WO2016051517A1 - オレンジ色の発光を示すルシフェラーゼ - Google Patents

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WO2016051517A1
WO2016051517A1 PCT/JP2014/076113 JP2014076113W WO2016051517A1 WO 2016051517 A1 WO2016051517 A1 WO 2016051517A1 JP 2014076113 W JP2014076113 W JP 2014076113W WO 2016051517 A1 WO2016051517 A1 WO 2016051517A1
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luciferase
seq
amino acid
acid sequence
luminescence
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PCT/JP2014/076113
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克典 小江
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オリンパス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12007—Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) (1.13.12.7), i.e. firefly-luciferase

Definitions

  • the present invention relates to a luciferase that exhibits orange luminescence.
  • fluorescent probes such as fluorescent dyes and fluorescent proteins, chemiluminescent probes utilizing luciferin-luciferase reaction, and the like are used.
  • luminescence measurement with excellent quantitativeness is used, which does not cause cell damage due to excitation light and does not cause the problem of self-luminescence.
  • the intensity of luciferase gene expression (specifically, the expression level) can be examined by measuring the intensity of luminescence from the cell due to luciferase activity. .
  • cells are first lysed to prepare a cell lysate, and then luciferin, adenosine triphosphate (ATP), etc. are added to the cell lysate, and light is emitted by a luminometer using a photomultiplier tube.
  • the intensity is quantified, and the expression level is specified based on the result.
  • the luminescence intensity is measured after lysing the cells. For this reason, the expression level of the luciferase gene at a certain point in time is obtained as an average value of all cells used for the measurement.
  • a luminescent gene such as a luciferase gene as a reporter gene
  • a calcium phosphate method for example, a calcium phosphate method, a lipofectin method, an electroporation method, or the like
  • a calcium phosphate method for example, a calcium phosphate method, a lipofectin method, an electroporation method, or the like
  • By connecting the target DNA fragment upstream or downstream of the luciferase gene to be introduced into the cell and measuring the expression level of the luciferase gene it becomes possible to examine the influence of the DNA fragment on the transcription of the luciferase gene.
  • a luciferase gene to be introduced into a cell and a target gene, it becomes possible to examine the influence of the gene product on the expression of the luciferase gene.
  • Non-Patent Document 1 a dual assay
  • Patent Document 2 a multi-color assay
  • the multicolor assay includes a plurality of luciferases that exhibit a maximum emission wavelength near 550 nm (green emission), luciferases that exhibit a maximum emission wavelength near 580 nm (orange emission), and luciferases that exhibit a maximum emission wavelength near 620 nm (red emission).
  • This is a method of simultaneously measuring and calculating the relative light amount of each luminescent enzyme in a sample containing a colored luminescent enzyme.
  • luciferases used in the multicolor assay are derived from a common firefly, it is possible to simultaneously detect a plurality of luminescent colors using a single type of substrate.
  • luciferases that have been marketed so far are the luciferase group derived from the Iriomote butterfly Rhagophtalmus ohbai, which includes green luciferase (SLG luciferase: Toyobo Co., Ltd.), orange luciferase (SLO luciferase: Toyobo Co., Ltd.). ) And red luciferase (SLR luciferase: Toyobo Co., Ltd.) (Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a luciferase that produces high-luminance orange luminescence.
  • the luciferase according to the embodiment has an amino acid sequence in which a mutation is introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.
  • the luciferase according to the embodiment catalyzes a luminescence reaction that produces luminescence having a maximum emission wavelength of 570 nm to 610 nm.
  • the luminescence has an intensity of 10 times or more compared with the luminescence of the luminescence reaction catalyzed by the luciferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48.
  • a luciferase that produces high-luminance orange light emission.
  • FIG. 1 is a diagram showing luminescence induced in HeLa cells containing various luciferases when D-luciferin is used as a luminescent substrate.
  • FIG. 2 is a graph showing the luminescence intensity of luminescence induced by various luciferases when D-luciferin is used as a substrate.
  • FIG. 3 is a graph showing emission spectra of luminescence induced by various luciferases when D-luciferin is used as a substrate.
  • the first embodiment of the present invention is luciferase.
  • “Luciferase” generally refers to an enzyme that catalyzes a chemical reaction in which luminescence occurs.
  • a substance that is a substrate for the enzyme is called luciferin.
  • Luminescence occurs when luciferin undergoes a chemical change by the catalytic action of luciferase in the presence of ATP.
  • luciferases derived from fireflies and bacteria are obtained.
  • the luciferase according to the embodiment is also synonymous with the luciferase defined as described above, but is a luciferase obtained from a firefly described later.
  • luciferin means luciferin that is a substrate for firefly luciferase and analogs thereof.
  • Luciferin is a substance described as a substrate in WO2009 / 096197 and WO2010 / 106896, for example. Specifically, for example, dimethylaniline-monoene luciferin, dimethylaniline-diene luciferin, dimethylaniline luciferin, D-luciferin, and derivatives thereof.
  • the luciferase according to the embodiment has an amino acid sequence in which a mutation is introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 is obtained by introducing a mutation into the amino acid sequence of wild-type luciferase (SEQ ID NO: 1) obtained from Lucioura kurouiwae.
  • a crocodile firefly is a firefly belonging to the genus Firefly belonging to the order of the Arthropodata Insecta.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 is obtained by replacing the 283rd serine residue from the N-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with a glycine residue.
  • substitution mutation may be represented as “S283G mutation” or “S283G”, and the luciferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 may be represented as “S283G mutant” or “variant 1”. is there.
  • amino acid sequence of wild-type luciferase obtained from the crocodile firefly is as follows. (SEQ ID NO: 1)
  • amino acid sequence of the S283G mutant (mutant 1) is as follows. (SEQ ID NO: 38)
  • the mutation introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 is, for example, substitution, deletion and / or addition of amino acid residues. Further, a mutation may be introduced at one position on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, or a mutation may be introduced at a plurality of positions.
  • the amino acid sequence of the luciferase according to the embodiment and the amino acid sequence of the original SEQ ID NO: 38 may have a certain homology. For example, these amino acid sequences are 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 99.8%. It has the above homology.
  • the luciferase according to the embodiment catalyzes a luminescence reaction that generates luminescence having a maximum emission wavelength of 570 nm to 610 nm.
  • the light having a wavelength of 570 nm to 610 nm is light generally called orange.
  • the maximum emission wavelength of light emitted by the luciferase according to the embodiment is preferably in the range of 580 nm to 600 nm, more preferably in the range of 585 nm to 595 nm, and most preferably in the vicinity of 590 nm.
  • the luminescence by the luciferase according to the embodiment has the maximum emission wavelength in this range, but light having a wavelength outside this range may be mixed. However, it is preferable that the intensity of light having a wavelength outside such a range is small.
  • orange luminescence is obtained at a temperature suitable for culturing organisms.
  • orange luminescence is obtained in a temperature range suitable for culturing mammalian cells, and the temperature is, for example, 32 ° C. to 42 ° C., more specifically 35 ° C. To 39 ° C., particularly around 37 ° C.
  • high intensity luminescence can be obtained as compared with the conventional orange luciferase.
  • orange luciferase derived from Iriomotebotaru (Rhagophtalmus ohbai) (commercially available from Toyobo as SLO luciferase)
  • it has a strength of 10 times or more, preferably 20 times or more, More preferably, the strength is 29 times or more.
  • amino acid sequence of SLO luciferase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is as follows. (SEQ ID NO: 48)
  • the base sequence of the gene for SLO luciferase (Toyobo Co., Ltd.) is as follows. (SEQ ID NO: 49)
  • the luciferase according to the embodiment is a luciferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
  • substitution of one amino acid residue is introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.
  • the 256th valine residue from the N-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 is substituted with an alanine residue.
  • this substitution mutation may be expressed as “V256A mutation” or “V256A”.
  • the luciferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 is introduced with mutations of S283G and V256A based on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of wild-type luciferase derived from Kuroiwa firefly.
  • the luciferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 may be represented as “variant 2”.
  • amino acid sequence of variant 2 is as follows. (SEQ ID NO: 40)
  • the luciferase according to the embodiment is a further variant of the variant 2, which is a variant in which the properties of the variant 2 with respect to light emission are maintained.
  • a luminescence reaction that has an amino acid sequence that is a group and generates luminescence having a maximum emission wavelength of 570 nm to 610 nm, and the luminescence is compared with luminescence of a luminescence reaction catalyzed by a luciferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48 Thus, it is a luciferase having 10 times or more strength.
  • the homology between the amino acid sequence of variant 2 and the amino acid sequence of a further variant of variant 2 is preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more or 99% or more .
  • the higher this homology the higher the possibility that the properties of variant 2 will be maintained in further variants, and a practically sufficient effect is expected.
  • luciferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42.
  • substitution of two amino acid residues is introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38.
  • the first substitution is the above-described substitution of V256A.
  • the second substitution is a substitution in which the 111th arginine residue from the N-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 is replaced with a histidine residue.
  • this substitution mutation may be expressed as “R111H mutation”, “R111H” or the like.
  • the luciferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 mutations of R111H, S283G, and V256A are introduced based on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of wild-type luciferase derived from Kuroiwa firefly.
  • the luciferase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 may be represented as “variant 3”.
  • amino acid sequence of variant 3 is as follows. (SEQ ID NO: 42)
  • the luciferase according to the embodiment is a further mutant of the mutant 3, which is a mutant in which the light emission property of the mutant 3 is maintained. Specifically, it is an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42, wherein the 111th, 283rd and 256th amino acid residues from the N-terminal side are histidine residues, respectively.
  • the homology between the amino acid sequence of variant 3 and the amino acid sequence of a further variant of variant 3 is preferably 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more or 99% or more .
  • the S283G mutant (mutant 1) may be excluded from the luciferase according to the embodiment.
  • the luciferase according to the embodiment can be used for observation and quantification of luminescence in a living body, like a general luciferase. Furthermore, the luciferase according to the embodiment can be used in a multicolor assay together with a luciferase that induces luminescence other than orange. In particular, it can be used in a three-color multicolor assay with red and green luciferases.
  • the second embodiment of the present invention is a nucleic acid having a base sequence encoding the luciferase according to the embodiment.
  • the nucleic acid according to the embodiment may have a sequence whose codon is optimized for a specific species.
  • the term “optimization” as used herein means that a codon of a gene contained in a nucleic acid is replaced with a codon having a high codon appearance frequency in a specific biological species. When optimization is performed, gene expression in a specific species is increased compared to when optimization is not performed. Codons are optimized, for example, for mammalian cells, and specifically can be optimized for mice, humans, and the like.
  • the nucleic acid according to the embodiment may further include a transcription factor binding region such as a promoter in addition to the luciferase base sequence.
  • the nucleic acid according to the embodiment may be in the form of a vector.
  • This vector may contain elements contained in a general vector such as an antibiotic resistance gene and an origin of replication, in addition to a transcription factor binding region such as a gene encoding luciferase according to the embodiment and a promoter.
  • nucleic acid according to the embodiment is a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 41. This base sequence encodes variant 2.
  • the base sequence encoding variant 2 is as follows. (SEQ ID NO: 41)
  • nucleic acid according to the embodiment is a nucleic acid having the base sequence of SEQ ID NO: 43. This base sequence encodes variant 3.
  • the base sequence encoding variant 3 is as follows. (SEQ ID NO: 43)
  • the third embodiment of the present invention is a method for producing the luciferase according to the embodiment.
  • the method according to the embodiment includes a step of introducing a mutation into the gene of mutant 1.
  • a mutation is introduced into the base sequence encoding mutant 1 (SEQ ID NO: 39).
  • the base sequence encoding variant 1 is as follows. (SEQ ID NO: 39)
  • the mutation may be introduced by a general method. For example, mutations may be introduced at random using a mutagen such as nitrosoguanidine or ultraviolet rays. Alternatively, mutations may be introduced randomly by PCR using DNA polymerase that induces mutation at a certain frequency. Alternatively, the intended mutation may be introduced at a specific position by a recombinant technique or the like.
  • a mutagen such as nitrosoguanidine or ultraviolet rays.
  • mutations may be introduced randomly by PCR using DNA polymerase that induces mutation at a certain frequency.
  • the intended mutation may be introduced at a specific position by a recombinant technique or the like.
  • the method according to the embodiment includes a step of selecting a target mutant from candidate mutants following the step of introducing a mutation.
  • Such a selection may be made by a general screening technique. Specifically, for example, the nucleic acid after mutation introduction is inserted into an expression vector, the vector is further incorporated into E. coli, and the mutant gene is expressed in the E. coli. Thereafter, a substance such as luciferin necessary for the luminescence reaction is supplied to cause the luminescence reaction. Then, E. coli expressing the luciferin according to the embodiment can be selected from the state of luminescence. That is, Escherichia coli that emits orange with high brightness can be selected. Thereafter, optionally, a nucleic acid containing a luciferase gene may be extracted from the selected Escherichia coli, and further its base sequence may be confirmed.
  • chemiluminescent samples when a chemiluminescent sample with low emission intensity is imaged with a microscope, the exposure time required to capture a clear image becomes long.
  • chemiluminescent samples limit the research applications that can be used. For example, if exposure time of 30 minutes is required due to low emission intensity, it is possible to shoot for 30 minutes over time, but it is not possible to shoot in a shorter time or even in real time. It is. Further, when acquiring an image, it is necessary to acquire and compare a plurality of images in order to focus on the luminescent cells, but when a long exposure time is required due to low emission intensity, 1 It takes time and effort to acquire only one image.
  • the luciferase according to the embodiment can induce orange luminescence with high brightness as compared with the known luciferase, and therefore has a particularly advantageous effect when used as a reporter for protein imaging. That is, since the luciferase according to the embodiment can provide high luminescence intensity even in a small amount, it enables favorable detection of proteins with low expression levels. Further, since the obtained emission intensity is high, the exposure time required for detection can be shortened. For this reason, if this luciferase is used as a reporter for temporal observation, the exposure time required for imaging can be shortened, and observation near real time becomes possible. That is, observation over time with high time resolution becomes possible.
  • luciferase that produces conventional orange light cannot obtain light with sufficient light emission intensity. In the first place, the number of luciferases that produce orange luminescence is small. Therefore, the usefulness of conventional multicolor assays with red, orange and green is low.
  • the luciferase according to the embodiment, high-luminance orange luminescence is generated. Therefore, the luciferase is used in a multi-color assay of red, orange, and green, so that the separation from other luciferase signals is enhanced. Highly quantitative measurement is possible.
  • Example 1 Cloning of luciferase gene derived from Japanese croaker.
  • Materials As adults 4 adults of Kuroiwa firefly (Lucioura kuroiwae) from Kumejima, Okinawa were used.
  • RNA extraction reagent TRIzol Reagent (Invitrogen) were placed in a Lysing Matrix D tube (MP-Biomedicals), which is a tube containing beads for tissue and cell homogenization.
  • MP-Biomedicals Lysing Matrix D tube
  • This tube is attached to a tissue cell disruption device FastPrep 24 (MP-Biomedicals) or FastPrep FP100A (MP-Biomedicals), and a firefly luminescent device is used as a reagent under conditions of a vibration speed of 6.5 m / s and a vibration time of 45 seconds. It was crushed inside. After completion, the tube was removed from the crusher and placed on ice for 30 minutes. Then, it was crushed again under the same conditions.
  • RNA was separated and purified from the crushed solution. 100 ⁇ l of the obtained RNA solution was precipitated and concentrated by the ethanol precipitation method. Next, a full-length cDNA was synthesized from the precipitated and concentrated total RNA using a full-length cDNA synthesis reagent GeneRacer (Invitrogen) according to the manual. 20 ⁇ l of the obtained cDNA solution was used as a firefly full-length cDNA library for the following gene experiments.
  • GeneRacer GeneRacer
  • Y, R and N in the primer sequence represent mixed bases: Y represents C or T, R represents A or G, and N represents , A, G, C or T): flexLuc5-ATA (5′-ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTA AT-3 ′: SEQ ID NO: 8), flexLuc5-ATG (5′-ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTG AT-3 ′: SEQ ID NO: 9), flexLuc5-ATT (5′-ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTT AT-3 ′: SEQ ID NO: 10), flexLuc5-ACA (5′-ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTA AT-3 ′: SEQ ID NO: 11), flexLuc5-ACG (5′-ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTG AT-3 ′: SEQ ID NO: 12), flexLuc5-ACT (5′-ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTT AT-3 ′
  • the GeneRacer 5 ′ Primer and the GeneRacer 5 ′ Nested Primer included in the full-length cDNA synthesis reagent GeneRacer kit (Invitrogen) were used.
  • nested PCR was performed in which the gene amplified once by PCR was used as a template and the gene was amplified more specifically by the inner primer pair. PCR was performed using polymerase Ex-Taq (Takara Bio Inc.) according to the manual.
  • the luciferase gene was amplified using 12 kinds of primer pairs consisting of any of the 12 kinds of specific mixed primers prepared as described above and GeneRacer 5 'Primer.
  • Final concentration is 10 ⁇ Ex Taq Buffer (20 mM Mg2 + plus), final concentration is 0.2 mM each dNTP Mixture (2.5 mM each), final concentration is 0.05 U / ⁇ l TaKaRa Ex Taq (5 U / ⁇ l)
  • a 10 ⁇ l PCR reaction solution containing one of 12 primers with a final concentration of 1.0 ⁇ M and GeneRacer 3 ′ Primer with a final concentration of 0.3 ⁇ M was prepared, and 0.2 ⁇ l of a firefly full-length cDNA library solution was added thereto.
  • PCR reaction heat denaturation at 94 ° C. for 2 minutes was first performed, and then 94 ° C. for 30 seconds, 45 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 90 seconds were repeated for 30 cycles.
  • 1 ⁇ l of the PCR reaction solution was electrophoresed using a 1% Tris acetate buffer (TAE) agarose gel, and after ethidium bromide staining, the amplified gene band was observed under ultraviolet irradiation. Since gene amplification was slightly observed in all 12 reaction solutions, nested PCR reactions were carried out as follows using these PCR reaction solutions as templates.
  • TAE Tris acetate buffer
  • the luciferase gene was amplified using 4 types of primer pairs consisting of 4 out of 12 types of primers used in the first PCR and GeneRacer 3 'Nested Primer.
  • Final concentration is 10 ⁇ Ex Taq Buffer (20 mM Mg2 + plus), final concentration is 0.2 mM each dNTP Mixture (2.5 mM each), final concentration is 0.05 U / ⁇ l TaKaRa Ex Taq (5 U / ⁇ l)
  • a 10 ⁇ l PCR reaction solution containing one of 12 kinds of primers having a final concentration of 1.0 ⁇ M and a GeneRacer 3 ′ Primer having a final concentration of 0.3 ⁇ M was prepared, and the first PCR reaction solution was used as a template for sterilized water.
  • PCR final volume 20 ⁇ l
  • a combination of primers that efficiently amplified the gene in the vicinity of about 1.4 kbp was collected using a gel extraction technique.
  • Gel extraction was performed according to the manual using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation).
  • Subcloning of the PCR product extracted from the gel was performed using the TA cloning technique.
  • TA cloning was performed according to the manual using pGEM-T Easy Vector System (Promega Corporation). Thereafter, this vector DNA was transformed into E. coli (TOP10 strain or DH5 ⁇ strain), and insert positive colonies were selected using a blue / white screening technique.
  • the selected colony was subjected to direct colony PCR to confirm that the gene was introduced.
  • M13-F (-29) Primer (5'-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3 ': SEQ ID NO: 22) and M13 Reverse (5'-GGA TAA CAA TTT CAC AGG-3': A primer pair consisting of SEQ ID NO: 23) was used.
  • Final concentration is 10 ⁇ Ex Taq Buffer (20 mM Mg2 + plus), final concentration is 0.2 mM each dNTP Mixture (2.5 mM each), final concentration is 0.05 U / ⁇ l TaKaRa Ex Taq (5 U / ⁇ l)
  • a 10 ⁇ l PCR reaction solution containing a primer pair each having a final concentration of 0.2 ⁇ M was prepared, and a small amount of E. coli colony was added thereto as a template.
  • the PCR reaction was first heat-denatured at 94 ° C. for 1 minute, then repeated 25 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes, and finally an extension reaction at 72 ° C. for 2 minutes.
  • 2 ⁇ l of the PCR reaction solution was electrophoresed using a 1% TAE agarose gel. After ethidium bromide staining, the amplified gene band was observed under ultraviolet irradiation.
  • the base sequence of the gene was determined using the direct sequencing method.
  • PCR product purification kit ExoSAP-IT GE Healthcare Bioscience
  • excess dNTPs and primers contained in the PCR reaction solution were removed, and a template for PCR direct sequencing was prepared.
  • BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems
  • PCR product purification and sequencing were performed according to the respective manuals. After the sequencing reaction, the reaction product was purified as follows. 2.5 times volume of 100% ethanol was added to the reaction solution, and nucleic acid was precipitated using a centrifuge.
  • the gene sequence obtained by sequencing was analyzed using the “sequence linkage” function of the sequence information analysis software DNASIS Pro. This sequence was subjected to homology search using a blastx search provided by National Center for Biotechnology Information (NCBI), and confirmed to be highly homologous to the base sequence of known firefly luciferase. The base sequence obtained by the above experiment and analysis was determined to be on the 5 'end side of the novel firefly luciferase gene.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • GeneRacer 3 ′ Primer and GeneRacer 3 ′ Nested Primer used were those included in the full-length cDNA synthesis reagent GeneRacer kit (Invitrogen).
  • GeneRacer kit Invitrogen.
  • a nested PCR was performed in which the gene once amplified by PCR was used as a template and the gene was amplified more specifically by the inner primer pair. PCR was performed using polymerase Ex-Taq (Takara Bio Inc.) according to the manual.
  • the luciferase gene was amplified using a primer pair consisting of a primer prepared from the base sequence of the 5 'terminal side untranslated region and GeneRacer 3' Primer.
  • Final concentration is 10 ⁇ Ex Taq Buffer (20 mM Mg2 + plus), final concentration is 0.2 mM each dNTP Mixture (2.5 mM each), final concentration is 0.05 U / ⁇ l TaKaRa Ex Taq (5 U / ⁇ l)
  • a 20 ⁇ l PCR reaction solution containing primers each having a final concentration of 0.3 ⁇ M was prepared, and 0.4 ⁇ l of a firefly full-length cDNA library solution was added thereto.
  • the concentration of the firefly full-length cDNA library solution was not quantified.
  • the PCR reaction was first heat-denatured at 94 ° C. for 2 minutes, then repeated 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes, and finally an extension reaction at 72 ° C. for 5 minutes.
  • 1 ⁇ l of the PCR reaction solution was electrophoresed using a 1% TAE agarose gel. After ethidium bromide staining, the amplified gene band was observed under ultraviolet irradiation. Since gene amplification was slightly observed, nested PCR reactions were performed using this PCR reaction solution as a template.
  • a luciferase gene was amplified using a primer pair consisting of a primer No2-Kuroiwa-F2 (GTTCGGTATACCGCGAGTTCGGGCAA: SEQ ID NO: 26) and a GeneRacer 3 'Nested Primer for the nested PCR.
  • Final concentration is 10 ⁇ Ex Taq Buffer (20 mM Mg2 + plus), final concentration is 0.2 mM each dNTP Mixture (2.5 mM each), final concentration is 0.05 U / ⁇ l TaKaRa Ex Taq (5 U / ⁇ l)
  • 20 ⁇ l of a nested PCR reaction solution containing primers each having a final concentration of 0.3 ⁇ M was prepared, and 1.0 ⁇ l of a solution obtained by diluting the first PCR reaction solution 10-fold with sterile water was added thereto as a template.
  • the PCR reaction was first heat-denatured at 94 ° C. for 2 minutes, then repeated 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C.
  • PCR final volume 20 ⁇ l
  • a combination of primers that efficiently amplified the gene in the vicinity of about 2 kbp was collected using a gel extraction technique.
  • Gel extraction was performed according to the manual using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega Corporation).
  • Subcloning of the PCR product extracted from the gel was performed using the TA cloning technique.
  • TA cloning was performed according to the manual using pGEM-T Easy Vector System (Promega Corporation). Thereafter, this vector DNA was transformed into E. coli (TOP10 strain or DH5 ⁇ strain), and insert positive colonies were selected using a blue / white screening technique.
  • the selected colony was subjected to direct colony PCR to confirm that the gene was introduced.
  • M13-F (-29) Primer (5'-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3 ': SEQ ID NO: 22) and M13 Reverse (5'-GGA TAA CAA TTT CAC AGG-3': A primer pair consisting of SEQ ID NO: 23) was used.
  • Final concentration is 10 ⁇ Ex Taq Buffer (20 mM Mg2 + plus), final concentration is 0.2 mM each dNTP Mixture (2.5 mM each), final concentration is 0.05 U / ⁇ l TaKaRa Ex Taq (5 U / ⁇ l)
  • a 10 ⁇ l PCR reaction solution containing a primer pair each having a final concentration of 0.2 ⁇ M was prepared, and a small amount of E. coli colony was added thereto as a template.
  • the PCR reaction was first heat-denatured at 94 ° C. for 1 minute, then repeated 25 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 2 minutes, and finally an extension reaction at 72 ° C. for 2 minutes.
  • 2 ⁇ l of the PCR reaction solution was electrophoresed using a 1% TAE agarose gel. After ethidium bromide staining, the amplified gene band was observed under ultraviolet irradiation.
  • the base sequence of the gene was determined using the direct sequencing method.
  • PCR product purification kit ExoSAP-IT GE Healthcare Bioscience
  • excess dNTPs and primers contained in the PCR reaction solution were removed, and a template for PCR direct sequencing was prepared.
  • BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems
  • Primers used for sequencing were vector primers or gene-specific primers.
  • PCR product purification and sequencing were performed according to the respective manuals. After the sequencing reaction, the reaction product was purified as follows.
  • SEQ ID NO: 44 The nucleotide sequence determined by sequencing is shown in SEQ ID NO: 44.
  • the base sequence from the start codon to the stop codon in SEQ ID NO: 44 was used as the base sequence of the wild type crocodile firefly luciferase gene.
  • the base sequence of the wild-type black luciferase gene is as follows. (SEQ ID NO: 2).
  • the full-length firefly luciferase gene was obtained by sequencing.
  • the base sequence (SEQ ID NO: 2) and the sequence translated into amino acids (SEQ ID NO: 1) were subjected to homology search using blastx and blastp search provided by NCBI. Each search confirmed high homology with the base sequence and amino acid sequence of known firefly luciferase.
  • the base sequence obtained by the above experiment and analysis was determined to be the full-length cDNA sequence of the wild-type croaker luciferase gene.
  • the protein encoded by this luciferase gene is referred to as wild-type crocodile firefly luciferase.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) obtained by translating the base sequence of SEQ ID NO: 2 exhibits luminescence activity as luciferase
  • the wild-type crocodile firefly luciferase gene contains EcoRI and BamHI restriction enzyme recognition sequences.
  • genetic modification was performed to remove these recognition sequences in these base sequences. This treatment was performed to facilitate the introduction of the luciferase gene described later into an expression vector.
  • the gene mutation was introduced by a molecular biological genetic modification method using primers of SEQ ID NOs: 45, 46 and 47.
  • the sequence after mutagenesis is the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 3 does not include EcoRI and BamHI restriction enzyme recognition sequences.
  • the primer sequence (SEQ ID NO: 29, 30) for introduction into a vector containing restriction enzyme recognition sequences of EcoRI and BamHI was used. It was introduced into pRSET-B vector (Invitrogen). The obtained vector DNA was transformed into Escherichia coli JM109 (DE3) strain to form colonies. Using the primer pair of SEQ ID NOs: 31 and 32, it was confirmed whether the gene was normally introduced into the colony. Luminescence was observed by spraying a solution containing D-Luciferin on a colony into which a gene was normally introduced.
  • Example 2 Production of S283G mutant crocodile firefly luciferase
  • a mutant gene expressing S283G mutant-type croaker luciferase was prepared.
  • the base sequence (SEQ ID NO: 2) of the wild-type black luciferase gene prepared in Example 1 was optimized for expression in mammalian cells.
  • the optimized base sequence is as follows. (SEQ ID NO: 4)
  • the amino acid sequence encoded by the optimized base sequence is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 is the same as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • S283G a mutation introduced into this optimized luciferase gene so that the 283rd serine from the N-terminal side in the encoded amino acid sequence was replaced with glycine.
  • S283G primer (GAC TAC AAG TGC ACC GGC ATG CTC GTG CCC: SEQ ID NO: 33) was used.
  • mutant 1 The luciferase encoded by this gene is referred to as “mutant 1” or “S283G mutant”.
  • the amino acid sequence of variant 1 is shown in SEQ ID NO: 38. According to Mutant 1, luminescence with higher brightness than wild-type luciferase and emission color shifted to the longer wavelength side was obtained.
  • Mutant 1 (S283G) was subjected to random mutagenesis from about 570 bp to about 1132 bp of luciferase using GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit (Agilent).
  • JP-Kuroiwa (mam) -570-F primer (cgtggaagtggaacacacacacac: SEQ ID NO: 36)
  • JP-Kuroiwa (mam) -1132-R primer (TGGTGTCCAGGTCGATCACTTTGAC: SEQ ID NO: 37) This was carried out according to the instructions attached to the kit.
  • the mutated plasmid obtained by the above method was transformed into Escherichia coli JM109 (DE3) strain (Promega) to form colonies.
  • the colonies were sprayed with D-Luciferin at a final concentration of 2 mM, and then luminescence was imaged with a CCD camera DP-70 (Olympus). The colonies that were brighter than other colonies and showed orange luminescence were picked up, and after the introduction of mutations, the sequence was read using a sequencer to confirm that random mutations were introduced into the luciferase gene.
  • mutant 2 One of the genes into which the mutation thus obtained is introduced is referred to as “mutant 2”.
  • the base sequence of variant 2 is shown in SEQ ID NO: 41.
  • the amino acid sequence encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 40.
  • mutant 2 has a mutation (V256A) in which the 256th valine residue from the N-terminal side in the amino acid sequence is replaced with an alanine residue in addition to the mutation of S283G. It was.
  • mutant 2 random mutagenesis was performed again on mutant 2. That is, a random mutation was introduced into the same domain as described above using GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit (Agilent).
  • variant 3 The base sequence of variant 3 is shown in SEQ ID NO: 43.
  • the amino acid sequence encoded by the base sequence is shown in SEQ ID NO: 42.
  • SEQ ID NO: 42 in variant 3, in addition to the mutations of S283G and V256A, there is a mutation (R111H) in which the 111th arginine residue from the N-terminal side in the amino acid sequence is replaced with a histidine residue. It was happening.
  • the mutation at the 111th residue from the N-terminal side in the amino acid sequence is a mutation that was not originally intended, and is considered to have been accidentally substituted in PCR.
  • Example 4 Observation of luminescence in HeLa cells, measurement of luminescence intensity and emission spectrum.
  • the luminescence intensity in HeLa cells was measured for each of the wild luciferase and mutant luciferase (mutants 1 to 3) obtained in Examples 1 to 3, It compared with the orange luciferase (SLO luciferase: Toyobo Co., Ltd.) derived from the Iriomote firefly Rhagophthalmus ohbai.
  • SLO luciferase Toyobo Co., Ltd.
  • a Kozak sequence (gccrccatgg: SEQ ID NO: 6) was assigned to each gene. All four sequences are codon optimized for expression in mammalian cells. Subsequently, these sequences were inserted between the SgfI and PmeI sites of the multicloning site of pF9A CMV hRLuc neo Flexi vector (Promega), respectively. The insertion of each gene into the vector was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35.
  • the pF9A vector contains the Renilla luciferase gene (hRLuc) as an internal control in the vector sequence, and the luminescence intensity of the luminescence gene inserted into the multicloning site can be calculated as the ratio of the luminescence intensity of Renilla luciferase. is there.
  • Luminescence observation Each of the 5 types of expression vectors thus prepared was transfected into HeLa cells seeded in a 48-well plate by the lipofection method. At the stage when the gene was expressed, 2 mM D-luciferin was added as a substrate and photographed using a DP70 color CCD (manufactured by Olympus Corporation) with an exposure time of 1 minute (ISO 1600). The cell culture temperature was about 37 ° C.
  • FIG. 1 summarizes the images acquired by shooting.
  • FIG. 1 shows the results in four adjacent wells for variant 1, variant 2, variant 3, wild type 3 and SLO in order from the top.
  • FIG. 1 shows the observation result acquired in color in monochrome.
  • mutants 1 to 3 were able to obtain a sufficient emission image. According to the color results, the light emitted from the variant 1 was reddish, whereas the light emitted from the variants 2 and 3 was orange light.
  • the luminescence intensity at the time when 60 minutes had elapsed was defined as the luminescence intensity of five luciferases. Thereafter, coelenterazine was added according to the manual, and the luminescence intensity by Renilla luciferase as an internal control was measured at 37 ° C. for 1 second using a Luminescence sensor under the conditions of measurement for 1 second per well. A value obtained by dividing the luminescence intensity by the citrus luciferase from the luminescence intensity by the Renilla luciferase was calculated as the luminescence intensity of each luciferase.
  • LumiFl SpectroCapture (slit width 0.5 mm, exposure time 1 minute) was used as a measurement device, and the solution contained 2 mM D-luciferin / CO2 Independent Medium (Invitrogen), and HeLa cells each expressing various luciferases. was suspended and allowed to emit light in the cells, and the emission spectrum was measured in an environment of 37 degrees. This HeLa cell is a cell suspended by trypsin treatment.
  • the “maximum emission wavelength” means a wavelength at which the emission intensity is maximum in a spectrum obtained by measuring luminescence of luciferin induced by luciferase.
  • wild-type black luciferase showed a maximum emission wavelength of about 585 nm in HeLa cells suspended in a medium at about 37 degrees. Under the same conditions, the maximum emission wavelength was about 606 nm for variant 1, about 590 nm for variant 2, about 590 nm for variant 3, and about 594 nm for SLO luciferase (Toyobo).
  • the croaker luciferase variants 2 and 3 have luminescence intensities 20.6 times and 29.1 times the luminescence intensities of SLO luciferase while exhibiting the same maximum emission wavelength as SLO luciferase. It was.

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Abstract

　実施形態に係るルシフェラーゼは、配列番号３８のアミノ酸配列に対して変異が導入されたアミノ酸配列を有する。実施形態に係るルシフェラーゼは、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒する。前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有する。

Description

オレンジ色の発光を示すルシフェラーゼ
　本発明は、オレンジ色の発光を示すルシフェラーゼに関する。
　細胞内のシグナル伝達および遺伝子発現といった細胞の機能を調べるためには、蛍光色素および蛍光タンパク質といった蛍光プローブ並びにルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する化学発光プローブ等が用いられている。
　特に遺伝子の発現調節の解析には、励起光による細胞のダメージが生じず且つ自家発光の問題が生じない、定量性に優れた発光計測が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を観察する場合、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光強度を測定することで、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ（具体的には発現量）を調べることができる。具体的には、最初に細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後この細胞溶解液にルシフェリンおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで発光強度を定量し、その結果に基づいて発現量を特定する。
　この方法では、発光強度の測定は細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、測定に使用した全細胞の平均値として得られる。
　ルシフェラーゼ遺伝子等の発光遺伝子をレポーター遺伝子として導入する方法として、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクチン法またはエレクトロポレーション法等を使用でき、これらの方法は目的および細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流または下流に目的のＤＮＡ断片を繋ぎ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することで、当該ＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることが可能となる。また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子と目的の遺伝子とを共発現させることで、当該遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることが可能となる。
　時間経過に沿って発光遺伝子の発現量を分析するには、生きた細胞からの発光強度を経時的に測定する必要がある。このような測定は、ルミノメーターを備えたインキュベーターにて細胞を培養し、細胞集団全体からの発光強度を一定時間ごとに測定することで行われる。細胞集団全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることにより、一定の周期性をもった発現リズム等を分析することができる。
　しかし、１つのルシフェラーゼをレポーターとした解析ではインターナルコントロールがないため、目的とする遺伝子転写活性を定量することが困難である。そこで、デュアルアッセイ（非特許文献１）やマルチカラーアッセイ（特許文献１および非特許文献２）など、発光色の異なる複数のルシフェラーゼをレポーターとして用いる手法が確立された。
　特にマルチカラーアッセイは、５５０ｎｍ付近に最大発光波長を示すルシフェラーゼ（緑色発光）、５８０ｎｍ付近に最大発光波長を示すルシフェラーゼ（オレンジ色発光）および６２０ｎｍ付近に最大発光波長を示すルシフェラーゼ（赤色発光）といった複数色の発光酵素を含む検体において、各発光酵素による相対光量を同時に測定および算出する方法である。
　マルチカラーアッセイに使用するルシフェラーゼの全てを、共通したホタルに由来のものとする場合、単一種の基質を用いて、複数の発光色を同時に検出することが可能となる。これまでに市販されているそのようなルシフェラーゼの例は、イリオモテボタルＲｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ　ｏｈｂａｉ由来のルシフェラーゼ群であり、それには、緑色ルシフェラーゼ（ＳＬＧルシフェラーゼ：東洋紡株式会社）、オレンジ色ルシフェラーゼ（ＳＬＯルシフェラーゼ：東洋紡株式会社）および赤色ルシフェラーゼ（ＳＬＲルシフェラーゼ：東洋紡株式会社）が含まれる（特許文献１）。
　しかしながら、ＳＬＯルシフェラーゼのような従来のオレンジ色ルシフェラーゼは、他の色のルシフェラーゼと比較して発光強度が低い。そのため、これを利用したマルチカラーアッセイは、ノイズの影響を受けやすく、感度の高い測定を行うことは困難である。
特開２００７－２１８７７４号公報
Naylor L. H.(1999)Biochem. Pharmacol., 58(5):749-757, Reporter gene technology: the future looks bright. Nakajima, Y., T. Kimura, K. Sugata, T. Enomoto, T. Asakawa, H. Kubota, M. Ikeda, and Y. Ohmiya., (2005)BioTechniques, 38:891-894, A multicolor luciferase assay system, one-step monitoring of multiple gene expressions with a single substrate. Viviani VR, Silva AC, Perez GL, Santelli RV, Bechara EJ, Reinach FC., (1999)Photochem. Photobiol., 70(2):254-260, Cloning and molecular characterization of the cDNA for the Brazilian larval click-beetle Pyrearinus termitilluminans luciferase.
　本発明の目的は、高輝度のオレンジ色の発光を生じさせるルシフェラーゼを提供することにある。
　実施形態に係るルシフェラーゼは、配列番号３８のアミノ酸配列に対して変異が導入されたアミノ酸配列を有する。実施形態に係るルシフェラーゼは、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒する。前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有する。
　本発明によれば、高輝度のオレンジ色の発光を生じさせるルシフェラーゼが提供される。
図１は、Ｄ－ルシフェリンを発光基質として用いた場合に、種々のルシフェラーゼを含むＨｅＬａ細胞内にて誘起される発光を示す図である。 図２は、Ｄ－ルシフェリンを基質として用いた場合に、種々のルシフェラーゼによって誘起される発光の発光強度を示す図である。 図３は、Ｄ－ルシフェリンを基質として用いた場合に、種々のルシフェラーゼによって誘起される発光の発光スペクトルを示す図である。
　本発明の第１の実施形態はルシフェラーゼである。
　「ルシフェラーゼ」とは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。実施形態に係るルシフェラーゼも、上述の通り定義されるルシフェラーゼと同義であるが、後述するホタルから取得されたルシフェラーゼである。
　実施形態に関してルシフェリンとは、ホタルルシフェラーゼの基質となるルシフェリンおよびそのアナログを意味する。ルシフェリンは、例えば、ＷＯ２００９／０９６１９７及びＷＯ２０１０／１０６８９６に基質として記載されている物質である。具体的には、例えば、ジメチルアニリン－モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン－ジエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、Ｄ－ルシフェリン及びこれらの誘導体である。
　実施形態に係るルシフェラーゼは、配列番号３８のアミノ酸配列に対して変異が導入されたアミノ酸配列を有する。
　配列番号３８のアミノ酸配列とは、クロイワボタル（Ｌｕｃｉｏｒａ　ｋｕｒｏｉｗａｅ）から取得された野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）に変異を導入したものである。クロイワボタルとは節足動物門昆虫綱コウチュウ目ホタル科ホタル属に属すホタルである。配列番号３８のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目のセリン残基がグリシン残基に置換されたものである。本願では、このような置換変異を「Ｓ２８３Ｇ変異」または「Ｓ２８３Ｇ」と表す場合があり、また、配列番号３８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを「Ｓ２８３Ｇ変異体」または「変異体１」と表す場合がある。
　クロイワボタルから取得された野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、次の通りである。
MEKEENVIYGPEPFYPVEEGSAGTQLHRFMERYAKMGAICFSNALTGQDVTYAEYFDRSVRLAEALRRHGLTPEKKIGICSENCLEFFIPVLSGAYIASPVAPTNEIYTIRELVHSFGISEPMIVFSSKKGLDKVLEVQKTVHSIKTIVIIDSSTTYRGYDSMDAFVKKYVPANFNLSEFKTVEVDNETHTLLIMNSSGSTGLPKGVLVRHCGAVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFVCGYRIVMLTKFDDEVLLKTLQDYKCTSVILVPTLFAILNRSELLEKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMKVKVIDLDTKKTLGPNRRGEICVKGPMLMTGYEKNPTETKEIIDEDGWLHSGDIGYWDEDHHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGIPDPEAGELPGAVVVLEKGKHLTEQEVLDYVAGQVYNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKAIREILKKPQAKM（配列番号１）
　また、Ｓ２８３Ｇ変異体（変異体１）のアミノ酸配列は、次の通りである。
MEKEENVIYGPEPFYPVEEGSAGTQLHRFMERYAKMGAICFSNALTGQDVTYAEYFDRSVRLAEALRRHGLTPEKKIGICSENCLEFFIPVLSGAYIASPVAPTNEIYTIRELVHSFGISEPMIVFSSKKGLDKVLEVQKTVHSIKTIVIIDSSTTYRGYDSMDAFVKKYVPANFNLSEFKTVEVDNETHTLLIMNSSGSTGLPKGVLVRHCGAVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFVCGYRIVMLTKFDDEVLLKTLQDYKCTGVILVPTLFAILNRSELLEKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMKVKVIDLDTKKTLGPNRRGEICVKGPMLMTGYEKNPTETKEIIDEDGWLHSGDIGYWDEDHHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGIPDPEAGELPGAVVVLEKGKHLTEQEVLDYVAGQVYNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKAIREILKKPQAKM（配列番号３８）
　配列番号３８のアミノ酸配列に対して導入される変異とは、例えば、アミノ酸残基の置換、欠失および／または付加等である。また、配列番号３８のアミノ酸配列上において、１カ所に変異が導入されてもよく、または複数カ所に変異が導入されてもよい。実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列と、元となる配列番号３８のアミノ酸配列とは、一定の相同性を有してよい。例えば、これらのアミノ酸配列は、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上または９９．８％以上の相同性を有する。
　実施形態に係るルシフェラーゼは、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒する。
　５７０ｎｍから６１０ｎｍの波長を有する光とは、一般にオレンジ色と言われる光である。実施形態に係るルシフェラーゼによる発光の最大発光波長は、好ましくは５８０ｎｍから６００ｎｍの範囲にあり、さらに好ましくは５８５ｎｍから５９５ｎｍの範囲にあり、最も好ましくは５９０ｎｍ付近である。
　実施形態に係るルシフェラーゼによる発光は、この範囲に最大発光波長を有するが、この範囲から外れる波長の光が混在していてもよい。しかしながら、そのような範囲外の波長の光の強度は小さい方が好ましい。
　実施形態に係るルシフェラーゼによると、生物の培養に適した温度においてオレンジ色の発光が得られる。好ましくは、実施形態に係るルシフェラーゼによると、哺乳類細胞の培養に適した温度域においてオレンジ色の発光が得られ、その温度とは、例えば３２℃から４２℃であり、より具体的には３５℃から３９℃であり、特に３７℃付近である。
　実施形態に係るルシフェラーゼによると、従来のオレンジ色ルシフェラーゼと比較して、高い強度の発光が得られる。例えば、イリオモテボタル（Ｒｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ　ｏｈｂａｉ）由来のオレンジ色ルシフェラーゼ（ＳＬＯルシフェラーゼとして東洋紡株式会社から市販されている）と比較すると、１０倍以上の強度を有し、好ましくは２０倍以上の強度を有し、さらに好ましくは２９倍以上の強度を有する。
　なお、ＳＬＯルシフェラーゼ（東洋紡株式会社製）のアミノ酸配列は以下の通りである。
MANEIILHGAKPRDPLDLGTAGIQLYRALTNFSFLREALIDAHTEEVVSYADILENSCRLAKCYENYGLRQNSVISVCSENSTIFFYPVIAALYMGVITATVNDSYTERELLETLNISKPELVFCSKKAIKNMMALKRNVNFIKKVVLLDSKEDMGEAQCLSNFMARYSEPNLDVRNFKPRDFDAKEQVALIMSSSGTTGLPKGVVLTHRNLSVRFVHCKDPLFGNRTIPSTSILSIVPFHHAFGMFTTLSYFIVGLRVVLLKRFEEKFFLSTIEKYRIPTIVLAPPVMVFLAKSPLVDQYDLSSIREVATGGAPVGTEVAVAVAKRLKIGGILQGYGLTETCCAVLITPHDDVKTGSTGRVAPYVQAKIVDLTTGKSLGPNKRGELCFKSEIIMKGYFNNKQATEEAIDKEGWLHSGDVGYYDDDGHFFVVDRLKELIKYKGYQVAPAELEWLLLQHPSIKDAGVTGVPDEAAGELPGACIVLQEGKSLTEQEIIDYIAERVSPTKRIRGGVVFVDDIPKGATGKLVRSELRKLLAQKKSKL（配列番号４８）
　また、ＳＬＯルシフェラーゼ（東洋紡株式会社製）の遺伝子の塩基配列は以下の通りである。
ATGGCTAACGAGATCATCCTGCACGGCGCCAAGCCCAGGGACCCCCTGGACCTGGGCACCGCCGGCATTCAGCTCTACAGGGCCCTGACCAACTTCTCCTTCCTGAGGGAGGCCCTGATCGACGCCCACACCGAGGAGGTGGTGTCTTACGCCGACATCCTGGAGAACAGCTGTAGACTGGCTAAGTGCTACGAGAACTACGGCCTGCGCCAGAACAGCGTGATCTCCGTGTGCAGCGAGAATAGCACCATCTTCTTCTACCCCGTGATCGCCGCCCTGTACATGGGCGTGATCACCGCCACCGTGAACGACAGCTACACCGAGCGGGAGCTGCTGGAGACCCTGAACATCTCCAAGCCCGAACTGGTGTTCTGCTCCAAGAAGGCCATCAAGAACATGATGGCCCTGAAGAGGAACGTGAACTTCATCAAGAAGGTGGTGCTGCTGGACAGCAAGGAGGATATGGGCGAGGCCCAGTGCCTGAGCAACTTCATGGCCCGGTACTCCGAGCCCAACCTGGACGTGAGAAACTTCAAGCCAAGGGACTTCGACGCCAAGGAGCAGGTGGCCCTTATTATGTCCTCCTCTGGCACCACCGGCCTGCCAAAGGGCGTGGTGCTGACCCACAGGAACCTGAGCGTGCGCTTCGTCCACTGCAAGGACCCCCTGTTCGGCAACAGAACCATCCCCTCCACCTCCATCCTGTCCATCGTGCCCTTCCACCACGCCTTCGGAATGTTCACAACCCTGTCCTACTTCATCGTGGGCCTGAGAGTGGTGCTGCTGAAGAGATTCGAGGAGAAGTTCTTCCTGAGCACCATCGAGAAGTACAGAATCCCAACAATCGTGCTGGCCCCTCCTGTGATGGTGTTCCTGGCTAAGAGCCCCCTGGTGGACCAGTACGACCTGTCCAGCATCAGAGAGGTGGCCACCGGCGGCGCCCCTGTGGGCACCGAGGTTGCCGTGGCCGTGGCCAAGCGGCTGAAGATCGGCGGCATCCTCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCTGCTGCGCCGTGCTGATCACCCCCCACGACGACGTGAAGACCGGCTCCACCGGCAGGGTAGCCCCCTACGTGCAGGCTAAGATCGTGGACCTGACCACCGGCAAGTCCCTGGGACCTAACAAGAGAGGCGAGCTGTGCTTCAAGAGCGAGATCATCATGAAGGGCTACTTCAACAACAAGCAGGCCACCGAGGAGGCCATCGACAAGGAGGGCTGGCTGCACTCCGGCGACGTGGGATACTACGACGACGATGGACATTTCTTCGTGGTGGACCGGCTGAAAGAGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCCGCCGAGCTGGAGTGGCTGCTGCTCCAGCACCCATCCATCAAGGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCCGACGAGGCCGCCGGCGAGCTGCCCGGCGCCTGCATCGTGCTCCAGGAGGGCAAGAGCCTGACCGAGCAGGAGATCATCGACTACATCGCCGAGCGAGTGTCTCCCACCAAGCGCATCCGGGGCGGAGTCGTCTTCGTGGACGACATCCCCAAGGGCGCCACCGGCAAGCTGGTGAGAAGCGAGCTGCGGAAGCTGCTGGCCCAGAAGAAGTCCAAGCTGTAA（配列番号４９）
　実施形態に係るルシフェラーゼの具体例の１つは、配列番号４０のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。このアミノ酸配列は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸残基の置換が導入されたものである。具体的には、配列番号３８のアミノ酸配列のＮ末端側から２５６番目のバリン残基がアラニン残基に置換されている。この置換変異を本願では「Ｖ２５６Ａ変異」または「Ｖ２５６Ａ」等と表す場合がある。配列番号４０のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼは、クロイワボタル由来の野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）を基準とすると、Ｓ２８３ＧおよびＶ２５６Ａの変異が導入されている。本願では、配列番号４０のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを、「変異体２」と表す場合がある。
　変異体２のアミノ酸配列は以下の通りである。
MEKEENVIYGPEPFYPVEEGSAGTQLHRFMERYAKMGAICFSNALTGQDVTYAEYFDRSVRLAEALRRHGLTPEKKIGICSENCLEFFIPVLSGAYIASPVAPTNEIYTIRELVHSFGISEPMIVFSSKKGLDKVLEVQKTVHSIKTIVIIDSSTTYRGYDSMDAFVKKYVPANFNLSEFKTVEVDNETHTLLIMNSSGSTGLPKGVLVRHCGAVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFACGYRIVMLTKFDDEVLLKTLQDYKCTGVILVPTLFAILNRSELLEKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMKVKVIDLDTKKTLGPNRRGEICVKGPMLMTGYEKNPTETKEIIDEDGWLHSGDIGYWDEDHHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGIPDPEAGELPGAVVVLEKGKHLTEQEVLDYVAGQVYNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKAIREILKKPQAKM（配列番号４０）
　実施形態に係るルシフェラーゼの別の具体例は、変異体２の更なる変異体であって、変異体２の発光に関する性質が維持された変異体である。具体的には、配列番号４０のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｎ末端側から２８３番目および２５６番目のアミノ酸残基が、それぞれグリシン残基およびアラニン残基であるアミノ酸配列を有し、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒し、前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有するルシフェラーゼである。
　変異体２のアミノ酸配列と、変異体２の更なる変異体のアミノ酸配列との間の相同性は、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上である。この相同性が高いほど、変異体２の性質が、更なる変異体においても維持される可能性が高まり、実用上十分な効果が期待される。
　実施形態に係るルシフェラーゼの別の具体例は、配列番号４２のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。このアミノ酸配列は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して２つのアミノ酸残基の置換が導入されたものである。１つの目の置換は、上述のＶ２５６Ａの置換である。２つ目の置換は、配列番号３８のアミノ酸配列のＮ末端側から１１１番目のアルギニン残基がヒスチジン残基に代わった置換である。この置換変異を本願では「Ｒ１１１Ｈ変異」または「Ｒ１１１Ｈ」等と表す場合がある。配列番号４２のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼは、クロイワボタル由来の野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）を基準とすると、Ｒ１１１Ｈ、Ｓ２８３ＧおよびＶ２５６Ａの変異が導入されている。本願では、配列番号４２のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを、「変異体３」と表す場合がある。
　変異体３のアミノ酸配列は以下の通りである。
MEKEENVIYGPEPFYPVEEGSAGTQLHRFMERYAKMGAICFSNALTGQDVTYAEYFDRSVRLAEALRRHGLTPEKKIGICSENCLEFFIPVLSGAYIASPVAPTNEIYTIHELVHSFGISEPMIVFSSKKGLDKVLEVQKTVHSIKTIVIIDSSTTYRGYDSMDAFVKKYVPANFNLSEFKTVEVDNETHTLLIMNSSGSTGLPKGVLVRHCGAVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFACGYRIVMLTKFDDEVLLKTLQDYKCTGVILVPTLFAILNRSELLEKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMKVKVIDLDTKKTLGPNRRGEICVKGPMLMTGYEKNPTETKEIIDEDGWLHSGDIGYWDEDHHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGIPDPEAGELPGAVVVLEKGKHLTEQEVLDYVAGQVYNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKAIREILKKPQAKM（配列番号４２）
　実施形態に係るルシフェラーゼの別の具体例は、変異体３の更なる変異体であって、変異体３の発光に関する性質が維持された変異体である。具体的には、配列番号４２のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｎ末端側から１１１番目、２８３番目および２５６番目のアミノ酸残基が、それぞれヒスチジン残基、グリシン残基およびアラニン残基であるアミノ酸配列を有し、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒し、前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有するルシフェラーゼである。
　変異体３のアミノ酸配列と、変異体３の更なる変異体のアミノ酸配列との間の相同性は、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上である。この相同性が高いほど、変異体３の性質が、更なる変異体においても維持される可能性が高まり、実用上十分な効果が期待される。
　実施形態に係るルシフェラーゼから、Ｓ２８３Ｇ変異体（変異体１）は除外されてもよい。
　実施形態に係るルシフェラーゼは、一般的なルシフェラーゼと同様に、生体内における発光の観察や定量に使用することができる。さらに、実施形態に係るルシフェラーゼは、オレンジ色以外の発光を誘起するルシフェラーゼとともに、マルチカラーアッセイに使用することができる。特に、赤色ルシフェラーゼおよび緑色ルシフェラーゼとともに、３色のマルチカラーアッセイに使用することができる。
　本発明の第２の実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を有する核酸である。
　実施形態に係る核酸は、特定の生物種に対してコドンが最適化された配列を有していてよい。ここにいう「最適化」とは、核酸に含まれる遺伝子のコドンを、特定の生物種においてコドン出現頻度が高いコドンに代えることを意味する。最適化を行った場合、特定の生物種における遺伝子の発現は、最適化をしない場合に比べて高まる。コドンは、例えば哺乳細胞に最適化され、具体的にはマウス、ヒト等に最適化できる。
　実施形態に係る核酸は、ルシフェラーゼの塩基配列以外にも、プロモーターといった転写因子結合領域をさらに含んでよい。
　実施形態に係る核酸は、ベクターの形態であってよい。このベクターは、実施形態に係るルシフェラーゼをコードする遺伝子およびプロモーター等の転写因子結合領域に加えて、抗生物質耐性遺伝子および複製起点といった一般的なベクターに含まれる要素を含んでよい。
　実施形態に係る核酸の具体例の１つは、配列番号４１の塩基配列を有する核酸である。この塩基配列は、変異体２をコードする。
　変異体２をコードする塩基配列は以下の通りである。
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCcCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCGCGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGCGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCGGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAATCTGACCGAGATTGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACTGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACACCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA（配列番号４１）
　実施形態に係る核酸の別の具体例は、配列番号４３の塩基配列を有する核酸である。この塩基配列は、変異体３をコードする。
　変異体３をコードする塩基配列は以下の通りである。
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCACGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGCGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCGGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAATCTGACCGAGATTGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACTGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACACCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA（配列番号４３）
　本発明の第３の実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼを製造する方法である。
　実施形態に係る方法は、変異体１の遺伝子に変異を導入する工程を含む。例えば、変異体１をコードする塩基配列（配列番号３９）に対して変異が導入される。
　なお、変異体１をコードする塩基配列は以下の通りである。
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCGCGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGTGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCGGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA（配列番号３９）
　変異は、一般的な方法によって導入してよい。例えば、ニトロソグアニジンや紫外線といった突然変異原を利用してランダムに変異を導入してもよい。また、一定の頻度で突然変異を誘発するＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ法によってランダムに変異を導入してもよい。あるいは、組み換え技術等により特定の位置に意図した変異を導入してもよい。
　実施形態に係る方法は、変異を導入する工程に続いて、候補となる変異体の中から目的とする変異体を選択する工程を含む。
　このような選択は、一般的なスクリーニング技術によって行ってよい。具体的には、例えば、変異導入後の核酸を発現ベクターに挿入し、さらにそのベクターを大腸菌に組み込み、その大腸菌内にて変異体の遺伝子を発現させる。その後、発光反応に必要なルシフェリン等の物質を供給して、発光反応を生じさせる。そして、発光の様子から、実施形態に係るルシフェリンを発現する大腸菌を選択できる。すなわち、高輝度でオレンジ色に光る大腸菌を選択できる。その後、任意に、選択した大腸菌から、ルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸を抽出したり、さらにその塩基配列を確認したりしてもよい。
　以上説明した本発明の実施形態によれば、以下のような効果が得られる。
　すなわち、本発明の実施形態によれば、高輝度のオレンジ色の発光を実現することができる。
　従来、発光強度が低い化学発光試料を顕微鏡により撮像する場合、鮮明な画像を撮影するために必要な露出時間は長くなる。このような化学発光試料は、使用できる研究用途が制限される。例えば、発光強度の低さのために３０分間の露出時間が必要となる場合、３０分間の経時的撮影は可能であっても、より短い時間での撮影、さらにはリアルタイムでの撮影は不可能である。また、画像の取得に当って、発光する細胞に焦点を合わせるために複数枚の画像を取得し比較する必要があるが、発光強度の低さのために長い露出時間を必要とする場合、１枚の画像を取得するだけでも手間と時間を要することになる。
　これに対し、実施形態に係るルシフェラーゼは、既知のルシフェラーゼと比較して、高輝度のオレンジ色の発光を誘起できるため、タンパク質のイメージングのためのレポーターとして利用する場合に特に有利な効果を奏する。すなわち、実施形態に係るルシフェラーゼは、少量でも高い発光強度を提供できるため、発現量が低いタンパク質の良好な検出を可能とする。また、得られる発光強度が高いことにより、検出に必要な露出時間を短縮できる。このため、このルシフェラーゼを経時的観察のためのレポーターとして利用すれば、撮影に必要な露出時間を短くすることが可能となり、よりリアルタイムに近い観察が可能となる。すなわち、時間分解能が高い経時的観察が可能となる。
　また、従来のオレンジ色の発光を生じるルシフェラーゼでは、十分な発光強度の発光は得られない。そもそも、オレンジ色の発光を生じるルシフェラーゼの数は少ない。そのため、赤色、オレンジ色および緑色による、従来のマルチカラーアッセイの有用性は低い。
　一方、実施形態に係るルシフェラーゼによれば、高輝度なオレンジ色の発光を生じさせるため、赤色、オレンジ色および緑色のマルチカラーアッセイに利用することで、その他のルシフェラーゼのシグナルとの分離性が高まり、定量性の高い測定が可能となる。
　［実施例１：クロイワボタル由来のルシフェラーゼ遺伝子のクローニング］
　１．材料
　材料として沖縄県久米島産クロイワボタル（Ｌｕｃｉｏｒａ　ｋｕｒｏｉｗａｅ）の成虫４個体を用いた。
　２．トータルＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成
　ホタルの成虫からハサミを用いて発光器を切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるＬｙｓｉｎｇ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｄチューブ（ＭＰ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に、採取した発光器および１ｍＬのトータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ　２４（ＭＰ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）またはＦａｓｔＰｒｅｐ　ＦＰ１００Ａ（ＭＰ－Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に装着し、振動速度６．５ｍ／ｓおよび振動時間４５秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、３０分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕した。
　次に、トータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔの説明書に従って、破砕した溶液からトータルＲＮＡの分離精製を行った。得られたＲＮＡ溶液１００μｌを、エタノール沈殿法によって沈殿濃縮した。次に、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）をマニュアルに従って使用して、沈殿濃縮したトータルＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ溶液２０μｌをホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーとして以下の遺伝子実験に用いた。
　３．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側の同定
　３－１．Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄ（ＲＡＣＥ）法に用いるプライマーの作製
　クロイワボタルのルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によって行った。このＰＣＲに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。
　ホタルルシフェラーゼにおいてよく保存されているアミノ酸領域を確認するために、既に公開されている１０種類のホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列を、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ　Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）を用いて比較した。比較に用いた近縁生物は、ラムフィリス・ノクティルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ　ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）（登録番号ＣＡＡ６１６６８）、ルキオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ　ｃｒｕｃｉａｔａ）（登録番号Ｐ１３１２９）、ルキオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ　ｌａｔｅｒａｌｉｓ）（登録番号Ｑ０１１５８）、ルキオラ・ミングレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ　ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）（登録番号Ｑ２６３０４）、ホタリア・パルヴラ（Ｈｏｔａｒｉａ　ｐａｒｖｕｌａ）（登録番号ＡＡＣ３７２５３）、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）（登録番号ＢＡＦ４８３９０）、フォトゥリス・ペンシルヴァニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ　ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）（登録番号Ｑ２７７５７）、ピロコエリア・ミヤコ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ　ｍｉｙａｋｏ）（登録番号ＡＡＣ３７２５４）、ピロコエリア・ルファ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ　ｒｕｆａ）（登録番号ＡＡＧ４５４３９）およびラハゴフタルムス・オーバイ（Ｒｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ　ｏｈｂａｉ）（登録番号ＢＡＦ３４３６０）である。
　その結果、ホタルルシフェラーゼのＣ末端側４４０残基付近に位置するＬ－Ｉ－Ｋ－Ｙ－Ｋ－Ｇ－Ｙ－Ｑ－Ｖ（配列番号７）のアミノ酸配列がよく保存されていることがわかった。この９つのアミノ酸配列をコードするコドンから塩基配列を予測し、５’末端ＲＡＣＥ　ＰＣＲに用いる１２種類のホタルルシフェラーゼ特異的混合プライマーを設計した。このプライマーの名称および配列は以下の通りである（プライマー配列中のＹ、ＲおよびＮは混合塩基を示す。すなわち、Ｙは、ＣまたはＴを示し、Ｒは、ＡまたはＧを示し、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴを示す）：
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＡＴＡ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　ＡＴ－３’：配列番号８）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＡＴＧ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＡＴ－３’：配列番号９）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＡＴＴ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＡ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＴ－３’：配列番号１０）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＡＣＡ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＡ　ＴＡＣ　ＴＴＡ　ＡＴ－３’：配列番号１１）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＡＣＧ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＡ　ＴＡＣ　ＴＴＧ　ＡＴ－３’：配列番号１２）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＡＣＴ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＡ　ＴＡＣ　ＴＴＴ　ＡＴ－３’：配列番号１３）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＧＴＡ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＧ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　ＡＴ－３’：配列番号１４）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＧＴＧ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＧ　ＴＡＴ　ＴＴＧ　ＡＴ－３’：配列番号１５）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＧＴＴ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＧ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＴ－３’：配列番号１６）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＧＣＡ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＧ　ＴＡＣ　ＴＴＡ　ＡＴ－３’：配列番号１７）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＧＣＧ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＧ　ＴＡＣ　ＴＴＧ　ＡＴ－３’：配列番号１８）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５－ＧＣＴ（５’－ＡＣＹ　ＴＧＲ　ＴＡＮ　ＣＣＹ　ＴＴＧ　ＴＡＣ　ＴＴＴ　ＡＴ－３’：配列番号１９）。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。
　３－２．５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによる、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側のクローニング
　上述の通り作製したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーおよび５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＣＧＡ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＣＡＣ　ＧＡＧ　ＧＡＣ　ＡＣＴ　ＧＡ－３’：配列番号２０）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｎｅｓｔｅｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＧＧＡ　ＣＡＣ　ＴＧＡ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＴＡ－３’：配列番号２１）を用いて５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’　ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’　Ｎｅｓｔｅｄ　Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。５’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ－Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
　一度目のＰＣＲとして、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーのいずれかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’　Ｐｒｉｍｅｒとから成る１２通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’　Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％トリス酢酸緩衝液（ＴＡＥ）アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。１２の反応溶液の全てにおいてわずかに遺伝子増幅が認められたため、これらのＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応を次の通り実施した。
　ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲとして、一度目のＰＣＲで使用した１２種類プライマーのうちの４つとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’　Ｎｅｓｔｅｄ　Ｐｒｉｍｅｒとから成る４通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’　Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせ条件を確認した。
　３－３．５’－ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
　５’－ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
　約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３－Ｆ（－２９）　Ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＣＡＣ　ＧＡＣ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　Ｃ－３’：配列番号２２）とＭ１３　Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’－ＧＧＡ　ＴＡＡ　ＣＡＡ　ＴＴＴ　ＣＡＣ　ＡＧＧ－３’：配列番号２３）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
　増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上清を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ－Ｄｉ　Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃で２分間熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌ　ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。得られた塩基配列を、クロイワボタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側非翻訳領域の塩基配列とする。この配列は次の通りである。
GTTCGGTATACTCGCGAGTTCGGGCAAAAAATAACAAGTAGCGCAAGATGGAAAAAGAAGAAAATGTGATATACGGTCCCGAGCCGTTTTACCCCGTCGAAGAGGGATCTGCAGGAACGCAACTGCACAGATTTATGGAGCGATACGCCAAAATGGGGGCTATATGTTTTTCTAACGCCCTCACGGGCCAAGATGTAACGTATGCCGAATATTTTGACCGACCGGTTCGTTTAGCGGAAGCTTTGAGAAGGCACGGCTTAACGCCAGAGAAAAAAATCGGTATTTGCAGCGAAAATTGCTTAGAATTTTTCATTCCGGTGCTTTCGGGAGCGTATATCGCTTCACCCGTCGCTCCAACTAACGAAATTTACACTATACGCGAATTGGTTCACAGTTTTGGAATATCCGAGCCAATGATCGTGTTTAGCTCAAAGAAAGGATTGGATAAAGTCTTGGAAGTACAAAAAACAGTGCACTCTATTAAAACAATAGTCATTATTGATAGCTCAACTACTTATCGAGGATATGACAGCATGGATGCGTTTGTTAAAAAAATACGTACCCGCAAATTTCAATTTATCCGAATTCAAAACTGTAGAAGTCGATAATGAAACTCACACTCTTCTTATAATGAACTCGTCCGGTTCCACCGG（配列番号２４）
　シークエンシングによって得られた遺伝子配列を、配列情報解析ソフトウェア　ＤＮＡＳＩＳ　Ｐｒｏの「シークエンス連結」機能を用いて解析した。この配列をＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）が提供するｂｌａｓｔｘサーチを利用して相同性検索を実施し、既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側であると決定した。
　４．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’Ｒａｃｅ　ＰＣＲおよび完全長ｃＤＮＡの取得
　４－１．３’Ｒａｃｅ　ＰＣＲに用いるプライマーの設計
　５’Ｒａｃｅ　ＰＣＲの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側非翻訳領域の配列を基にして、３’ＲＡＣＥに用いるプライマー（配列番号２７）およびＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲに用いるプライマー（配列番号２８）を作製した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。
　４－２．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ取得のための３’Ｒａｃｅ　ＰＣＲ
　上述の通り作成したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーＮｏ２－Ｋｕｒｏｉｗａ－Ｆ１（ＧＴＴＣＧＧＴＡＴＡＣＴＣＧＣＧＡＧＴＴＣＧ）：配列番号２５）、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’　Ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＧＣＴ　ＧＴＣ　ＡＡＣ　ＧＡＴ　ＡＣＧ　ＣＴＡ　ＣＧＴ　ＡＡＣ　Ｇ－３’：配列番号２７）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’　Ｎｅｓｔｅｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＣＧＣ　ＴＡＣ　ＧＴＡ　ＡＣＧ　ＧＣＡ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＴＧ－３’：配列番号２８）を用いて３’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’　ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’　Ｎｅｓｔｅｄ　Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。３’－ＲＡＣＥ　ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ－Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
　一度目のＰＣＲとして、５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’　Ｐｒｉｍｅｒとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．４μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。わずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応を実施した。
　Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲとして、Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ用のプライマーＮｏ２－Ｋｕｒｏｉｗａ－Ｆ２（ＧＴＴＣＧＧＴＡＴＡＣＴＣＧＣＧＡＧＴＴＣＧＧＧＣＡＡ：配列番号２６）とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’　Ｎｅｓｔｅｄ　Ｐｒｉｍｅｒとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＮｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅していることを確認した。
　４－３．３’－Ｒａｃｅで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
　３’－ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
　約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３－Ｆ（－２９）　Ｐｒｉｍｅｒ（５’－ＣＡＣ　ＧＡＣ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＣＧＡ　Ｃ－３’：配列番号２２）とＭ１３　Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’－ＧＧＡ　ＴＡＡ　ＣＡＡ　ＴＴＴ　ＣＡＣ　ＡＧＧ－３’：配列番号２３）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ　Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
　増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスに用いたプライマーはベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上清を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ－Ｄｉ　Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。シークエンシングにより決定された塩基配列を配列番号４４に示す。配列番号４４における開始コドンから終止コドンまでの塩基配列を、野生型クロイワボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列とした。野生型クロイワボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列は次の通りである。
ATGGAAAAAGAAGAAAATGTGATATACGGTCCCGAGCCGTTTTACCCCGTCGAAGAGGGATCTGCAGGAACGCAACTGCACAGATTTATGGAGCGATACGCCAAAATGGGGGCTATATGTTTTTCTAACGCCCTCACGGGCCAAGATGTAACGTATGCCGAATATTTTGACCGATCGGTTCGTTTAGCGGAAGCTTTGAGAAGGCACGGCTTAACGCCAGAGAAAAAAATCGGTATTTGCAGCGAAAATTGCTTAGAATTTTTCATTCCGGTGCTTTCGGGAGCGTATATCGCTTCACCCGTCGCTCCAACTAACGAAATTTACACTATACGCGAATTGGTTCACAGTTTTGGAATATCCGAGCCAATGATCGTGTTTAGCTCAAAGAAAGGATTGGATAAAGTCTTGGAAGTACAAAAAACAGTGCACTCTATTAAAACAATAGTCATTATTGATAGCTCAACTACTTATCGAGGATATGACAGCATGGATGCGTTTGTTAAAAAATACGTACCCGCAAATTTCAATTTATCCGAATTCAAAACTGTAGAAGTCGATAATGAAACTCACACTCTTCTTATAATGAACTCGTCCGGTTCCACCGGTCTACCGAAAGGTGTGCTAGTCCGTCATTGTGGGGCAGTTACAAGATTTTCTCATTGCAGGGATCCGATTTTTGGTAATCAAGTTTCACCAGGCACAGCAATTTTAACGGTCGTTCCGTTCCATCATGGCTTTGGTATGTTCACTACTTTAGGATACTTTGTTTGTGGATACCGAATCGTAATGTTAACAAAATTTGATGACGAAGTATTGTTGAAAACCCTACAAGATTATAAGTGTACTAGTGTTATCCTAGTACCAACTTTGTTCGCTATCCTTAATAGAAGTGAACTACTGGAGAAATTCGACTTGTCTAATCTGACTGAAATTGCATCTGGTGGTGCCCCATTAGCAAAAGAAGTTGGGGAAGCCGTTGCCAGAAGATTTAATCTTCCTGGTGTTCGCCAAGGTTACGGTTTAACTGAAACCACATCCGCTTTTATTATCACCCCAGAAGGGGATGACAAACCAGGGGCTTCTGGAAAAGTTGTGCCTTTAATGAAAGTTAAAGTGATTGATCTTGACACTAAGAAAACGCTTGGTCCTAACCGTCGTGGAGAAATTTGCGTTAAGGGTCCTATGTTGATGACAGGTTACGAGAAGAATCCTACAGAAACTAAAGAAATTATCGACGAAGATGGTTGGCTGCACAGTGGAGATATTGGGTATTGGGACGAAGATCATCACTTCTTTATTGTAGATCGTCTCAAATCCTTAATCAAATACAAAGGATATCAAGTACCACCTGCTGAATTGGAATCCGTACTTTTACAACATCCAAATATATTTGATGCCGGTGTTGCCGGAATTCCCGATCCCGAAGCCGGGGAGCTTCCGGGTGCTGTGGTTGTATTAGAGAAAGGAAAACATCTAACTGAACAAGAAGTATTGGATTACGTTGCCGGACAAGTTTACAACGCAAAACGTTTACGCGGTGGCGTTCGTTTTGTAGACGAGGTACCTAAAGGTCTCACTGGAAAAATTGACGCAAAGGCAATTAGAGAAATTCTTAAGAAGCCGCAAGCTAAGATGTGA（配列番号２）。
　シークエンシングによって完全長ホタルルシフェラーゼ遺伝子を獲得した。この塩基配列（配列番号２）およびアミノ酸へ翻訳した配列（配列番号１）のそれぞれについて、ＮＣＢＩが提供するｂｌａｓｔｘおよびｂｌａｓｔｐサーチを利用して相同性検索を実施した。それぞれの検索で既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列およびアミノ酸配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を野生型クロイワボタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列であると決定した。
　以下、このルシフェラーゼ遺伝子にコードされるタンパク質を野生型クロイワボタルルシフェラーゼと称する。
　配列番号２の塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列（配列番号１）がルシフェラーゼとしての発光活性を示すかどうか確認するため、以下の実験を行った。
　上述の通り決定した塩基配列によれば、野生型クロイワボタルルシフェラーゼ遺伝子はＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、配列番号４５、４６、４７のプライマーを用いて分子生物学的遺伝子改変方法によって実施した。変異導入後の配列は、配列番号３に示される塩基配列である。配列番号３の塩基配列は、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素認識配列を含まない。配列番号３の塩基配列を大腸菌にて発現させるため、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素認識配列を含むベクターへ導入するためのプライマーペア（配列番号２９、３０）を用いて、配列番号３の塩基配列をｐＲＳＥＴ－Ｂベクター（インビトロジェン）に導入した。得られたベクターＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換し、コロニーを形成させた。配列番号３１と３２のプライマーペアを用いて、コロニーに正常に遺伝子が導入されているかどうかを確認した。正常に遺伝子導入されたコロニーにD-Luciferinを含む溶液を噴霧して発光を観察した。
　［実施例２：Ｓ２８３Ｇ変異型クロイワボタルルシフェラーゼの作製］
　下記のとおり、Ｓ２８３Ｇ変異型クロイワボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。
　実施例１において作製した野生型クロイワボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号２）を、哺乳細胞における発現に最適化した。最適化された塩基配列は次の通りである。
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCGCGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGTGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCAGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA（配列番号４）
　最適化された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号５に示す。配列番号５のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と同じである。
　さらに、この最適化されたルシフェラーゼ遺伝子に対し、コードされるアミノ酸配列上Ｎ末端側から２８３番目のセリンがグリシンに置換されるような変異（Ｓ２８３Ｇ）を導入した。この変異の導入には、ＫｒｏｉｗａＯｋｉｓｊ（ｍ）Ｓ２８３Ｇプライマー：（ＧＡＣ　ＴＡＣ　ＡＡＧ　ＴＧＣ　ＡＣＣ　ＧＧＣ　ＧＴＧ　ＡＴＣ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＣＣＣ：配列番号３３）を使用した。
　これにより、配列番号３９に示される塩基配列を有する遺伝子を取得した。この遺伝子にコードされるルシフェラーゼを「変異体１」または「Ｓ２８３Ｇ変異体」と称する。変異体１のアミノ酸配列は配列番号３８に示される。変異体１によると、野生型ルシフェラーゼよりも高輝度であって、発光色が長波長側にシフトした発光が得られた。
　なお、上記変異の導入は文献の記載に基づいて行った（Ａｓａｋｏ　Ｓａｗａｎｏ　ａｎｄ　Ａｔｓｕｓｈｉ　Ｍｉｙａｗａｋｉ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，　Ｖｏｌ．２８，　Ｎｏ．１６）。
　［実施例３：ランダム変異導入］
　Ｓ２８３Ｇ変異型クロイワボタルルシフェラーゼに対し、ランダムに変異を導入し、さらなる変異を有したクロイワボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。
　変異体１（Ｓ２８３Ｇ）に対し、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ　ＩＩ　ＥＺＣｌｏｎｅ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（アジレント社）を用いてルシフェラーゼの５７０ｂｐ付近から１１３２ｂｐ付近のドメインへのランダムな変異導入を行った。変異導入には、ＪＰ－Ｋｕｒｏｉｗａ（ｍａｍ）－５７０－Ｆプライマー：（ｃｇｔｇｇａａｇｔｇｇａｃａａｃｇａｇａｃａｃａｃ：配列番号３６）およびＪＰ－Ｋｕｒｏｉｗａ（ｍａｍ）－１１３２－Ｒプライマー：（ＴＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣ：配列番号３７）のプライマーセットを用いて、キット添付の説明書にしたがって実施した。
　上記方法にて得られた変異導入済みのプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株（プロメガ社）に形質転換してコロニーを形成させた。このコロニーに対して最終濃度２ｍＭのＤ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを噴霧後、ＣＣＤカメラＤＰ－７０（オリンパス）にて発光を撮像した。他のコロニーよりも明るく、オレンジ色発光を呈するコロニーを拾い上げ、変異導入後にシーケンサーを用いて配列を読み取り、ランダムな変異がルシフェラーゼ遺伝子に導入されていることを確認した。
　そのように取得した変異が導入された遺伝子の１つを「変異体２」と称する。変異体２の塩基配列は配列番号４１に示される。また、その塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号４０に示す。配列番号４０に示されるように、変異体２では、Ｓ２８３Ｇの変異に加えて、アミノ酸配列上のＮ末端側から２５６番目のバリン残基がアラニン残基に置換される変異（Ｖ２５６Ａ）が生じていた。
　さらに、変異体２に対して、再度ランダムな変異導入を行った。すなわち、変異体２の遺伝子に対し、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ　ＩＩ　ＥＺＣｌｏｎｅ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（アジレント社）を用いて上記と同様のドメインへのランダムな変異導入を行った。
　そして、上記と同様にコロニーを形成させ、発光を撮像した。変異体２よりも高い輝度で発光するコロニーを取得し、そのルシフェラーゼ遺伝子を解析した。この遺伝子の１つを、「変異体３」と称する。変異体３の塩基配列を配列番号４３に示す。また、その塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号４２に示す。配列番号４２に示されるように、変異体３では、Ｓ２８３ＧおよびＶ２５６Ａの変異に加えて、アミノ酸配列上のＮ末端側から１１１番目のアルギニン残基がヒスチジン残基に置換される変異（Ｒ１１１Ｈ）が生じていた。アミノ酸配列上のＮ末端側から１１１番目の残基における変異は、当初意図していなかった変異であり、ＰＣＲにおいて偶然に置換されたものと考えられる。
　［実施例４：ＨｅＬａ細胞内における発光観察、発光強度および発光スペクトルの測定］
　１．発現ベクターの作製
　以下の通り、実施例１から３において取得したクロイワボタルの野生型ルシフェラーゼおよび変異型ルシフェラーゼ（変異体１から３）のそれぞれについてＨｅＬａ細胞内での発光強度を測定し、これらを、イリオモテボタルＲｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ　ｏｈｂａｉ由来の橙色ルシフェラーゼ（ＳＬＯルシフェラーゼ：東洋紡株式会社）と比較した。
　各遺伝子に対してＫｏｚａｋ配列（ｇｃｃｒｃｃａｔｇｇ：配列番号６）を付与した。なお、これら４種の配列とも哺乳細胞における発現に対してコドン最適化されている。その後、これら配列をそれぞれ、ｐＦ９Ａ　ＣＭＶ　ｈＲＬｕｃ　ｎｅｏ　Ｆｌｅｘｉ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。各遺伝子のベクターへの挿入は、配列番号３４および配列番号３５に示されるプライマーを使用して行った。ｐＦ９Ａベクターは内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲＬｕｃ）をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度との比として算出することが可能である。
　同様の手順に従って、比較のためのルシフェラーゼであるＳＬＯルシフェラーゼ遺伝子に対してＫｏｚａｋ配列を付与した後、ｐＦ９Ａベクターのマルチクローニングサイトに挿入した。
　２．発光観察
　そのように作製した５種の発現ベクターの各々を、４８穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にリポフェクション法で遺伝子導入した。遺伝子が発現した段階で、２ｍＭのＤ－ルシフェリンを基質として添加し、ＤＰ７０カラーＣＣＤ（オリンパス株式会社製）を用いて露光時間１分間（ＩＳＯ１６００）で撮影した。なお、細胞の培養温度は約３７℃とした。
　撮影により取得した画像を図１にまとめる。図１では、上から順に変異体１、変異体２、変異体３、野生型３およびＳＬＯについての、４つの隣接したウェルにおける結果が示されている。なお、図１は、カラーで取得した観察結果をモノクロで表示したものである。
　図１に示されるように、野生型クロイワボタルルシフェラーゼおよびＳＬＯルシフェラーゼでは、上述の撮影条件では、顕著な発光像を得ることができなかった。一方、変異体１から３では、十分な発光像を得ることができた。そして、カラーの結果によると、変異体１における発光は赤みがかった光であるのに対して、変異体２および３による発光はオレンジ色の光であった。
　３．発光強度の比較
　次に、発光強度の比較を行った。これは、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（米国プロメガ社製、製品番号Ｅ２９４０）を用いて実施した。５種の発現ベクターを、４８穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、２２時間後ＰＢＳで細胞を洗浄した。４８穴プレートの各ウェルに２ｍＭ　Ｄ－ルシフェリン／ＣＯ２　Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２００μｌずつ添加し、３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を用いて６０分間発光強度を測定した。６０分経過時点の発光強度を５種のルシフェラーゼの発光強度とした。その後、マニュアルに従ってセレンテラジンを添加し、内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度を３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒを用いて１５分間発光強度を測定した。クロイワボタル野生型ルシフェラーゼ、変異体１から３、ＳＬＯルシフェラーゼによる発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度でそれぞれ除算した値を算出し、その値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。
　結果を図２に示す。図２に示されるように、ＨｅＬａ細胞においてクロイワボタルルシフェラーゼを発現させた場合、ＳＬＯルシフェラーゼによる発光強度を基準とすると、野生型では１．２倍、変異体１では１７．１倍、変異体２では２０．６倍および変異体３では２９．１倍となった。すなわち、従来のオレンジ色ルシフェラーゼと比較して、変異体２および３によれば、非常に高輝度のオレンジ色の発光を得られることがわかった。
　４．発光スペクトルの測定
　次に、発光スペクトルを測定した。
　測定のための装置としてＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）（スリット幅０．５ｍｍ、露光時間１分）を用い、２ｍＭ　Ｄ－ルシフェリン／ＣＯ２　Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む溶液で、各種ルシフェラーゼをそれぞれ遺伝子発現するＨｅＬａ細胞を懸濁し、細胞内で発光させて発光スペクトルを３７度の環境下で測定した。なお、このＨｅＬａ細胞はトリプシン処理して浮遊させた細胞である。
　測定された発光スペクトルを図３に示す。また、各ルシフェラーゼの最大発光波長を以下の表１にまとめる。なお、「最大発光波長」とは、ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光を測定することによって得られるスペクトルにおいて、発光強度が最大となる波長を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図３および表１より、野生型クロイワボタルルシフェラーゼは、約３７度の培地中で浮遊するＨｅＬａ細胞内において、約５８５ｎｍの最大発光波長を示した。また、同じ条件において、変異体１では約６０６ｎｍ、変異体２では約５９０ｎｍ、変異体３では約５９０ｎｍおよびＳＬＯルシフェラーゼ（東洋紡社）では約５９４ｎｍの最大発光波長を示した。
　変異体１では、やや長波長側に最大発光波長がシフトしているのに対し、変異体２および３では、ＳＬＯルシフェラーゼとほぼ同様の最大発光波長を示した。
　また、図３から、変異体１から３によるスペクトルは、１つのピークから成るシャープなものであることがわかった。
　以上より、クロイワボタルルシフェラーゼ変異体２および３はＳＬＯルシフェラーゼと同様な最大発光波長を示しながら、ＳＬＯルシフェラーゼによる発光強度の２０．６倍および２９．１倍の発光強度を有するものであることがわかった。
　このような、従来にないほど高輝度なオレンジ色ルシフェラーゼである変異体２および３を、レポーターとしてマルチカラーアッセイを実施することで、オレンジ色領域のシグナルを効果的に得ることが可能になると考えられる。

Claims (10)

  1. 　配列番号３８のアミノ酸配列に対して変異が導入されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼであって、
    　前記ルシフェラーゼは、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒し、前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有するルシフェラーゼ。
  2. 　導入される前記変異は、配列番号３８のアミノ酸配列におけるＮ末端側から２５６番目のバリン残基がアラニン残基に置換される変異を含む請求項１に記載のルシフェラーゼ。
  3. 　導入される前記変異は、配列番号３８のアミノ酸配列におけるＮ末端側から１１１番目のアルギニン残基がヒスチジン残基に置換される変異を含む請求項１または２に記載のルシフェラーゼ。
  4. 　配列番号４０のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ。
  5. 　配列番号４０のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｎ末端側から２８３番目および２５６番目のアミノ酸残基が、それぞれグリシン残基およびアラニン残基であるアミノ酸配列を有し、
    　５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒し、前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有するルシフェラーゼ。
  6. 　配列番号４２のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ。
  7. 　配列番号４２のアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｎ末端側から１１１番目、２８３番目および２５６番目のアミノ酸残基が、それぞれヒスチジン残基、グリシン残基およびアラニン残基であるアミノ酸配列を有し、
    　５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒し、前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有するルシフェラーゼ。
  8. 　請求項１から７の何れか１項に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を有する核酸。
  9. 　配列番号４１の塩基配列を有する請求項８に記載の核酸。
  10. 　配列番号４３の塩基配列を有する請求項８に記載の核酸。
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