JP2014100100A - クエン酸特異的蛍光センサータンパク質及びこれを用いるクエン酸の測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】クエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、アミノ末端側からカルボキシル末端側へ順に、第1のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列と、蛍光タンパク質のアミノ酸配列と、第2のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列とを含む。第1のクエン酸結合ポリペプチドと第2のクエン酸結合ポリペプチドとは、特定のアミノ酸配列からなるセンサーヒスチジンキナーゼCitAの細胞周辺腔ドメインのペプチド結合が切断されて得られる2個のポリペプチドである。前記蛍光タンパク質は、環状異性化蛍光タンパク質である。クエン酸検出剤は、前記センサータンパク質と、これを発現する形質転換体とを含む。
【選択図】なし
Description
1.1 材料
大腸菌JM109株と、BL21(DE3)株とが、それぞれ、発現ベクター構築用宿主と、組換えタンパク質産生用宿主として用いられた。本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質に使用するクエン酸結合タンパク質であるセンサーヒスチジンキナーゼCitAの遺伝子はグラム陰性桿菌クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)NBRC13541株から取得された。クレブシエラ・ニューモニエ菌は独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手された。本発明の実施例で用いるクエン酸輸送体タンパク質CitTは大腸菌W3110株から取得された。これらの細菌の培養にはLB培地が使用され、必要に応じて適切な抗生物質(100μg/mLアンピシリン)が添加された。遺伝子操作に用いるPCRプライマーPr1ないしPr32は以下の表1に示される。Pr1ないしPr32のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列表では配列番号8ないし配列番号39に列挙される。
本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質に使用するクエン酸結合タンパク質として、クレブシエラ・ニューモニエ菌のセンサーヒスチジンキナーゼCitAの細胞周辺腔ドメインが選択された。CitA細胞周辺腔ドメインは、全長アミノ酸残基547個のCitAタンパク質の第45番目から176番目までのアミノ酸残基の部分である。CitA細胞周辺腔ドメインをエンコードするDNAは、クレブシエラ・ニューモニエ菌NBRC13541株の染色体DNA抽出物から、表1に列挙されたPr1及びPr2プライマーを用いるPCR法で増幅された。得られた増幅断片はpET−21d(+)ベクター(Novagen、メルク株式会社)のNco I及びXho I部位に挿入され、プラスミドpECitAPが得られた。
緑蛍光タンパク質の野生型のS65T変異体(EGFP)をエンコードするプラスミドpBEGFP−FのDNAを鋳型として、表1に列挙されたPr3及びPr4プライマーにより、EGFPの第145番目から第238番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチドをエンコードするDNA断片Aが増幅された。また、Pr5及びPr6プライマーにより、EGFPの第2番目から第144番目までのアミノ酸残基からなるポリペプチドをエンコードするDNA断片Bが増幅された。つぎに、DNA断片A及びDNA断片Bの混合物を鋳型として、Pr3及びPr6プライマーにより、cpFPをエンコードするDNA断片Cが増幅された。DNA断片CはpUC19のPst I及びKnp I部位に挿入された。さらに、Pr7ないしPr12のプライマーを用いて、F46L、T65G、V68L、S72A、H148D及びT203F(アミノ酸残基の番号はGFP野生型タンパク質のアミノ末端を第1番目の残基とする。)の突然変異がDNA断片Cに導入され、DNA断片C−muが得られた。
CitAPの第97番目から第105番目までのアミノ酸残基は、クエン酸との結合の際に最も大きい構造変化を示す可動性領域である。そこで、CitAPの第N番目のアミノ酸残基と、第N+1番目のアミノ酸残基との間にcpFGが挿入される融合タンパク質CFN(Nは97から105までの整数)が作成された。まず、第1のリンカー(Ser−Ala−Gly)と、cpFPと、第2のリンカー(Gly−Thr)とが連結されたポリペプチドをエンコードするDNA断片Dが、点突然変異が導入されたcpFPのDNA断片C−muを鋳型として、Pr13及びPr14プライマーを用いてPCR増幅された。つぎに、CP97、CP98、・・・、P105の第1のクエン酸結合ポリペプチドをエンコードするDNA断片は、Pr1プライマーと、それぞれ、Pr15、Pr17、・・・、Pr31との対を用いてPCR増幅された。CP97、CP98、・・・、CP105の第2のクエン酸結合ポリペプチドをエンコードするDNA断片は、Pr2プライマーと、それぞれ、Pr16、Pr18、・・・、Pr32との対を用いてPCR増幅された。そして、CP97、CP98、・・・、CP105のそれぞれについて、第1のクエン酸結合ポリペプチドをエンコードするDNA断片と、DNA断片C−muと、第2のクエン酸結合ポリペプチドをエンコードするDNA断片との混合物を鋳型として、Pr1及びPr2を用いて、CitAPとcpFPとの融合タンパク質をエンコードするDNA断片がPCR増幅により得られた。これらのDNA断片はpET−21d(+)のNco I及びXho I部位に挿入され、発現ベクターpECF97、pECF98、・・・、pECF105が得られた。
発現ベクターpECF97、pECF98、・・・、pECF105は大腸菌BL21(DE3)株に形質転換され、CF97、CF98、・・・、CF105のそれぞれとHisタグとの融合タンパク質として発現された。これらの形質転換された大腸菌は、100μg/mLのアンピシリンが添加されたLB培地3mL中で37°C、160rpm、8時間振盪培養され、前培養液が得られた。この前培養液50μLは、バッフル付き500mL三角フラスコ中の前記アンピシリン添加LB培地50mLに稙菌され、37°C、120rpm、3時間振盪培養された。その後、イソプロピルチオ−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)が終濃度0.1mg/mLとなるように添加され、25°C、120rpm、18時間振盪培養され、組換えタンパク質が産生された。培養終了後の大腸菌は遠心分離で回収され、50mMのNa2HPO4−NaH2PO4バッファー(pH7.0)で2回洗菌された。前記大腸菌は超音波破砕機(UD−201、株式会社トミー精工)により破砕され、得られた細胞破砕液は、遠心分離(15,000×g、4°C、30分)され、上清が無細胞抽出液とされた。
前記大腸菌無細胞抽出液は、TNI5バッファー(20mM Tris−HCl(pH7.9)、500mL NaCl及び5mM イミダゾール)で平衡化されたHisTrapHTカラム(GEヘルスケア・ジャパン株式会社)に供された。その後カラム容量の5倍量のTNI5バッファーが前記カラムに通液されてカラムがリンスされた。CFNのHisタグ融合タンパク質はTNI500バッファー(20mM Tris−HCl(pH7.9)、500mL NaCl及び500mM イミダゾール)で溶出された。CFNのHisタグ融合タンパク質は、さらに、セファデックスG−25(PD−10カラム、GEヘルスケア・ジャパン株式会社)を用いたゲル濾過により、50mMのNa2HPO4−NaH2PO4バッファー(pH7.0)にバッファーが置換された。精製されたCFNのHisタグ融合タンパク質の定量には、クーマジータンパク質アッセイ試薬(サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)が用いられた。
2.1 材料及び方法
精製されたCFNは、50mMのNa2HPO4−NaH2PO4バッファー(pH7.0)中で、蛍光分光光度計(FP−6200、日本分光株式会社)で励起スペクトルが測定され、クエン酸濃度による蛍光特性の変化が調べられた。測定条件は、励起波長範囲:350−512nm、発光波長525nm又は540nm、スペクトルバンド幅5nm、応答性:中、波長走査速度:2000nm/分、利得:中。
CFNの精製タンパク質のうち、CF97、CF99、CF100、CF102、CF103、CF104及びCF105は、クエン酸濃度の上昇とともに蛍光強度が減少した。これに対しCF98及びCF101は、クエン酸濃度の上昇とともに蛍光強度が増大した。そこで、CFNタンパク質はいずれもクエン酸特異的蛍光センサータンパク質であることが示された。CFNタンパク質のうち、CF98及びCF99は他のCFNタンパク質よりもクエン酸濃度依存的な蛍光強度の変化が顕著であった。そこで、以下では、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質の典型例として、CF98及びCF99について詳細に蛍光特性が調べられた。
3.1 材料及び方法
CitTをエンコードするDNA断片は大腸菌W3110株の染色体DNA抽出物を鋳型としてPCR増幅により得られた。前記DNA断片は、pRSFDuet−1(Novagen、メルク株式会社)のNde I及びMfe I部位に挿入され、発現ベクターpRCITTが得られた。pRCITTか、その空ベクターのpRSFDuet−1かがpECF98とともに大腸菌BL21(DE3)株に導入された形質転換体が作成された。クエン酸特異的蛍光センサータンパク質CF98とクエン酸輸送体CitTとが共発現する大腸菌の培養液に2.5mMのクエン酸を添加したときの蛍光を、CF98のみが発現する大腸菌の蛍光と比較された。
図5Aは、クエン酸輸送体タンパク質CitTと本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質CF98とが共発現された大腸菌のクエン酸添加前に撮影された蛍光顕微鏡画像である。スケールは10μmである。大腸菌の菌体全体が均一に蛍光を発していた。図5Bは、クエン酸輸送体タンパク質CitTと本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質CF98とが共発現された大腸菌に、0.025mM、0.25mM及び2.5mMのクエン酸を添加したときの蛍光強度の経時変化を示すグラフである。陰性対照として、CitTの発現ベクターpRCITTのかわりに空ベクターpRSFDuet−1がpECF98とともに形質転換され、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質CF98のみが発現された大腸菌に2.5mMのクエン酸を添加したときの蛍光強度の経時変化が調べられた。縦軸は蛍光強度で、横軸は測定開始後の経過時間(単位:秒)で、矢印はクエン酸が添加された時刻を表す。蛍光測定開始から25秒後にクエン酸が添加された。クエン酸輸送体タンパク質CitTと本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質CF98とが共発現された大腸菌では、クエン酸の添加後に蛍光強度が増大した。蛍光強度は添加されたクエン酸の濃度が高いほど強かった。CF98のみが発現する大腸菌では蛍光強度の変化はほとんど認められなかった。図5A及び図5Bは、ともに、励起波長は485nm、発光波長は535nmであった。なお、pH蛍光指示剤のSNARF−5Fを用いて、クエン酸の添加により大腸菌菌体内のpHは変化しないことが確認された。したがって、本発明のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質は、生体細胞内のクエン酸濃度を非破壊的に、経時的に測定することができる。
Claims (8)
- アミノ末端側からカルボキシル末端側へ順に、
第1のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列と、蛍光タンパク質のアミノ酸配列と、第2のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列とを含み、
第1のクエン酸結合ポリペプチドと第2のクエン酸結合ポリペプチドとは、配列番号1に列挙されるアミノ酸配列からなるセンサーヒスチジンキナーゼCitAの細胞周辺腔ドメインのペプチド結合が第54番目又は第55番目のアミノ酸残基と次のアミノ酸残基との間で切断されて得られる2個のポリペプチドのうち、それぞれ、アミノ末端側ポリペプチドと、カルボキシル末端側ポリペプチドとであり、前記蛍光タンパク質は、配列番号2に列挙されるアミノ酸配列からなる環状異性化蛍光タンパク質である、
クエン酸特異的蛍光センサータンパク質。 - 第1のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列と前記蛍光タンパク質のアミノ酸配列との間には第1のリンカーのアミノ酸配列が挿入され、前記蛍光タンパク質のアミノ酸配列と第2のクエン酸結合ポリペプチドのアミノ酸配列との間には第2のリンカーのアミノ酸配列が挿入される、請求項1に記載のクエン酸特異的蛍光センサータンパク質。
- (1)配列番号3又は4に列挙されるアミノ酸配列からなるタンパク質と、
(2)配列番号3又は4に列挙されるアミノ酸配列に1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、
(3)配列番号3又は4に列挙されるアミノ酸配列と78%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、
(4)配列番号5又は6に列挙されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと80%以上の相同性を示すポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、
(5)配列番号5又は6に列挙されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下で雑種形成するポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、クエン酸特異的蛍光センサー活性を有するタンパク質と、
(6)特異的結合タグペプチドが前記(1)ないし(5)のいずれかのタンパク質に連結した、融合タンパク質とからなるグループから選択される少なくとも1種類のタンパク質を含む、クエン酸特異的蛍光センサータンパク質。 - 請求項1ないし3のいずれか1つのクエン酸特異的蛍光センサータンパク質をエンコードするポリヌクレオチド。
- 請求項4に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項5に記載の発現ベクターが発現可能に導入された形質転換体。
- 請求項1ないし3のいずれか1つのクエン酸特異的蛍光センサータンパク質、及び/又は、請求項5に記載の形質転換体を含む、クエン酸検出剤。
- (1)請求項7に記載の形質転換体を含むクエン酸検出剤を被検サンプルに接触させるステップと、
(2)クエン酸濃度に依存する変化を示す第1の励起波長での蛍光特性と、クエン酸濃度に依存する変化を示さないか、あるいは、第1の励起波長でのクエン酸濃度に依存する蛍光特性の変化とは異なる蛍光特性の変化を示す第2の励起波長での蛍光特性とを測定するステップとを含む、クエン酸濃度の測定方法。
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