JP5896624B2 - ホタル由来ルシフェラーゼ - Google Patents
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Description
1.材料
材料として沖縄県沖縄本島で採集したオキナワマドボタル(Pyrocoelia matsumurai)の幼虫を用いた。
ホタルの幼虫からハサミを用いて発光器を切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるLysing Matrix Dチューブ(MP−Biomedicals社)に、採取した発光器および1mLのトータルRNA抽出試薬TRIzol Reagent(インビトロジェン社)を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置FastPrep 24(MP−Biomedicals社)またはFastPrep FP100A(MP−Biomedicals社)に装着し、振動速度6.5m/sおよび振動時間45秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、30分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕を実施した。
3−1.Rapid Amplification of cDNA End(RACE)法に用いるプライマーの作製
オキナワマドボタルのルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをPolymerase chain reaction(PCR)法によって行った。このPCRに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。
上述の通り作製したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した12種類の特異的混合プライマーおよび5’末端特異的プライマーであるGeneRacer5’Primer(5’−CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA−3’:配列番号19)およびGeneRacer5’Nested Primer(5’−GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA−3’:配列番号20)を用いて5’−RACE PCRを行った。GeneRacer5’ PrimerおよびGeneRacer5’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれているものを使用した。5’−RACE PCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
5’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
4−1.3’Race PCRに用いるプライマーの設計
5’Race PCRの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側非翻訳領域の配列を基にして、3’RACEに用いるプライマーおよびNested PCRに用いるプライマーを作成した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。
上述の通り作成したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの5’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーNo6(2/3)−Full−F1(GACACTAACGCGCTAACATCATTGCAAGA:配列番号23)およびGeneRacer3’ Primer(5’−GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G−3’:配列番号24)およびGeneRacer3’ Nested Primer(5’−CGC TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG−3’:配列番号25)を用いて3’−RACE PCRを行った。GeneRacer3’ PrimerおよびGeneRacer3’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれているものを使用した。3’−RACE PCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
3’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
1.野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現
野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、pRSET−Bベクター(インビトロジェン)に導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。
上述の通り決定した塩基配列によれば、野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼ遺伝子はBamHIおよびEcoRIの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」(羊土社、2001年発行、p.17−25)に示される方法に従った。変異導入後の配列は、配列番号3に示される塩基配列である。
ルシフェラーゼ遺伝子を、pRSET−Bベクターの制限酵素サイトBamHI−EcoRI間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素BamHI認識配列GGATCCを含むプライマー、並びに終始コドンおよびその後ろに制限酵素EcoRI認識配列GAATTCを含むプライマーを作成した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。PCRにはポリメラーゼKOD−Plis−(東洋紡績株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
JM109(DE3)を含む大腸菌溶液50μlにルシフェラーゼ発現ベクター0.5μlを添加し、氷上で10分、その後42℃で1分、最後に氷上で2分インキュベートした。その後、大腸菌溶液50μlをSOC培地200μlに加えた。その大腸菌/SOC培地混合溶液を37℃で20分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル100μlをLB培地プレート(100μg/mlアンピシリンを含む)にストリークし、37℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、500mlスケールのLB培地で培養した。培養は37℃で24時間、18℃で24時間行った。合計48時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、0.1M Tris−HCl溶液(pH8.0)に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離(15000rpm、10分)し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム2mlのカラムにNi−Agar懸濁液500μlと0.1M Tris−HCl2mlを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て4℃の条件で行った。25mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液2mlでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに500mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液を2ml加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムPD−10(GEヘルスケア)でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをVivaspin6(ザルトリウス)で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、50%グリセリン溶液とした。保存は−20℃で行った。
測定のための装置としてLumiFlSpectroCapture(ATTO)を用い、0.1Mクエン酸/0.1M Na2HPO4 buffer(pH6.0−8.0)に1mM D−ルシフェリン、2mM ATPおよび4mM MgCl2を含む溶液に、精製酵素を1μg/mlから10μg/mlの間の最終濃度で添加し、酵素添加後15秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果を図1に示す。
4−1.D−ルシフェリンおよびATPの濃度の決定
D−ルシフェリン溶液中のD−ルシフェリン濃度およびATP溶液中のATP濃度を以下の通りに決定した。
D−ルシフェリン:λmax 328nm、ε18200、pH5.0
ATP:λmax 259nm、ε15400、pH7.0。
様々なD−ルシフェリン濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、D−ルシフェリンに対するKm値を決定した。
様々なATP濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ATPに対するKm値を決定した。
野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼによる発光強度を、既知のルシフェラーゼおよびローダミン6Gによる発光強度と比較した。
ローダミン6Gを0.1Mクエン酸/0.2M Na2HPO4(pH4.0)溶液に溶解した。このローダミン6G溶液を15000rpmで1分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を0.1Mクエン酸/0.2M Na2HPO4溶液で1000倍希釈し、希釈液の吸光度を測定した。測定はNanoVue(GEヘルスケア)で行った。測定は530nmにおいて5回行い、その平均値として0.048の吸光度が得られた。ローダミン6Gのε値(1.16x105mol−1cm−1)を用いて元のローダミン6G溶液の濃度を算出した結果、414μMであった。この溶液を0.1Mクエン酸/0.2M Na2HPO4溶液(pH4.0)で希釈し、30μMの希釈液を作製した。
JM109(DE3)株を含む溶液50μlにルシフェラーゼ発現ベクターを含む溶液0.5μlを添加し、氷上で10分、42℃で1分、氷上で2分インキュベートした。その後、この大腸菌溶液50μlをSOC培地200μlに加えた。大腸菌/SOC培地混合溶液を37℃で20分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル100μlをLB培地プレート(100μg/mlアンピシリンを含む)にストリークし、37℃で一晩インキュベートした。翌日、できたコロニーをピックアップし、500mlスケールのLB培地で培養した。培養は37℃で24時間、18℃で24時間行った。合計48時間の培養の後、遠心分離によって菌体を回収し、0.1M Tris−HCl溶液(pH8.0)に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離し(15000rpm、10分間)、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム2mlのカラムにNi−Agar懸濁液500μlおよび0.1M Tris−HCl溶液2mlを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て4℃の条件で行った。25mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液2mlでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに500mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液を2ml加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムPD−10(GEヘルスケア)でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをVivaspin6(ザルトリウス)で限界ろ過した。
以上のように測定したローダミン6G、P.ピラリスルシフェラーゼおよび野生型オキナワマドボタルルシフェラーゼによる化学発光の強度を図3に示す。
オキナワマドボタルをHeLa細胞に発現させて、細胞内での発光強度を測定した。
アミノ酸配列上531番目のイソロイシンをアルギニンに置換する変異(I531R)
アミノ酸配列上355番目のグルタミン酸をアルギニンに置換する変異(E355R)
アミノ酸配列上367番目のバリンをアラニンに置換する変異(V367A)
アミノ酸配列上446番目のリシンをグルタミンに置換する変異(K446Q)
I424L変異:OkinawaMado_I424L(GGCTGGCTGCATTCAGGCGATcTgGCCTACTACGATAAGGACGGC:配列番号29)
I531R変異:OkinawaMado_I531R(CCCAAAGGTCTCACAGGCAAGAgaGACTCTCGAAAAATTCGAGAA:配列番号30)
E355R変異:OkinawaMado_E355R(AGTGCAGTAATCATTACTCCAagGGGCGACGACAAACCAGGAGCC:配列番号31)
V367A変異:OkinawaMado_V367A(CCAGGAGCCTGCGGCAAGGTCGcCCCCTTCTTTTCCGCCAAAATTGTG:配列番号32)
K446Q変異:OkinawaMado_K446Q(CTGAAAAGTCTGATCAAGTACcAGGGCTACCAGGTGCCACCTGCA:配列番号33)
変異体2:I424L、I531R、E355R、V367AおよびK446Q
変異体1のアミノ酸配列は配列番号36に記載され、変異体1をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号34に記載される。また、変異体2のアミノ酸配列は配列番号37に記載され、変異体2をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号35に記載される。
Claims (3)
- 配列番号36または37に記載のアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼ。
- 請求項1に記載の変異型ルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸。
- 配列番号34または配列番号35に示される塩基配列を含む請求項2に記載の核酸。
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