JP6674687B2 - 蛍光特性を示す新規なポリペプチド、およびその利用 - Google Patents
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Description
1)以下の(1)〜(4)の何れかに示す、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチド。(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜21個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するポリペプチド、(4)上記(1)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
2)以下の(1)〜(4)の何れかに記載のポリヌクレオチド。(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜21個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(4)上記(1)に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体を意図している。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、特に言及のない限り、デオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。また、ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖構造であってもよく、一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。
本発明に係るポリペプチドは、以下の(1)〜(4)の何れかに示す、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチド(以下、「蛍光ポリペプチド」と称する)である。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する蛍光ポリペプチド。
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜21個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有する蛍光ポリペプチド。なお、置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸の個数は、1〜21個であることが好ましく、1〜14個であることがより好ましく、1〜7個であることがさらに好ましく、1〜5または6個であることが特に好ましい。
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有する蛍光ポリペプチド。なお、配列同一性は、90%以上であることが好ましく、95%以上であることがより好ましく、96%以上、97%以上、98%以上、或いは99%以上であることが特に好ましい。
(4)上記(1)に記載の蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有する蛍光ポリペプチド。なお、ストリンジェントな条件については、本発明に係るポリヌクレオチドの欄で後述する。
最大励起波長(nm):498〜499
最大蛍光波長(nm):525〜530(緑色)
モル吸光係数(M-1cm-1):50000〜78000
量子収率(%):50〜54
蛍光寿命(ナノ秒):2.2
なお、UnaGと同等の励起波長を有するとは、例えば、最大励起波長が480nm〜520nmの範囲内であり、或いは、490nm〜510nmの範囲内であり、或いは、494nm〜504nmの範囲内であることを意味している。
また、UnaGと同等の蛍光波長を有するとは、例えば、最大蛍光波長が507nm〜547nmの範囲内であり、或いは、517nm〜537nmの範囲内であり、或いは、522nm〜532nmの範囲内であることを意味している。
Y=[Kd+Bt+Pt−{(Kd+Bt+Pt)2−4×Bt×Pt}1/2]/(2×Pt)
Yはビリルビンの結合度(蛍光強度)、Kdは解離定数、Btはビリルビン濃度、Ptはアポ体のUnaGタンパク質濃度(5nM)を表す。
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記蛍光ポリペプチドの何れかをコードするものである。このポリヌクレオチドは、具体的には、以下の(1)〜(4)の何れかに記載のポリヌクレオチドである。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜21個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸の個数は、1〜21個であることが好ましく、1〜14個であることがより好ましく、1〜7個であることがさらに好ましく、1〜5または6個であることが特に好ましい。
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、アミノ酸配列の配列同一性は、90%以上であることが好ましく、95%以上であることがより好ましく、96%以上、97%以上、98%以上、或いは99%以上であることが特に好ましい。例えば、ウナギに由来する変異遺伝子、またはウナギ以外の生物に由来する相同遺伝子がこの範疇に含まれる。
(4)上記(1)に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。なお、ストリンジェントな条件下とは、例えば、参考文献[Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)]に記載の条件などが挙げられる。ストリンジェントな条件下とは、より具体的には例えば、6×SSC(1×SSCの組成:0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5%SDS、5×デンハートおよび100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件、および当該条件におけるハイブリダイズ後に65℃で約0.1Mまたはそれより低い塩を含む溶液中、好ましくは0.2×SSCまたは同程度のイオン強度を有する任意の他の溶液において洗浄する条件が挙げられる。なお、このポリヌクレオチドは、上記(1)に記載のポリヌクレオチドの塩基配列に対して85%以上の配列同一性を有することが好ましく、90%以上の配列同一性を有することがより好ましく、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或いは99%以上の配列同一性を有することがさらに好ましい。
本発明に係るポリヌクレオチド(例えばDNA)は、適当なベクター中に挿入された組み換えベクターとして利用に供することもできる。当該ベクターの種類は、例えば、自立的に複製するベクター(例えばプラスミドなど)でもよいし、或いは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
本発明に係るポリヌクレオチド、または、本発明に係る組み換えベクター(本発明の核酸構築物と総称する)を適当な宿主細胞に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明に係る蛍光ポリペプチドとビリルビンとの複合体(ホロ体)も本発明の範疇である。この複合体は、所定波長の励起光を照射することによって蛍光を発する。また、ビリルビンを安定的に保持する保持担体として、本発明に係る蛍光ポリペプチドは機能し得る。この複合体は、ビリルビンと結合していない蛍光ポリペプチド(アポ体)を単離精製した後に、ビリルビンと接触させることで再構成した複合体であってもよい。
本発明に係るビリルビンの検出方法は、1)本発明に係る蛍光ポリペプチド、または本発明に係る融合ポリペプチドと、ビリルビンの検出の対象物とを接触させる接触工程、および、2)接触工程後に当該ポリペプチドまたは当該融合ポリペプチドから発される蛍光を検出する検出工程、を含む方法である。
ビリルビンの検出の対象物の種類は、ビリルビン含有の有無、またはその含有量を検出したい対象物であれば特に限定されない。対象物としては、例えば、生物系試料、または非生物系試料が挙げられる。生物系試料としては、特に限定されないが、例えば、細胞自身、細胞抽出液および体液由来試料(例えば、血液、唾液、リンパ液、髄液および尿などに由来する試料)などが挙げられ、中でも体液由来試料が好ましく、血液由来または尿由来の試料がより好ましい。血液由来の試料としては、生体から採取した血液自身、血清および血漿などが挙げられる。なお、生体はヒトであっても非ヒト脊椎動物であってもよいが、ヒトまたは非ヒト哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。また、細胞自身、または細胞抽出液としては、例えば、脾臓細胞(特に細網細胞)、肝細胞、およびこれら細胞の抽出液が挙げられる。非生物系試料としては、ビリルビンを所定の濃度で含むビリルビン標準サンプルなどが挙げられる。
(検出工程)
上記検出工程は、接触工程後に行われ、本発明に係るポリペプチドまたは融合ポリペプチドから発される蛍光を検出する工程である。蛍光の検出方法は特に限定されないが、例えば、UVトランスイルミネーターもしくはLEDトランスイルミネーター、蛍光顕微鏡、蛍光検出器またはフローサイトメトリーなどの蛍光検出手段を用いて、蛍光発光の有無または蛍光強度を測定すればよい。蛍光発光の有無を測定すれば、対象物中にビリルビンが含まれる(蛍光発光有り)か否か(蛍光発光無し)を検出することができる。また、蛍光強度を測定すれば、対象物中のビリルビンの含有量を検出することができる。
本発明に係るビリルビンの検出方法は、さらに必要に応じて、上記検出工程での検出結果に基づき、肝臓疾患の素因の有無または発症の有無を検査する検査工程をさらに含んでいてもよい。
本発明に係るビリルビンの検出方法の他の応用例としては、生物系試料などの生物由来の対象物に含まれており、ビリルビンとの結合性を有する生体物質について、対象物のビリルビンの検出を介することによって、間接的に生体物質を検出する、生体物質の検出方法が挙げられる。例えば、対象物(特に血液由来の試料)中のHDLコレステロール量の測定が挙げられる。HDLコレステロールはビリルビンへの特異的な結合性を示す。
本発明に係るビリルビンの検出キットは、1)本発明に係る蛍光ポリペプチド、2)本発明に係る蛍光ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、3)本発明に係る組み換えベクター、4)本発明に係る形質転換体、または5)本発明に係る融合ポリペプチドから選択される少なくとも1種以上を含んでなる。この検出キットは、1)〜3)または5)から選択される少なくとも1種を含んでなることが好ましい。
また、本発明に係るポリペプチドの一態様として、基体に固定された形態が挙げられる。ポリペプチドが供されて固定化される基体の材質は特に限定されず、具体的には例えば、ポリスチレン、マグネティックビーズ、滅菌和紙、滅菌濾紙、滅菌不織布、またはPVDF膜(ポリフッ化ビニリデン膜)もしくはPTFE膜(ポリテトラフルオロエチレン膜)等の親水性膜、またはシリコーンゴムなどの柔軟性のある高分子材料、ポリグリコール酸もしくはポリ乳酸などの生分解性ポリマー、または寒天培地、コラーゲンゲルもしくはゼラチンゲルなどのハイドロゲルならびに金薄膜等が挙げられる。このように基体に固定化されることによって、上述したビリルビンの検出等に好適に用いられる。
すなわち、本発明は、以下の1)〜11)の何れかを包含する。
1)以下の(1)〜(4)の何れかに示す、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチド。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜21個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有するポリペプチド、(4)上記(1)に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
2)以下の(1)〜(4)の何れかに記載のポリヌクレオチド。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列において1〜21個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されたアミノ酸配列を有し、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列に対して85%以上の配列同一性を有し、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、(4)上記(1)に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
3)上記ポリペプチドのビリルビンに対する解離定数が、0.1nM以上100nM以下であることを特徴とする、1)に記載のポリペプチド。
4)上記3)に記載のポリヌクレオチドを有する組み換えベクター。
5)上記3)に記載のポリヌクレオチドまたは上記4)に記載の組み換えベクターが導入されている形質転換体。
6)上記1)または3)に記載のポリペプチドと他のポリペプチドとからなる融合ポリペプチド。
7)ビリルビンと結合していない、上記1)、3)または6)に記載のポリペプチドに、ビリルビンを接触させることによって構成されたポリペプチド−ビリルビン複合体。
8)対象物中のビリルビンを検出する方法であって、上記1)に記載のポリペプチド、3)に記載のポリペプチドまたは上記5)に記載の融合ポリペプチドと、上記対象物とを接触させる接触工程、および、上記接触工程後に上記ポリペプチドまたは上記融合ポリペプチドから発される蛍光を検出する検出工程、を含む、検出方法。
9)上記対象物が生体から取得した血液由来または尿由来の試料である、7)に記載の検出方法。
10)上記検出工程での検出結果に基づき、肝臓疾患または溶血性疾患の素因の有無または発症の有無を検査する検査工程をさらに含む、8)または9)に記載の検出方法。
11)上記1)に記載のポリペプチド、上記2)に記載のポリヌクレオチド、3)に記載のポリペプチド、上記4)に記載の組み換えベクター、上記5)に記載の形質転換体、または上記6)に記載の融合ポリペプチドから選択される少なくとも1種以上を含む、ビリルビンの検出キット。
〔1.ニホンウナギ由来のUnaG遺伝子のクローニング〕
(材料および方法)
<実験材料>
天然のニホンウナギ(Anguilla japonica)の稚魚であるシラスウナギ(ケニス株式会社より入手)を使用した。
生体のシラスウナギ(約0.2g前後)を液体窒素に投入し、即時凍結させた。その後、液体窒素中においてテフロンホモゲナイザーを用いて、シラスウナギを破砕した。ホモゲナイザー容器中のシラスウナギにTRIzol(登録商標)試薬3mlを添加し、氷上で溶解後、低温室においてホモジナイズを行った。コニカルチューブにホモジネートを移し、0.6mlのクロロホルムを添加した。上述のクロロホルムを添加したホモジネートを攪拌し室温において5分静置した。7000rpm、4℃で20分間遠心後、水層を回収した(約1.5ml)。回収した水層に、1.5mlのイソプロパノールを添加して攪拌し、室温において10分間静置した。続いて、15,000rpmの回転速度で、4℃において10分間遠心した。上清を除去し、沈殿を75%エタノールでリンスし、10,000rpmの回転速度で4℃において5分間遠心し、エタノールを除去し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を風乾させ、100μlのRNaseフリーの水に溶解し、ニホンウナギのtotal RNAを得た。得られたtotal RNAについて、260nmの波長における吸光度(以降A260と表記し、異なる波長における吸光度についても同様の表記方法とする)を測定し、RNAの濃度を求めた(1A260≒40ngRNA/μlとして換算)。
林ら(Hayashi et al., Fish. Sci. 75, 1461-1469, 2009)によって単離および同定されたウナギの蛍光タンパク質の9つのアミノ酸断片配列の情報に基づき、配列番号7〜16に示す縮重プライマーを設計した。さらに、配列番号17〜23に示すRACE用のアダプタープライマーを設計し、3’RACE法および5’RACE法により、ニホンウナギの蛍光タンパク質をコードする遺伝子のクローニングを行った。以下にクローニングの手順について詳細を記載する。なお、クローニングに用いた、配列番号7〜23に示すプライマーは、表1にもその塩基配列を示した。
上述の方法によって得られた、完全長cDNAの5’側末端、3’側末端、ならびにその他の領域を配列の重複に基づき統合して配列番号2に示す420bpの塩基配列を得て、これをUnaG遺伝子の完全長cDNA配列とした。また、配列番号2の塩基配列の他に、配列番号4で示した塩基配列も配列番号2のバリアントとして得られた。なお、以下の実験は、すべて配列番号2の配列に基づき行った。
〔2−1.大腸菌におけるUnaGタンパク質(アポ体)の発現〕
(材料および方法)
<大腸菌発現用組み換え体(ベクター)の作製>
上記のようにして得たUnaG遺伝子全長の配列を有するDNA断片を、GST融合タンパク質を大腸菌において発現可能な、GSTタグ配列を有する大腸菌発現ベクターpGEX−2T(GEヘルスケア)のBamHIおよびEcoRIの制限酵素サイトにライゲーションし、大腸菌株DH5αに形質転換することによってサブクローニングし、大腸菌のUnaG(アポ体)発現ベクター(pGEX−2T−UnaG)を構築した。
構築した発現ベクター(pGEX−2T−UnaG)を大腸菌株BL21(DE3)に形質転換し、形質転換体をLB固体培地のプレート上で培養してコロニーを得た。得られたコロニーを、LB液体培地40mlに植菌し、37℃において一晩前培養した。ここで、得られた大腸菌液のグリセロールストックを作製し、以下に記載の実験において、大腸菌発現用組み換え体(ベクター)を用いる場合は、上記グリセロールストックを植菌に用いた。前培養液を用いて、LB培地400mlにスケールアップし、37℃において1時間培養した(A600≒1.0)。その後、LB培地に終濃度0.4mMとなるようにIPTG(イソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクシド)を加え、17℃において6時間振とうし、UnaGタンパク質の発現を誘導した。8000rpmの回転速度で3分間遠心分離を行い、大腸菌の菌体を回収した。
タンパク質濃度は以下のように算出された。なお、〔2.組み換えUnaGタンパク質の発現〕〜〔7.ヒト血清中ビリルビンの検出〕に記載されている実験方法のうちタンパク質濃度を測定する場合は、すべて同様の方法により算出された。
タンパク質濃度=A280/εM=A280/18450(mol/dm3)
〔2−2.哺乳類細胞におけるUnaGタンパク質(ホロ体)の発現〕
(材料および方法)
<哺乳類細胞発現用組み換え体(ベクター)の作製>
鋳型DNAとして配列番号2のUnaG遺伝子の完全長cDNA、センスプライマー(配列番号24)、およびアンチセンスプライマー(配列番号25)を用いたPCRにより哺乳類細胞用発現ベクターに挿入するDNAを増幅した。哺乳類細胞用発現ベクターpcDNA3(インビトロジェン株式会社)のKpnI制限酵素サイトおよびBamHI制限酵素サイトに、FLAGタグ配列(配列番号26)を挿入したpcDNA3−FLAGベクターのBamHI制限酵素サイトおよびEcoRI制限酵素サイトに、増幅したDNA断片をライゲーションした後、大腸菌株DH5αに形質転換することによりクローニングした。大腸菌からベクターを抽出した後にベクターを精製し、DNA配列解析により配列を確認し、哺乳類細胞UnaG発現ベクター(pcDNA3−FLAG−UnaG)を構築した。
HEK293T細胞を直径10cmのディッシュ20枚に播種し、10%のウシ胎児血清(GIBCO社製)および抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)を含むDulbecco's Modified Eagle Medium(高グルコース)(GIBCO)で5%のCO2および37℃の条件下で培養した。50〜60%コンフルエントまで細胞が増殖したら、ディッシュ中の培地を抗生物質を含まない培地に交換し、予め混合した哺乳類細胞UnaG発現ベクターのプラスミドDNAおよびトランスフェクション試薬(10cmディッシュ1枚あたり、DNAを10μg、FuGene(登録商標)HDトランスフェクション試薬を40μl、Opti-MEM(登録商標)I Reduced-Serum Medium(GIBCO)を500μl)をディッシュ1枚あたり500μl添加し、トランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を一晩培養し、ディッシュ中の培地を抗生物質を含む培地に交換した。さらに一晩培養し、タンパク質を発現させた。
図1は組み換えUnaGタンパク質の、大腸菌および哺乳類細胞における発現を示した図である。(a)は、組み換えUnaGタンパク質を発現させた大腸菌(2)をUVトランスイルミネーターによって青色の光を照射して観察した図である。左上は対照としてベクターpRSETをトランスフェクションした大腸菌(1)であり、右上はEGFPを発現させた大腸菌(3)である。(b)は、(a)に示した大腸菌(1)〜(3)の細胞抽出液をSDS−PAGE電気泳動により電気泳動したゲルをCBB染色法によって染色した図である。(c)は、組み換えUnaGタンパク質を発現させた哺乳類細胞HEK293Tを蛍光顕微鏡下で観察した、微分干渉像および蛍光像の図である。図1の(b)および(c)に示されているように、大腸菌および哺乳類細胞のいずれにおいて発現した場合もUnaGタンパク質は、十分な発現量を示した。また、上述の精製の操作によって、不純物を十分に除去することができた。しかしながら、図1の(a)の顕微鏡写真から明らかなように、大腸菌においてUnaGタンパク質を発現させた場合、大腸菌の細胞内において、UnaGタンパク質は蛍光を示さなかった。一方、図1の(c)の顕微鏡写真から明らかなように哺乳類の細胞において発現させたUnaGタンパク質は蛍光を示した。
(材料および方法)
<UnaGタンパク質の蛍光スペクトル、吸収スペクトルおよび量子収率の測定>
UnaGタンパク質の蛍光特性について分析するため、蛍光スペクトル、吸収スペクトルおよび量子収率の測定を行った。励起スペクトルおよび蛍光スペクトルは分光蛍光光度計RF−5300PC(株式会社島津製作所)によって測定された(励起波長475nm、蛍光波長550nm)。吸収スペクトルは分光光度計 U−2900(株式会社日立ハイテクノロジーズ)によって測定された。量子収率は絶対PL量子収率測定装置Quantaurus−QY(浜松ホトニクス株式会社)によって測定された(励起波長470nm、480nm)。また、公知の蛍光タンパク質であるEGFPについても同様に測定を行い、UnaGタンパク質の値と比較した。結果を表2に示す。
(材料および方法)
<密度勾配遠心分離法によるウシ胎児血清(FBS)の分画>
FBS(GIBCO)20mlにKBrを8g(0.4gKBr/ml)加え、0.4g/mlのKBrを含むPBSで36mlにメスアップした。この溶液を遠心チューブ6本に6mlずつ分注し、分注した溶液の上から0.75%食塩水6mlを重層した。遠心管およびSw41Tiローター(ベックマン・コールター社)を用いて170,000g、15℃で20時間超遠心分離(ベックマン・コールター社)を行った。続いて、分画機(エスケーエスバイオインターナショナル社)を用いて、各遠心チューブ中の分画血清の上層から0.33mlずつ分注した。
アポ体のUnaGタンパク質は、上述の項目2−1の方法によって作製したものを用いた。10%FBS溶液に0.5μMとなるようにアポ体のUnaGタンパク質を添加し、室温で30分間インキュベートし再構成した。
図3は、FBSおよびFBS画分との再構成によるUnaGタンパク質の蛍光特性等を示した図である。(a)は、FBSによって再構成したアポ体のUnaGタンパク質(左)およびホロ体のUnaGタンパク質(哺乳類細胞由来のFLAG−UnaGタンパク質)(右)の励起スペクトルおよび蛍光スペクトルを示した図である。(b)は、FBSを密度勾配超遠心分離により分画し、各画分とアポ体のUnaGタンパク質とを再構成し測定した蛍光強度(実線)および各血清画分のタンパク質濃度(破線)を示した図である。縦軸は蛍光強度(左軸)とタンパク質濃度(mg/ml)(右軸)、横軸は画分番号を示す。
リガンドの抽出はBligh and Dyer法(Bligh, E.G. & Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917, 1959)に従って行った。哺乳類細胞由来のFLAG−UnaGタンパク質(ホロ体)溶液0.4mlに対し、クロロホルム0.5mlおよびメタノール1mlを加えて混合した。上記混合物に対し、クロロホルム0.5mlおよびバッファー0.5mlを加えてさらに混合し、最終的に水溶液:メタノール:クロロホルムの比を0.9:1:1となるようにした。その後、1,500rpmの遠心力で5分間遠心分離を行い、リガンドを含む脂質成分が抽出された有機溶媒層と、水層とに分離させた。このうち、リガンドを含む脂質の抽出液(すなわち有機溶媒層)を回収した。
上述の方法によって、ホロ体のUnaGタンパク質から抽出されたリガンドおよび血清に含まれている成分の1つであるビリルビンについて、吸収スペクトルを比較し、吸収スペクトルが一致するものを探索した。結果を図4に示す。
図4は、ビリルビン(左)と、UnaGリガンド(右)の吸収スペクトルを示した図である。横軸は吸収光の波長を示し、縦軸は吸光度を示した。図4に示されているように、UnaGのリガンドの吸収スペクトルは、ビリルビンの吸収スペクトルと一致した。したがって、UnaGのリガンドはビリルビンであることが示された。
(材料および方法)
<再構成によるホロ体のUnaGの作製>
100%DMSOに溶解させたビリルビン(和光純薬)をPBSによって希釈し、ビリルビンの濃度がアポ体のUnaG溶液に対してモル比において2倍の量となるように、アポ体のUnaGタンパク質溶液にビリルビンを添加し、混合した。混合の際、ビリルビン溶液のDMSOの終濃度と、アポ体のUnaGタンパク質溶液のDMSOの終濃度とが同じになるようにした。混合した溶液を入れた容器を遮光し、室温において10分間静置した。その後、PD−10カラム(GEヘルスケア株式会社)に該混合溶液を供して、混合溶液に含まれるバッファーを、PBSへバッファー交換しつつ余剰のビリルビンを除いた。必要に応じて、Amicon Ultra(3000MWCO、メルクミリポア)を用いて限外濾過することによって、ホロ体のUnaGタンパク質の濃縮を行った。
<ビリルビンまたはビリルビン類縁体を用いたアポ体のUnaGタンパク質の再構成>
ビリルビンまたはビリルビン類縁体である、ビリベルジン(Tronto Research Chemicals)、ウロビリン(MP Biomedicals)もしくはジタウロビリルビン(Frontier Scientific)を終濃度が、0.125μM、0.25μM、0.5μM、1.0μM、および2.0μMとなるようにPBSで希釈し、0.5μMのアポ体のUnaGタンパク質と混合し、室温で30分間静置した。96穴マイクロプレート(greiner bio−one)に200μlずつ添加し、EnSpire マルチモードプレートリーダー(PerkinElmer)を用いて波長497nmの励起光で波長527nmの蛍光強度を測定した。結果を図5に示す。
図5は、アポ体のUnaGタンパク質溶液に各濃度のビリルビンまたは各濃度のビリルビン類縁体を添加して再構成したUnaGタンパク質の蛍光強度を示す。横軸はリガンド濃度(μM)、縦軸は蛍光強度を示す。ビリルビン類縁体を加えてもUnaGは蛍光を発せず、UnaGの蛍光はビリルビン特異的であることが示された。
(材料および方法)
<変異導入(R82EK84E)によるUnaG改変体の作製方法およびR82EK84E改変体のUnaGタンパク発現>
GENEART(登録商標) Site-Directed Mutagenesis System(インビトロジェン株式会社)を使用し、製品に添付されている手順書に従って、UnaGのアミノ酸配列に対する部位特異的な変異導入を行った。上述の2−1.に記載の大腸菌発現用組み換え体(ベクター)pGEX−2T−UnaGを鋳型とし、センスプライマー(配列番号27)とアンチセンスプライマー(配列番号28)を用いてPCRにより野生体のUnaGタンパク質の82番目のアミノ酸であるR、および84番目のアミノ酸であるKをそれぞれEに置換した。変異を導入したpGEX−2T−UnaG(R82EK84E)を大腸菌株BL21(DE3)に形質転換し、上述の2−1.に記載の野生体のUnaGタンパク質の発現方法と同様の方法によってタンパク質を発現させた。UnaGタンパク質の精製についても上述の2−1.に記載の方法と同様に行った。ただし、Thrombin消化に用いたThrombinは40ユニットとし、20℃において、3時間の条件により行った。精製後、ビリルビンと再構成させることによりホロ体を調製した。ホロ体の調製方法は、上述の2−2.に記載の方法と同様の方法を用いて行った。R82EK84E改変体の推定アミノ酸配列を配列番号5に示した。
野生体のUnaGタンパク質(10mg/ml)およびR82EK84E改変体のUnaGタンパク質(8.5mg/ml)のタンパク質溶液20μlをマイクロトラック粒度分析計MT3000II(日機装株式会社)に供し、動的光散乱法を用いて粒子径を測定した。粒子径に対する頻度をプロットし、凝集性を評価した。結果を図6に示す。
R82EK84E改変体の蛍光特性について分析するため、蛍光スペクトル、吸収スペクトルおよび量子収率の測定を行った。測定は上述の3.に記載の方法と同様の方法によって行った。蛍光寿命は小型蛍光寿命測定装置Quantaurus-Tau(浜松ホトニクス株式会社)で測定した。また、野生体のUnaGタンパク質の値と比較した。結果を表3に示す。
(材料および方法)
<滴定によるアポ体のUnaGタンパク質とビリルビンとの結合>
アポ体のUnaGタンパク質の濃度が5nMのアポ体のUnaGタンパク質溶液に、ビリルビン濃度が最終的に10nMになるまでビリルビンを滴定し、蛍光分光光度計で蛍光スペクトルを測定した。グラフ作成ソフトウェアOrigin(OriginLab社)を用いて、各データの最大蛍光波長527nmの蛍光強度をグラフにし、下記の式を用いてカーブフィットすることにより解離定数を求めた。
Y=[Kd+Bt+Pt−{(Kd+Bt+Pt)2−4×Bt×Pt}1/2]/(2×Pt)
Yはビリルビンの結合度(蛍光強度)、Kdは解離定数、Btはビリルビン濃度、Ptはアポ体のUnaGタンパク質濃度(5nM)を表す。
ヒト検体を用いた実験は、独立行政法人理化学研究所の「人を対象とする研究規定」に従い、承認を得て実施した。
さらに、三菱化学メディエンス株式会社に生化学検査を依頼し、血清中の総ビリルビン値および直接ビリルビン値を酵素法(Doumas, B.T. et al., Clin. Chem.. 33, 1349-1353, 1987; Kurosaka K et al., Clin. Chim. Acta. 269, 125-136, 1998)により測定し、間接ビリルビン値を計算法により測定した。なお、計算法とは総ビリルビン量と直接ビリルビン量とを測定し、総ビリルビン量から直接ビリルビン量を差し引いた値を間接ビリルビン量とする方法である。間接ビリルビンの値と血清中のUnaGの蛍光強度との相関係数を求めた。結果を図8に示す。
図7は、ヒト血清にUnaGを混合した場合の蛍光検出結果を示した図である。縦軸は血清にアポ体のUnaGタンパク質を添加したときを0分としたときの経過時間、横軸は蛍光強度を指す。10検体の検査結果を示した。
(材料および方法)
<ランダム変異誘発>
Diversify(登録商標)PCRランダム突然変異誘発キット(Clonetech)を用いて、PCRで野生体のUnaGにランダムに突然変異を導入した。野生体のUnaGの鋳型DNAをもとにセンスプライマー(配列番号31)、アンチセンスプライマー(配列番号32)を用いて、PCRによりベクターに挿入するDNAを増幅した。大腸菌発現ベクターpRSETBのKpnI/BamHI制限酵素サイトにmCherry配列を挿入したpRSETB-mCherryベクターのBamHI/EcoRI制限酵素サイトに増幅したDNA断片をライゲーションした後、大腸菌株JM109(DE3)に形質転換しクローニングした。mCherryのアミノ酸配列を配列番号33、塩基配列を配列番号34に示す。
上述の形質転換によって得られた大腸菌コロニーから、ランダムにコロニーをピックアップし、LB培地1mlに植菌し、37℃で1晩培養した。8000rpmの回転速度で1分間遠心後、上清を除いた。回収した菌体に、B-PER Protein Extraction Reagents(Thermo Scientific)を400μl添加し、5分間攪拌した。8000rpmの回転速度で、4℃で3分間遠心し、上清を回収した。96穴マイクロプレート(FIAブラックプレート、greiner bio-one)に各サンプルをそれぞれ50μlずつ4穴に分注した。ビリルビン溶液を150μl添加し、終濃度がそれぞれ0.01、0.1、1.0および10μMとなるようにした。室温で20分間インキュベートし、EnSpire(登録商標)マルチモードプレートリーダー(株式会社パーキンエルマー)を用いて、UnaGの野生体および改変体について、波長497nmの励起光で波長527nmの蛍光強度を測定した。また、mCherryについて、励起波長580nmで波長610nmの蛍光強度を測定した。UnaGタンパク質のmCherryに対する蛍光強度比を求めてプロットした。野生体のUnaGタンパク質と比較して、ビリルビンに低親和性を示し、且つ野生体と同程度の蛍光強度を保つクローンであるUnaG改変体のタンパク質のプロットの結果を図9に示す。
配列解析の結果、野生体の12番目のAがEに、80番目のSがNにそれぞれ置換したアミノ酸配列を有する変異体(以降A12ES80N改変体と称する)であることが分かった。得られたアミノ酸配列を配列番号29に示す。
<大腸菌におけるA12ES80N改変体UnaGタンパク質(アポ体)の発現>
A12ES80N改変体のDNA断片を大腸菌発現ベクターpcRSETBのKpnI/BamHI制限酵素サイトにFLAGタグ配列(配列番号26)を挿入したpRSETB-FLAGベクターのBamHIおよびEcoRIの制限酵素サイトにライゲーションし、大腸菌株JM109(DE3)に形質転換しサブクローニングした。
菌体を5mlのPBSで懸濁し、リゾチーム(4mg/ml)を50μl添加し、液体窒素で菌体を凍結させた後融解させた。この凍結融解の作業を3回繰り返し、3分間超音波処理を行った後、7000rpm、4℃で20分間遠心分離し、上清を回収し可溶化液を得た。PBSで平衡化した1mlのNi−NTA Agarose(QIAGEN)と可溶化液を4℃で1時間インキュベートし、担体にHis−FLAG融合UnaGを結合させた。担体の総容量の10倍以上の5mMのイミダゾールを含むPBSで洗浄した後、更に担体の総容量の15倍以上の10mMのイミダゾールを含むPBSで洗浄した。その後、300mMのイミダゾールを含むPBSを500μlずつ担体に添加し、His−FLAG−UnaG改変体タンパク質を溶出し、ブラッドフォード法を用いて溶出画分を検出した。溶出画分を回収し、Amicon Ultra−4(メルクミリポア)を用いて限外濾過を行い、濃縮した。イミダゾールを除去するために、PBSで平衡化した脱塩カラムPD−10(GEヘルスケア)に濃縮したタンパク溶液を添加し、PBSを500μlずつ加えHis−FLAG−UnaG改変体タンパク質を溶出し、ブラッドフォード法を用いて溶出画分を検出した。精製したHis−FLAG−UnaG改変体タンパク質について、以下に示した計算式によりA280の吸光度に基づきタンパク質濃度を求めた。その後SDS−PAGE電気泳動によって精製の確認を行った。
εM=Trp(2)×5500+Tyr(7)×1490+Cystine(0)×125=21430(A280/mol/cm)
タンパク濃度=A280/εM=A280/21430(mol/dm3)
精製後、ビリルビンと再構成させることによりホロ体を調製した。ホロ体の調製方法は、上述の2−2.に記載の方法と同様の方法を用いて行った。
ホロ体のA12ES80N改変体タンパク質の蛍光特性について分析するため、蛍光スペクトル、吸収スペクトルおよび量子収率(励起波長470nm)の測定を行った。測定は上述の3.に記載の方法と同様の方法によって行った。また、野生体のUnaGタンパク質の値と比較した。結果を図10および表4に示す。
(材料および方法)
<解離定数測定>
アポ体のA12ES80N改変体タンパク質にビリルビンを滴定し、分光蛍光光度計F-2500(株式会社日立ハイテクノロジーズ)で蛍光強度を測定した。その結果をプロットし、データ分析およびグラフ作成ソフトウェアOrigin(OriginLab社)によりフィッティングを行い解離定数(Kd)を求めた。ビリルビンの滴定方法および解離定数の測定方法については、7.に記載の方法と同様の方法によって行った。結果を図11に示す。
図11は、ビリルビンの量と、野生体のUnaGタンパク質(左)またはA12ES80N改変体のUnaGタンパク質(右)の蛍光強度との相関を示した図である。カーブフィッティングの結果、UnaG野生体のKd=98pMに対し、A12ES80N改変体はKd=1.9nMの親和力でビリルビンに結合することが分かった。
Claims (3)
- ビリルビンと結合していない、ポリペプチド又は融合ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、以下の(1)〜(4)のいずれか1つに示す、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチドから成る群より選択され、且つ、前記融合ポリペプチドが、以下の(1)〜(4)のいずれか1つに示す、ビリルビン存在下において蛍光特性を有するポリペプチドから成る群より選択されるポリペプチドと他のポリペプチドとから成る融合ポリペプチドである、前記ポリペプチド又は融合ポリペプチド。
(1) 配列番号1記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(2) 配列番号1記載のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するポリペプチド、
(3) 配列番号1記載のアミノ酸配列においてA12E及びS80N、またはR82E及びK84Eから成る群より選択される1以上の置換を有するポリペプチド、及び、
(4) 配列番号5又は29記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。 - 請求項1記載のポリペプチド又は融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1記載のポリペプチド又は融合ポリペプチドを含むビリルビン検出用組成物。
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