JP2014018191A - オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼ - Google Patents
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Abstract
【課題】様々な色の発光を生じさせるルシフェラーゼの提供。
【解決手段】オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、そのアミノ酸配列は57個のアミノ酸から成る部分配列を含み、前記部分配列において、N末端側から1番目から19番目のアミノ酸配列は特定のアミノ酸配列であり、N末端側から20番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸であり、N末端側から21番目から57番目のアミノ酸配列は他の特定のアミノ酸配列であり、少なくともpH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記20番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼである。
【選択図】図1
【解決手段】オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、そのアミノ酸配列は57個のアミノ酸から成る部分配列を含み、前記部分配列において、N末端側から1番目から19番目のアミノ酸配列は特定のアミノ酸配列であり、N末端側から20番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸であり、N末端側から21番目から57番目のアミノ酸配列は他の特定のアミノ酸配列であり、少なくともpH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記20番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼである。
【選択図】図1
Description
本発明は、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼに関する。
種々の生物に由来するルシフェラーゼが多数知られている。異なる生物に由来するルシフェラーゼ同士は、互いに固有の色の発光を生じさせる場合が多い。しかしながら、所望の色の発光を生じさせるルシフェラーゼを多数揃えることは困難である。
一方、単一のルシフェラーゼに対して添加物を加えて発光の色を変化させることも試みられている。この場合、色ごとに添加物の成分や濃度等が異なる場合がある。
また、ルシフェラーゼのペプチドの構造やルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を、試行錯誤して改変することで、発光の色が異なる変異体を取得しようとする試みも存在する。この場合、ペプチドや塩基配列の改変部位が色ごとに異なる場合があり、色のバリエーションを増やすことは困難であり、また、改変後のルシフェラーゼ同士の特性が異なることがある。
"Bioluminescent Indicator for Determining Protein-Protein Interactions Using Intramolecular Complementation of Split Click Beetle Luciferase" Anal. Chem., 2007, 79 (13), pp 4820-4826
本発明の目的は、様々な色の発光を生じさせるルシフェラーゼを提供することにある。
本発明に係るルシフェラーゼは、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、そのアミノ酸配列は57個のアミノ酸から成る部分配列を含み、前記部分配列において、N末端側から1番目から19番目のアミノ酸配列は配列番号3に示されるアミノ酸配列であり、N末端側から20番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸であり、N末端側から21番目から57番目のアミノ酸配列は配列番号4に示されるアミノ酸配列であり、少なくともpH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記20番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼである。
また、本発明に係るルシフェラーゼは、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、そのアミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列において少なくともN末端側から285番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、少なくともpH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記285番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼである。
本発明によれば、様々な色の発光を生じさせるルシフェラーゼが提供される。
本発明の第1実施形態はルシフェラーゼに関する。
本発明の第1実施形態に係るルシフェラーゼは、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、そのアミノ酸配列は57個のアミノ酸から成る部分配列を含み、前記部分配列において、N末端側から1番目から19番目のアミノ酸配列は配列番号3に示されるアミノ酸配列であり、N末端側から20番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸であり、N末端側から21番目から57番目のアミノ酸配列は配列番号4に示されるアミノ酸配列であり、少なくともpH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記20番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼである。
ルシフェラーゼとは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ATPの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが酸化する際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。
本発明において、オキナワマドボタル(Pyrocoelia matsumurai)とは節足動物門昆虫綱コウチュウ目ホタル科マドボタル属に属すホタルである。オキナワマドボタルの例は、主に沖縄本島に生息する基亜種ピロコエリア・マツムライ・マツムライ(Pyrocoelia matsumurai matsumurai)である。
本発明において、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼには、オキナワマドボタルが本来有する野生型のルシフェラーゼだけでなく、この野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列に変異が生じた変異型ルシフェラーゼが含まれる。この変異は、例えば、1つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加である。この変異は、例えば、ルシフェラーゼの酵素活性には影響がないまたはほとんど影響がない変異、またはタンパク質の分解に対する耐性の向上といった酵素活性には直接影響しないものの、実験的な操作性を向上させる変異である。この変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で、例えば、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上または99%以上の相同性を有する。
オキナワマドボタルの野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、次の通りである:
MEDDHKNIVHGPAPFYPLEEGTAGEQLHRAMKRYAQVPGTIAFTDAHVEVNITYSEYFEMACRLAETMKRYGLGLQHHIAVCSENSLQFFMPVCGALFIGVGVAPTNDIYNERELYNSLSISQPTIVFCSKRALQKILGVQKKLPVIEKIVILDSREDYMGKQSMYSFIESHLPAGFNEYDYVPDTFDRETATALIMNSSGSTGLPKGVELTHKNVCVRFSHCRDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLVDKYDLSNLHEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGDDKPGACGKVVPFFSAKIVDLDTSKTLGVNQRGELCLKGPMIMKGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYYDKDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPFIFDAGVAGIPDADAGELPAAVVVLEEGKTMTEQEVMDYVAGQVTASKRLRGGVKFVDEVPKGLTGKIDSRKIREMLTMGKKSKL(配列番号1)。
MEDDHKNIVHGPAPFYPLEEGTAGEQLHRAMKRYAQVPGTIAFTDAHVEVNITYSEYFEMACRLAETMKRYGLGLQHHIAVCSENSLQFFMPVCGALFIGVGVAPTNDIYNERELYNSLSISQPTIVFCSKRALQKILGVQKKLPVIEKIVILDSREDYMGKQSMYSFIESHLPAGFNEYDYVPDTFDRETATALIMNSSGSTGLPKGVELTHKNVCVRFSHCRDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLVDKYDLSNLHEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGDDKPGACGKVVPFFSAKIVDLDTSKTLGVNQRGELCLKGPMIMKGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYYDKDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPFIFDAGVAGIPDADAGELPAAVVVLEEGKTMTEQEVMDYVAGQVTASKRLRGGVKFVDEVPKGLTGKIDSRKIREMLTMGKKSKL(配列番号1)。
なお、配列番号2に示されるアミノ酸配列(MYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLVDKYDLSNLHEIASGGAPLAK)は、配列番号1に示されるアミノ酸配列のN末端側から266番目から322番目のアミノ酸配列と同一である。また、配列番号3に示されるアミノ酸配列(MYRFEEELFLRSLQDYKIQ)は、配列番号1に示されるアミノ酸配列のN末端側から266番目から284番目のアミノ酸配列と同一であり、配列番号2に示されるアミノ酸配列のN末端側から1番目から19番目のアミノ酸配列と同一である。さらに、配列番号4に示されるアミノ酸配列(ALLVPTLFSFFAKSTLVDKYDLSNLHEIASGGAPLAK)は、配列番号1に示されるアミノ酸配列のN末端側から286番目から322番目のアミノ酸配列と同一であり、配列番号2に示されるアミノ酸配列のN末端側から21番目から57番目のアミノ酸配列と同一である。
第1実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列に含まれる部分配列は、野生型ルシフェラーゼの配列番号2に示されるアミノ酸配列に対応しているものの、配列番号2に示されるアミノ酸配列のN末端側から20番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸に変異している。すなわち、この部分配列のうち、N末端側から1番目から19番目のアミノ酸配列は配列番号3に示されるアミノ酸配列であり、N末端側から20番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸であり、N末端側から21番目から57番目のアミノ酸配列は配列番号4に示されるアミノ酸配列である。
部分配列のN末端側から20番目のアミノ酸は、セリン以外の任意のアミノ酸とすることができる。例えば、この20番目のアミノ酸は、アラニン(A)、アルギニン(R)、アスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、システイン(C)、グルタミン(Q)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、リジン(K)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、プロリン(P)、スレオニン(T)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)またはバリン(V)である(括弧内のアルファベットはそれぞれのアミノ酸の一文字略号である。以下、同様)。特に、20番目のアミノ酸の例は、スレオニン(T)、リジン(K)またはイソロイシン(I)である。また、20番目のアミノ酸の別の例は、修飾されたアミノ酸である。
第1実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列は、部分配列以外の配列において、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列と完全に一致していなくてもよい。すなわち、第1実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列は、上述したように、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して変異が生じたものであってよい。
第1実施形態に係るルシフェラーゼによって触媒される発光反応により生じる発光は、比較対象となるルシフェラーゼによる発光とは異なる発光スペクトルを示す。ここにおいて、比較対象となるルシフェラーゼとは、第1実施形態に係るルシフェラーゼの部分配列のN末端側から20番目のアミノ酸をセリンに置換されているアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。すなわち、第1実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較対象となるルシフェラーゼのアミノ酸配列とは、この20番目のアミノ酸のみが異なる。
特に、第1実施形態に係るルシフェラーゼによって触媒されるpH7付近の環境下での発光反応により生じる発光は、比較対象となるルシフェラーゼを用いた場合に生じる発光とは異なる最大発光波長を示す。好ましくは、これらの発光が異なる色として区別できる程度に、互いの最大発光波長は異なる。なお、pH7付近とは、生体内の主要な領域において検出されるpHを意味し、例えばpH6.5からpH7.5の範囲を意味する。実施形態に係るルシフェラーゼは、生体内の種々の領域においてpHが変動したとしても、pH7付近において示す特性を維持するものであってよい。
第1実施形態に係るルシフェラーゼは、既知の手法によって作製することができる。例えば、一般的な変異導入方法を用いて、野生型のルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を改変し、第1実施形態に係るルシフェラーゼの遺伝子を取得できる。さらに、この遺伝子を細胞に導入し、細胞内で第1実施形態に係るルシフェラーゼを発現させることができる。第1実施形態に係るルシフェラーゼは、その他のタンパク質と融合した状態で細胞内に発現させることもできる。
本発明の第2実施形態はルシフェラーゼに関する。
本発明の第2実施形態に係るルシフェラーゼは、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、そのアミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列において少なくともN末端側から285番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、少なくともpH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記285番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼである。
第2実施形態に係るルシフェラーゼは、第1実施形態に係るルシフェラーゼと同様に、オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼである。
第2実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列(配列番号1)と比較した場合、少なくともN末端側から285番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸となっている。この285番目のアミノ酸は、例えば、アラニン(A)、アルギニン(R)、アスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、システイン(C)、グルタミン(Q)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、リジン(K)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、プロリン(P)、スレオニン(T)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)またはバリン(V)である。特に、285番目のアミノ酸の例は、スレオニン(T)、リジン(K)またはイソロイシン(I)である。また、285番目のアミノ酸の別の例は、修飾されたアミノ酸である。
第2実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で、285番目のアミノ酸だけでなく、それ以外のアミノ酸も異なっていてもよい。
第2実施形態に係るルシフェラーゼによって触媒される発光反応により生じる発光は、比較対象となるルシフェラーゼによる発光とは異なる発光スペクトルを示す。ここにおいて、比較対象となるルシフェラーゼとは、第2実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列のN末端側から285番目のアミノ酸をセリンに置換したアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。すなわち、第2実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列と比較対象となるルシフェラーゼのアミノ酸配列とは、この285番目のアミノ酸のみが異なる。
特に、第2実施形態に係るルシフェラーゼによって触媒されるpH7付近の環境下での発光反応により生じる発光は、比較対象となるルシフェラーゼを用いた場合に生じる発光とは異なる最大発光波長を示す。好ましくは、これらの発光が異なる色として区別できる程度に、互いの最大発光波長は異なる。なお、pH7付近とは、生体内の主要な領域において検出されるpHを意味し、例えばpH6.5からpH7.5の範囲を意味する。実施形態に係るルシフェラーゼは、生体内の種々の領域においてpHが変動したとしても、pH7付近において示す特性を維持するものであってよい。
第2実施形態に係るルシフェラーゼは、第1実施形態に係るルシフェラーゼと同様に、既知の手法によって作製することができる。
第1および第2実施形態に係るルシフェラーゼにおいて、pH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長は、557から618nmであってよい。さらに、第1および第2実施形態に係るルシフェラーゼにおいて、pH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長は、600から618nmであってよい。
第1実施形態に係るルシフェラーゼを利用して、部分配列のN末端側から20番目のアミノ酸が互いに異なる複数の第1実施形態に係るルシフェラーゼから成るルシフェラーゼのセットを構成することができる。また、第2実施形態に係るルシフェラーゼを利用して、そのアミノ酸配列のN末端側から285番目のアミノ酸が互いに異なる複数の第2実施形態に係るルシフェラーゼから成るルシフェラーゼのセットを構成することができる。
第1実施形態または第2実施形態に係るルシフェラーゼによれば、わずか1つのアミノ酸の置換により発光の色を変化させることができる。このような1つのアミノ酸の置換により得られる、互いに発光の色が異なる複数のルシフェラーゼは、互いに1つのアミノ酸しか違わないため、立体構造といったタンパク質の特性に殆ど差がでない。そのため、これらのルシフェラーゼを同一の条件の下で使用することが可能となり、それぞれから得られた結果を直接比較することも可能となる。また、これらのルシフェラーゼに対して、単一のルシフェリンを使用することができるため、これらのルシフェラーゼを単一の被験試料中に同時に発現させることができ、同時に測定することが可能となる。
本発明の第3実施形態は核酸に関する。
第3実施形態に係る核酸は、第1または第2実施形態に係るルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む。第3実施形態に係る核酸は、プロモーターといった転写制御のための因子が結合する領域をさらに含んでよい。第3実施形態に係る核酸は、第1または第2実施形態に係るルシフェラーゼとは異なるタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでよい。この場合、この異なるタンパク質とルシフェラーゼとが融合した状態で発現されるように、ルシフェラーゼの遺伝子とこの異なるタンパク質の遺伝子とが核酸上に配置されている。
本発明の第4実施形態はベクターに関する。
第4実施形態に係るベクターは、第3実施形態に係る核酸を含む。第4実施形態に係るベクターは、抗生物質耐性遺伝子および複製起点といった一般的なベクターに含まれる要素を含んでよい。
第3実施形態に係る核酸によれば、第1または第2実施形態に係るルシフェラーゼを遺伝子の形で保存することができる。さらに、第4実施形態に係るベクターによれば、このような遺伝子を生物に対して容易に導入することができる。
本発明の第5実施形態は被験試料を分析する方法に関する。
第5実施形態に係る方法は、pH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が557nm以上且つ570nm未満である請求項1または2に記載のルシフェラーゼ、pH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が570nm以上且つ600nm未満である請求項1または2に記載のルシフェラーゼ、およびpH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が600nm以上且つ618nm以下である請求項1または2に記載のルシフェラーゼから成る群から選択される少なくとも2つのルシフェラーゼを含む被験試料を用意すること、前記被験試料に対してルシフェリンを投与すること、および前記ルシフェリンが酸化する際に生じる発光を検出することを含む。
被験試料は、種々の生物であってよい。被験試料は、例えば、細胞、組織または個体である。細胞は、例えば哺乳類の細胞であってよい。被験試料へのルシフェラーゼの導入は、既知の方法により行うことができる。例えば、ルシフェラーゼの遺伝子を被験試料に導入して、遺伝子を発現させることができる。少なくとも2つのルシフェラーゼは被験試料中に同時に存在してもよく、またはそれぞれのルシフェラーゼが被験試料中に存在する時間がずれていてもよい。
ルシフェリンの投与は既知の方法により行うことができる。例えば、被験試料が培養細胞である場合には、培養液中にルシフェリンを投与することができる。あるいは、マイクロマニュピレーション法により被験試料中に直接ルシフェリンを投与してもよい。ルシフェリンは、任意のタイミングで投与することができる。被験試料に対して、単一のルシフェリンを投与することができる。
発光の検出は経時的に行うことができる。発光の検出は、既知の方法により行うことができる。例えば、光電子倍増管を用いて、光子の量を定量することができる。あるいは、光学的結像手段を用いて行うことができる。光学的結像手段は、特定の波長を有した光を選択的に捉える手段を備えてよい。また、光学的結像手段は、検出した画像を電子データに変換するための撮像素子を備えてよい。光学的結像手段の例は蛍光顕微鏡である。また別の例は、発光イメージングシステムLV200(オリンパス株式会社)である。
第5実施形態に係る方法で使用される3種のルシフェラーゼは、互いに区別可能な色を有した発光をそれぞれ生じさせる。したがって、第5実施形態に係る方法によれば、単一の被験試料から複数の異なる発光を検出することが可能となる。また、いずれのルシフェラーゼについても単一のルシフェリンによって発光を生じさせることができるため、操作が容易となるだけでなく、条件のそろった精度の高い観察が可能となる。
本発明の第6実施形態は、タンパク質間の相互作用を観察する方法に関する。
第6実施形態に係る方法は、少なくとも2種以上の融合タンパク質を含む被験試料を用意すること、被験試料に対してルシフェリンを投与すること、および被験試料から放射される発光を検出することを含む。
被験試料に含まれる融合タンパク質の1つは、第1または第2実施形態に係るルシフェラーゼの断片Aと任意のタンパク質Xとから成る。便宜的にこの融合タンパク質をA−Xと呼ぶ。残る融合タンパク質は、第1または第2実施形態に係るルシフェラーゼの断片Bnと任意のタンパク質Ynとから成る。便宜的にこの融合タンパク質をBn−Ynと呼ぶ。
ここで、nは任意の整数であり、被験対象に発現する融合タンパク質の種類の数から1を引いた値である。例えば、被験対象が3種の融合タンパク質を発現する場合、nは2となる。この場合、3種の融合タンパク質のうちの1種はA−Xであり、その他の2種はB1−X1およびB2−X2である。
断片Aは、例えばルシフェラーゼのN末端側断片であり、断片Bnはその残りとなるC末端側断片である。あるいは、断片Aは、例えばルシフェラーゼのC末端側断片であり、断片Bnはその残りとなるN末端側断片である。いずれの断片も、全長ルシフェラーゼが本来有する酵素活性を失っている。
ここで、第1実施形態に係るルシフェラーゼの部分配列のN末端側から20番目のアミノ酸および第2実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列のN末端側から285番目のアミノ酸を、便宜的に、ともに「置換アミノ酸」と呼ぶ場合、断片Bnは必ずこの置換アミノ酸を含む。一方、断片Aはこの置換アミノ酸を含まない。そして、nが3以上である場合、すなわち、Bn−Ynが被験試料中に複数種存在する場合、融合タンパク質中の置換アミノ酸のアミノ酸の種類は互いに異なる。
ルシフェリンの投与は、第5実施形態に係る方法と同様に行うことができる。
発光の検出は、第5実施形態に係る方法と同様に行うことができる。但し、第6実施形態に係る方法では、nが3以上である場合、発光の色が何であるかの判断が行われる。すなわち、発光の最大発光波長が特定される。
第6実施形態に係る方法では、タンパク質Xとタンパク質Ynとが相互作用した場合、それぞれに融合している断片Aと断片Bnとが接近し、ルシフェラーゼの酵素活性が復活する。このとき、付近にルシフェリンが存在していれば、ルシフェラーゼの触媒作用によりルシフェリンが酸化され、発光が生じる。この発光に基づいて、タンパク質Xとタンパク質Ynとの相互作用を確認することができる。
さらに、nが3以上であり、被験試料中に融合タンパク質Bn−Ynが複数種存在する場合には、Bnに応じて生じる発光の色が異なるため、発光の色に基づいて、タンパク質Xに対して、どのタンパク質Ynが結合したかを判定することができる。
また、光学的結像手段を用いて被験試料を観察することで、タンパク質同士の局所的な相互作用を調べることができる。さらに、経時的に観察することで、相互作用の変動を調べることができる。
(1)野生型ルシフェラーゼ遺伝子の取得
特開2011−167079号に開示される方法に倣って、野生型ルシフェラーゼ遺伝子を取得した。すなわち、オキナワマドボタルから作製した完全長cDNAライブラリーを鋳型として、適宜設定したプライマーセットを用いてPCR法により野生型ルシフェラーゼ遺伝子をクローニングした。
特開2011−167079号に開示される方法に倣って、野生型ルシフェラーゼ遺伝子を取得した。すなわち、オキナワマドボタルから作製した完全長cDNAライブラリーを鋳型として、適宜設定したプライマーセットを用いてPCR法により野生型ルシフェラーゼ遺伝子をクローニングした。
完全長cDNAライブラリーは次のようにして取得した。沖縄県沖縄本島で採集したオキナワマドボタル(Pyrocoelia matsumurai)の幼虫から発光器を採取し、Lysing Matrix Dチューブ(MP−Biomedicals社)に1mLのトータルRNA抽出試薬TRIzol Reagent(インビトロジェン社)とともに入れた。このチューブを組織細胞破砕装置FastPrep 24(MP−Biomedicals社)またはFastPrep FP100A(MP−Biomedicals社)に装着して、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。破砕した溶液からトータルRNAの分離精製した後、完全長cDNA合成試薬GeneRacer(インビトロジェン社)を使用して、沈殿濃縮したトータルRNAから完全長cDNAを合成した。
プライマーセットは、オキナワマドボタルに由来する野生型ルシフェラーゼの遺伝子(配列番号5)に基づいて適宜作製した。PCR法によって増幅された遺伝子を含む核酸をベクターに挿入した。以下に、野生型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を示す:
ATGGAAGATGATCATAAAAATATTGTGCACGGTCCAGCGCCATTCTATCCTTTAGAGGAGGGAACTGCTGGAGAACAATTGCACAGAGCGATGAAGAGGTATGCACAGGTTCCAGGGACAATTGCTTTTACTGATGCACACGTAGAGGTAAACATTACATATTCCGAATATTTTGAAATGGCTTGCCGATTGGCCGAAACTATGAAGAGGTACGGACTTGGTTTGCAACACCACATTGCTGTTTGTAGTGAAAATTCTCTTCAGTTTTTTATGCCTGTATGCGGTGCTCTATTTATTGGGGTTGGAGTTGCACCAACAAATGATATTTACAATGAACGTGAATTATACAACAGTTTGTCCATATCACAACCTACAATAGTATTTTGTTCCAAAAGAGCTCTGCAAAAAATTCTAGGAGTACAAAAGAAATTACCTGTAATTGAGAAAATTGTTATTCTGGATTCTCGAGAGGATTATATGGGGAAACAATCTATGTACTCGTTCATTGAATCTCATTTACCTGCCGGTTTTAATGAATATGATTACGTACCGGATACTTTTGATCGCGAAACAGCAACAGCACTTATAATGAATTCATCAGGATCTACTGGATTGCCCAAGGGTGTTGAGCTTACTCACAAAAATGTTTGTGTTAGATTTTCTCACTGCAGAGATCCTGTGTTTGGTAATCAAATTATTCCCGATACTGCGATTTTAACAGTTATACCATTTCATCATGGTTTTGGAATGTTTACAACACTAGGATACTTAACGTGTGGATTTCGTATTGTGCTTATGTATAGATTTGAAGAGGAATTATTTTTACGATCACTTCAAGATTATAAAATTCAAAGTGCGTTGTTGGTACCAACCCTATTTTCATTCTTTGCCAAAAGCACCTTAGTCGACAAATACGATTTATCCAACTTACATGAAATTGCATCTGGTGGAGCTCCCCTCGCAAAAGAAGTTGGAGAAGCCGTAGCAAAACGTTTTAAGCTGCCGGGTATACGACAAGGGTACGGACTTACCGAAACTACCTCAGCTGTTATAATTACACCAGAAGGGGATGATAAACCAGGAGCATGTGGTAAAGTTGTTCCATTCTTTTCTGCCAAAATTGTTGATCTCGATACAAGCAAAACTTTGGGTGTTAATCAGCGAGGGGAATTATGTCTGAAAGGTCCAATGATAATGAAGGGTTACGTAAACAATCCAGAAGCAACAAATGCATTGATAGACAAAGATGGATGGTTACACTCTGGTGACATAGCTTACTATGACAAAGATGGTCATTTCTTCATAGTGGATCGTTTGAAATCGTTAATTAAATACAAAGGTTACCAGGTACCACCTGCCGAATTAGAATCGATATTGCTGCAACATCCCTTCATATTTGATGCAGGTGTTGCAGGAATTCCCGACGCAGATGCCGGTGAACTTCCTGCAGCCGTTGTTGTCTTAGAGGAAGGTAAAACGATGACTGAACAAGAAGTGATGGATTATGTTGCGGGACAAGTAACTGCTTCTAAACGTTTACGTGGAGGAGTTAAGTTTGTGGACGAAGTACCTAAAGGTCTAACTGGAAAGATTGATTCAAGAAAAATCAGGGAAATGCTTACGATGGGAAAAAAATCCAAATTGTAA(配列番号5)。
ATGGAAGATGATCATAAAAATATTGTGCACGGTCCAGCGCCATTCTATCCTTTAGAGGAGGGAACTGCTGGAGAACAATTGCACAGAGCGATGAAGAGGTATGCACAGGTTCCAGGGACAATTGCTTTTACTGATGCACACGTAGAGGTAAACATTACATATTCCGAATATTTTGAAATGGCTTGCCGATTGGCCGAAACTATGAAGAGGTACGGACTTGGTTTGCAACACCACATTGCTGTTTGTAGTGAAAATTCTCTTCAGTTTTTTATGCCTGTATGCGGTGCTCTATTTATTGGGGTTGGAGTTGCACCAACAAATGATATTTACAATGAACGTGAATTATACAACAGTTTGTCCATATCACAACCTACAATAGTATTTTGTTCCAAAAGAGCTCTGCAAAAAATTCTAGGAGTACAAAAGAAATTACCTGTAATTGAGAAAATTGTTATTCTGGATTCTCGAGAGGATTATATGGGGAAACAATCTATGTACTCGTTCATTGAATCTCATTTACCTGCCGGTTTTAATGAATATGATTACGTACCGGATACTTTTGATCGCGAAACAGCAACAGCACTTATAATGAATTCATCAGGATCTACTGGATTGCCCAAGGGTGTTGAGCTTACTCACAAAAATGTTTGTGTTAGATTTTCTCACTGCAGAGATCCTGTGTTTGGTAATCAAATTATTCCCGATACTGCGATTTTAACAGTTATACCATTTCATCATGGTTTTGGAATGTTTACAACACTAGGATACTTAACGTGTGGATTTCGTATTGTGCTTATGTATAGATTTGAAGAGGAATTATTTTTACGATCACTTCAAGATTATAAAATTCAAAGTGCGTTGTTGGTACCAACCCTATTTTCATTCTTTGCCAAAAGCACCTTAGTCGACAAATACGATTTATCCAACTTACATGAAATTGCATCTGGTGGAGCTCCCCTCGCAAAAGAAGTTGGAGAAGCCGTAGCAAAACGTTTTAAGCTGCCGGGTATACGACAAGGGTACGGACTTACCGAAACTACCTCAGCTGTTATAATTACACCAGAAGGGGATGATAAACCAGGAGCATGTGGTAAAGTTGTTCCATTCTTTTCTGCCAAAATTGTTGATCTCGATACAAGCAAAACTTTGGGTGTTAATCAGCGAGGGGAATTATGTCTGAAAGGTCCAATGATAATGAAGGGTTACGTAAACAATCCAGAAGCAACAAATGCATTGATAGACAAAGATGGATGGTTACACTCTGGTGACATAGCTTACTATGACAAAGATGGTCATTTCTTCATAGTGGATCGTTTGAAATCGTTAATTAAATACAAAGGTTACCAGGTACCACCTGCCGAATTAGAATCGATATTGCTGCAACATCCCTTCATATTTGATGCAGGTGTTGCAGGAATTCCCGACGCAGATGCCGGTGAACTTCCTGCAGCCGTTGTTGTCTTAGAGGAAGGTAAAACGATGACTGAACAAGAAGTGATGGATTATGTTGCGGGACAAGTAACTGCTTCTAAACGTTTACGTGGAGGAGTTAAGTTTGTGGACGAAGTACCTAAAGGTCTAACTGGAAAGATTGATTCAAGAAAAATCAGGGAAATGCTTACGATGGGAAAAAAATCCAAATTGTAA(配列番号5)。
(2)変異型ルシフェラーゼ遺伝子の作製
取得された野生型ルシフェラーゼ遺伝子に対して変異を導入し、変異型ルシフェラーゼ遺伝子を作製した。この変異は、アミノ酸配列のN末端側から285番目のセリンが、セリン以外の種々のアミノ酸に置換されるような変異であった。
取得された野生型ルシフェラーゼ遺伝子に対して変異を導入し、変異型ルシフェラーゼ遺伝子を作製した。この変異は、アミノ酸配列のN末端側から285番目のセリンが、セリン以外の種々のアミノ酸に置換されるような変異であった。
変異の導入は、一般的な部位特異的突然変異導入法により行った。285番目のセリンを、アラニン(A)、アルギニン(R)、アスパラギン(N)、アスパラギン酸(D)、システイン(C)、グルタミン(Q)、グルタミン酸(E)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、リジン(K)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、プロリン(P)、スレオニン(T)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)またはバリン(V)に置換するための変異導入用オリゴヌクレオチドをそれぞれ作製し、変異導入のために用いた。具体的には、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」(羊土社、2001年発行、p.17−25)に記載される方法に倣って行った。
作製された19個の変異型ルシフェラーゼ遺伝子および野生型ルシフェラーゼ遺伝子を、それぞれ発現用ベクターpRSET−Bに挿入した。
(3)大腸菌におけるルシフェラーゼの発現
上記の通り作製した20種の発現用ベクターを大腸菌JM109(DE3)株にそれぞれ形質転換し、コロニーを形成させた。得られたコロニーを培養し、LB寒天培地に塗布し、24時間かけて再度コロニーを形成させた。そして、55℃で1時間熱処理し、1時間室温で放置した後に、0.5mMのD−ルシフェリンを含む液体を噴霧した後、CCDカメラ(DP70、オリンパス製)で1分間撮影した。
上記の通り作製した20種の発現用ベクターを大腸菌JM109(DE3)株にそれぞれ形質転換し、コロニーを形成させた。得られたコロニーを培養し、LB寒天培地に塗布し、24時間かけて再度コロニーを形成させた。そして、55℃で1時間熱処理し、1時間室温で放置した後に、0.5mMのD−ルシフェリンを含む液体を噴霧した後、CCDカメラ(DP70、オリンパス製)で1分間撮影した。
取得された画像を図1(a)に示す。但し、この図に含まれる画像は、カラーにて取得された画像をモノクロに変換したものである。それぞれの大腸菌の左上には、285番目のアミノ酸をどのアミノ酸に置換したかが記載されており、例えば「S285N」と付された大腸菌は、285番目のアミノ酸がセリン(S)からアスパラギン(N)に置換されたルシフェラーゼを発現する大腸菌である。なお、「S285S」と付された大腸菌は、285番目のアミノ酸がセリン(S)のままであることを意味しており、すなわち、この大腸菌は野生型ルシフェラーゼを発現する。
取得されたカラーの画像から、野生型ルシフェラーゼを発現するS285Sでは、菌体が緑色に発光することがわかる。一方、変異型ルシフェラーゼを発現する大腸菌では、菌体が種々の色で発光していることがわかる。例えば、285番目のアミノ酸がスレオニンに置換されたS285Tでは菌体が黄色に発光しており、リジンに置換されたS285Kでは菌体がオレンジ色に発光しており、イソロイシンに置換されたS285Iでは菌体が赤色に発光していることがわかる。
(4)ルシフェラーゼの精製
上記20種のルシフェラーゼの各々を、それらが発現する大腸菌から抽出した。
上記20種のルシフェラーゼの各々を、それらが発現する大腸菌から抽出した。
JM109(DE3)を含む大腸菌溶液50μlにルシフェラーゼ発現ベクター0.5μlを添加し、氷上で10分、その後42℃で1分、最後に氷上で2分インキュベートした。その後、大腸菌溶液50μlをSOC培地200μlに加えた。その大腸菌/SOC培地混合溶液を37℃で20分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル100μlをLB培地プレート(100μg/mlアンピシリンを含む)にストリークし、37℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、5mlスケールのLB培地で培養した。培養は37℃で24時間、18℃で24時間行った。合計48時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収した。菌体は、200μlのB-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)に再度懸濁し、マニュアルに従って破砕およびルシフェラーゼを含む上清を抽出した。
(5)発光スペクトルの測定
抽出したルシフェラーゼに各々ついて、インビトロで発光スペクトルを測定した。最終濃度2mMとなるようにD−ルシフェリンを加えた後、発光スペクトルを測定した。測定には、LumiFlSpectroCapture(ATTO)を用いた。
抽出したルシフェラーゼに各々ついて、インビトロで発光スペクトルを測定した。最終濃度2mMとなるようにD−ルシフェリンを加えた後、発光スペクトルを測定した。測定には、LumiFlSpectroCapture(ATTO)を用いた。
測定した結果を図2から6に示した。図2には、「S285W」、「S285P」および「S285D」以外の発光スペクトルを示した。なお、参考のために、「25℃」および「37℃」として、それぞれの温度においてコメツキムシ由来のルシフェラーゼを使用した場合に得られる発光スペクトルを示した。個々のスペクトルを確認し易くすることを目的として、図3から6には、図2に示された発光スペクトルを4から5個ずつに分けてそれぞれ示した。また、図1(b)の表には、それぞれのルシフェラーゼの最大発光波長をまとめた。図2から6から、変異型ルシフェラーゼは、それぞれ野生型ルシフェラーゼとは異なる発光スペクトルを示すことがわかる。
以上の結果から、285番目のセリンを置換するだけで、種々の発光スペクトルを有するルシフェラーゼを取得できることが示された。
Claims (9)
- オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、
そのアミノ酸配列は57個のアミノ酸から成る部分配列を含み、前記部分配列において、N末端側から1番目から19番目のアミノ酸配列は配列番号3に示されるアミノ酸配列であり、N末端側から20番目のアミノ酸はセリン以外のアミノ酸であり、N末端側から21番目から57番目のアミノ酸配列は配列番号4に示されるアミノ酸配列であり、
少なくともpH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記20番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼ。 - オキナワマドボタルに由来するルシフェラーゼであって、
そのアミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列において少なくともN末端側から285番目のアミノ酸がセリン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列であり、
少なくともpH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が、前記285番目のアミノ酸がセリンであることを除いて同一のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを用いた場合の最大発光波長とは異なるルシフェラーゼ。 - pH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が557から618nmである請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。
- pH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が600から618nmである請求項3に記載のルシフェラーゼ。
- 前記20番目のアミノ酸または前記285番目のアミノ酸は、スレオニン、リジンまたはイソロイシンである請求項1から4の何れか1項に記載のルシフェラーゼ。
- 請求項1から5の何れか1項に記載のルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む核酸。
- 請求項6に記載の核酸を含むベクター。
- pH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が互いに異なる複数の請求項1または2に記載のルシフェラーゼから成る群から選択される少なくとも2つ以上のルシフェラーゼを含む被験試料を用意すること、
前記被験試料に対してルシフェリンを投与すること、および
前記ルシフェリンが酸化する際に生じる発光を検出すること
を含む被験試料を分析する方法。 - pH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が557nm以上且つ570nm未満である請求項1または2に記載のルシフェラーゼ、
pH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が570nm以上且つ600nm未満である請求項1または2に記載のルシフェラーゼ、および
pH7付近の環境下における発光反応を触媒した場合に放射される発光の最大発光波長が600nm以上且つ618nm以下である請求項1または2に記載のルシフェラーゼ
から成る群から選択される少なくとも2つのルシフェラーゼを含む被験試料を用意すること、
前記被験試料に対してルシフェリンを投与すること、および
前記ルシフェリンが酸化する際に生じる発光を検出すること
を含む被験試料を分析する方法。
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WO2016051517A1 (ja) * | 2014-09-30 | 2016-04-07 | オリンパス株式会社 | オレンジ色の発光を示すルシフェラーゼ |
-
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US10287556B2 (en) | 2014-09-30 | 2019-05-14 | Olympus Corporation | Luciferase showing orange luminescence |
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