JP5860651B2 - ホタル由来ルシフェラーゼ - Google Patents

Description

本発明はホタル由来ルシフェラーゼに関する。

細胞内のシグナル伝達および遺伝子発現といった細胞の機能を調べるためには、蛍光色素および蛍光タンパク質といった蛍光プローブ並びにルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する化学発光プローブが用いられている。特に遺伝子の発現調節の解析には、励起光による細胞のダメージが生じず且つ自家発光の問題が生じない、定量性に優れた発光計測が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を観察する場合、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光強度を測定することで、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ（具体的には発現量）を調べることができる。発光の測定は、最初に細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後この細胞溶解液にルシフェリンおよびアデノシン三リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＴＰ））等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで定量するという手順で行われる。すなわち、発光の測定は細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、細胞全体の平均値として測定される。ルシフェラーゼ遺伝子等の発光遺伝子をレポーター遺伝子として導入する方法として、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクチン法またはエレクトロポレーション法等を使用でき、各方法は目的および細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流または下流に目的のＤＮＡ断片を繋ぎ、ルシフェラーゼの発現量を分析することで、当該ＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることが可能となる。また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子と目的の遺伝子とを共発現させることで、当該遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることが可能となる。

時間経過に沿って発光遺伝子の発現量を分析するには、生きた細胞からの発光強度を経時的に測定する必要がある。このような測定は、ルミノメーターを備えたインキュベーターにて細胞を培養し、全細胞集団からの発光を一定時間ごとに定量することで行われる。これにより、一定の周期性をもった発現リズム等を分析することができ、細胞集団全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることができる。

近年、生物学および医学の研究において、生きた試料を対象とした画像による動的変化の経時的観察の必要性が高まってきている。蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子機能を動的に捉えるために、タイムラプスまたは動画撮像が行われている。従来技術では、蛍光試料を用いた経時的観察（例えば、蛍光分子を付したタンパク質１分子の動画観察）が行われている。

一方、経時的観察のために発光試料を用いる場合、発光試料の発光強度は極めて小さいため、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラを用いて観察する必要がある。また最近では、発光試料を観察するための光学系を有した顕微鏡も開発されている（特許文献１および２）。

発光強度が小さい化学発光試料を顕微鏡により撮像する場合、鮮明な画像を撮影するために必要な露出時間は長くなる。このような発光試料は、使用できる研究用途が制限される。例えば、発光強度の小ささのために３０分間の露出時間が必要となる場合、３０分間の経時的撮影は可能であっても、より短い時間での撮影、さらにはリアルタイムでの撮影は不可能である。また、画像の取得に当って、発光する細胞に焦点を合わせるために複数枚の画像を取得し比較する必要があるが、発光強度の小ささのために長い露出時間を必要とする場合、１枚の画像を取得するだけでも手間と時間とを要することになる。

特開２００６−３０１５９９号公報 国際公開第０６／０８８１０９号

本発明の目的は、新規ルシフェラーゼを提供することにある。

本発明の一態様に係るルシフェラーゼは、クメジマミナミボタル（Ｄｒｉｌａｓｔｅｒ ｋｕｍｅｊｉｍｅｎｓｉｓ）に由来する。

本発明によれば、高い発光強度を示すルシフェラーゼが提供されるため、発光像を撮像するために必要な露出時間を短縮することができ、且つ従来よりも時間分解能が高い経時的観察が可能となる。

野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られた、各ｐＨにおけるルシフェリンの発光スペクトルを示す図である。 野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼおよびＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのＫｍ値をプロットした図である。 野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼおよびＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼを用いた場合に得られた発光強度を比較した図である。 野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られた、各温度における発光スペクトルを示す図である。 変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られた、各温度における発光スペクトルを示す図である。

本発明の実施形態は、クメジマミナミボタル（Ｄｒｉｌａｓｔｅｒ ｋｕｍｅｊｉｍｅｎｓｉｓ）に由来するルシフェラーゼに関する。

「ルシフェラーゼ」とは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。実施形態に係るルシフェラーゼも、上述の通り定義されるルシフェラーゼと同義であるが、後述するホタルから初めて取得された新規のルシフェラーゼである。実施形態に関してルシフェリンとは、好ましくは、ホタルルシフェラーゼの基質となるホタルルシフェリンを意味する。より好ましくは、ホタルルシフェリンとはＤ−ルシフェリンである。

実施形態に係るルシフェラーゼは、クメジマミナミボタル（Ｄｒｉｌａｓｔｅｒ ｋｕｍｅｊｉｍｅｎｓｉｓ）に由来する。クメジマミナミボタルとは、節足動物門昆虫綱コウチュウ目ホタル科ミナミボタル属に属すホタルである。なお、ここにいう「由来する」とは、クメジマミナミボタルが有する野生型のルシフェラーゼに加えて、その変異体をも含むことを意味する。

実施形態に係るルシフェラーゼによれば、既知のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる。従って、実施形態に係るルシフェラーゼは、タンパク質のイメージングのためのレポーターとして利用する場合に特に有利な効果を奏する。すなわち、実施形態に係るルシフェラーゼは、少量でも高い発光強度を提供できるため、発現量が低いタンパク質の良好な検出を可能とする。また、実施形態に係るルシフェラーゼは、得られる発光強度が高いことにより検出に必要な露出時間を短縮できる。このため、実施形態に係るルシフェラーゼを経時的観察のためのレポーターとして利用すれば、撮影に必要な時間を短くすることが可能となり、よりリアルタイムに近い観察が可能となる。すなわち、時間分解能が高い経時的観察が可能となる。

実施形態に係るルシフェラーゼの一例は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼである。当該ルシフェラーゼは、クメジマミナミボタルから得られた野生型のルシフェラーゼである。この明細書および特許請求の範囲では、当該ルシフェラーゼを、野生型ルシフェラーゼ、野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼまたは野生型クメジマミナミボタル由来ルシフェラーゼ等と称する。

図１は、実施形態に係る野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼを用いた場合に得られたルシフェリンの発光スペクトルを示す。この図に示されるとおり、実施形態に係る野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼは、ｐＨ８．０および７．５において、それぞれ最大発光波長を５５７および５６０ｎｍに有する。また、ｐＨ７．０において、最大発光波長を５６０ｎｍに有し、６１０ｎｍ付近により小さなピークを有する。また、ｐＨ６．５および６．０において、それぞれ、最大発光波長を５９２および６１３ｎｍに有する。ここで「最大発光波長」とは、ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光を測定することによって得られるスペクトルにおいて、発光強度が最大となる波長を意味する。

実施形態に係るルシフェラーゼは、クメジマミナミボタルから取得された野生型のルシフェラーゼだけでなく、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の一部に変異が生じた変異型のルシフェラーゼを含む。ここでは、このようなルシフェラーゼを、変異型ルシフェラーゼ、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼまたは変異型クメジマミナミボタル由来ルシフェラーゼ等と称する。

そのような変異は、ルシフェラーゼの酵素活性を向上させる変異であってよい。すなわち、そのような変異は、野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼよりも高い発光強度をもたらす変異であってよい。例えば、実施形態に係る変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼを用いた場合に達成される発光強度は、野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼを用いた場合に達成される発光強度の１．５倍以上、１．８倍以上、２．０倍以上、４倍以上または５倍以上であり得る。

図３は、ＨｅＬａ細胞中での野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ、野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼおよびＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（以下、「Ｐ．ピラリスルシフェラーゼ」という。）によるルシフェリンの発光強度を比較したグラフを示す。この図から、野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼは、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼの２．０４倍の発光強度を、また変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼはＰ．ピラリスルシフェラーゼの４．９４倍の発光強度を達成できることがわかる。このように、実施形態に係るルシフェラーゼを用いた場合は、従来のホタルルシフェラーゼを用いた場合と比較して、より高い発光強度を達成できる。

実施形態に係るクメジマミナミボタルに由来する野生型ルシフェラーゼにより、既存のＰ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度の２．０倍以上の発光強度が得られる。また、実施形態に係る変異型クメジマミナミボタルに由来するルシフェラーゼにより、既存のＰ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度の３．０倍以上の発光強度が得られる。好ましくは、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度の３．５倍以上、４．０倍以上、４．５倍以上、４．８倍以上、４．９倍以上の発光強度が得られる。

発光強度の向上をもたらす変異の例は、野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）における４２４番目のイソロイシン（Ｉ）をロイシン（Ｌ）に置換する変異（Ｉ４２４Ｌ）である。

あるいは、上記の変異は、配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質に対しても導入することができる。例えば、そのようなタンパク質のアミノ酸配列と配列番号１との対応関係を考慮して変異を導入することができる。そのようなタンパク質にＩ４２４Ｌ変異を導入したい場合、配列番号１と導入の対象とするタンパク質の配列とを比較して、配列番号１に示されるアミノ酸配列の４２４番目のＩに対応するアミノ酸残基を決定し、当該アミノ酸をＬに置換することでＩ４２４Ｌ変異を導入することができる。ここにおいて「対応するアミノ酸残基」は、例えば相同性検索といった公知の技術を利用して決定することができる。

実施形態に係る変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼの一例は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼは、野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ（配列番号１）に対して、Ｉ４２４ＬおよびＮ２Ｄの変異を導入して得られた変異型ルシフェラーゼである。ここで、Ｎ２Ｄの変異は、以下で説明するＫｏｚａｋ配列付加に伴うものである。変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼを用いた場合に達成され得る発光強度は、例えば、野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ（配列番号１）を用いた場合に達成され得る発光強度の１．５倍以上、好ましくは、１．８倍以上、より好ましくは、２．０倍以上である。

また、実施形態は、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼに対して更なる変異を導入したものも含む。例えば、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼに対して、さらなる発光強度の向上を目的として、さらなる変異を導入したものを含む。あるいは、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼに対して、発光強度の向上とは別の目的、例えば、可溶性の向上、分解に対する耐性の向上等を目的として、さらなる変異を導入したものを含む。具体的には、実施形態は、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号３１）との間で一定の相同性を示すアミノ酸配列を含むルシフェラーゼである。ここにおいて、アミノ酸配列における一定の相同性とは、例えば、７５％以上、８０％以上、８５%以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性である。また、好ましくは、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼに対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列の１から２０のアミノ酸が変異したものであり、１から１５のアミノ酸が変異したものであり、１から１０のアミノ酸が変異したものであり、１から５のアミノ酸が変異したものであり、１から４のアミノ酸が変異したものであり、１から３のアミノ酸が変異したものであり、１または２のアミノ酸が変異したものである。好ましくは、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼに対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼでは、Ｉ４２４Ｌの変異が維持されている。すなわち、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼに対して更なる変異が導入された変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列において、４２４番目のアミノ酸（またはそれに対応するアミノ酸）がロイシンである。ここにおいて「対応するアミノ酸」は、例えば相同性検索といった公知の技術を利用して決定することができる。

実施形態に係る変異型ルシフェラーゼのその他の例は、実験的な操作性を向上させる変異が導入された変異型ルシフェラーゼである。たとえば、野生型ルシフェラーゼが哺乳細胞内において低い可溶性を示す場合、実施形態に係る変異型ルシフェラーゼは、その可溶性を高める変異が導入されたルシフェラーゼである。

変異型ルシフェラーゼとは、実施形態に係るルシフェラーゼの特徴、すなわち従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて、ルシフェラーゼのアミノ酸配列に変異、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加等が生じたルシフェラーゼであってよい。この変異とは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の１以上のアミノ酸の変異または１から数個のアミノ酸の変異であり、好ましくは、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列の１から２０のアミノ酸の変異、１から１５のアミノ酸の変異、１から１０のアミノ酸の変異、１から５のアミノ酸の変異、１から４のアミノ酸の変異、１から３のアミノ酸の変異、１または２のアミノ酸の変異である。好ましくは、当該変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で７５％以上、８０％以上、８５%以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有する。

本発明の他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸に関する。すなわち、当該核酸は、クメジマミナミボタルに由来するルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸である。実施形態において、核酸とは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを指す。また、実施形態において、ルシフェラーゼの「遺伝子」とは、主として、ｍＲＮＡに転写される領域、すなわち構造遺伝子を意味する。

実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の一例は、配列番号２に示される塩基配列を含む核酸である。この配列を有する遺伝子は、クメジマミナミボタルからクローニングされており、野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼをコードする。

実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の別の例は、配列番号２または３２に示される塩基配列を含む核酸である。配列番号３２の配列を有する遺伝子は変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼをコードする。変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼは、クメジマミナミボタルからクローニングされた野生型の塩基配列に対して変異を導入することで得られる配列である。

実施形態に係る核酸は、野生型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸であっても、そこにおいて変異が生じた変異型ルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸であってもよい。ここにおいて、変異型ルシフェラーゼ遺伝子とは、コードされたルシフェラーゼが、実施形態に係るルシフェラーゼの特徴、すなわち従来のルシフェラーゼと比較して高い発光強度が得られる限りにおいて、塩基配列中の特定の塩基、たとえば数個の塩基の置換、欠失および／または付加等を受けた遺伝子であってよい。また、塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異が含まれる。すなわち、実施形態に係る核酸には、野生型ルシフェラーゼをコードする変異型ルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸が含まれる。

そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の一例は、遺伝子中に存在する特定の制限酵素の認識配列を無効にする変異である。この変異によって、遺伝子を含む核酸は当該制限酵素によって切断されなくなるものの、当該遺伝子は変異前と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードできる。このような変異は、制限酵素の認識配列を構成するコドンを、異なる塩基配列の同義コドンに変換することで達成できる。このような変異は、遺伝子組み換えに使用する制限酵素の認識配列が当該遺伝子中に存在する場合に有用である。この場合、予め遺伝子中の認識配列を無効にしておくことで、制限酵素で処理した場合に遺伝子を含む核酸が断片化することを防ぐことができ、結果として組み換えが容易になる。特定の制限酵素の認識配列を無効にした例は、配列番号３に示される塩基配列である。当該塩基配列は、クメジマミナミボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列からＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列を無効にしたものである。

そのようなコードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の別の例は、遺伝子のコドンを特定の生物種における発現に最適化させる変異である。ここにいう「最適化」とは、核酸に含まれる遺伝子のコドンを、特定の生物種においてコドン出現頻度が高いコドンに代えることを意味する。最適化を行った場合、特定の生物種における遺伝子の発現は、最適化をしない場合に比べて高まる。実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子はホタルから取得されたものであるため、当該遺伝子を導入しようとする生物種が分類学的にホタルから遠い程、最適化の効果はより高いと考えられる。実施形態において特定の生物種とは、例えば細菌細胞、酵母細胞および哺乳細胞である。更に哺乳細胞は、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞である。

実施形態に係るコドンが最適化されたルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸の一例は、配列番号３に示される塩基配列を含む核酸である。当該核酸は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列が無効にされており、且つ哺乳細胞における発現にコドンが最適化されている。

実施形態に係る核酸は、Ｋｏｚａｋ配列が付与されたルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸を含む。Ｋｏｚａｋ配列とは、開始コドンとその前後の複数の塩基配列から成る配列であり、Ｋｏｚａｋ配列が存在することで、その遺伝子の発現量が増大することがわかっている。Ｋｏｚａｋ配列は、生物種または生物群ごとに共通配列が見出されている。実施形態に係るＫｏｚａｋ配列を含む核酸は、それを導入する生物種に対応したＫｏｚａｋ配列を有する。例えば哺乳細胞に導入される場合、核酸は、Ｋｏｚａｋ配列としてｇｃｃｒｃｃａｔｇｇ（配列番号５）（ｒはグアニンまたはアデニンを意味する）の配列を含む。Ｋｏｚａｋ配列を付与するルシフェラーゼ遺伝子は、野生型遺伝子であってもよいが、上述のようなコドンの最適化を行った変異型遺伝子であってもよい。

本発明のさらに他の実施形態はこれらの核酸を含むベクターに関する。当該ベクターには、ルシフェラーゼをコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。

また、本発明のさらに他の実施形態は発光プローブに関する。当該発光プローブは、野生型のルシフェラーゼを含むものでもよいが、変異型ルシフェラーゼを含むものでもよい。特に、公知の技術によって、発光プローブとしての利用に適した改変を加えたものが好ましい。さらに実施形態は、上記発光プローブを用いた種々の試料（インビボ、インビトロ）に関する種々の使用（イメージング、測光等）に有効に適用できる。

本発明のさらに他の実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内の機能を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼを細胞内に導入する工程、および前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。例えば、ＤＮＡ中の特定の発現調節領域の下流に実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼの発現を、それが誘起するルシフェリンの発光の有無によって検出することで、発現調節領域の機能を調べることが可能である。

本発明のさらに他の実施形態は、上記実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内タンパク質を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼと解析の対象とするタンパク質とから成る融合タンパク質を細胞内に導入する工程；および、前記ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。

当該方法は、解析の対象とするタンパク質の細胞内の局在の観察、および、その局在の時間変化の観察（タイムラプス）を含む。また、当該方法は、タンパク質の局在だけでなく、そのタンパク質が単に発現したか否かの確認をも含む。使用される細胞に特別な限定はなく、細胞のイメージングの分野において通常使用できる細胞であってよい。また、解析の対象とするタンパク質も特別に限定はなく、研究の目的に応じたタンパク質を選択することができる。当該タンパク質は、使用する細胞内に本来存在するタンパクであってよく、または細胞内に本来存在しない異種性のまたは改変したタンパク質であってよい。

融合タンパク質を細胞内に導入する場合、既知の導入方法を使用することができる。１つの方法は、細胞外で精製した融合タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって融合タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、融合タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって融合タンパク質を細胞に取り込ませることができる。また別の方法は、まず融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を導入し、その後細胞内で融合タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから融合タンパク質を発現させることができる。ここにおいて、融合タンパク質の遺伝子は、実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子と解析の対象とするタンパク質の遺伝子とを含む遺伝子であり、ここにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子とタンパク質遺伝子とは、それぞれ正常に翻訳されるよう連結されている。

ルシフェリンの発光をイメージング装置により検出する工程は、既知の検出方法を使用することができる。例えば、ルシフェラーゼを含む融合タンパク質を発現する細胞に、ルシフェリン、ＡＴＰおよびＭｇ^２＋イオン等を適宜与えてルシフェラーゼにルシフェリンの発光反応を誘起させ、発生した発光をイメージング装置により検出することができる。イメージング装置とは、例えば発光を捉えるためのフィルターを備えた顕微鏡である。顕微鏡を使用することで、細胞内における発光の位置を特定して、この情報をもとにタンパク質の局在を特定することが可能となる。また、イメージング装置として、経時的に撮像できる機能を備えた顕微鏡を使用することができ、この顕微鏡によって経時的観察も可能となる。

［実施例１：クメジマミナミボタル由来のルシフェラーゼ遺伝子のクローニング］
１．材料
材料として沖縄県久米島で採集したクメジマミナミボタル（Ｄｒｉｌａｓｔｅｒ ｋｕｍｅｊｉｍｅｎｓｉｓ）の幼虫を用いた。

２．トータルＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成
ホタルの幼虫からハサミを用いて発光器を切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄチューブ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に、採取した発光器および１ｍＬのトータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ ２４（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）またはＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１００Ａ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に装着し、振動速度６．５ｍ／ｓおよび振動時間４５秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、３０分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕を実施した。

次に、トータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔの説明書に従って、破砕した溶液からトータルＲＮＡの分離精製を行った。得られたｍＲＮＡ溶液１００μｌを、エタノール沈殿法によって沈殿濃縮した。次に、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）をマニュアルに従って使用して、沈殿濃縮したトータルＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ溶液２０μｌをホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーとして以下の遺伝子実験に用いた。

３．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側の同定
３−１．Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ（ＲＡＣＥ）法に用いるプライマーの作製
クメジマミナミボタルのルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によって行った。このＰＣＲに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。

ホタルルシフェラーゼにおいてよく保存されているアミノ酸領域を確認するために、既に公開されている１０種類のホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列を、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）を用いて比較した。比較に用いた近縁生物は、ラムフィリス・ノクティルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）（登録番号ＣＡＡ６１６６８）、ルキオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）（登録番号Ｐ１３１２９）、ルキオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）（登録番号Ｑ０１１５８）、ルキオラ・ミングレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）（登録番号Ｑ２６３０４）、ホタリア・パルヴラ（Ｈｏｔａｒｉａ ｐａｒｖｕｌａ）（登録番号ＡＡＣ３７２５３）、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）（登録番号ＢＡＦ４８３９０）、フォトゥリス・ペンシルヴァニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）（登録番号Ｑ２７７５７）、ピロコエリア・ミヤコ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍｉｙａｋｏ）（登録番号ＡＡＣ３７２５４）、ピロコエリア・ルファ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｒｕｆａ）（登録番号ＡＡＧ４５４３９）およびラハゴフタルムス・オーバイ（Ｒｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｏｈｂａｉ）（登録番号ＢＡＦ３４３６０）である。

その結果、ホタルルシフェラーゼのＣ末端側４４０残基付近に位置するＬ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｋ−Ｇ−Ｙ−Ｑ−Ｖ（配列番号６）のアミノ酸配列がよく保存されていることがわかった。この９つのアミノ酸配列をコードするコドンから塩基配列を予測し、５’末端ＲＡＣＥ ＰＣＲに用いる１２種類のホタルルシフェラーゼ特異的混合プライマーを設計した。このプライマーの名称および配列は以下の通りである（プライマー配列中のＹ、ＲおよびＮは混合塩基を示す）：ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＴ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号７）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号８）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号９）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＣ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号１０）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＣ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号１１）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＣ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号１２）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号１３）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号１４）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号１５）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＣ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号１６）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＣ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号１７）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＣ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号１８）。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。

３−２．５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによる、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側のクローニング
上述の通り作製したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーおよび５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ−３’：配列番号１９）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’：配列番号２０）を用いて５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。

一度目のＰＣＲとして、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーのいずれかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒとから成る１２通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％トリス酢酸緩衝液（ＴＡＥ）アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。１２の反応溶液の全てにおいてわずかに遺伝子増幅が認められたため、これらのＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を次の通り実施した。

ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、一度目のＰＣＲで使用した１２種類プライマーのうちの４つとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとから成る４通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ^２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせ条件を確認した。

３−３．５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。

約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９） Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ Ｃ−３’：配列番号２１）とＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＧＧ−３’：配列番号２２）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ^２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。

増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上清を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。

シークエンシングによって得られた遺伝子配列を、配列情報解析ソフトウェア ＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏの「シークエンス連結」機能を用いて解析した。この配列をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）が提供するｂｌａｓｔｘサーチを利用して相同性検索を実施し、既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側であると決定した。

４．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’Ｒａｃｅ ＰＣＲおよび完全長ｃＤＮＡの取得
４−１．３’Ｒａｃｅ ＰＣＲに用いるプライマーの設計
５’Ｒａｃｅ ＰＣＲの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側非翻訳領域の配列を基にして、３’ＲＡＣＥに用いるプライマーおよびＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲに用いるプライマーを作成した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。

４−２．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ取得のための３’Ｒａｃｅ ＰＣＲ
上述の通り作成したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマー（ＡＣＴＴＡＴＴＣＧＴＡＣＣＴＴＧＴＣＣＡＴＴＧＧＣ）ならびにＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’：配列番号２６）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’：配列番号２７）を用いて３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。

一度目のＰＣＲとして、５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ^２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．４μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。わずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。

Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ用のプライマー（ＡＣＴＴＡＴＴＣＧＴＡＣＣＴＴＧＴＣＣＡＴＴＧＧＣＡＴＧＡＡ：配列番号２５）とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’：配列番号２７）とから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ^２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅していることを確認した。

４−３．３’−Ｒａｃｅで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
３’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。

約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９） Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ Ｃ−３’：配列番号２１）とＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＧＧ−３’：配列番号２２）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ^２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。

増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスに用いたプライマーはベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上清を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。

シークエンシングによって完全長ホタルルシフェラーゼ遺伝子を獲得した。この遺伝子の塩基配列を配列番号２（ＡＴＧＡＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＴＡＣＡＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＴＣＡＴＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＡＡＡＡＣＴＡＴＴＴＴＡＡＧＡＴＡＴＧＣＴＣＡＧＴＴＡＣＣＴＧＧＴＡＣＴＡＴＡＧＣＴＴＴＴＡＣＧＧＡＴＧＣＡＣＡＴＡＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＣＣＴＡＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＣＧＴＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＧＴＡＴＧＡＡＧＡＧＡＴＡＣＧＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴＡＡＡＡＣＡＴＧＣＡＡＴＡＧＣＡＧＴＴＴＧＴＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＧＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＣＣＧＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＣＡＴＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＣＧＴＡＧＣＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＣＴＡＴＡＴＡＡＴＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣＣＣＡＣＡＡＴＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＣＣＡＡＡＡＧＡＧＣＣＴＴＡＣＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧＴＴＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＧＴＣＣＴＡＧＡＴＣＡＴＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＴＴＡＣＡＴＴＣＡＡＴＧＣＡＴＴＣＧＴＴＴＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＡＴＣＡＣＡＣＴＴＴＡＡＣＧＡＡＣＡＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＴＴＧＡＣＣＧＣＡＡＴＧＡＴＣＡＡＧＴＧＧＣＡＣＴＡＡＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＴＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＧＴＴＡＴＧＴＴＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＧＡＴＴＴＴＣＴＣＡＴＴＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＧＴＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＡＡＡＴＴＡＴＴＣＣＣＧＡＴＡＣＴＧＣＡＡＴＴＴＴＡＡＣＧＧＴＡＡＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣＣＡＣＧＧＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＴＴＴＡＣＡＡＣＡＴＴＧＧＧＴＴＡＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣＧＧＡＴＴＴＣＧＴＡＴＴＧＴＣＧＴＡＡＴＧＣＡＴＡＡＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＧＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＴＡＴＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＴＧＣＡＴＴＡＣＴＡＧＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＴＡＣＴＴＴＡＧＴＡＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＣＴＴＧＴＣＧＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＣＴＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＣＴＣＧＣＴＡＡＡＧＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＡＣＧＡＴＴＴＡＡＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＴＴＡＴＧＧＡＴＴＧＡＣＣＧＡＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＧＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＣＴＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＡＣＡＧＧＡＡＡＡＧＴＡＧＴＡＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＣＴＴＧＡＣＡＣＡＣＧＴＣＡＡＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＣＧＡＡＣＴＡＴＧＴＣＴＴＡＡＡＧＧＴＧＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣＣＡＣＡＡＡＴＧＣＡＴＴＡＡＴＴＧＡＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧＴＴＧＣＡＴＴＣＡＧＧＣＧＡＴＡＴＴＧＣＡＴＡＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＣＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＧＴＡＧＡＴＣＧＡＴＴＧＡＡＡＴＣＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＧＧＴＴＡＴＣＡＧＧＴＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＡＡＴＴＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＣＴＴＴＴＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＣＴＴＴＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＧＴＧＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＣＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＡＴＴＡＴＧＴＴＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＣＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡＡＡＧＧＴＣＴＣＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＴＡＧＡＴＡＧＣＡＧＡＧＧＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＴＡＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＡＡＡＴＧＴＡＡ）とする。この塩基配列（配列番号２）をアミノ酸へと翻訳した配列を配列番号１（ＭＮＭＥＤＫＮＶＶＨＧＰＡＳＦＹＰＶＤＤＧＴＡＧＱＱＬＨＫＴＩＬＲＹＡＱＬＰＧＴＩＡＦＴＤＡＨＴＥＱＮＬＴＹＡＥＹＦＤＬＴＣＲＬＡＥＳＭＫＲＹＧＬＧＬＫＨＡＩＡＶＣＳＥＮＳＬＮＦＦＡＰＶＩＡＡＬＹＬＧＶＡＶＡＰＴＮＤＩＹＮＥＲＥＬＹＮＳＬＮＩＳＱＰＴＩＶＦＣＳＫＲＡＬＬＫＩＭＥＶＱＫＫＬＰＶＩＱＫＩＩＶＬＤＨＫＥＤＦＱＧＬＨＳＭＨＳＦＩＫＨＹＬＰＳＨＦＮＥＨＤＦＫＰＥＥＦＤＲＮＤＱＶＡＬＩＭＮＳＳＧＳＴＧＬＰＫＧＶＭＬＴＨＫＮＶＶＶＲＦＳＨＣＫＤＰＶＦＧＮＱＩＩＰＤＴＡＩＬＴＶＩＰＦＨＨＧＦＧＭＦＴＴＬＧＹＬＴＣＧＦＲＩＶＶＭＨＫＦＥＥＥＬＦＬＲＳＬＱＤＹＫＩＱＳＡＬＬＶＰＴＬＦＳＦＦＡＫＳＴＬＶＤＫＹＤＬＳＮＬＫＥＩＡＳＧＧＡＰＬＡＫＥＶＧＥＡＶＡＫＲＦＫＬＰＧＶＲＱＧＹＧＬＴＥＴＴＳＡＶＩＩＴＰＥＧＥＤＫＡＧＳＴＧＫＶＶＰＦＦＳＡＫＩＩＤＬＤＴＲＱＳＬＧＰＨＱＫＧＥＬＣＬＫＧＤＭＩＭＫＧＹＡＮＮＰＥＡＴＮＡＬＩＤＫＤＧＷＬＨＳＧＤＩＡＹＹＤＥＤＧＨＦＦＩＶＤＲＬＫＳＬＩＫＹＫＧＹＱＶＡＰＡＥＬＥＳＶＬＬＱＨＰＹＩＦＤＡＧＶＴＧＩＰＤＥＶＡＧＥＬＰＡＡＣＶＶＬＥＫＧＫＨＬＴＥＫＥＶＭＤＹＶＡＳＱＶＳＳＳＫＫＬＲＧＧＶＲＦＩＤＥＩＰＫＧＬＴＧＫＩＤＳＲＧＬＫＥＩＬＫＲＰＱＳＫＭ＊）とする。配列番号１および配列番号２について、ＮＣＢＩが提供するｂｌａｓｔｘまたはｂｌａｓｔｐサーチを利用して相同性検索を実施した。それぞれの検索で既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列であると決定した。

以下、この新規のルシフェラーゼを野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼと称する。

［実施例２：野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼの酵素学的なパラメータの測定］
１．野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現
野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクター（インビトロジェン）に導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。

１−１．野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ遺伝子の制限酵素認識部位の改変
上述の通り決定した塩基配列によれば、野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ遺伝子はＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」（羊土社、２００１年発行、ｐ．１７−２５）に示される方法に従った。変異導入後の配列は、配列番号３に示される塩基配列である。

１−２．野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現ベクターへの導入
ルシフェラーゼ遺伝子を、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクターの制限酵素サイトＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣを含むプライマー、並びに終止コドンおよびその後ろに制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列ＧＡＡＴＴＣを含むプライマーを作成した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。

最終濃度が等倍の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が１．０ｍＭのＭｇＳＯ_４、最終濃度が０．０２Ｕ／μｌのＴＯＹＯＢＯ ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（１Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマー対を含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型としてＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ認識配列を持たないルシフェラーゼ遺伝子の溶液を０．４μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５５℃３０秒および６８℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に６８℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を通常のエタノール沈殿法により沈殿濃縮し、制限酵素処理用１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒを４μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡績株式会社）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績株式会社）を各２μｌならびに滅菌脱イオン水３２μｌを加えて溶解し、３７℃で２時間保温して制限酵素処理した。その後、この反応溶液をエタノール沈殿法により沈殿濃縮した後、滅菌脱イオン水に溶解した。この溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った。紫外線照射下において確認されるＤＮＡバンドを含むゲルを、ナイフを用いて切り出した。この切り出したゲルからＷｉｚａｒｄ（Ｒ） ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＤＮＡを抽出した。これらの操作はマニュアルに従って実施した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｐａｃｋ（ニッポンジーン）をマニュアルに従って用いて、あらかじめ同様の方法で制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで処理したｐＲＳＥＴ−Ｂベクターに抽出したＤＮＡを導入した。このベクターＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換し、コロニーを形成させた。

得られたコロニーを鋳型としてダイレクトコロニーＰＣＲを実施し、ｐＲＳＥＴ−Ｂに導入したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。ダイレクトコロニーＰＣＲは、Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧ−３’：配列番号２８）およびＴ７ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＴＡ ＧＴＴ ＡＴＴ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＧＧ ＴＧＧ−３’：配列番号２９）のプライマー対を用いて行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ^２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマーを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。

増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴを用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスには、ベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上清を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ ジェネティックアナライザを用いて塩基配列を読み取り、正常に遺伝子発現ベクターｐＲＳＥＴ−Ｂに導入されていることを確認した。

２．発光タンパク質の精製
ＪＭ１０９（ＤＥ３）を含む大腸菌溶液５０μｌにルシフェラーゼ発現ベクター０．５μｌを添加し、氷上で１０分、その後４２℃で１分、最後に氷上で２分インキュベートした。その後、大腸菌溶液５０μｌをＳＯＣ培地２００μｌに加えた。その大腸菌／ＳＯＣ培地混合溶液を３７℃で２０分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル１００μｌをＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、５００ｍｌスケールのＬＢ培地で培養した。培養は３７℃で２４時間、１８℃で２４時間行った。合計４８時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム２ｍｌのカラムにＮｉ−Ａｇａｒ懸濁液５００μｌと０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ｍｌを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て４℃の条件で行った。２５ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液２ｍｌでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに５００ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２ｍｌ加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ６（ザルトリウス）で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、５０％グリセリン溶液とした。保存は−２０℃で行った。

３．発光スペクトルの測定
測定のための装置としてＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）を用い、０．１Ｍクエン酸／０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０−８．０）に１ｍＭ Ｄ−ルシフェリン、２ｍＭ ＡＴＰおよび４ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む溶液に、精製酵素を１μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの間の最終濃度で添加し、酵素添加後１５秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果を図１に示す。

図１より、取得された野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼは、ｐＨ８．０の環境において、５５７ｎｍ付近に最大発光波長を有することが示された。また、ｐＨ７．５において、５６０ｎｍ付近に最大発光波長を有することが示された。さらに、ｐＨ７．０において５６０ｎｍ付近に最大発光および６１０ｎｍ付近により小さなピークを有することが示された。また、さらに、ｐＨ６．５および６．０において、それぞれ、５９２ｎｍ付近および６１３ｎｍ付近に最大発光波長を有することが示された。

４．速度論的解析
４−１．Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰの濃度の決定
Ｄ−ルシフェリン溶液中のＤ−ルシフェリン濃度およびＡＴＰ溶液中のＡＴＰ濃度を以下の通りに決定した。

ＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて、Ｄ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定し、この測定結果と以下のε値とから濃度を算出した。
Ｄ−ルシフェリン：λ_ｍａｘ ３２８ｎｍ、ε１８２００、ｐＨ５．０
ＡＴＰ：λ_ｍａｘ ２５９ｎｍ、ε１５４００、ｐＨ７．０。

測定はそれぞれ１０回ずつ行い、吸光度の平均値を濃度算出に用いた。このように濃度を決定したＤ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液を用いて、以下のＫｍ値算出を行った。

４−２．Ｄ−ルシフェリンに対するＫｍ値の測定
様々なＤ−ルシフェリン濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、Ｄ−ルシフェリンに対するＫｍ値を決定した。

Ｄ−ルシフェリンを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、異なる濃度の１２種類のＤールシフェリン溶液を作製した。これらの溶液は、Ｄ−ルシフェリンの終濃度がそれぞれ０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、４８０および６４０μＭとなるようにＤ−ルシフェリンを含む。これらのＤ−ルシフェリン溶液を９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、４ｍＭ ＡＴＰおよび８ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を行った。測定にはＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を使用した。測定は各ルシフェリン濃度について３回ずつ行った。

得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ルシフェリン濃度Ｓに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。

４−３．ＡＴＰに対するＫｍ値の測定
様々なＡＴＰ濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ＡＴＰに対するＫｍ値を決定した。

ＡＴＰを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、異なる濃度の１２種類のＡＴＰ溶液を作製した。これらの溶液は、ＡＴＰの終濃度がそれぞれ５、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、４８０、６４０、８００、１２８０、１６００および１９２０μＭとなるようにＡＴＰを含む。これらのＡＴＰ溶液をそれぞれ９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、１ｍＭ Ｄ−ルシフェリン、８ｍＭ ＭｇＳＯ_４を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を行った。測定は各ＡＴＰ濃度について３回ずつ行った。

得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ＡＴＰ濃度Ｓに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。

上記のようにして決定されたＤ−ルシフェリンに対するＫｍ値およびＡＴＰに対するＫｍ値を表１に示す。表１には、同様に測定した既知のルシフェラーゼの各Ｋｍ値も示される。ＧＬ３とは既知のホタル由来のルシフェラーゼである。また、ＥＬｕｃ、ＣＢＧおよびＣＢＲとは既知のコメツキムシ由来のルシフェラーゼである。これらの既知のルシフェラーゼは市販されるものを使用した。

さらに、これらの結果について、縦軸をＡＴＰに対するＫｍ値とし、横軸をＤ−ルシフェリンに対するＫｍ値としてプロットした図を、図２として示す。

［実施例３：変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼの作製とＨｅＬａ細胞内における発光強度および発光スペクトルの比較］
変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。

哺乳細胞における発現に最適化した遺伝子（配列番号４）に対し、以下の変異を任意の組合せで導入した。
アミノ酸配列上４２４番目のイソロイシンをロイシンに置換する変異（Ｉ４２４Ｌ）

それぞれの変異の導入のために、以下の５種のプライマーを用いた。

Ｉ４２４Ｌ変異：（ＰｐｙＩ４２３Ｌ−４）＿Ｉ４２４Ｌ（ＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＧＡＣｃＴｇＧＣＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧ ：配列番号３０）、
変異の導入は文献の記載に基づいて行った（Ａｓａｋｏ Ｓａｗａｎｏ ａｎｄ Ａｔｓｕｓｈｉ Ｍｉｙａｗａｋｉ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００， Ｖｏｌ．２８， Ｎｏ．１６）。変異導入後にシーケンサーを用いて配列を読み取り、目的とする変異がクメジマミナミボタルルシフェラーゼ遺伝子に導入されていることを確認した。

作製した変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼは、Ｎ２ＤおよびＩ４２４Ｌの変異を有する。

変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列は配列番号３１に記載され、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列は配列番号３２に記載される。

次に、野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ、および変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼによる細胞内での発光強度について、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼと比較した。

野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸（配列番号２）、および変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼの遺伝子を含む核酸（配列番号３２）に対してＫｏｚａｋ配列を付与した。なお、これらの配列は、哺乳細胞における発現に対してコドン最適化されている。その後、ｐＦ９Ａ ＣＭＶ ｈＲＬｕｃ ｎｅｏ Ｆｌｅｘｉ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。ｐＦ９Ａベクターは内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲＬｕｃ）をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度との比として算出することが可能である。

得られた２種のプラスミドを、４８穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、２４時間後ＰＢＳで細胞を洗浄した。Ｄｕａｌ ｇｌｏｗ ｋｉｔ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の説明書に従って、４８穴プレートの各ウェルに２ｍＭ Ｄ−ルシフェリン／ＣＯ_２ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２００μｌずつ添加し、２５℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を用いて１２０分間発光強度を測定した。９０分経過時点の発光強度を野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼの発光強度とした。比較実験を実施し、９０分経過時点の発光強度を野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼの発光強度とした。各ウェル内の培養液を除去した後、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄した。次に各ウェルに１０μＭセレンテラジン／ＣＯ_２ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍを５００μｌずつ添加し、２５℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒを用いて３０分間発光強度を測定した。セレンテラジン添加後、１０分経過時点の発光強度を内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度とした。野生型クメジマミナミボタルルシフェラーゼ、変異体１、変異体２およびＰ．ピラリスルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２ ルシフェラーゼ、プロメガ社）による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度でそれぞれ除算した値を算出し、その値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。

図３には、野生型ルシフェラーゼ、変異型ルシフェラーゼ及びＰ．ピラリスルシフェラーゼによる９０分経過時点における発光強度を、内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる１０分経過時点における発光強度でそれぞれ除算して得られた発光強度比を示す。

図３に示されるように、野生型クメジマミナミボタルによって得られた発光強度は、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度と比較して２．０４倍高かった。変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼによって得られた発光強度は、Ｐ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度と比較して４．９４倍高かった。また、変異型クメジマミナミボタルルシフェラーゼによって得られた発光強度は、野生型クメジマミナミボタルによって得られた発光強度と比較して、２倍以上高かった。変異の導入によってクメジマミナミボタルルシフェラーゼの発光強度が増大することが示された。

また、ＨｅＬａ細胞に発現させた野生型および変異型ルシフェラーゼの発光スペクトルを実施例２と同様に測定した。ルシフェリン濃度は２０ｍMで、温度２５℃および３７℃で測定した。図４に野生型ルシフェラーゼの、図５に変異型ルシフェラーゼの測定結果を示す。図４および５から、温度は２５℃から３７℃と上昇するにつれて、野生型ルシフェラーゼでは最大波長が５８５ｎｍから５９８ｎｍへと、変異型ルシフェラーゼでは５６４ｎｍから５７７ｎｍへと、長波長側にシフトしていることがわかった。この結果は、図１に示した高ｐHから低ｐHへ変化したときのスペクトル変化と同様の結果であった。

Claims (7)

1. ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、および、ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
   Ｐ．ピラリスルシフェラーゼによる発光強度の２．０倍以上の発光強度を有し、ｐＨ７．０において最大発光波長を５６０ｎｍ付近に有する、クメジマミナミボタル（Ｄｒｉｌａｓｔｅｒ ｋｕｍｅｊｉｍｅｎｓｉｓ）に由来するルシフェラーゼ。
2. ｉ）配列番号３１に記載のアミノ酸配列、および、ｉｉ）配列番号３１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を示し、且つ２番目のアミノ酸またはそれに対応するアミノ酸残基がアスパラギン酸であり、４２４番目のアミノ酸またはそれに対応するアミノ酸がロイシンであるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、クメジマミナミボタルに由来するルシフェラーゼ。
3. 配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むルシフェラーゼよりも高い発光強度でルシフェリンを発光させる請求項２に記載のルシフェラーゼ。
4. Ｐ．ピラリス由来のルシフェラーゼに対して、４．９倍以上の強度で前記ルシフェリンを発光させる請求項２または請求項３に記載のルシフェラーゼ。
5. 請求項１から４の何れか１項に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸。
6. 配列番号２または配列番号３２に示される塩基配列を含む請求項５に記載の核酸。
7. 前記ルシフェラーゼの遺伝子のコドンが哺乳類における発現に最適化された請求項５または６に記載の核酸。

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