KR101962882B1 - 구연산염 검출 센서 및 이를 이용한 구연산염 검출 방법 - Google Patents

구연산염 검출 센서 및 이를 이용한 구연산염 검출 방법 Download PDF

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Abstract

하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 구연산염 검출 센서가 제공된다. 해당 구연산염 검출 센서는 따른 전립선 암(prostate cancer) 세포와 같은 세포에서 특이적으로 과소 발현되는 구연산염과 특이적으로 결합하여 녹색 형광색이 발현되므로, 이를 이용하여 세포 내에서의 구연산염을 용이하게 검출할 수 있다.
[화학식1]
Figure 112017052562710-pat00012

Description

구연산염 검출 센서 및 이를 이용한 구연산염 검출 방법{SENSORS FOR DETECTING CITRATE, AND METHOD OF DETECTING CITRATE USING THE SAME}
본 발명은 새로운 구연산염 검출 센서 및 이를 이용한 구연산염 검출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 새로운 화합물을 이용한 구연산염 검출 센서 및 이를 이용한 구연산염 검출 방법에 관한 것이다.
생리 환경에서 구연산 음이온(citrate anion)을 검출하기 위한 무 금속 수용체 분자 프로브의 개발은 생체 센서 및 의학 연구자들에게는 여전히 도전적인 과제이다. 구연산염(Citrate)은 생물학적 시스템의 크렙(Krebs) 주기에서 에너지 전달 및 생체 분자 합성을 위한 세포의 대사 경로에서 매우 중요한 역할을 하기 때문에 가장 중요한 표적 음이온 중 하나이다.
생물학적 체액에서의 구연산염 농도는 신장 기능 장애, 신장 결석 증 및 글리코겐 저장과 같은 일부 병리학적 상태를 진단하는 데 사용된다. 즉, 건강한 남성 체액의 구연산 농도가 정상 범위 인 50 ~ 200 mM 정도지만, 전립선 암 조직에서의 구연산 농도는 2 ~ 20 mM로 감소하여, 전립선암이 상당히 진행되었음을 확인 할 수 있다. 이처럼 전립선 암환자에게서는 구연산염의 농도가 현저하게 감소한다. 따라서, 인체 체액의 미량 시료로부터 구연산 농도를 모니터링 하는 것은 초기 단계에서 전립선암을 스크리닝 할 수 있는 폭 넓은 기회를 제공한다.
최근 형광 센서는 우수한 감도와 선택성, 현장 시각화, 조작 용이성, 저비용을 중심으로 저 분자, 양이온 및 음이온 검출, 생체분자 분석 등의 분야에서 새로운 기술로 널리 사용되고 있다.
최근에 디설폰화 된 알루미늄 착물을 이용한 형광 화학 센서가 보고 되었으며, 이는 아연-구연산염 배위 결합을 통해 구연산염에 결합됨에 따라 센서로서 기능할 수 있으며, 특히 아연-구연산염 배위 결합을 통해 구연산(citric acid) 음이온에 대한 이핵성 아연 착물을 형성할 수 있음이 보고되었다. 이때 주요 전략은 두 단계로 구성된 지표 변위 분석(indicator displacement assay, IDA)을 기반으로 설계 되었다.
이와 같이, 종래의 구연산염에 대한 화학 센서는 복합체 금속 이온이 구연산염과의 새로운 배위를 위해 빈 궤도를 가지고 있기 때문에 Al3+, Cu2+ 및 Zn2+와 같은 착물로 가장 자주 나타나고, 이를 이용해 IDA 형 프로브가 구연산염 이온을 감지할 수 있었다.
하지만, 이와 같은 금속 복합체를 형성하는 화학 센서는 살아있는 생물에 대한 반응을 하면 다음과 같은 단점을 보여준다. i) 구연산염과 금속-복합체 프로브의 결합 친화도가 복합 프로브의 금속이나 리간드와 결합이 보다 높을 경우에만 IDA 형 프로브가 구연산염을 감지 할 수 있다. ii) 생물학적 시스템에서 금속- 복합체 프로브를 사용하면 간질, 파킨슨 병 및 알츠하이머병과 같은 병리학적 질병을 유발할 수 있다. iii) 또한 IDA 형 프로브는 간접적으로 구연산염을 검출하므로 민감도가 낮고 반응도 느리다.
이에 따라, 구연산염을 직접적으로 단일 단계로 검출 할 수 있게 해주며, 세포 내 형광이미지에 활용할 수 있는 금속성 이온과 결합하지 않는 비IDA 유형의 화학 센서에 대한 개발이 필요한 실정이다.
KR 10-2017-0014006
본 발명의 구현예들에서는 구연산염 검출 센서 및 이를 이용한 구연산염 검출 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 구연산염 검출 센서가 제공된다.
[화학식1]
Figure 112017052562710-pat00001
예시적인 구현예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 구연산염과 반응하여, 녹색의 형광색이 발현될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 구연산염과 반응 할 때, 400 nm 내지 450 nm 파장 범위의 형광 강도가 450 nm내지 700 nm로 증가할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서의 pH는 6 내지 8로 조절될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서는 20 내지 37 ℃에서 구연산염을 검출할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서는 15분 이내에 구연산염 검출 결과를 보일 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서는10 nM 의 검출한계를 가질 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서는 세포 내에서 구연산염을 검출하는 용도로 사용될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서는 전립선 암 세포에서 구연산염을 검출하는 용도로 사용될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서는 종이에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 담지된 페이퍼 스트립형 센서(paper-strip type sensor)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 구연산염 검출센서를 포함하는 전립선암 진단 키트가 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112017052562710-pat00002
예시적인 구현예에서, 상기 전립선암 진단 키트는 인체의 체내로부터 분리된 생체 시료내 농도 측정부를 더 포함하고, 상기 생체 시료내 농도 측정부는 상기 구연산염 검출센서를 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 생체 시료내 농도 측정부는 전립선암 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함하고, 상기 지시서는 상기 생체 시료내 농도 측정부로부터 분석된 체액 및 혈액 중 하나 이상에서의 구연산염의 농도가 정상 대조군과 비교하여 1/10 미만으로 감소한 경우 전립선암 또는 전립선암 가능성이 있다고 진단하는 감별방법을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 생체 시료내 농도 측정부는 전립선암 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함하고, 상기 지시서는 상기 생체 시료내 농도 측정부로부터 분석된 체액 및 혈액 중 하나 이상과 반응한 상기 구연산염 검출 센서가 정상 대조군과 비교하여 청색(blue) 형광을 발현하는 경우, 전립선암 또는 전립선암 가능성이 있다고 진단하는 감별방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 구연산염 검출 센서를 준비하는 단계; 상기 구연산염 검출 센서와 분석 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 구연산염 검출 센서와 분석 시료의 반응 이후, 상기 구연산염 검출 센서의 형광 변화를 측정하여 구연산염을 검출하는 단계;를 포함하는, 구연산염 검출 방법이 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112017052562710-pat00003
예시적인 구현예에서, 상기 센서와 분석시료를 반응 시키는 단계는, 상기 센서와 분석 시료를 반응 챔버에 투입하는 단계; 상기 반응 챔버 내의 pH를 조절 하는 단계; 및 상기 반응 챔버 내에서 상기 센서와 분석 시료를 반응시키는 단계; 를 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 반응 챔버내의 pH는 6 내지 8로 조절될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 분석 시료는 인체의 체액 및 혈액 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서와 반응하는 분석시료는 전립선 암 세포의 체액 및 혈액 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 구연산염 검출 센서에 따르면, 보로네이트 작용기(boronate moiety) 부분이 루이스 산으로서 거동하여, 구연산염 감지시 금속 복합체를 대체할 수 있다. 이때, 보로네이트 작용기에 있는 보론 원소는 sp2 하이브리드와 및 삼각형 평면구조의 점유되어 있지 않은 'p' 궤도를 가지며, 이는 구연산염과의 새로운 배위 자리를 갖는다. 이때, 루이스 산성 붕소는 불화물(F-), 수산화물(OH-) 및 시안화물(CN-)과 같은 음이온의 수용체 역할을 할 수 있다.
이에 따라, 구연산염은 루이스 염기로 반응 할 수 있고 보론(루이스 산성)의 공극 'p' 궤도에 전자를 기증하여 sp2-삼각형 평면에서 sp3-사면체로 구조를 변형시킬 수 있고, 이 경우 구연산염과 반응하여 청색 형광에서 녹색 형광으로 형광파장의 변화될 수 있다. 이에 따라, 육안 및/또는 형광감도계 만으로도 구연산염을 용이하게 검출할 수 있다
아울러, 상기 구연산염 검출 센서는 구연산염에 대한 선택성과 감도가 매우 높으므로, 매우 빠르게 구연산염을 검출할 수 있다. 이에 따라, 상기 구연산염 검출 센서는 의약품, 화학물질 취급 산업현장, 환경오염 시료, 법과학 시료, 음용수 등과 같은 다양한 분야에서 널리 사용될 수 있으며, 특히, 살아있는 세포에도 직접 적용가능 하므로, 구연산염이 과소 발현되는 전립선 암 세포 주 내에서 용이하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 구연산염 검출 센서의 구연산염에 대한 감지 메커니즘을 나타내는 개략도이다.
도 2는 구연산염 검출 센서와 다양한 당량의 구연산 염의 반응 후, 구연산염에서의 1H NMR (400 MHz) 스펙트럼에서의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 구연산염의 몰분율(mole fraction)과 5-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)페닐)-3-(4-(4,5-디페닐-1H-이미다졸-2-일)페닐)-1,2,4-옥사디아졸(이하, ARBD)의 흡광도에 따른 Job plot 을 나타내는 그래프이다.
도 4는 구연산염 검출 센서가 구연산염과 반응할 때 시간의 함수로서 형광강도와의 상관관계를 나타낸 그래프이다.
도 5는 ARBD 형광 방출 스펙트럼과 구연산염과의 반응에 따른 형광 여기와 방출 파장을 나타내는 그래프이다.
도 6a 내지 6c는 각각 다양한 농도의 구연산염(0 - 0.9 μM)의 존재 하에의 구연산염 검출 센서의 시간에 따른 형광 강도 변화를 나타내는 그래프, 다양한 pH에서 ARBD와 구연산염에 대한 형광 방출 강도를 나타내는 그래프 및 이에 대한 형광 이미지를 나타내는 사진이다.
도 7a 내지 7c는 각각 다양한 농도의 구연산염을 적용하는 경우, 구연산염 검출 센서의 형광 반응 스펙트럼, 구연산염의 농도에 대한 형광 강도의 정량곡선, 형광 이미지 사진이다.
도 8a 내지 8c는 구연산염 검출을 위한 구연산염 검출 센서의 선택성 및 간섭에 관한 그래프들이다.
도 9는 세포주(prostate cancer cell)에 ARBD를 넣었을 때 발현되는 형광을 나타내는 사진이다.
이하, 본 발명의 구현예들을 첨부한 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 본 발명의 구현예들이 첨부된 도면을 참고로 설명되었으나 이는 예시를 위하여 설명되는 것이며, 이것에 의해 본 발명의 기술적 사상과 그 구성 및 적용이 제한되지 않는다.
본 명세서에서 “구연산염 검출 센서”란, 시료 내의 구연산염의 존부를 검출하는 센서뿐만 아니라, 시료 내의 구연산염의 농도를 측정할 수 있는 농도 측성 센서를 모두 포괄한다.
구연산염 검출 센서
본 발명의 일 구현예에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 구연산염 검출 센서가 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112017052562710-pat00004
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 5-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)페닐)-3-(4-(4,5-디페닐-1H-이미다졸-2-일)페닐)-1,2,4-옥사디아졸(이하, ARBD)이다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 구연산염 검출 센서가 구연산염과 반응하는 경우, 형광색이 발현될 수 있으며, 구체적으로 청색 형광에서 녹색 형광으로 형광파장이 변화되어 녹색 형광색이 발현될 수 있다.
도 1은 상기 ARBD를 포함하는 구연산염 검출 센서가 구연산염과 반응하는 경우, 형광 색의 변화를 나타낸다.
도 1을 살펴보면, 용액 상태의 일부 형광은 약한 청색 형광을 나타내고, 구연산염과 반응하는 경우, 응집 된 방출/응집 강화된 방출(AIE/AEE)로 지칭되는 그들의 응집 된 상태에서 증가된 형광 방출을 보임을 확인할 수 있다. 아울러, 구연산염과 형광센서가 반응하는 동안, 형광 방출 강도는 장파장(red shift) 방향으로 이동하면서 방출강도는 증가함을 확인할 수 있었으며 이때 구체적인 반응 메커니즘은 다음과 같이 예측된다.
(i) 구연산염 과 ARBD와 헤테로 원자의-NH 양성자의 수소 결합
(ii) 구연산염의 음전하 산소 원자와 ARBD에서 양전하를 띤 보론 원소사이의 이온 결합(이때, ARBD 전체에 걸쳐 긴 공액이 존재하기 때문에 헤테로 원소가 전자를 분자 전체에 분산(electron delocalization)을 시킴에 따라 붕소 원자에 양성적인 성질을 제공하기 때문에 보론 원소가 양전하를 띔)
한편, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 구연산염과 반응 할 때, 400 nm 내지 600 nm 파장 범위의 형광 강도가 450 nm내지 700 nm로 증가할 수 있다. 이에 따라, 육안 혹은 형광강도계(혹은 confocal과 같은 형광 이미지 측정장비)로 형광색과 강도 변화를 관찰하여, 구연산염을 검출할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서의 pH는 6 내지 8일 수 있으며, 보다 구체적으로는 pH 7일 수 있다. pH 값이 상기 범위를 벗어나는 경우 형광세기의 비가 저하되어 형광 발현이 미비할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서는 5 내지 50℃, 보다 구체적으로는 20 내지 37 ℃ 온도 범위내에서 구연산염을 검출할 수 있으며, 이와 같이 상온에서도 구연산염이 검출될 수 있어 널리 사용될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서는 15분 이내에 구연산염 검출 결과를 보일 수 있어, 구연산염을 매우 빠르게 검출할 수 있다는 이점이 존재한다.
또한, 상기 구연산염 검출 센서는 10 nM 의 검출한계를 가질 수 있어, 미세량의 구연산염을 검출할 수 있다는 이점이 존재한다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서는 세포 내 구연산염을 검출하는 용도로 사용될 수 있고, 구체적으로 전립선 세포, 구체적으로는 전립선 암 세포에서의 구연산염을 검출하는 용도로 사용될 수 있다.
즉, 건강한 남성 체액에서는 구연산 농도가 정상 범위 인 50 ~ 200 mM 정도지만, 전립선 암 조직세포에서의 구연산 농도는 2 ~ 20 mM로 감소하여, 전립선암이 상당히 진행되었음을 확인 할 수 있는데, 본 발명에 따른 구연산염 검출 센서를 이용하는 경우, 전립선 암 조직세포에서의 구연산염을 검출할 수 있고 그 검출 한계가 매우 낮아 전립선 암의 진행 여부를 용이하게 확인할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 일반 세포 내 포함되어 있는 구연산에서 반응하는 경우 녹색(green)의 형광을 발현하고, 전립선 암세포에서 구연산염과 반응하여 청색(blue)의 형광을 발현할 수 있다. 구체적으로, 일반 세포에서는 구연산염의 농도가 높아 녹색 형광색을 보이나, 전립선 암세포에서 구연산염과 반응하여 청색(blue)의 형광을 발현할 수 있다. 달리 말하면, 본 발명의 구연산염 검출 센서는 구연산염이 소량으로 존재하는 전립선 암세포에서는 청색(blue)의 형광을 발현할 수 있다.
한편, 제한되지 않으나, 상기 구연산염 검출 센서는 종이에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 담지된 페이퍼 스트립형 센서(paper-strip type sensor)일 수 있다. 이 경우, 구연산염 검출시 매우 간편하게 사용될 수 있다.
아울러, 상기 구연산염 검출 센서는 구연산염에 대한 선택성을 보여, 과산화수소(H2O2), 포도당, 과당, 자당 등에 반응하지 않고 구연산염에 대해서만 반응할 수 있다.
상술한 바와 같이 구연산염 검출 센서는 구연산염과 반응하였을 때 형광 발광 파장이 장파장 이동(red-shift)을 가져 오고 형광세기가 매우 증가할 수 있는 (5-(4- (4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)페닐)-3-(4-(4,5-디페닐-1H-이미다졸-2-일)페닐)-1,2,4-옥사디아졸을 포함한다. 상기 화합물은 구연산염에 대한 선택성과 감도가 매우 높아 육안 및/또는 형광감도계 만으로도 구연산염을 용이하게 검출할 수 있다. 이에 따라, 상기 구연산염 검출 센서는 의약품, 화학물질 취급 산업현장, 환경오염 시료, 법과학 시료, 음용수 등과 같은 다양한 분야에서 널리 사용될 수 있다.
전립선 암 검출 키트
본 발명의 일 구현예에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 구연산염 검출센서를 포함하는 전립선암 진단 키트가 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112017052562710-pat00005
예시적인 구현예에서, 상기 전립선암 진단 키트는 인체의 체내로부터 분리된 생체 시료내 농도 측정부를 더 포함할 수 있다. 이에 따라, 인체로부터 분리된 체액 및/또는 혈액 내 농도를 측정할 수 있고, 이 때 구연산염의 농도가 정상 대조군 대비 현저히 저하된 경우 전립선암 또는 전립선 암 가능성임을 진단할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 생체 시료내 농도 측정부는 전립선암 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함하고, 상기 지시서는 상기 생체 시료내 농도 측정부로부터 분석된 체액 및 혈액 중 하나 이상에서의 구연산염의 농도가 정상 대조군(50 ~ 200 mM)과 비교하여 1/10 미만으로(즉, 2~ 20mM) 감소한 경우 전립선암 또는 전립선암 가능성이 있다고 진단하는 감별방법을 포함한다.
이와 달리, 상기 생체 시료내 농도 측정부는 전립선암 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함하고, 상기 지시서는 상기 생체 시료내 농도 측정부로부터 분석된 체액 및 혈액 중 하나 이상과 반응한 상기 구연산염 검출 센서가 정상 대조군 대비 청색(blue) 형광을 발현하는 경우, 전립선암 또는 전립선암 가능성이 있다고 진단하는 감별방법을 포함할 수도 있다.
이에 따라, 상기 전립선암 진단 키트를 이용하여 전립선암 또는 전립선 암 가능성이 있음을 용이하게 진단할 수 있다.
구연산염 검출 센서를 이용한 구연산염 검출 방법.
본 발명의 다른 구현예에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 구연산염 검출 센서를 준비하는 단계; 상기 구연산염 검출 센서와 분석 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 구연산염 검출 센서와 분석 시료의 반응 이후, 상기 구연산염 검출 센서의 형광세기 변화를 측정하여 구연산염을 검출하는 단계;를 포함하는 구연산염 검출 방법이 제공된다.
[화학식 1]
Figure 112017052562710-pat00006
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서와 분석시료를 반응 시키는 단계는, 상기 센서와 분석 시료를 반응 챔버에 투입하는 단계; 상기 반응 챔버 내의 pH를 조절 하는 단계; 및 상기 반응 챔버 내에서 상기 센서와 분석 시료를 반응시키는 단계; 를 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 반응 챔버내의 pH는 6 내지 8로 조절될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서와 반응하는 분석시료는 인체의 체액 및 혈액 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 상기 구연산염 검출 센서와 반응하는 분석시료는 전립선 암 세포의 체액 및 혈액 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
이와 같이 상기 구연산염 검출 센서를 이용하여 구연산염을 검출하는 것은 굉장히 단순한 방법을 통해 수행될 수 있어, 상기 화합물은 구연산염에 대한 선택성과 감도가 매우 높아 육안 및/또는 형광감도계 만으로도 구연산염 를 용이하게 검출할 수 있다. 이에 따라, 상기 구연산염 검출 센서는 다양한 분야에서 널리 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예들에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: [화학식 1] 로 표시되는 화합물 합성
하기 화학식 1로 표시되는 화합물(5-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)페닐)-3-(4-(4,5-디페닐-1H-이미다졸-2-일)페닐)-1,2,4-옥사디아졸, 이하 “ARBD”)은 아래와 같이 합성되었다.
[화학식 1]
Figure 112017052562710-pat00007
디페닐에탄디온(혹은 벤질)(1)과 4-시아노벤즈알데히드(4-cyanobenzaldehyde)(2)을 암모늄 아세테이트 조건하에 첨가하여 합성한다. 합성된 4-(4,5-디페닐-1수소-이미다졸-2-일)벤조니트릴(4-(4,5-diphenyl-1H- imidazol-2-yl)benzonitrile)(3)을 하이드록실아민염화수소(hydroxylamine hydro chloride)와 반응시켜 N'-하이드록시-4-(4,5-디페닐-1수소-이미다졸l-2-일)벤즈아미딘(N'-hydroxy-4-(4,5-diphenyl-1H-imidazol-2-yl)benzamidine)(4)을 합성한다. 이후, 4-브로모벤조산(4-bromobenzoic acid)(5)과 비스(피나콜아토)디보론(bis (pinacolato)diboron)(6)을 반응시켜 4-카르복시페닐보론산 피날콜 에스테르(4-carboxyphenylboronic acid pinacol ester)(7)을 합성하고, 최종적으로 N'-하이드록시-4-(4,5-디페닐-1수소-이미다졸l-2-일)벤즈아미딘(4)과 4-카르복시페닐보론산 피나콜 에스테르(4-carboxyphenylboronic acid pinacol ester)(7)을 합성시켜 합성으로 최종적으로 “(5-(4- (4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)페닐)-3-(4-(4,5-디페닐-1H-이미다졸-2-일)페닐)-1,2,4-옥사디아졸(이하, ARBD)”가 합성된다.
[반응식 1]
Figure 112017052562710-pat00008
실험예 1: ARBD와 구연산염과 반응 메커니즘
ARBD와 구연산염의 메커니즘을 밝히기 위해 ARBD에 대해 1H NMR 적정을 실시하였으며 ARBD을 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0 당량의 구연산염과 반응시킨 후 1H NMR 적정 기술을 ARBD에 대해 DMSO-d6에서 수행하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 살펴보면, 구연산염 존재 하에서 ARBD는 보론 원소 및 보로네이트 메틸에스테르 양성자 Hc (δ1.32 ppm)와 결합 된 페닐 고리 Ha 및 Hb (δ8.30 및 7.94 ppm)로 나타내는 것을 확인할 수 있다. 아울러, 구연산염의 농도를 증가 시키면 보론에 붙어있는 페닐 수소와 보론에이트 메틸 에스테르 피크가 확실하게 업필드(upfield)로 이동하였다. ARBD에 0.5 당량의 구연산염을 첨가하면, 전형적인 페닐 피크는 업필드로 이동하고 δ8.28 (Ha) 및 7.93 ppm (Hb)에서 관찰되며, δ1.30 ppm (Ha)에서 메틸 에스테르 일중 피크가 나타남을 확인할 수 있었다. 1.0 당량의 구연산염을 ARBD에 첨가 한 후에 페닐 Ha 및 Hb (δ8.26 ppm 및7.92 ppm) 및 메틸 에스테르 Hc (δ1.26 ppm)가 여전히 업 필드로 변화되었다는 것이 명확히 확인 되었다. ARBD에 1.5 당량의 구연산을 첨가 한 경우, δ8.22 ppm (Ha) 및 7.91 ppm (Hb)에서 전형적인 페닐 피크가 관찰되었고, δ1.26 ppm (Ha)에서 메틸 에스테르가 나타남을 확인할 수 있었다. 또한, 구연산염의 농도를 2.0 당량으로 증가 시키면 δ8.17 (Ha), 7.88 (Hb) 및 1.14 ppm에서 각각 페닐 및 메틸 에스테르가 나타남을 확인할 수 있었다.
또한, 이때, 보론 원소 근처에 있는 수소는 변화를 겪고 이미다졸-NH 수소는 구연산염을 첨가하는 동안 변화하지 않는다는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 감지 경로가 ARBD (ARBD의 보론 충전: + 1.15 eV)에서 구연산과 보론 사이의 이온 상호 작용임을 분명히 나타낸다. 보로네이트 부분의 보론은 루이스 산(Lewis acid)으로 작용하고 sp2 혼성화가 있는 빈'p'궤도를 사용하여 구연산염으로부터 전자를 받아들인다. 음으로 하전된 구연산 이온은 전자를 쉽게 줄 수 있으며 루이스 염기로 작용한다. 구연산염에서 보론의 공극 'p'궤도로의 전자 이동은 sp2 삼각 평면구조로부터 sp3 사면체 구조로 혼성화 시켰다. ARBD-구연산염 복합체 구조의 접합체가 형성된 후에 ARBD의 극성이 증가되었고, 이는 전하 이동 착물(citrate-ARBD)의 국소 여기 상태의 형성을 통해 기증자(구연산염)와 수용체(ARBD) 사이의 에너지 간격이 감소하기 때문이다(증가된 형광 방출 강도는 주로 AIE 기계론적 경로에 속함).
이에 따라, 구연산염의 농도를 증가시키면서 더 큰 파장, 낮은 에너지 방출 스펙트럼을 관찰하였다
실험예 2: ARBD를 포함하는 구연산염 검출 센서 및 구연산염의 반응에 대한 화학양론 및 속도상수
ARBD를 포함하는 구연산염 검출 센서와 구연산염 사이의 반응에서의 결합 거동을 이해하기 위해, 이들의 반응을 Job plot을 이용하여 조사하였고 데이터를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 최대 흡수 강도는 0.5 몰분율에서 나타나는 것을 확인할 수 있어, 구연산염 검출 센서와 구연산염의 반응시 1:1 복합체가 형성됨을 확인할 수 있었다. 이와 같은 경우, 반응 속도론은 -kt = ln (Fmax-F)/Fmax로 표시 될 수 있다(이때, k=속도 상수, 'F' 및 'Fmax'는 시간 't'에서의 형광 강도). 아울러, 반응 완료 후 달성되는 최대 강도 반응 값을 ‘ln (Fmax-F)/Fmax vs 시간’의 plot을 이용하여 도 4에 나타낸 바와 같이 함께 계산하였으며, 그 결과 k (반응속도 상수)값은 0.148 min-1임을 확인할 수 있었다. 따라서, ARBD를 포함하는 구연산염 검출 센서와 구연산염의 반응은 0.148 min-1의 속도 상수 값을 보여, 반응 활성화 에너지가 상대적으로 높을 수 있음을 확인할 수 있었다.
한편, 도 5를 살펴보면, 구연산염 검출 센서는 구연산염과 반응하지 않는 경우, 346 nm 및 458 nm에서 약한 형광을 발산하면서 (청색) 형광을 발현함을 확인할 수 있었다. 이에 반해, pH 7.4에서 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid) 완충 용액 (2 vol % DMSO) 조건 하에서 2 μM의 ARBD을 포함하는 구연산염 검출 센서에 구연산과 넣은 경우, 파란색에서 녹색으로의 극적인 색상 변화와 함께 548 nm에서 강한 형광을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 구연산염의 존재 및 부재 하에서의 구연산염 검출 센서의 광 물리 특성을 표 1에 나타내었으나, 이 형광 변경은 시각화에 구별하는 것이 바람직하다.
ARBD와 구연산염과 반응 후 형광의 변화
화합물 최대 흡수파장
( λabs)		 최대 방출 파장
(λemiss)		 형광 양자수율(Fluorescence quantum yield)
ARBD 352 458 0.18
ARBD + 구연산염 352 548 0.51
한편, 도 6a 내지 6c는 각각 다양한 농도의 구연산염(0 - 0.9 μM)의 존재 하에의 구연산염 검출 센서의 시간에 따른 형광 강도 변화를 나타내는 그래프, 다양한 pH에서 ARBD와 구연산염에 대한 형광 방출 강도를 나타내는 그래프 및 이에 대한 형광 이미지를 나타내는 사진이다.
도 6a에서 측정 조건의 최적화를 시켜보면, 형광 세기 최대값이 약 15 분 내에 도달했다는 것(A)을 알 수 있다. 또한 형광 강도는 60 분까지 일정하게 유지되고, 전 농도 구간에서 일단 형광센서가 구연산염과 반응하는 경우 센서 자체가 일정하게 유지되며 높은 안정성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 도 6b 및 6c를 살펴보면, 구연산염 검출 센서의 형광 강도는 pH에 의해 거의 영향을 받지 않지만, 약 pH 7 내지 8에서 안정적이고 가장 높은 형광강도를 보여, 구연산염 검출 센서에 구연산이 도입되면 pH에 따라 형광 증강이 달라짐을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 구연산염 검출 센서와 구연산 염의 반응 메커니즘을 이용한 구연산염의 고감도 검출
ARBD 포함하는 구연산염 검출 센서의 구연산염 초기의 추적 능력(tracking ability)은 pH 7.4에서 10 mM HEPES 완충 용액(2 vol % DMSO) 조건하에서 ARBD를 이용한 UV-Vis 흡수 분광법을 이용하여 평가 되었다. 도 7a 내지 7c를 살펴보면, 선형 구연산염 농도의 첨가 시 ARBD의 형광 스펙트럼의 변화를 확인할 수 있다. 이를 살펴보면, 초기에 ARBD는 346 nm에서 흡수 피크를 보였으며, 1 μM의 구연산염을 0에서 12 μM 첨가 할 때마다 흡수 스펙트럼의 변화추이가 있음을 확인할 수 있었다, 346 nm에서의 흡광 강도는 구연산염을 첨가 할 때마다 감소하였고, 400 nm에서 새로운 피크 위치가 변화되면서 나타났다. 아울러, 도 7a 내지 7c에 도시 된 바와 같이, 구연산염의 농도의 증가는 형광 강도뿐만 아니라 형광 파장 변화 모두에 영향을 미침을 확인할 수 있었다. 또한, pH 7.4및 10 mM HEPES 완충 용액(2 vol % DMSO)조건 하에서 2 μM의 ARBD를 포함하는 구연산염 검출센서에 대해 구연산염의 농도를 0에서 800 nM까지 증가시키는 경우, 형광 강도 최대치는 548 nm까지 직선성으로 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 구연산염의 농도를 950 nM까지 증가 시키면, 548 nm의 피크는 파장을 변화시키지 않고 직선형으로 증가함을 확인할 수 있다. 이때, 검량곡선은 Y=0.66X + 250.76 (R2=0.9961), 검출 한계(limit of detection)는 10 nM (S/N = 3) 인 것으로 확인되며 이는 종래에 비해 훨씬 개선된 것임을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 구연산염 검출을 위한 구연산염 검출 센서의 선택성 및 간섭
구연산염 검출 센서를 이용하여 다른 생물학적 카르복실산 염 및 구연산염 검출을 위한 관련 유사 종에 대한 선택도 및 간섭 능력을 시험하고 도 8a 내지 8c에 나타내었다. 이 실험을 위해, 1 μM 구연산 염과 0.5 mM의 다양한 다른 이온들 첨가 하였다((1) 센서, (2) 구연산, (3) 푸마르산염(fumarate), (4) 벤조산염(benzoate), (5) 글루탄산염, (6) 숙신산염, (7) 말론산염, (8) 옥살산염, (9) 아세트산염, (10) 인산염, (11) 아황산염 및 (12) 황산염).도 8a에서는 분명히 구연산염만이 다른 종과 달리 형광 증진을 유도 할 수 있는 것처럼 확인되었으며, 더욱이 다른 종의 이온화합물이 구연산염 농도의 500 배 이상의 농도를 갖는 경우에서도 구연산염 검출에는 영향이 없음을 확인할 수 있었다(도 8b).
도 8c 에는 구연산염 검출 센서의 선택성 및 간섭 능력을 나타내었다. 도 8c를 살펴보면, 다른 이온 물질이 결과는 구연산염 농도의 500 배 이상의 농도를 갖는 경우에도, 구연산염 검출 센서가 고감도의 간섭 없이 선택적으로 구연산염에 반응한다는 것을 명확하게 보여준다. 또한, 보론에이트(boronate)는 디올 센서로 잘 알려져 있기 때문에, 과산화수소(H2O2), 포도당, 과당, 자당, 도파민 종과 같은 다른 디올 작용기를 갖는 물질에 대해서도 선택성을 확인 하였으나, ARBD를 포함하는 구연산염 검출 센서는 구연산염과 과산화수소에 대해서만 반응함을 확인할 수 있었다. 두 분석물질 모두 형광 강도에 대한 반응으로 반응하지만, 구연산은 녹색 형광을 방출하고 H2O2는 청색 형광을 방출함을 확인할 수 있었다. 생물학적 시료에서 'μM' 범위의 농도에서 구연산염만 녹색 형광을 방출하므로, 구연산염 검출 센서를 이용하는 경우 육안으로 구연산염을 용이하게 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 살아있는 PC3 세포에서 구연산염 검출 센서의 형광 발현
살아있는 세포(PC3)에서 구연산염 검출센서의 프로브 능력을 평가하고 도 9에 나타내었다. 이는 실시예에 따른 구연산염 검출 센서가 유일한 녹색 형광을 방출하는 구연산염의 탐지를 위한 우수한 측정 감도(nM 수준)를 보여주기 때문에 세포 주에서 구연산염 존부를 추적하는 것이 가능할 것으로 판단되기 때문이다. 구체적으로, ARBD(2 μM)를 포함하는 구연산염 검출센서를 30 분간 배양 한 후 PC3 세포에서의 이미지를 관찰하였다.
도 9의 (A) 내지(C)에는 세포주(prostate cancer cell)에 ARBD을 넣었을 때 일반적으로 발현되는 형광을 나타내었다. 발현되는 형광(A)와 세포주의 광학사진(B)에 이를 겹친 사진(C)를 나타내었으며, 세포주에 구연산염 검출센서가 삽입되어 있는 상태에서 구연산염을 첨가하여 발현되는 녹색의 형광을 관찰하였다. 구연산이 첨가된 후 사진(D)와 이의 광학사진(E), 그리고 이를 중첩하여 나타난 그림(F)을 도 9에 나타내었다.
도 9를 살펴보면, 구연산염 검출센서는 구연산염과 반응하여 녹색의 발현시킴을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 구연산염을 세포 내에서 관찰 할 수 있음을 확인 할 수 있었다.
앞에서 설명된 본 발명의 실시예는 본 발명의 기술적 사상을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 기재된 사항에 의하여만 제한되고, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상을 다양한 형태로 개량 변경하는 것이 가능하다. 따라서 이러한 개량 및 변경은 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것인 한 본 발명의 보호범위에 속하게 될 것이다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 구연산염 검출 센서.
    [화학식1]
    Figure 112017052562710-pat00009
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 구연산염과 반응하여, 녹색의 형광색이 발현되는, 구연산염 검출 센서.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물과 구연산염과 반응 할 때, 400 nm 내지 450 nm 파장 범위의 형광 강도가 450 nm내지 700 nm로 증가하는, 구연산염 검출 센서.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 구연산염 검출 센서의 pH는 6 내지 8로 조절되는, 구연산염 검출 센서.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 구연산염 검출 센서는 20 내지 37 ℃에서 구연산염을 검출하는, 구연산염 검출 센서.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 구연산염 검출 센서는 15분 이내에 구연산염 검출 결과를 보이는, 구연산염 검출 센서.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 구연산염 검출 센서는10 nM 의 검출한계를 갖는, 구연산염 검출 센서.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 구연산염 검출 센서는 세포 내에서 구연산염을 검출하는 용도로 사용되는, 구연산염 검출 센서.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 구연산염 검출 센서는 전립선 암 세포에서 구연산염을 검출하는 용도로 사용되는, 구연산염 검출 센서.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 구연산염 검출 센서는 종이에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 담지된 페이퍼 스트립형 센서(paper-strip type sensor)인, 특징으로 하는 구연산염 검출 센서.
  11. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 구연산염 검출센서를 포함하는 전립선암 진단 키트.
    [화학식 1]
    Figure 112017052562710-pat00010
  12. 제11항에 있어서,
    상기 전립선암 진단 키트는 인체의 체내로부터 분리된 생체 시료내 농도 측정부를 더 포함하고,
    상기 생체 시료내 농도 측정부는 상기 구연산염 검출센서를 포함하는, 전립선암 진단 키트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 생체 시료내 농도 측정부는 전립선암 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함하고,
    상기 지시서는 상기 생체 시료내 농도 측정부로부터 분석된 체액 및 혈액 중 하나 이상에서의 구연산염의 농도가 정상 대조군과 비교하여 1/10 미만으로 감소한 경우 전립선암 또는 전립선암 가능성이 있다고 진단하는 감별방법을 포함하는, 전립선암 진단 키트.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 생체 시료내 농도 측정부는 전립선암 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함하고,
    상기 지시서는 상기 생체 시료내 농도 측정부로부터 분석된 체액 및 혈액 중 하나 이상과 반응한 상기 구연산염 검출 센서가 정상 대조군과 비교하여 청색(blue) 형광을 발현하는 경우, 전립선암 또는 전립선암 가능성이 있다고 진단하는 감별방법을 포함하는, 전립선암 진단 키트.
  15. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 구연산염 검출 센서를 준비하는 단계;
    상기 구연산염 검출 센서와 분석 시료를 반응시키는 단계; 및
    상기 구연산염 검출 센서와 분석 시료의 반응 이후, 상기 구연산염 검출 센서의 형광 변화를 측정하여 구연산염을 검출하는 단계;를 포함하는, 구연산염 검출 방법.
    [화학식 1]
    Figure 112017052562710-pat00011
  16. 제15항에 있어서,
    상기 센서와 분석시료를 반응 시키는 단계는,
    상기 센서와 분석 시료를 반응 챔버에 투입하는 단계;
    상기 반응 챔버 내의 pH를 조절 하는 단계; 및
    상기 반응 챔버 내에서 상기 센서와 분석 시료를 반응시키는 단계; 를 포함하는, 구연산염 검출 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 반응 챔버내의 pH는 6 내지 8로 조절되는, 구연산염 검출 방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 분석 시료는 인체의 체액 및 혈액 중 하나 이상을 포함하는, 구연산염 검출 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 구연산염 검출 센서와 반응하는 분석시료는 전립선 암 세포의 체액 및 혈액 중 하나 이상을 포함하는, 구연산염 검출 방법.
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