 세포 독성 효과 분석을 위해 얻은 MTT 분석 (3-(4, 5-dimethyl thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetra zolium bromide Assay) 결과이다.
도 10는 Hela 세포 공초점 형광 현미경 이미지로 (A) 2 vol%의 bio-DMSO를 포함하는 pH 7.2에서 0.2 M Hepes 버퍼 용액에서 20 μM QSB와 함께 배양된 Hela 세포이며, 그리고 이에 (B 내지 D)는 3, 8 및 12 μM의 피루베이트 및 (E) 12 μM의 피루 베이트 (적색 채널)을 첨가하여, 미토-트래커(mito-tracker)의 그린 (녹색 채널) 및 그것들의 병합 (Merge)된 이미지이다.
본 명세서에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 구현예들을 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 본 발명의 구현예들이 첨부된 도면을 참고로 설명되었으나 이는 예시를 위하여 설명되는 것이며, 이것에 의해 본 발명의 기술적 사상과 그 구성 및 적용이 제한되지 않는다.
피루베이트 검출 센서
본 발명의 예시적인 구현예들에서는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 피루베이트 검출 센서를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112021027073949-pat00002
본 명세서에서 “피루베이트 검출 센서”란, 시료 내의 피루베이트의 존재 유무를 검출하는 센서뿐만 아니라, 시료 내의 피루베이트의 농도를 정량적으로 측정하고, 세포 이미징을 할 수 있는 형광 측정 센서를 모두 포괄한다.
피루베이트의 정량적 검출시 상기 화학식 1의 화합물이 피루베이트와 반응하면서, 강한 녹색 형광의 강도가 감소한다. 이는 QSB가 피루베이트와 반응하면서 QS로 변화되어 나타나는 현상이며, 이때 QS (Aminoquionoline- conjugated salicyladehyde)는 QSB에서 디페닐보란 성분이 분리되면서, 변화된 화합물이다.
대신에 적색 형광의 강도가 증가하는 비율계량 형광(Ratiometric Emission)을 발생시키게 되고, 루이스 산-염기 인지 메커니즘을 포함하는 비율 계량 형광을 통하여 피루베이트를 검출할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 피루베이트가 반응하여, 적색의 형광이 발현될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 피루베이트가 반응하여, 700 nm 내지 750 nm 에서 형광 강도가 증가할 수 있다. 예컨대, 715 nm의 적색 형광의 세기가 발현될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 피루베이트 검출 센서는 pH 6 내지 8에서 피루베이트를 검출할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 피루베이트 검출 센서는 상온 내지 37 ℃ 에서 피루베이트를 검출할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 피루베이트 검출 센서는 세포 내의 피루베이트를 검출할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 화학식 1로 표시되는 디페닐보란 유도체가 세포 내 주입되어 세포 내 존재하는 피루베이트와 직접 반응하여 형광 이미지를 발현할 수 있다. 이는 세포를 파괴하고 세포 내 물질을 추출하는 기존 방식과 차이가 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 피루베이트 검출 센서는 인체의 체내로부터 분리된 생체 시료 내의 피루베이트를 검출할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 생체 시료는 인체의 체내로부터 분리된 인체의 체액 및 혈액 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 피루베이트 검출 센서는 15 분 이내에 피루베이트 검출 결과를 나타낼 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 피루베이트 검출 센서의 검출한계는 0.1 μM 일 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 피루베이트 검출 센서의 색상 변화는 육안으로 측정되거나, 형광 광도계로 정량적으로 측정될 수 있다. 또는 분광 광도계로도 측정될 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 전술한 피루베이트 검출 센서를 포함하는 농도 측정부; 및 농도 측정 결과를 형광 이미지로 나타내는 표시부;를 포함하는 피루베이트 검출용 형광 이미징 센서를 제공한다.
피루베이트 검출 방법
본 발명의 또다른 구현예에서, 전술한 피루베이트 검출 센서를 준비하는 단계; 상기 피루베이트 검출 센서와 분석 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 반응 이후, 상기 피루베이트 검출 센서의 형광 변화를 측정하여 피루베이트를 검출하는 단계;를 포함하는, 피루베이트 검출 방법을 제공한다.
예시적인 구현예에서, 상기 반응시키는 단계는, 상기 피루베이트 검출 센서와 분석 시료를 반응 챔버에 투입하는 단계; 상기 반응 챔버 내의 pH 및 온도 중 하나 이상을 조절하는 단계; 및 상기 반응 챔버 내에서 상기 피루베이트 검출 센서와 분석 시료를 반응시키는 단계; 를 포함할 수 있다.
피루베이트는 당뇨병, 퇴행성 신경질환, 간질환 및 암을 포함하는 병리학적인 조건에서 물질대사가 변화할 수 있어, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 질환의 조기 진단이 가능하다고 할 수 있다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 살리실알데하이드에 아미노퀴놀린이 결합된 디페닐보란 유도체 화합물 (Aminoquionoline-conjugated salicyladehyde diphenylborane derivative, QSB) 프로브 제조
[화학식 1]
Figure 112021027073949-pat00003
상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 피루베이트 검출 센서가 피루베이트와 반응하는 경우, 새로운 파장의 형광이 발현될 수 있으며, 구체적으로 적색 형광이 발현될 수 있다.
제조예 1) 4-(Diethylamino)-2-((diphenylboryl)oxy)benzaldehyde의 합성
QSB의 상세한 합성 경로 방식은 반응식 도 1에 묘사되었다. 4-(Diethylamino)salicylaldehyde(1) (250.90 mg, 1.30 mmol), Bromodiphenyl borane(2) (318.40 mg, 1.30 mmol)의 혼합물을 실온에서 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF)에 용해시키고 12 시간 동안 교반하였다.
생성된 혼합물을 에틸 아세테이트 (EtOAc)/물에 녹인 후 유기 용매를 분리하고 수집 된 용매를 MgSO4를 사용하여 건조시켰다.
진공 증발기로 용매를 제거하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (헥산:EtOAc = 6:1)로 정제하여 백색 고체 (310.80 mg, 87 %)를 얻었다. 백색 고체 파우더의 NMR 측정 결과는 하기와 같다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d 1 ) δ10.46 (s, 1 H), 7.70 - 7.75 (m, 5 H), 7.37 - 7.41 (m, 6 H), 6.21 (dd, J = 1.8, 9.0 Hz, 1 H), 5.56 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 2.93 (q, J = 7.1 Hz, 4 H), 0.76 (t, J = 7.1 Hz, 6 H).
제조예 2) (E)- N -(4-(diethylamino)-2-((diphenylboryl)oxy)benzylidene)quinolin-8-amine (QSB) 합성
8-Aminoquinoline (92.30 mg, 0.64 mmol) 및 4-(Diethylamino)-2- ((diphenylboryl)oxy) benzaldehyde (3) (300.00 mg, 0.70 mmol)를 건조 EtOH에 용해시키고 반응 혼합물을 12 시간 환류하였다.
생성된 혼합물을 실온으로 냉각하고 진공 증발기로 용매를 제거하고 잔류물을 컬럼 크로마토그래피 (헥산:EtOAc = 4:1)로 정제하여 갈색 고체 (280.70 mg, 78.60 %)를 얻었다. 갈색 고체 파우더의 NMR 측정 결과는 하기와 같다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ8.93 (dd, J = 1.7, 4.2 Hz, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.70 (dd, J = 1.7, 4.1 Hz, 1H), 8.38 (dd, J = 1.6, 8.3 Hz, 1H), 8.16 (dd, J = 1.6, 8.3 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.65 - 7.69 (m, 5 H), 7.34 - 7.37 (m, 5 H), 7.27 (t, J = 7.9 Hz, 2H), 6.85 (dd, J = 1.2, 7.5 Hz, 1H), 6.29 (dd, J = 2.4, 8.9 Hz, 1H), 2.9 (q, J = 7.1 Hz, 4 H), 0.67 (t, J = 7.1 Hz, 6 H) (도 2A). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ167.0, 156.7, 153.4, 148.6, 146.7, 140.1, 137.7, 133.4, 131.5, 128.8, 126.6, 125.5, 123.0, 122.0, 120.1, 118.5, 117.1, 115.8, 114.6, 112.8, 45.7, 18.0 (도 2B). HR-MS m/z: calculated for C32H30BN3O, M = 483.4111, found [M+H]+ = 484.3526. (도 2C).
실시예 2: 분광학적 측정
광물리적 특성은 각각 Cary 8454 분광 광도계와 Cary Eclipse (Agilent Tech. USA)를 사용하여, UV-Vis 및 형광 스펙트럼을 통해 연구하였다.
프로브(검출 센서)의 저장용액 (Stock solution)은 각각 UV-Vis 흡수 및 형광 분광 측정을 위해 2 vol% DMSO를 포함하는 pH 7.2의 0.2 M Hepes 버퍼 용액에서 각각 50 및 20 μM의 프로브 QSB를 제조하였다.
피루베이트 분석용 물질 및 간섭 효과 물질은 2vol% DMSO 를 포함하는 Hepes 버퍼 용액에 용해하였다. 선택성 연구 (Selectivity test)는 피루베이트 및 간섭 효과 물질을 별도로 첨가하여 측정하고, 간섭 효과 (Interference Effect)를 시험하기 위해 피루베이트 및 간섭 효과 물질을 프로브 용액과 혼합하고 테스트 용액으로 포도당, 과산화수소, 구연산염, 글루타메이트, 아세테이트, 인산염, 질산염, 숙신산염, 아황산염, 푸마르산염, 벤조산염 및 과염소산염 용액을 10 ml 메스 플라스크 (Volumetric flask)에 준비하였다. (도 8)
모든 광학 스펙트럼은 실온의 석영 셀(Qartz cuvette) 에서 수행하였으며, QSB 및 QS의 기하학적 형태를 최적화하기 위한 밀도 함수 이론 (DFT) 계산은 B3LYP 방법 및 (6-311G (d, p))의 편광 함수로 설정된 triple-ζ기반의 Gaussian 16 프로그램을 기반으로 수행하였다.
실시예 3: 세포 배양, 세포 독성 시험 및 공촛점 형광현미경 이미징
살아있는 헬라 세포(Live Hela Cell)는 5 % CO2 환경에서 37 ℃ 에서 페니실린 (Penicillin, 100 mg/ml) 및 스트렙토 마이신 설페이트 (100 mg/ml, Streptomycin Sulfate), RPMI 배지1640 (세포 배양용 성장 매질)을 보충한 10 % FBS (Fetal Bovine Serun, 소 태아혈청)를 사용하여 배양되었다.
프로브 QSB의 생체 적합성을 조사하기 위해 MTT 분석법 (3-(4,5-dimethyl -thiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Assay)을 다양한 농도의 QSB와 함께 사용하였다.
96-웰 플레이트(96-well plate)에서 배양된 세포를 37 ℃ 에서 24 시간 동안 서로 다른 농도 (0 ~ 130 μM)의 QSB로 처리했다. 프로브를 포함하는 웰에서 배지를 제거하고 DBS (Biodegradable polyurethane)로 채우고 웰을 포함하는 염색 된 세포를 37 ℃ 에서 4 시간 동안 MTT 분석을 계속하여 포르마잔(formazan) 결정을 형성했다.
포르마잔 결정은 DMSO에 용해되었고 용액의 흡광도는 BioTek ELX800 마이크로 플레이트 리더 (Plate reader, Fisher Scientific, USA)를 사용하여 570 nm에서 기록되었다.
세포 생존율은 대조군에 대한 샘플의 흡광도 비율로 하였다. 공초점 형광 현미경 이미지는 63x oil 침지 대물 렌즈와 다이오드 레이저를 광원으로 사용하여 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 (LSM 700, Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 형광 이미지에서 촬영되었다.
바이오 이미징을 진행하기 전에, 세포를 20 μM의 프로브 QSB로 30 분 동안 배양하고 RPMI-1640 매체로 3 회 세척 후, 세포를 추가 15 분 동안 다양한 농도의 피루베이트와 함께 배양하였다.
현재 프로브의 형광 염색 능력은 상용 MitoTraker (살아있는 세포에서 미토콘드리아 염색이 가능한 붉은색 형광 염료)를 사용하여 시험되었으며 Colocalization Assay (형광 현미경에서 두 개의 형광 파장을 공간 오버랩으로 관찰하는 형광 분석법)는 배양된 Hela 세포주와 동일한 방식으로 이루어졌다.
실시예 4: 프로브 QSB의 디자인 및 합성
본 발명의 일 구현예에 따르면, 개발 초기 단계에서 새로운 바이오 마커인 피루베이트의 농도를 검출하는 간단한 화학적 접근을 통해 간단하게 피루베이트의 농도를 측정할수 있는 신규 형광 물질인, QSB를 설계하고 합성하였다.
예컨대, 프로브, QSB는 살리실알데하이드에 아미노 퀴놀린이 결합된 디펜닐보란 유도체 화합물 (Aminoquionoline-conjugated salicyladehyde diphenylborane derivative, QSB)로 구성된다. 피루베이트를 인지하는 부분(Moiety)은 Salicyl- aldehyde에 부착된 새로운 인지 부분 (Moiety)으로 Diphenylborane을 개발하였다.
퀴놀린 기반 화합물은 높은 양자수율과 생체 적합성으로 인해 생물학적 형광 화학 센서에 적용되었다. 추가로, 살리실알데하이드에 아미노 퀴놀린이 결합된 디펜닐보란 유도체 (도 1)가 합성되었다.
Dipehylborane의 붕소는 비어있는 'p' 궤도에서 루이스 염기(Lewis base)인 피루베이트에서 전자쌍을 받아들이기 때문에 루이스 산 (Lewis acid)으로 작용한다. 4-(Diethylamino) salicylaldehyde는 π-congugation 및 전자 공여 특성, 광 변색 및 형광 특성을 증진시키기 위해 결합되었다.
퀴놀린 부분(Quinoline moiety)에 있는 헤테로 원자를 가진 방향족 화합물은 광전자 센서 물질에 광범위하게 적용되며, 광화학적 특성과 π-π* 전자 전이를 억제시켜 Schiff 염기인 QSB를 설계하는데 도입하였다.
실시예 5: 광 물리적 특성
화합물 QSB를 사용하여 UV-Vis 및 형광의 특성을 분석하였다. 도 4A에서 2 vol % DMSO를 포함하는 pH 7.2의 0.2 M Hepes 완충 용액에 50 μM의 프로브 QSB는 360 nm에서 흡수 시그날(Absorption peak)을 보인다.
프로브 QSB의 형광 특성은 서로 다른 여기 (330 ~ 370 nm)에서 2 vol% DMSO를 포함하는 pH 7.2의 0.2 M Hepes 버퍼 용액에서 20 μM의 QSB로 분석되었다.
여기(Excitation) 파장 범위는 QSB의 UV 흡수에 따라 고정되었으며, 얻어진 결과는 도 4B에 방출 피크는 485 nm에서 나타났고 330 nm에서 여기 되었다 (도 4B, 검은색 곡선).
각 10 nm에서 360 nm까지 여기 파장을 추가로 증가시키면 방출 피크 강도는 485 nm에서 증가했다. 특히, 360 nm 여기 곡선에서 715 nm에서 작은 피크가 생성된 반면, 485 nm에서 방출 강도는 370 nm 여기에서 낮아졌다.
따라서 실험 전반에 걸쳐 프로브 QSB는 360 nm에서 여기(Excitation) 되었고 다른 실험 조건에서 형광(Emission) 반응을 측정하였다.
실시예 6: QSB를 사용한 피루베이트 측정 전략 및 메커니즘
2 vol% DMSO를 포함하는 pH 7.2의 0.2 M Hepes 완충 용액에 50 μM의 QSB는 360 nm에서 흡광 피크를 보인다. 프로브에 3 μM 피루베이트를 각각 추가할 때마다 360 nm에서 흡광도가 감소했으며, 피루베이트 9 μM까지 장파장 이동 (red-shift) (최대 429 nm)으로 415 nm에서 새로운 증분 강도가 표현되었다.
프로브 용액에 최대 24 μM까지 피루베이트를 추가하면 흡수피크가 429 nm에서 조금씩 단파장쪽인 403 nm로 이동하면서 피크 강도가 증가했다.
도 4에서 보는 바와 같이 피루베이트를 연속적으로 첨가할 때마다 327 nm에서의 피크 강도가 감소하며, 관찰된 스펙트럼 현상은 QSB와 피루베이트 사이의 sp2 삼각 평면에서 sp3 사면체 혼성화의 중간체 형성 때문일 수 있으며, 403 nm에서 피크는 QSB에서 디페닐 보란(Diphenylborane) 부분(Moiety)이 떨어져 나가면서, QS를 새롭게 형성하는 것으로 보인다(도 1).
피루베이트의 검출은 형광 적정으로 측정하였다. 2 vol% DMSO를 포함하는 pH 7.2의 0.2 M Hepes 버퍼 용액에서 20 μM의 QSB를 360 nm에서 여기 (Excitation)하면 125 nm의 스토크 이동(Stoke's shift)이 일어나면서 485 nm (강한 녹색 형광)에서 방출 (Emisssion) 피크가 나타나고 동시에 715 nm에서 또 다른 뾰족한 피크가 나타났다 (도 5 곡선 'a').
프로브 용액에 1 μM 피루베이트를 첨가하면 485 nm에서 방출 피크가 감소하고 동시에 715 nm에서 적색 영역의 피크 강도가 증가되었다 (도 5 곡선 'b').
위의 반응 용액에 최대 13 μM까지 피루베이트를 계속 첨가하면, 485 nm에서 점진적인 감소와 더불어 715 nm에서 증가가 상호 반비례하면서 피크 강도가 나타난다. 얻어진 피크 강도 비(F715nm/F485nm) 대 피루베이트 농도 사이의 선형 그림 (도 5 내의 삽입된 그래프)으로 보여졌으며, 검출 한계는 0.1 μM 인 것으로 나타났다.
QSB와 피루베이트 사이의 인지 메카니즘 (Recognition mechanism)은 루이스 산-염기 (Lewis acid-base) 상호 작용현상에 속한다. QSB에서 QS의 형성은 QSB의 보론 원소에서 비어있는 'p'궤도에 의한 Lewis acid의 성격을 갖고 있어 발생하게 된다.
사면체 기하학의 중간 구조는 보론에 피루베이트가 반응하면서, O-B-O (산소-붕소-산소) 중간체가 형성된 후에 QSB에서 O-B 결합이 분리되어 새로운 알코올 형태의 QS로 전환된다.
그 결과, QSB에서 QS로의 변환은 여기 상태 분자가 양성자 이동 (Excited State Intramolecular Proton Transfer, ESIPT)을 통한 분자의 호변 이성질체 현상(Tautomerism)으로 에너지가 이완되면서 형광 파장이 변화하게 된다.
실시예 7: 인지 전략에 대한 실험적 및 이론적 증거
프로브 QSB가 QS로의 변형은 1H NMR 및 HR-MS 구조 규명을 통해 입증되었다.
QSB에서 diphenylborane의 방향족 수소는 δ7.65-7.69 (m, 5 H), 7.34-7.37 (m, 5 H) (도 6)에서 pyruvate로 적정한 후 사라졌고 (청록색 점선 화살표) 14.70 ppm (OH 피크-녹색 점선 화살표), 도 6에서와 같이 QS의 방향족 화합물의 수소에 약간의 화학적 이동이 추가되었다.
추가적으로, N-디에틸 수소 양성자 (분홍색 점선 화살표)가 upfield에서 downfield로 이동된 것은 디페닐보란의 방향족 벤젠 그룹이 QSB에서 분리되었기 때문이다.
또한 피루베이트와의 반응 후 QSB의 HR-Mass는 [M + H]+ = 484.3526 (도 2C)에서 [M + H]+ = 320.7538로 변경되어 QS의 가능한 구조에 해당한다 (도 2D).
QSB와 피루베이트 사이의 가능한 반응은 루이스 산-염기 반응에 의존한다. 루이스 염기(Lewis base)인 피루베이트는 QSB (도 1)에서 루이스 산(Lewis acid)인 삼각 평면 sp2 혼성화 붕소 원소에 존재하는 비어있는 'p' 궤도에 전자를 줌으로서 사면체 sp3 혼성화를 포함하는 중간체를 구성하여 QS 부분(모이어티)으로 분리 변형되었다.
1H NMR, HR-MS의 실험 데이터는 QSB에서 QS로의 변환을 보여주고있다 (도 2C, 도 2D). 또한 밀도 함수 이론 (DFT) 계산을 탐색하여 QSB 및 QS의 구조에 퍼져있는 에너지 수준과 분자궤도를 계산하였다.
QSB 및 QS의 기하학적 모양을 최적화하기 위해 B3LYP 방법 및 (6-311G (d, p))의 편광 함수로 설정된 triple-ζ기반으로 설정된 Gaussian 16 프로그램을 기반으로 DFT 계산을 수행하였다.
얻어진 HOMO (High Occupied Molecular Orbital)와 LUMO (Lower Unoccupied Molecular Orbital)를 도 7에 나타내었다. HOMO 수준에서 QSB 프로브의 전자 구름은 주로 살리실알데히드 페닐 고리 (Salicylaldehyde phenyl ring)에 집중되었다.
알코올 QS 골격을 형성하기 위해 피루베이트와 반응 후, HOMO에서 전자 구름이 퀴놀린 및 살리실 알데히드 페닐 고리 부분(Quinoline and salicyl aldehyde phenyl ring moieties)에 퍼져 있다.
QSB에서 붕소 원소는 전자가 더 부족하여 이민 (CH = N) 질소에서 전자를 가져와 분자 내 B-N 결합을 통한 전이상태를 형성한다. 따라서, HOMO에서 QSB의 전자 구름은 주로 퀴놀린이 아닌 살리실알데히드 페닐 부분에 존재한다. QSB의 퀴놀린 전자는 이미 보론 원소와 공유되기 때문이다.
피루베이트는 전자 기여 후 이민 질소보다 붕소와 더 강한 결합을 형성할 수 있으며, 그 결과 QSB의 B-O 결합이 끊어지고 피루베이트와 새로운 B-O 결합이 형성될 수 있다.
프로브 QSB와 제품 QS의 HOMO-LUMO 에너지 준위 차이는 3.558 eV 및 3.671 eV였으며, QS는 QSB에서 QS로 전자 흡수 능력이 감소하고 가능한 여기 상태의 분자내 양성자 이동 (Excited state intramolecular proton transfer, ESIPT)으로 인해 발생할 수 있는 QSB보다 작은 에너지를 보유한 것으로 보이며, 이민과 알코올 사이에 ESIPT 메커니즘이 발생한다.
이 이론적 결과는 분광학적 실험 결과와 일치하고 피루베이트가 보론 원소에 인지되는 메커니즘을 확인되었다.
실시예 8: 프로브 QSB의 피루베이트 인지 능력
형광 화학센서의 중요한 역할은 특정 표적 분자에 대한 선택적 방출 신호를 얻는 것이다.
현재 프로브 QSB의 선택적 검출 및 간섭 능력을 조사하기 위해 pH 7.2에서 2 vol% DMSO를 포함하는 0.2 M Hepes 버퍼 용액에서 20 μM의 QSB(control, 1)에 대해 방출 반응이 관찰되었으며, 13 μM의 피루베이트(2) 및 6.5 mM의 다른 가능한 간섭 효과 물질 (포도당(3), 과산화수소(4), 구연산염(5), 글루타메이트(6), 아세테이트(7), 인산염(8), 질산염(9), 숙신산 염(10), 아황산염(11), 푸마르산염(12), 벤조산염(13) 및 과염소산염(14))이 포함되어있다.
도 8A에서 볼 수 있듯이 프로브 QSB는 피루베이트에 대해 485 nm에서 ?칭(Quenching, 주어진 물질의 형광강도를 감소시키는 모든 과정을 의미) 현상을 확인했으며 715 nm에서 뾰족한 피크로 적색 이동하였다. 이러한 독특한 방출 피크는 다른 간섭 효과 물질 중에서 피루베이트에 대해서만 나타났다 (도 8A의 빨간색 선). 프로브의 간섭 효과 (Interference test)를 조사하기 위해 각각의 간섭 효과 물질(6.5 mM)을 pyruvate (13 μM)와 함께 혼합하여 형광 방출을 비교 분석했다.
500배 과량의 다른 이온도 피루베이트와 함께 프로브에 첨가되었고, 715 nm에서 향상된 형광강도를 얻은 것은 피루베이트의 존재 때문이며 (도 8B) 루이스 산-염기의 반응으로 가능했다.
관찰된 총체적 방출 강도는 막대 차트로 나타내었고, 도 8C에 표시된 것처럼 해당 사진 이미지가 도 8D, 8E에 표시되었다. 이러한 발견은 현재 프로브 QSB가 피루베이트가 첨가됨에 따라 녹색 형광 (QSB)이 빨간색 형광 (QS)으로 바뀌는 독특한 형광 방출신호를 바탕으로 선택적으로 피루베이트 검출에 활용할 수 있다.
녹색 및 적색형광의 강도 비는 의심 할 여지없이 프로브인 QSB를 사용하여 피루베이트를 진단할 때 달성된다.
바이오 시스템에서 프로브를 사용하기 위해 다양한 pH 범위에서 프로브의 안정성을 평가했다.
이 실험에서 방출 강도는 pH 3~10 범위의 서로 다른 pH에서 2 vol% DMSO를 포함하는 0.2 M Hepes 버퍼 용액에서 20 μM의 QSB로 조사되었다. 프로브 QSB는 485 및 715 nm에서 두 개의 형광 피크를 갖으므로 두 피크는 서로 다른 pH 값에서 고려되었고 얻은 결과는 도 9a-9c에 표시되었다.
485 nm에서 가장 높은 방출 강도는 도 9a의 pH 7 (검은 색 선)에서 관찰되었다. 715 nm에서의 방출 강도는 pH 값 3에서 10 (빨간색 선)으로 점차 증가했다. 염기성 매체에서 적색 형광 특성은 프로브 QSB의 감지 능력을 증가시켰지만, 큰 영향을 주지는 않았다.
프로브, QSB는 pH 7에서 매우 안정적이고 좋은 반응을 보인다. 따라서, 모든 실험은 생리학적 pH 7.2에서 수행되었다. 피루베이트 검출에 대한 QSB의 반응 시간을 모니터링하기 위해, 피루베이트 2, 5, 8, 10 및 13 μM (in 2 vol % DMSO)를 포함하는 pH 7.2에서 0.2 M Hepes 버퍼 용액에서 20 μM의 QSB로 반응역학을 조사하였다.
이 시간 응답 실험의 경우, 485 및 715 nm에서 방출 강도가 피루베이트를 첨가 한 후 확인되었고 F715nm/F485nm의 비율이 분 단위의 시간으로 나타냈다 (도 9B). 그 결과, 프로브 QSB가 피루베이트의 농도와 관계없이 15 분의 반응 시간에 안정적으로 반응함을 보여준다.
피루베이트에 대한 프로브의 성능을 기반으로, 살아있는 HeLa 세포의 생리적 조건에서 바이오 이미징에 사용할 수 있다.
실시예 9: QSB를 사용하여 살아있는 HeLa 세포에서 피루베이트 첨가에 따른 형광이미징
프로브 QSB는 다른 가능한 간섭 중에서 피루베이트를 선택적으로 인식하고 반응 시간 조사를 통해 생물학적 응용을 위한 프로브로의 사용이 가능한지 여부를 조사했다. 살아있는 세포주에서 피루베이트 생체 분자를 진단하기 위해, 바이오 형광 이미징 연구에 앞서 프로브의 세포 독성시험을 위해 다양한 농도의 프로브 0 ~ 130 μM을 사용하여 HeLa 세포에 대한 전통적인 MTT 분석을 수행하였다.
MTT 분석 결과, HeLa 세포의 80 % 이상이 130 μM의 고농도에서도 생존하는 것으로 나타났다 (도 9c). 따라서, 살아있는 세포에서 피루베이트를 검출 할 때 QSB는 바이오 이미징 시약으로 사용할 수 있다. 프로브는 이미징을 진행하기 전에 30 분 동안 HeLa 세포와 함께 배양되었으며, 프로브의 형광 이미지는 녹색 채널에서 강한 녹색형광 (도 10A)으로 나타났으며 적색 채널에서는 형광이 관찰되지 않았다.
프로브를 피루베이트 검출에 사용하기 위해 프로브로 첨가된 세포에 다양한 함량의 피루베이트 (3, 8 및 12 μM)를 첨가하고 15분 동안 배양했다.
공 초점 형광이미지는 녹색 채널 (도 10B-D, 녹색 채널)에서 형광이 없는 중간 녹색으로 표시되었으며, 빨간색 채널의 형광은 피루베이트 농도와 관련하여 희미한 빨간색에서 강한 적색 형광으로 표시되었다.
살아있는 존재의 피루베이트 의존 메커니즘이 미토콘드리아에서 발생했기 때문에 미토콘드리아 피루베이트 플럭스(pyruvate flux) 모니터는 필수적이다.
프로브 QSB의 미토콘드리아 세포 내 표적화 능력은 공동 형광조사 (Colocalization)를 위한 참조 염료로 상업적으로 이용 가능한 미토트래커 그린 (MitoTracker Green FM, A green-fluorescent mitochondrial stain)을 사용하여 개발되었다.
프로브 및 기준 미토콘드리아 염료를 37 ℃에서 30 분 동안 HeLa 세포와 함께 배양했다. 12 μM의 pyruvate를 프로브 염색된 세포에 추가하고 15 분 동안 배양하고 이미지화 했다 (도 10E).
프로브와 피루베이트로 추가된 세포는 적색 형광을 보였고 세포 내 염색된 이미지를 얻었다 (도 10E). 공동 형광조사 (Colocalization)는 미토 추적기 그린(MitoTracker Green)을 기준으로 하여, 녹색 채널에서 조사되었고 세포에서 미토콘드리아 염색 부분을 분석했다.
밝은, 빨강 및 녹색 채널의 이미지는 도 10E에 표시된 것처럼 함께 겹쳐졌고, 미토콘드리아 염료를 사용한 프로브의 공동 형광조사 효과는 프로브 QSB가 주로 피어슨 상관계수가 0.96으로 미토콘드리아를 표적으로 삼는 것으로 나타났다.
결과는 프로브 QSB가 미토콘드리아 표적화 능력을 보유하고 시험관 내 모델에서 바이오마커인 피루베이트의 농도는 F715nm/F485nm의 형광강도 비를 측정함으로서 측정할 수 있음을 명확하게 나타낸다.
현재의 새로운 바이오 마커로서 피루베이트의 정량적 검출은 강한 녹색 형광에서 강한 적색 형광으로 전환됨에 따라 프로브 QSB가 Diphenylborane이 분리 제거된 QS로 변경하여 모니터링 할 수 있다.
새롭게 준비된 프로브는 형광 파장이 변화된 형광의 강도비를 이용하여, 피루베이트가 당뇨, 신경성 퇴행질환, 간질환 및 암 관련 병리 상태의 변화에 민감함으로 이러한 질병의 임상 연구에 활용될 수 있다.
이상에서 본 발명의 비제한적이고 예시적인 실시예를 설명하였으나, 본 발명의 기술 사상은 첨부 도면이나 상기 설명 내용에 한정되지 않는다. 본 발명의 기술 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 형태의 변형이 가능함이 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하며, 또한, 이러한 형태의 변형은 본 발명의 특허청구 범위에 속한다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 피루베이트 검출 센서:
    [화학식 1]
    Figure 112021027073949-pat00004
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 피루베이트가 반응하여, 적색의 형광이 발현되는, 피루베이트 검출 센서.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 피루베이트가 반응하여, 700 nm 내지 750 nm 에서 형광 강도가 증가하는, 피루베이트 검출 센서.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 피루베이트 검출 센서는 pH 6 내지 8에서 피루베이트를 검출하는, 피루베이트 검출 센서.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 피루베이트 검출 센서는 상온 내지 37 ℃ 에서 피루베이트를 검출하는, 피루베이트 검출 센서.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 피루베이트 검출 센서는 세포 내의 피루베이트를 검출하는 것인, 피루베이트 검출 센서.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 피루베이트 검출 센서는 인체의 체내로부터 분리된 생체 시료 내의 피루베이트를 검출하는 것인, 피루베이트 검출 센서.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생체 시료는 인체의 체내로부터 분리된 인체의 체액 및 혈액 중 하나 이상을 포함하는, 피루베이트 검출 센서.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 피루베이트 검출 센서는 15 분 이내에 피루베이트 검출 결과를 나타내는, 피루베이트 검출 센서.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 피루베이트 검출 센서의 검출한계는 0.1 μM 인, 피루베이트 검출 센서.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 피루베이트 검출 센서의 색상 변화는 육안으로 측정되거나, 형광 광도계로 정량적으로 측정되는, 피루베이트 검출 센서.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 피루베이트 검출 센서를 포함하는 농도 측정부; 및
    농도 측정 결과를 형광 이미지로 나타내는 표시부;를 포함하는 피루베이트 검출용 형광 이미징 센서.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 피루베이트 검출 센서를 준비하는 단계;
    상기 피루베이트 검출 센서와 분석 시료를 반응시키는 단계; 및
    상기 반응 이후, 상기 피루베이트 검출 센서의 형광 변화를 측정하여 피루베이트를 검출하는 단계;를 포함하는, 피루베이트 검출 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 반응시키는 단계는,
    상기 피루베이트 검출 센서와 분석 시료를 반응 챔버에 투입하는 단계;
    상기 반응 챔버 내의 pH 및 온도 중 하나 이상을 조절하는 단계; 및
    상기 반응 챔버 내에서 상기 피루베이트 검출 센서와 분석 시료를 반응시키는 단계; 를 포함하는, 피루베이트 검출 방법.
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CN115479924A (zh) * 2022-07-28 2022-12-16 湘潭大学 一种基于温度响应型病毒分子印迹水凝胶荧光传感器的制备与应用
CN115479924B (zh) * 2022-07-28 2024-05-07 湘潭大学 一种基于温度响应型病毒分子印迹水凝胶荧光传感器的制备与应用

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