JP6150642B2 - オレンジ色の発光を示すルシフェラーゼ - Google Patents
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ATGGCTAACGAGATCATCCTGCACGGCGCCAAGCCCAGGGACCCCCTGGACCTGGGCACCGCCGGCATTCAGCTCTACAGGGCCCTGACCAACTTCTCCTTCCTGAGGGAGGCCCTGATCGACGCCCACACCGAGGAGGTGGTGTCTTACGCCGACATCCTGGAGAACAGCTGTAGACTGGCTAAGTGCTACGAGAACTACGGCCTGCGCCAGAACAGCGTGATCTCCGTGTGCAGCGAGAATAGCACCATCTTCTTCTACCCCGTGATCGCCGCCCTGTACATGGGCGTGATCACCGCCACCGTGAACGACAGCTACACCGAGCGGGAGCTGCTGGAGACCCTGAACATCTCCAAGCCCGAACTGGTGTTCTGCTCCAAGAAGGCCATCAAGAACATGATGGCCCTGAAGAGGAACGTGAACTTCATCAAGAAGGTGGTGCTGCTGGACAGCAAGGAGGATATGGGCGAGGCCCAGTGCCTGAGCAACTTCATGGCCCGGTACTCCGAGCCCAACCTGGACGTGAGAAACTTCAAGCCAAGGGACTTCGACGCCAAGGAGCAGGTGGCCCTTATTATGTCCTCCTCTGGCACCACCGGCCTGCCAAAGGGCGTGGTGCTGACCCACAGGAACCTGAGCGTGCGCTTCGTCCACTGCAAGGACCCCCTGTTCGGCAACAGAACCATCCCCTCCACCTCCATCCTGTCCATCGTGCCCTTCCACCACGCCTTCGGAATGTTCACAACCCTGTCCTACTTCATCGTGGGCCTGAGAGTGGTGCTGCTGAAGAGATTCGAGGAGAAGTTCTTCCTGAGCACCATCGAGAAGTACAGAATCCCAACAATCGTGCTGGCCCCTCCTGTGATGGTGTTCCTGGCTAAGAGCCCCCTGGTGGACCAGTACGACCTGTCCAGCATCAGAGAGGTGGCCACCGGCGGCGCCCCTGTGGGCACCGAGGTTGCCGTGGCCGTGGCCAAGCGGCTGAAGATCGGCGGCATCCTCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCTGCTGCGCCGTGCTGATCACCCCCCACGACGACGTGAAGACCGGCTCCACCGGCAGGGTAGCCCCCTACGTGCAGGCTAAGATCGTGGACCTGACCACCGGCAAGTCCCTGGGACCTAACAAGAGAGGCGAGCTGTGCTTCAAGAGCGAGATCATCATGAAGGGCTACTTCAACAACAAGCAGGCCACCGAGGAGGCCATCGACAAGGAGGGCTGGCTGCACTCCGGCGACGTGGGATACTACGACGACGATGGACATTTCTTCGTGGTGGACCGGCTGAAAGAGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCCGCCGAGCTGGAGTGGCTGCTGCTCCAGCACCCATCCATCAAGGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCCGACGAGGCCGCCGGCGAGCTGCCCGGCGCCTGCATCGTGCTCCAGGAGGGCAAGAGCCTGACCGAGCAGGAGATCATCGACTACATCGCCGAGCGAGTGTCTCCCACCAAGCGCATCCGGGGCGGAGTCGTCTTCGTGGACGACATCCCCAAGGGCGCCACCGGCAAGCTGGTGAGAAGCGAGCTGCGGAAGCTGCTGGCCCAGAAGAAGTCCAAGCTGTAA(配列番号49)
MEKEENVIYGPEPFYPVEEGSAGTQLHRFMERYAKMGAICFSNALTGQDVTYAEYFDRSVRLAEALRRHGLTPEKKIGICSENCLEFFIPVLSGAYIASPVAPTNEIYTIRELVHSFGISEPMIVFSSKKGLDKVLEVQKTVHSIKTIVIIDSSTTYRGYDSMDAFVKKYVPANFNLSEFKTVEVDNETHTLLIMNSSGSTGLPKGVLVRHCGAVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFACGYRIVMLTKFDDEVLLKTLQDYKCTGVILVPTLFAILNRSELLEKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMKVKVIDLDTKKTLGPNRRGEICVKGPMLMTGYEKNPTETKEIIDEDGWLHSGDIGYWDEDHHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGIPDPEAGELPGAVVVLEKGKHLTEQEVLDYVAGQVYNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKAIREILKKPQAKM(配列番号40)
MEKEENVIYGPEPFYPVEEGSAGTQLHRFMERYAKMGAICFSNALTGQDVTYAEYFDRSVRLAEALRRHGLTPEKKIGICSENCLEFFIPVLSGAYIASPVAPTNEIYTIHELVHSFGISEPMIVFSSKKGLDKVLEVQKTVHSIKTIVIIDSSTTYRGYDSMDAFVKKYVPANFNLSEFKTVEVDNETHTLLIMNSSGSTGLPKGVLVRHCGAVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFACGYRIVMLTKFDDEVLLKTLQDYKCTGVILVPTLFAILNRSELLEKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMKVKVIDLDTKKTLGPNRRGEICVKGPMLMTGYEKNPTETKEIIDEDGWLHSGDIGYWDEDHHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGIPDPEAGELPGAVVVLEKGKHLTEQEVLDYVAGQVYNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKAIREILKKPQAKM(配列番号42)
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCcCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCGCGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGCGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCGGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAATCTGACCGAGATTGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACTGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACACCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA(配列番号41)
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCACGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGCGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCGGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAATCTGACCGAGATTGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACTGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACACCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA(配列番号43)
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCGCGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGTGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCGGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA(配列番号39)
1.材料
材料として沖縄県久米島産クロイワボタル(Luciora kuroiwae)の成虫4個体を用いた。
ホタルの成虫からハサミを用いて発光器を切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるLysing Matrix Dチューブ(MP−Biomedicals社)に、採取した発光器および1mLのトータルRNA抽出試薬TRIzol Reagent(インビトロジェン社)を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置FastPrep 24(MP−Biomedicals社)またはFastPrep FP100A(MP−Biomedicals社)に装着し、振動速度6.5m/sおよび振動時間45秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、30分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕した。
3−1.Rapid Amplification of cDNA End(RACE)法に用いるプライマーの作製
クロイワボタルのルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをPolymerase chain reaction(PCR)法によって行った。このPCRに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。
flexLuc5−ATA(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTA AT−3’:配列番号8)、
flexLuc5−ATG(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTG AT−3’:配列番号9)、
flexLuc5−ATT(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTT AT−3’:配列番号10)、
flexLuc5−ACA(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTA AT−3’:配列番号11)、
flexLuc5−ACG(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTG AT−3’:配列番号12)、
flexLuc5−ACT(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTT AT−3’:配列番号13)、
flexLuc5−GTA(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTA AT−3’:配列番号14)、
flexLuc5−GTG(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTG AT−3’:配列番号15)、
flexLuc5−GTT(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTT AT−3’:配列番号16)、
flexLuc5−GCA(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTA AT−3’:配列番号17)、
flexLuc5−GCG(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTG AT−3’:配列番号18)、
flexLuc5−GCT(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTT AT−3’:配列番号19)。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。
上述の通り作製したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した12種類の特異的混合プライマーおよび5’末端特異的プライマーであるGeneRacer5’Primer(5’−CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA−3’:配列番号20)およびGeneRacer5’Nested Primer(5’−GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA−3’:配列番号21)を用いて5’−RACE PCRを行った。GeneRacer5’ PrimerおよびGeneRacer5’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれているものを使用した。5’−RACE PCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
5’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
GTTCGGTATACTCGCGAGTTCGGGCAAAAAATAACAAGTAGCGCAAGATGGAAAAAGAAGAAAATGTGATATACGGTCCCGAGCCGTTTTACCCCGTCGAAGAGGGATCTGCAGGAACGCAACTGCACAGATTTATGGAGCGATACGCCAAAATGGGGGCTATATGTTTTTCTAACGCCCTCACGGGCCAAGATGTAACGTATGCCGAATATTTTGACCGACCGGTTCGTTTAGCGGAAGCTTTGAGAAGGCACGGCTTAACGCCAGAGAAAAAAATCGGTATTTGCAGCGAAAATTGCTTAGAATTTTTCATTCCGGTGCTTTCGGGAGCGTATATCGCTTCACCCGTCGCTCCAACTAACGAAATTTACACTATACGCGAATTGGTTCACAGTTTTGGAATATCCGAGCCAATGATCGTGTTTAGCTCAAAGAAAGGATTGGATAAAGTCTTGGAAGTACAAAAAACAGTGCACTCTATTAAAACAATAGTCATTATTGATAGCTCAACTACTTATCGAGGATATGACAGCATGGATGCGTTTGTTAAAAAAATACGTACCCGCAAATTTCAATTTATCCGAATTCAAAACTGTAGAAGTCGATAATGAAACTCACACTCTTCTTATAATGAACTCGTCCGGTTCCACCGG(配列番号24)
4−1.3’Race PCRに用いるプライマーの設計
5’Race PCRの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側非翻訳領域の配列を基にして、3’RACEに用いるプライマー(配列番号27)およびNested PCRに用いるプライマー(配列番号28)を作製した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。
上述の通り作成したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの5’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーNo2−Kuroiwa−F1(GTTCGGTATACTCGCGAGTTCG):配列番号25)、GeneRacer3’ Primer(5’−GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G−3’:配列番号27)およびGeneRacer3’ Nested Primer(5’−CGC TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG−3’:配列番号28)を用いて3’−RACE PCRを行った。GeneRacer3’ PrimerおよびGeneRacer3’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれているものを使用した。3’−RACE PCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
3’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
ATGGAAAAAGAAGAAAATGTGATATACGGTCCCGAGCCGTTTTACCCCGTCGAAGAGGGATCTGCAGGAACGCAACTGCACAGATTTATGGAGCGATACGCCAAAATGGGGGCTATATGTTTTTCTAACGCCCTCACGGGCCAAGATGTAACGTATGCCGAATATTTTGACCGATCGGTTCGTTTAGCGGAAGCTTTGAGAAGGCACGGCTTAACGCCAGAGAAAAAAATCGGTATTTGCAGCGAAAATTGCTTAGAATTTTTCATTCCGGTGCTTTCGGGAGCGTATATCGCTTCACCCGTCGCTCCAACTAACGAAATTTACACTATACGCGAATTGGTTCACAGTTTTGGAATATCCGAGCCAATGATCGTGTTTAGCTCAAAGAAAGGATTGGATAAAGTCTTGGAAGTACAAAAAACAGTGCACTCTATTAAAACAATAGTCATTATTGATAGCTCAACTACTTATCGAGGATATGACAGCATGGATGCGTTTGTTAAAAAATACGTACCCGCAAATTTCAATTTATCCGAATTCAAAACTGTAGAAGTCGATAATGAAACTCACACTCTTCTTATAATGAACTCGTCCGGTTCCACCGGTCTACCGAAAGGTGTGCTAGTCCGTCATTGTGGGGCAGTTACAAGATTTTCTCATTGCAGGGATCCGATTTTTGGTAATCAAGTTTCACCAGGCACAGCAATTTTAACGGTCGTTCCGTTCCATCATGGCTTTGGTATGTTCACTACTTTAGGATACTTTGTTTGTGGATACCGAATCGTAATGTTAACAAAATTTGATGACGAAGTATTGTTGAAAACCCTACAAGATTATAAGTGTACTAGTGTTATCCTAGTACCAACTTTGTTCGCTATCCTTAATAGAAGTGAACTACTGGAGAAATTCGACTTGTCTAATCTGACTGAAATTGCATCTGGTGGTGCCCCATTAGCAAAAGAAGTTGGGGAAGCCGTTGCCAGAAGATTTAATCTTCCTGGTGTTCGCCAAGGTTACGGTTTAACTGAAACCACATCCGCTTTTATTATCACCCCAGAAGGGGATGACAAACCAGGGGCTTCTGGAAAAGTTGTGCCTTTAATGAAAGTTAAAGTGATTGATCTTGACACTAAGAAAACGCTTGGTCCTAACCGTCGTGGAGAAATTTGCGTTAAGGGTCCTATGTTGATGACAGGTTACGAGAAGAATCCTACAGAAACTAAAGAAATTATCGACGAAGATGGTTGGCTGCACAGTGGAGATATTGGGTATTGGGACGAAGATCATCACTTCTTTATTGTAGATCGTCTCAAATCCTTAATCAAATACAAAGGATATCAAGTACCACCTGCTGAATTGGAATCCGTACTTTTACAACATCCAAATATATTTGATGCCGGTGTTGCCGGAATTCCCGATCCCGAAGCCGGGGAGCTTCCGGGTGCTGTGGTTGTATTAGAGAAAGGAAAACATCTAACTGAACAAGAAGTATTGGATTACGTTGCCGGACAAGTTTACAACGCAAAACGTTTACGCGGTGGCGTTCGTTTTGTAGACGAGGTACCTAAAGGTCTCACTGGAAAAATTGACGCAAAGGCAATTAGAGAAATTCTTAAGAAGCCGCAAGCTAAGATGTGA(配列番号2)。
下記のとおり、S283G変異型クロイワボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCGCGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGTGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCAGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA(配列番号4)
S283G変異型クロイワボタルルシフェラーゼに対し、ランダムに変異を導入し、さらなる変異を有したクロイワボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。
1.発現ベクターの作製
以下の通り、実施例1から3において取得したクロイワボタルの野生型ルシフェラーゼおよび変異型ルシフェラーゼ(変異体1から3)のそれぞれについてHeLa細胞内での発光強度を測定し、これらを、イリオモテボタルRhagophthalmus ohbai由来の橙色ルシフェラーゼ(SLOルシフェラーゼ:東洋紡株式会社)と比較した。
そのように作製した5種の発現ベクターの各々を、48穴のプレートに播種したHeLa細胞にリポフェクション法で遺伝子導入した。遺伝子が発現した段階で、2mMのD−ルシフェリンを基質として添加し、DP70カラーCCD(オリンパス株式会社製)を用いて露光時間1分間(ISO1600)で撮影した。なお、細胞の培養温度は約37℃とした。
次に、発光強度の比較を行った。これは、Dual−Glo(登録商標)Luciferase Assay System(米国プロメガ社製、製品番号E2940)を用いて実施した。5種の発現ベクターを、48穴のプレートに播種したHeLa細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、22時間後PBSで細胞を洗浄した。48穴プレートの各ウェルに2mM D−ルシフェリン/CO2 Independent Medium(Invitrogen)を200μlずつ添加し、37℃、各ウェルあたり1秒間測定の条件でLuminescensor(ATTO)を用いて60分間発光強度を測定した。60分経過時点の発光強度を5種のルシフェラーゼの発光強度とした。その後、マニュアルに従ってセレンテラジンを添加し、内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度を37℃、各ウェルあたり1秒間測定の条件でLuminescensorを用いて15分間発光強度を測定した。クロイワボタル野生型ルシフェラーゼ、変異体1から3、SLOルシフェラーゼによる発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度でそれぞれ除算した値を算出し、その値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。
次に、発光スペクトルを測定した。
Claims (6)
- 配列番号40のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ。
- 配列番号42のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ。
- 配列番号41の塩基配列を有する核酸。
- 配列番号43の塩基配列を有する核酸。
- 配列番号38のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ。
- 配列番号39の塩基配列を有する核酸。
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JP2013148455A JP6150642B2 (ja) | 2013-07-17 | 2013-07-17 | オレンジ色の発光を示すルシフェラーゼ |
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