JP2015019604A - オレンジ色の発光を示すルシフェラーゼ - Google Patents

Abstract

【課題】高輝度のオレンジ色の発光を生じさせるルシフェラーゼの提供。【解決手段】実施形態に係るルシフェラーゼは、クロイワボタル（Ｌｕｃｉｏｒａ ｋｕｒｏｉｗａｅ）から取得された野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して変異が導入されたアミノ酸配列を有する。実施形態に係るルシフェラーゼは、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒する。前記発光は、イリオモテボタル（Ｒｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｏｈｂａｉ）由来のオレンジ色ルシフェラーゼ（ＳＬＯルシフェラーゼ）に触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有する。【選択図】図２

Description

本発明は、オレンジ色の発光を示すルシフェラーゼに関する。

細胞内のシグナル伝達および遺伝子発現といった細胞の機能を調べるためには、蛍光色素および蛍光タンパク質といった蛍光プローブ並びにルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する化学発光プローブ等が用いられている。

特に遺伝子の発現調節の解析には、励起光による細胞のダメージが生じず且つ自家発光の問題が生じない、定量性に優れた発光計測が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を観察する場合、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光強度を測定することで、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ（具体的には発現量）を調べることができる。具体的には、最初に細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後この細胞溶解液にルシフェリンおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで発光強度を定量し、その結果に基づいて発現量を特定する。

この方法では、発光強度の測定は細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、測定に使用した全細胞の平均値として得られる。

ルシフェラーゼ遺伝子等の発光遺伝子をレポーター遺伝子として導入する方法として、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクチン法またはエレクトロポレーション法等を使用でき、これらの方法は目的および細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流または下流に目的のＤＮＡ断片を繋ぎ、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することで、当該ＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることが可能となる。また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子と目的の遺伝子とを共発現させることで、当該遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることが可能となる。

時間経過に沿って発光遺伝子の発現量を分析するには、生きた細胞からの発光強度を経時的に測定する必要がある。このような測定は、ルミノメーターを備えたインキュベーターにて細胞を培養し、細胞集団全体からの発光強度を一定時間ごとに測定することで行われる。細胞集団全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることにより、一定の周期性をもった発現リズム等を分析することができる。

しかし、１つのルシフェラーゼをレポーターとした解析ではインターナルコントロールがないため、目的とする遺伝子転写活性を定量することが困難である。そこで、デュアルアッセイ（非特許文献１）やマルチカラーアッセイ（特許文献１および非特許文献２）など、発光色の異なる複数のルシフェラーゼをレポーターとして用いる手法が確立された。

特にマルチカラーアッセイは、５５０ｎｍ付近に最大発光波長を示すルシフェラーゼ（緑色発光）、５８０ｎｍ付近に最大発光波長を示すルシフェラーゼ（オレンジ色発光）および６２０ｎｍ付近に最大発光波長を示すルシフェラーゼ（赤色発光）といった複数色の発光酵素を含む検体において、各発光酵素による相対光量を同時に測定および算出する方法である。

マルチカラーアッセイに使用するルシフェラーゼの全てを、共通したホタルに由来のものとする場合、単一種の基質を用いて、複数の発光色を同時に検出することが可能となる。これまでに市販されているそのようなルシフェラーゼの例は、イリオモテボタルＲｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｏｈｂａｉ由来のルシフェラーゼ群であり、それには、緑色ルシフェラーゼ（ＳＬＧルシフェラーゼ：東洋紡株式会社）、オレンジ色ルシフェラーゼ（ＳＬＯルシフェラーゼ：東洋紡株式会社）および赤色ルシフェラーゼ（ＳＬＲルシフェラーゼ：東洋紡株式会社）が含まれる（特許文献１）。

しかしながら、ＳＬＯルシフェラーゼのような従来のオレンジ色ルシフェラーゼは、他の色のルシフェラーゼと比較して発光強度が低い。そのため、これを利用したマルチカラーアッセイは、ノイズの影響を受けやすく、感度の高い測定を行うことは困難である。

特開２００７−２１８７７４号公報

Naylor L. H.(1999)Biochem. Pharmacol., 58(5):749-757, Reporter gene technology: the future looks bright. Nakajima, Y., T. Kimura, K. Sugata, T. Enomoto, T. Asakawa, H. Kubota, M. Ikeda, and Y. Ohmiya., (2005)BioTechniques, 38:891-894, A multicolor luciferase assay system, one-step monitoring of multiple gene expressions with a single substrate. Viviani VR, Silva AC, Perez GL, Santelli RV, Bechara EJ, Reinach FC., (1999)Photochem. Photobiol., 70(2):254-260, Cloning and molecular characterization of the cDNA for the Brazilian larval click-beetle Pyrearinus termitilluminans luciferase.

本発明の目的は、高輝度のオレンジ色の発光を生じさせるルシフェラーゼを提供することにある。

実施形態に係るルシフェラーゼは、配列番号３８のアミノ酸配列に対して変異が導入されたアミノ酸配列を有する。実施形態に係るルシフェラーゼは、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒する。前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有する。

本発明によれば、高輝度のオレンジ色の発光を生じさせるルシフェラーゼが提供される。

図１は、Ｄ−ルシフェリンを発光基質として用いた場合に、種々のルシフェラーゼを含むＨｅＬａ細胞内にて誘起される発光を示す図である。 図２は、Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合に、種々のルシフェラーゼによって誘起される発光の発光強度を示す図である。 図３は、Ｄ−ルシフェリンを基質として用いた場合に、種々のルシフェラーゼによって誘起される発光の発光スペクトルを示す図である。

本発明の第１の実施形態はルシフェラーゼである。

「ルシフェラーゼ」とは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。実施形態に係るルシフェラーゼも、上述の通り定義されるルシフェラーゼと同義であるが、後述するホタルから取得されたルシフェラーゼである。

実施形態に関してルシフェリンとは、ホタルルシフェラーゼの基質となるルシフェリンおよびそのアナログを意味する。ルシフェリンは、例えば、ＷＯ２００９／０９６１９７及びＷＯ２０１０／１０６８９６に基質として記載されている物質である。具体的には、例えば、ジメチルアニリン−モノエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン−ジエン型ルシフェリン、ジメチルアニリン型ルシフェリン、Ｄ−ルシフェリン及びこれらの誘導体である。

実施形態に係るルシフェラーゼは、配列番号３８のアミノ酸配列に対して変異が導入されたアミノ酸配列を有する。

配列番号３８のアミノ酸配列とは、クロイワボタル（Ｌｕｃｉｏｒａ ｋｕｒｏｉｗａｅ）から取得された野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）に変異を導入したものである。クロイワボタルとは節足動物門昆虫綱コウチュウ目ホタル科ホタル属に属すホタルである。配列番号３８のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端側から２８３番目のセリン残基がグリシン残基に置換されたものである。本願では、このような置換変異を「Ｓ２８３Ｇ変異」または「Ｓ２８３Ｇ」と表す場合があり、また、配列番号３８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを「Ｓ２８３Ｇ変異体」または「変異体１」と表す場合がある。

クロイワボタルから取得された野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列は、次の通りである。
MEKEENVIYGPEPFYPVEEGSAGTQLHRFMERYAKMGAICFSNALTGQDVTYAEYFDRSVRLAEALRRHGLTPEKKIGICSENCLEFFIPVLSGAYIASPVAPTNEIYTIRELVHSFGISEPMIVFSSKKGLDKVLEVQKTVHSIKTIVIIDSSTTYRGYDSMDAFVKKYVPANFNLSEFKTVEVDNETHTLLIMNSSGSTGLPKGVLVRHCGAVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFVCGYRIVMLTKFDDEVLLKTLQDYKCTSVILVPTLFAILNRSELLEKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMKVKVIDLDTKKTLGPNRRGEICVKGPMLMTGYEKNPTETKEIIDEDGWLHSGDIGYWDEDHHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGIPDPEAGELPGAVVVLEKGKHLTEQEVLDYVAGQVYNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKAIREILKKPQAKM（配列番号１）

また、Ｓ２８３Ｇ変異体（変異体１）のアミノ酸配列は、次の通りである。
MEKEENVIYGPEPFYPVEEGSAGTQLHRFMERYAKMGAICFSNALTGQDVTYAEYFDRSVRLAEALRRHGLTPEKKIGICSENCLEFFIPVLSGAYIASPVAPTNEIYTIRELVHSFGISEPMIVFSSKKGLDKVLEVQKTVHSIKTIVIIDSSTTYRGYDSMDAFVKKYVPANFNLSEFKTVEVDNETHTLLIMNSSGSTGLPKGVLVRHCGAVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFVCGYRIVMLTKFDDEVLLKTLQDYKCTGVILVPTLFAILNRSELLEKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMKVKVIDLDTKKTLGPNRRGEICVKGPMLMTGYEKNPTETKEIIDEDGWLHSGDIGYWDEDHHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGIPDPEAGELPGAVVVLEKGKHLTEQEVLDYVAGQVYNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKAIREILKKPQAKM（配列番号３８）

配列番号３８のアミノ酸配列に対して導入される変異とは、例えば、アミノ酸残基の置換、欠失および／または付加等である。また、配列番号３８のアミノ酸配列上において、１カ所に変異が導入されてもよく、または複数カ所に変異が導入されてもよい。実施形態に係るルシフェラーゼのアミノ酸配列と、元となる配列番号３８のアミノ酸配列とは、一定の相同性を有してよい。例えば、これらのアミノ酸配列は、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上または９９．８％以上の相同性を有する。

実施形態に係るルシフェラーゼは、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒する。

５７０ｎｍから６１０ｎｍの波長を有する光とは、一般にオレンジ色と言われる光である。実施形態に係るルシフェラーゼによる発光の最大発光波長は、好ましくは５８０ｎｍから６００ｎｍの範囲にあり、さらに好ましくは５８５ｎｍから５９５ｎｍの範囲にあり、最も好ましくは５９０ｎｍ付近である。

実施形態に係るルシフェラーゼによる発光は、この範囲に最大発光波長を有するが、この範囲から外れる波長の光が混在していてもよい。しかしながら、そのような範囲外の波長の光の強度は小さい方が好ましい。

実施形態に係るルシフェラーゼによると、生物の培養に適した温度においてオレンジ色の発光が得られる。好ましくは、実施形態に係るルシフェラーゼによると、哺乳類細胞の培養に適した温度域においてオレンジ色の発光が得られ、その温度とは、例えば３２℃から４２℃であり、より具体的には３５℃から３９℃であり、特に３７℃付近である。

実施形態に係るルシフェラーゼによると、従来のオレンジ色ルシフェラーゼと比較して、高い強度の発光が得られる。例えば、イリオモテボタル（Ｒｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｏｈｂａｉ）由来のオレンジ色ルシフェラーゼ（ＳＬＯルシフェラーゼとして東洋紡株式会社から市販されている）と比較すると、１０倍以上の強度を有し、好ましくは２０倍以上の強度を有し、さらに好ましくは２９倍以上の強度を有する。

なお、ＳＬＯルシフェラーゼ（東洋紡株式会社製）のアミノ酸配列は以下の通りである。
MANEIILHGAKPRDPLDLGTAGIQLYRALTNFSFLREALIDAHTEEVVSYADILENSCRLAKCYENYGLRQNSVISVCSENSTIFFYPVIAALYMGVITATVNDSYTERELLETLNISKPELVFCSKKAIKNMMALKRNVNFIKKVVLLDSKEDMGEAQCLSNFMARYSEPNLDVRNFKPRDFDAKEQVALIMSSSGTTGLPKGVVLTHRNLSVRFVHCKDPLFGNRTIPSTSILSIVPFHHAFGMFTTLSYFIVGLRVVLLKRFEEKFFLSTIEKYRIPTIVLAPPVMVFLAKSPLVDQYDLSSIREVATGGAPVGTEVAVAVAKRLKIGGILQGYGLTETCCAVLITPHDDVKTGSTGRVAPYVQAKIVDLTTGKSLGPNKRGELCFKSEIIMKGYFNNKQATEEAIDKEGWLHSGDVGYYDDDGHFFVVDRLKELIKYKGYQVAPAELEWLLLQHPSIKDAGVTGVPDEAAGELPGACIVLQEGKSLTEQEIIDYIAERVSPTKRIRGGVVFVDDIPKGATGKLVRSELRKLLAQKKSKL（配列番号４８）

また、ＳＬＯルシフェラーゼ（東洋紡株式会社製）の遺伝子の塩基配列は以下の通りである。
ATGGCTAACGAGATCATCCTGCACGGCGCCAAGCCCAGGGACCCCCTGGACCTGGGCACCGCCGGCATTCAGCTCTACAGGGCCCTGACCAACTTCTCCTTCCTGAGGGAGGCCCTGATCGACGCCCACACCGAGGAGGTGGTGTCTTACGCCGACATCCTGGAGAACAGCTGTAGACTGGCTAAGTGCTACGAGAACTACGGCCTGCGCCAGAACAGCGTGATCTCCGTGTGCAGCGAGAATAGCACCATCTTCTTCTACCCCGTGATCGCCGCCCTGTACATGGGCGTGATCACCGCCACCGTGAACGACAGCTACACCGAGCGGGAGCTGCTGGAGACCCTGAACATCTCCAAGCCCGAACTGGTGTTCTGCTCCAAGAAGGCCATCAAGAACATGATGGCCCTGAAGAGGAACGTGAACTTCATCAAGAAGGTGGTGCTGCTGGACAGCAAGGAGGATATGGGCGAGGCCCAGTGCCTGAGCAACTTCATGGCCCGGTACTCCGAGCCCAACCTGGACGTGAGAAACTTCAAGCCAAGGGACTTCGACGCCAAGGAGCAGGTGGCCCTTATTATGTCCTCCTCTGGCACCACCGGCCTGCCAAAGGGCGTGGTGCTGACCCACAGGAACCTGAGCGTGCGCTTCGTCCACTGCAAGGACCCCCTGTTCGGCAACAGAACCATCCCCTCCACCTCCATCCTGTCCATCGTGCCCTTCCACCACGCCTTCGGAATGTTCACAACCCTGTCCTACTTCATCGTGGGCCTGAGAGTGGTGCTGCTGAAGAGATTCGAGGAGAAGTTCTTCCTGAGCACCATCGAGAAGTACAGAATCCCAACAATCGTGCTGGCCCCTCCTGTGATGGTGTTCCTGGCTAAGAGCCCCCTGGTGGACCAGTACGACCTGTCCAGCATCAGAGAGGTGGCCACCGGCGGCGCCCCTGTGGGCACCGAGGTTGCCGTGGCCGTGGCCAAGCGGCTGAAGATCGGCGGCATCCTCCAGGGCTACGGCCTGACCGAGACCTGCTGCGCCGTGCTGATCACCCCCCACGACGACGTGAAGACCGGCTCCACCGGCAGGGTAGCCCCCTACGTGCAGGCTAAGATCGTGGACCTGACCACCGGCAAGTCCCTGGGACCTAACAAGAGAGGCGAGCTGTGCTTCAAGAGCGAGATCATCATGAAGGGCTACTTCAACAACAAGCAGGCCACCGAGGAGGCCATCGACAAGGAGGGCTGGCTGCACTCCGGCGACGTGGGATACTACGACGACGATGGACATTTCTTCGTGGTGGACCGGCTGAAAGAGCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCCGCCGAGCTGGAGTGGCTGCTGCTCCAGCACCCATCCATCAAGGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCCGACGAGGCCGCCGGCGAGCTGCCCGGCGCCTGCATCGTGCTCCAGGAGGGCAAGAGCCTGACCGAGCAGGAGATCATCGACTACATCGCCGAGCGAGTGTCTCCCACCAAGCGCATCCGGGGCGGAGTCGTCTTCGTGGACGACATCCCCAAGGGCGCCACCGGCAAGCTGGTGAGAAGCGAGCTGCGGAAGCTGCTGGCCCAGAAGAAGTCCAAGCTGTAA（配列番号４９）

実施形態に係るルシフェラーゼの具体例の１つは、配列番号４０のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。このアミノ酸配列は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸残基の置換が導入されたものである。具体的には、配列番号３８のアミノ酸配列のＮ末端側から２５６番目のバリン残基がアラニン残基に置換されている。この置換変異を本願では「Ｖ２５６Ａ変異」または「Ｖ２５６Ａ」等と表す場合がある。配列番号４０のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼは、クロイワボタル由来の野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）を基準とすると、Ｓ２８３ＧおよびＶ２５６Ａの変異が導入されている。本願では、配列番号４０のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを、「変異体２」と表す場合がある。

変異体２のアミノ酸配列は以下の通りである。
MEKEENVIYGPEPFYPVEEGSAGTQLHRFMERYAKMGAICFSNALTGQDVTYAEYFDRSVRLAEALRRHGLTPEKKIGICSENCLEFFIPVLSGAYIASPVAPTNEIYTIRELVHSFGISEPMIVFSSKKGLDKVLEVQKTVHSIKTIVIIDSSTTYRGYDSMDAFVKKYVPANFNLSEFKTVEVDNETHTLLIMNSSGSTGLPKGVLVRHCGAVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFACGYRIVMLTKFDDEVLLKTLQDYKCTGVILVPTLFAILNRSELLEKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMKVKVIDLDTKKTLGPNRRGEICVKGPMLMTGYEKNPTETKEIIDEDGWLHSGDIGYWDEDHHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGIPDPEAGELPGAVVVLEKGKHLTEQEVLDYVAGQVYNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKAIREILKKPQAKM（配列番号４０）

実施形態に係るルシフェラーゼの別の具体例は、変異体２の更なる変異体であって、変異体２の発光に関する性質が維持された変異体である。具体的には、配列番号４０のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｎ末端側から２８３番目および２５６番目のアミノ酸残基が、それぞれグリシン残基およびアラニン残基であるアミノ酸配列を有し、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒し、前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有するルシフェラーゼである。

変異体２のアミノ酸配列と、変異体２の更なる変異体のアミノ酸配列との間の相同性は、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上である。この相同性が高いほど、変異体２の性質が、更なる変異体においても維持される可能性が高まり、実用上十分な効果が期待される。

実施形態に係るルシフェラーゼの別の具体例は、配列番号４２のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。このアミノ酸配列は、配列番号３８のアミノ酸配列に対して２つのアミノ酸残基の置換が導入されたものである。１つの目の置換は、上述のＶ２５６Ａの置換である。２つ目の置換は、配列番号３８のアミノ酸配列のＮ末端側から１１１番目のアルギニン残基がヒスチジン残基に代わった置換である。この置換変異を本願では「Ｒ１１１Ｈ変異」または「Ｒ１１１Ｈ」等と表す場合がある。配列番号４２のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼは、クロイワボタル由来の野生型ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）を基準とすると、Ｒ１１１Ｈ、Ｓ２８３ＧおよびＶ２５６Ａの変異が導入されている。本願では、配列番号４２のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼを、「変異体３」と表す場合がある。

変異体３のアミノ酸配列は以下の通りである。
MEKEENVIYGPEPFYPVEEGSAGTQLHRFMERYAKMGAICFSNALTGQDVTYAEYFDRSVRLAEALRRHGLTPEKKIGICSENCLEFFIPVLSGAYIASPVAPTNEIYTIHELVHSFGISEPMIVFSSKKGLDKVLEVQKTVHSIKTIVIIDSSTTYRGYDSMDAFVKKYVPANFNLSEFKTVEVDNETHTLLIMNSSGSTGLPKGVLVRHCGAVTRFSHCRDPIFGNQVSPGTAILTVVPFHHGFGMFTTLGYFACGYRIVMLTKFDDEVLLKTLQDYKCTGVILVPTLFAILNRSELLEKFDLSNLTEIASGGAPLAKEVGEAVARRFNLPGVRQGYGLTETTSAFIITPEGDDKPGASGKVVPLMKVKVIDLDTKKTLGPNRRGEICVKGPMLMTGYEKNPTETKEIIDEDGWLHSGDIGYWDEDHHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESVLLQHPNIFDAGVAGIPDPEAGELPGAVVVLEKGKHLTEQEVLDYVAGQVYNAKRLRGGVRFVDEVPKGLTGKIDAKAIREILKKPQAKM（配列番号４２）

実施形態に係るルシフェラーゼの別の具体例は、変異体３の更なる変異体であって、変異体３の発光に関する性質が維持された変異体である。具体的には、配列番号４２のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｎ末端側から１１１番目、２８３番目および２５６番目のアミノ酸残基が、それぞれヒスチジン残基、グリシン残基およびアラニン残基であるアミノ酸配列を有し、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒し、前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有するルシフェラーゼである。

変異体３のアミノ酸配列と、変異体３の更なる変異体のアミノ酸配列との間の相同性は、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上である。この相同性が高いほど、変異体３の性質が、更なる変異体においても維持される可能性が高まり、実用上十分な効果が期待される。

実施形態に係るルシフェラーゼから、Ｓ２８３Ｇ変異体（変異体１）は除外されてもよい。

実施形態に係るルシフェラーゼは、一般的なルシフェラーゼと同様に、生体内における発光の観察や定量に使用することができる。さらに、実施形態に係るルシフェラーゼは、オレンジ色以外の発光を誘起するルシフェラーゼとともに、マルチカラーアッセイに使用することができる。特に、赤色ルシフェラーゼおよび緑色ルシフェラーゼとともに、３色のマルチカラーアッセイに使用することができる。

本発明の第２の実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を有する核酸である。

実施形態に係る核酸は、特定の生物種に対してコドンが最適化された配列を有していてよい。ここにいう「最適化」とは、核酸に含まれる遺伝子のコドンを、特定の生物種においてコドン出現頻度が高いコドンに代えることを意味する。最適化を行った場合、特定の生物種における遺伝子の発現は、最適化をしない場合に比べて高まる。コドンは、例えば哺乳細胞に最適化され、具体的にはマウス、ヒト等に最適化できる。

実施形態に係る核酸は、ルシフェラーゼの塩基配列以外にも、プロモーターといった転写因子結合領域をさらに含んでよい。

実施形態に係る核酸は、ベクターの形態であってよい。このベクターは、実施形態に係るルシフェラーゼをコードする遺伝子およびプロモーター等の転写因子結合領域に加えて、抗生物質耐性遺伝子および複製起点といった一般的なベクターに含まれる要素を含んでよい。

実施形態に係る核酸の具体例の１つは、配列番号４１の塩基配列を有する核酸である。この塩基配列は、変異体２をコードする。

変異体２をコードする塩基配列は以下の通りである。
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCcCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCGCGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGCGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCGGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAATCTGACCGAGATTGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACTGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACACCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA（配列番号４１）

実施形態に係る核酸の別の具体例は、配列番号４３の塩基配列を有する核酸である。この塩基配列は、変異体３をコードする。

変異体３をコードする塩基配列は以下の通りである。
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCACGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGCGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCGGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAATCTGACCGAGATTGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACTGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACACCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA（配列番号４３）

本発明の第３の実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼを製造する方法である。

実施形態に係る方法は、変異体１の遺伝子に変異を導入する工程を含む。例えば、変異体１をコードする塩基配列（配列番号３９）に対して変異が導入される。

なお、変異体１をコードする塩基配列は以下の通りである。
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCGCGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGTGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCGGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA（配列番号３９）

変異は、一般的な方法によって導入してよい。例えば、ニトロソグアニジンや紫外線といった突然変異原を利用してランダムに変異を導入してもよい。また、一定の頻度で突然変異を誘発するＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＰＣＲ法によってランダムに変異を導入してもよい。あるいは、組み換え技術等により特定の位置に意図した変異を導入してもよい。

実施形態に係る方法は、変異を導入する工程に続いて、候補となる変異体の中から目的とする変異体を選択する工程を含む。

このような選択は、一般的なスクリーニング技術によって行ってよい。具体的には、例えば、変異導入後の核酸を発現ベクターに挿入し、さらにそのベクターを大腸菌に組み込み、その大腸菌内にて変異体の遺伝子を発現させる。その後、発光反応に必要なルシフェリン等の物質を供給して、発光反応を生じさせる。そして、発光の様子から、実施形態に係るルシフェリンを発現する大腸菌を選択できる。すなわち、高輝度でオレンジ色に光る大腸菌を選択できる。その後、任意に、選択した大腸菌から、ルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸を抽出したり、さらにその塩基配列を確認したりしてもよい。

以上説明した本発明の実施形態によれば、以下のような効果が得られる。

すなわち、本発明の実施形態によれば、高輝度のオレンジ色の発光を実現することができる。

従来、発光強度が低い化学発光試料を顕微鏡により撮像する場合、鮮明な画像を撮影するために必要な露出時間は長くなる。このような化学発光試料は、使用できる研究用途が制限される。例えば、発光強度の低さのために３０分間の露出時間が必要となる場合、３０分間の経時的撮影は可能であっても、より短い時間での撮影、さらにはリアルタイムでの撮影は不可能である。また、画像の取得に当って、発光する細胞に焦点を合わせるために複数枚の画像を取得し比較する必要があるが、発光強度の低さのために長い露出時間を必要とする場合、１枚の画像を取得するだけでも手間と時間を要することになる。

これに対し、実施形態に係るルシフェラーゼは、既知のルシフェラーゼと比較して、高輝度のオレンジ色の発光を誘起できるため、タンパク質のイメージングのためのレポーターとして利用する場合に特に有利な効果を奏する。すなわち、実施形態に係るルシフェラーゼは、少量でも高い発光強度を提供できるため、発現量が低いタンパク質の良好な検出を可能とする。また、得られる発光強度が高いことにより、検出に必要な露出時間を短縮できる。このため、このルシフェラーゼを経時的観察のためのレポーターとして利用すれば、撮影に必要な露出時間を短くすることが可能となり、よりリアルタイムに近い観察が可能となる。すなわち、時間分解能が高い経時的観察が可能となる。

また、従来のオレンジ色の発光を生じるルシフェラーゼでは、十分な発光強度の発光は得られない。そもそも、オレンジ色の発光を生じるルシフェラーゼの数は少ない。そのため、赤色、オレンジ色および緑色による、従来のマルチカラーアッセイの有用性は低い。

一方、実施形態に係るルシフェラーゼによれば、高輝度なオレンジ色の発光を生じさせるため、赤色、オレンジ色および緑色のマルチカラーアッセイに利用することで、その他のルシフェラーゼのシグナルとの分離性が高まり、定量性の高い測定が可能となる。

［実施例１：クロイワボタル由来のルシフェラーゼ遺伝子のクローニング］
１．材料
材料として沖縄県久米島産クロイワボタル（Ｌｕｃｉｏｒａ ｋｕｒｏｉｗａｅ）の成虫４個体を用いた。

２．トータルＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成
ホタルの成虫からハサミを用いて発光器を切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄチューブ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に、採取した発光器および１ｍＬのトータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ ２４（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）またはＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１００Ａ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に装着し、振動速度６．５ｍ／ｓおよび振動時間４５秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、３０分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕した。

次に、トータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔの説明書に従って、破砕した溶液からトータルＲＮＡの分離精製を行った。得られたＲＮＡ溶液１００μｌを、エタノール沈殿法によって沈殿濃縮した。次に、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）をマニュアルに従って使用して、沈殿濃縮したトータルＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ溶液２０μｌをホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーとして以下の遺伝子実験に用いた。

３．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側の同定
３−１．Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ（ＲＡＣＥ）法に用いるプライマーの作製
クロイワボタルのルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によって行った。このＰＣＲに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。

ホタルルシフェラーゼにおいてよく保存されているアミノ酸領域を確認するために、既に公開されている１０種類のホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列を、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）を用いて比較した。比較に用いた近縁生物は、ラムフィリス・ノクティルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）（登録番号ＣＡＡ６１６６８）、ルキオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）（登録番号Ｐ１３１２９）、ルキオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ）（登録番号Ｑ０１１５８）、ルキオラ・ミングレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）（登録番号Ｑ２６３０４）、ホタリア・パルヴラ（Ｈｏｔａｒｉａ ｐａｒｖｕｌａ）（登録番号ＡＡＣ３７２５３）、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）（登録番号ＢＡＦ４８３９０）、フォトゥリス・ペンシルヴァニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）（登録番号Ｑ２７７５７）、ピロコエリア・ミヤコ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍｉｙａｋｏ）（登録番号ＡＡＣ３７２５４）、ピロコエリア・ルファ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｒｕｆａ）（登録番号ＡＡＧ４５４３９）およびラハゴフタルムス・オーバイ（Ｒｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｏｈｂａｉ）（登録番号ＢＡＦ３４３６０）である。

その結果、ホタルルシフェラーゼのＣ末端側４４０残基付近に位置するＬ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｋ−Ｇ−Ｙ−Ｑ−Ｖ（配列番号７）のアミノ酸配列がよく保存されていることがわかった。この９つのアミノ酸配列をコードするコドンから塩基配列を予測し、５’末端ＲＡＣＥ ＰＣＲに用いる１２種類のホタルルシフェラーゼ特異的混合プライマーを設計した。このプライマーの名称および配列は以下の通りである（プライマー配列中のＹ、ＲおよびＮは混合塩基を示す。すなわち、Ｙは、ＣまたはＴを示し、Ｒは、ＡまたはＧを示し、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴを示す）：
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＴ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号８）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号９）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号１０）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＣ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号１１）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＣ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号１２）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＡ ＴＡＣ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号１３）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号１４）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号１５）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号１６）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＡ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＣ ＴＴＡ ＡＴ−３’：配列番号１７）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＧ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＣ ＴＴＧ ＡＴ−３’：配列番号１８）、
ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＴ（５’−ＡＣＹ ＴＧＲ ＴＡＮ ＣＣＹ ＴＴＧ ＴＡＣ ＴＴＴ ＡＴ−３’：配列番号１９）。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。

３−２．５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによる、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側のクローニング
上述の通り作製したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーおよび５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ−３’：配列番号２０）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’：配列番号２１）を用いて５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。

一度目のＰＣＲとして、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーのいずれかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’ Ｐｒｉｍｅｒとから成る１２通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％トリス酢酸緩衝液（ＴＡＥ）アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。１２の反応溶液の全てにおいてわずかに遺伝子増幅が認められたため、これらのＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を次の通り実施した。

ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、一度目のＰＣＲで使用した１２種類プライマーのうちの４つとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとから成る４通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせ条件を確認した。

３−３．５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。

約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９） Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ Ｃ−３’：配列番号２２）とＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＧＧ−３’：配列番号２３）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。

増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上清を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃で２分間熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌ ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。得られた塩基配列を、クロイワボタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側非翻訳領域の塩基配列とする。この配列は次の通りである。
GTTCGGTATACTCGCGAGTTCGGGCAAAAAATAACAAGTAGCGCAAGATGGAAAAAGAAGAAAATGTGATATACGGTCCCGAGCCGTTTTACCCCGTCGAAGAGGGATCTGCAGGAACGCAACTGCACAGATTTATGGAGCGATACGCCAAAATGGGGGCTATATGTTTTTCTAACGCCCTCACGGGCCAAGATGTAACGTATGCCGAATATTTTGACCGACCGGTTCGTTTAGCGGAAGCTTTGAGAAGGCACGGCTTAACGCCAGAGAAAAAAATCGGTATTTGCAGCGAAAATTGCTTAGAATTTTTCATTCCGGTGCTTTCGGGAGCGTATATCGCTTCACCCGTCGCTCCAACTAACGAAATTTACACTATACGCGAATTGGTTCACAGTTTTGGAATATCCGAGCCAATGATCGTGTTTAGCTCAAAGAAAGGATTGGATAAAGTCTTGGAAGTACAAAAAACAGTGCACTCTATTAAAACAATAGTCATTATTGATAGCTCAACTACTTATCGAGGATATGACAGCATGGATGCGTTTGTTAAAAAAATACGTACCCGCAAATTTCAATTTATCCGAATTCAAAACTGTAGAAGTCGATAATGAAACTCACACTCTTCTTATAATGAACTCGTCCGGTTCCACCGG（配列番号２４）

シークエンシングによって得られた遺伝子配列を、配列情報解析ソフトウェア ＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏの「シークエンス連結」機能を用いて解析した。この配列をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）が提供するｂｌａｓｔｘサーチを利用して相同性検索を実施し、既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側であると決定した。

４．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’Ｒａｃｅ ＰＣＲおよび完全長ｃＤＮＡの取得
４−１．３’Ｒａｃｅ ＰＣＲに用いるプライマーの設計
５’Ｒａｃｅ ＰＣＲの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側非翻訳領域の配列を基にして、３’ＲＡＣＥに用いるプライマー（配列番号２７）およびＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲに用いるプライマー（配列番号２８）を作製した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。

４−２．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ取得のための３’Ｒａｃｅ ＰＣＲ
上述の通り作成したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーＮｏ２−Ｋｕｒｏｉｗａ−Ｆ１（ＧＴＴＣＧＧＴＡＴＡＣＴＣＧＣＧＡＧＴＴＣＧ）：配列番号２５）、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＣＧ ＣＴＡ ＣＧＴ ＡＡＣ Ｇ−３’：配列番号２７）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＣＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＣＡＧ ＴＧ−３’：配列番号２８）を用いて３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。３’−ＲＡＣＥ ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。

一度目のＰＣＲとして、５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｐｒｉｍｅｒとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．４μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。わずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応を実施した。

Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲとして、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ用のプライマーＮｏ２−Ｋｕｒｏｉｗａ−Ｆ２（ＧＴＴＣＧＧＴＡＴＡＣＴＣＧＣＧＡＧＴＴＣＧＧＧＣＡＡ：配列番号２６）とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’ Ｎｅｓｔｅｄ Ｐｒｉｍｅｒとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅していることを確認した。

４−３．３’−Ｒａｃｅで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
３’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。

約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９） Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣ ＧＡＣ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ Ｃ−３’：配列番号２１）とＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＧＧ−３’：配列番号２２）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。

増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスに用いたプライマーはベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上清を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上清を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。得られた塩基配列を、野生型クロイワボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列とした。この配列は次の通りである。
ATGGAAAAAGAAGAAAATGTGATATACGGTCCCGAGCCGTTTTACCCCGTCGAAGAGGGATCTGCAGGAACGCAACTGCACAGATTTATGGAGCGATACGCCAAAATGGGGGCTATATGTTTTTCTAACGCCCTCACGGGCCAAGATGTAACGTATGCCGAATATTTTGACCGATCGGTTCGTTTAGCGGAAGCTTTGAGAAGGCACGGCTTAACGCCAGAGAAAAAAATCGGTATTTGCAGCGAAAATTGCTTAGAATTTTTCATTCCGGTGCTTTCGGGAGCGTATATCGCTTCACCCGTCGCTCCAACTAACGAAATTTACACTATACGCGAATTGGTTCACAGTTTTGGAATATCCGAGCCAATGATCGTGTTTAGCTCAAAGAAAGGATTGGATAAAGTCTTGGAAGTACAAAAAACAGTGCACTCTATTAAAACAATAGTCATTATTGATAGCTCAACTACTTATCGAGGATATGACAGCATGGATGCGTTTGTTAAAAAATACGTACCCGCAAATTTCAATTTATCCGAATTCAAAACTGTAGAAGTCGATAATGAAACTCACACTCTTCTTATAATGAACTCGTCCGGTTCCACCGGTCTACCGAAAGGTGTGCTAGTCCGTCATTGTGGGGCAGTTACAAGATTTTCTCATTGCAGGGATCCGATTTTTGGTAATCAAGTTTCACCAGGCACAGCAATTTTAACGGTCGTTCCGTTCCATCATGGCTTTGGTATGTTCACTACTTTAGGATACTTTGTTTGTGGATACCGAATCGTAATGTTAACAAAATTTGATGACGAAGTATTGTTGAAAACCCTACAAGATTATAAGTGTACTAGTGTTATCCTAGTACCAACTTTGTTCGCTATCCTTAATAGAAGTGAACTACTGGAGAAATTCGACTTGTCTAATCTGACTGAAATTGCATCTGGTGGTGCCCCATTAGCAAAAGAAGTTGGGGAAGCCGTTGCCAGAAGATTTAATCTTCCTGGTGTTCGCCAAGGTTACGGTTTAACTGAAACCACATCCGCTTTTATTATCACCCCAGAAGGGGATGACAAACCAGGGGCTTCTGGAAAAGTTGTGCCTTTAATGAAAGTTAAAGTGATTGATCTTGACACTAAGAAAACGCTTGGTCCTAACCGTCGTGGAGAAATTTGCGTTAAGGGTCCTATGTTGATGACAGGTTACGAGAAGAATCCTACAGAAACTAAAGAAATTATCGACGAAGATGGTTGGCTGCACAGTGGAGATATTGGGTATTGGGACGAAGATCATCACTTCTTTATTGTAGATCGTCTCAAATCCTTAATCAAATACAAAGGATATCAAGTACCACCTGCTGAATTGGAATCCGTACTTTTACAACATCCAAATATATTTGATGCCGGTGTTGCCGGAATTCCCGATCCCGAAGCCGGGGAGCTTCCGGGTGCTGTGGTTGTATTAGAGAAAGGAAAACATCTAACTGAACAAGAAGTATTGGATTACGTTGCCGGACAAGTTTACAACGCAAAACGTTTACGCGGTGGCGTTCGTTTTGTAGACGAGGTACCTAAAGGTCTCACTGGAAAAATTGACGCAAAGGCAATTAGAGAAATTCTTAAGAAGCCGCAAGCTAAGATGTGA（配列番号２）。

シークエンシングによって完全長ホタルルシフェラーゼ遺伝子を獲得した。この塩基配列（配列番号２）またはアミノ酸へ翻訳した配列（配列番号１）について、ＮＣＢＩが提供するｂｌａｓｔｘまたはｂｌａｓｔｐサーチを利用して相同性検索を実施した。それぞれの検索で既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列であると決定した。

以下、この新規のルシフェラーゼ遺伝子にコードされるタンパク質を野生型クロイワボタルルシフェラーゼと称する。

［実施例２：Ｓ２８３Ｇ変異型クロイワボタルルシフェラーゼの作製］
下記のとおり、Ｓ２８３Ｇ変異型クロイワボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。

実施例１において作製した野生型クロイワボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号２）を、哺乳細胞における発現に最適化した。最適化後の塩基配列は次の通りである。
ATGGAAAAAGAGGAAAACGTCATCTACGGCCCCGAGCCCTTCTACCCTGTGGAAGAAGGCAGCGCCGGCACCCAGCTGCACCGGTTCATGGAAAGATACGCCAAGATGGGCGCCATCTGCTTCAGCAATGCCCTGACCGGCCAGGACGTGACCTACGCCGAGTACTTCGACAGAAGCGTGCGGCTGGCCGAGGCCCTGAGAAGGCATGGACTGACCCCCGAGAAGAAGATCGGCATCTGCAGCGAGAACTGCCTGGAATTTTTCATCCCCGTGCTGAGCGGCGCCTATATCGCCTCTCCTGTGGCCCCCACCAACGAGATCTACACCATCCGCGAGCTGGTGCACAGCTTCGGCATCAGCGAGCCCATGATCGTGTTCAGCAGCAAGAAAGGCCTGGACAAGGTGCTGGAAGTGCAGAAAACCGTGCACAGCATCAAGACCATCGTGATCATCGACAGCAGCACCACCTACCGGGGCTACGACAGCATGGACGCCTTCGTGAAGAAATACGTGCCCGCCAACTTCAACCTGAGCGAGTTCAAGACCGTGGAAGTGGACAACGAGACACACACCCTGCTGATCATGAACAGCTCCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGCTCGTCAGACATTGTGGCGCCGTGACCCGGTTCAGCCACTGCAGAGATCCCATCTTCGGAAACCAGGTGTCCCCCGGCACCGCCATTCTGACCGTGGTGCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACTTCGTGTGCGGCTACCGGATCGTGATGCTGACCAAGTTCGACGACGAGGTGCTGCTGAAAACCCTGCAGGACTACAAGTGCACCAGCGTGATCCTGGTGCCCACCCTGTTCGCCATCCTGAACAGAAGCGAGCTGCTGGAAAAGTTCGACCTGAGCAACCTGACCGAGATCGCCTCTGGCGGAGCCCCTCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAAGCCGTCGCCAGACGGTTCAATCTGCCCGGCGTGCGGCAGGGCTACGGACTGACAGAGACAACCAGCGCCTTCATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCTCTGGAAAGGTGGTGCCCCTGATGAAGGTCAAAGTGATCGACCTGGACACCAAGAAAACCCTGGGCCCCAACAGACGGGGCGAGATCTGTGTGAAGGGCCCCATGCTGATGACCGGCTACGAGAAGAACCCCACCGAGACAAAAGAGATCATCGACGAGGACGGCTGGCTGCACTCTGGCGACATCGGCTACTGGGACGAGGACCACCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCTGTGCTGCTGCAGCATCCCAACATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGCATCCCTGATCCTGAAGCTGGCGAACTGCCAGGCGCTGTGGTGGTGCTGGAAAAAGGCAAGCACCTGACAGAGCAGGAAGTGCTGGACTACGTCGCCGGCCAGGTGTACAACGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCGTGGATGAAGTGCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACGCCAAGGCCATCAGAGAGATCCTGAAGAAACCCCAGGCCAAGATGTGA（配列番号４）

さらに、この最適化後のルシフェラーゼ遺伝子に対し、コードされるアミノ酸配列上Ｎ末端側から２８３番目のセリンがグリシンに置換されるような変異（Ｓ２８３Ｇ）を導入した。この変異の導入には、ＫｒｏｉｗａＯｋｉｓｊ（ｍ）Ｓ２８３Ｇプライマー：（ＧＡＣ ＴＡＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＡＣＣ ＧＧＣ ＧＴＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＣＣ：配列番号３３）を使用した。

これにより、配列番号３９に示される塩基配列を有する遺伝子を取得した。この遺伝子にコードされるルシフェラーゼを「変異体１」または「Ｓ２８３Ｇ変異体」と称する。変異体１のアミノ酸配列は配列番号３８に示される。変異体１によると、野生型ルシフェラーゼよりも高輝度であって、発光色が長波長側にシフトした発光が得られた。

なお、上記変異の導入は文献の記載に基づいて行った（Ａｓａｋｏ Ｓａｗａｎｏ ａｎｄ Ａｔｓｕｓｈｉ Ｍｉｙａｗａｋｉ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００， Ｖｏｌ．２８， Ｎｏ．１６）。

［実施例３：ランダム変異導入］
Ｓ２８３Ｇ変異型クロイワボタルルシフェラーゼに対し、ランダムに変異を導入し、さらなる変異を有したクロイワボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。

変異体１（Ｓ２８３Ｇ）に対し、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ ＥＺＣｌｏｎｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アジレント社）を用いてルシフェラーゼの５７０ｂｐ付近から１１３２ｂｐ付近のドメインへのランダムな変異導入を行った。変異導入には、ＪＰ−Ｋｕｒｏｉｗａ（ｍａｍ）−５７０−Ｆプライマー：（ｃｇｔｇｇａａｇｔｇｇａｃａａｃｇａｇａｃａｃａｃ：配列番号３６）およびＪＰ−Ｋｕｒｏｉｗａ（ｍａｍ）−１１３２−Ｒプライマー：（ＴＧＧＴＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＴＣＡＣＴＴＴＧＡＣ：配列番号３７）のプライマーセットを用いて、キット添付の説明書にしたがって実施した。

上記方法にて得られた変異導入済みのプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株（プロメガ社）に形質転換してコロニーを形成させた。このコロニーに対して最終濃度２ｍＭのＤ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを噴霧後、ＣＣＤカメラＤＰ−７０（オリンパス）にて発光を撮像した。他のコロニーよりも明るく、オレンジ色発光を呈するコロニーを拾い上げ、変異導入後にシーケンサーを用いて配列を読み取り、ランダムな変異がルシフェラーゼ遺伝子に導入されていることを確認した。

そのように取得した変異が導入された遺伝子の１つを「変異体２」と称する。変異体２の塩基配列は配列番号４１に示される。また、その塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号４０に示す。配列番号４０に示されるように、変異体２では、Ｓ２８３Ｇの変異に加えて、アミノ酸配列上のＮ末端側から２５６番目のバリン残基がアラニン残基に置換される変異（Ｖ２５６Ａ）が生じていた。

さらに、変異体２に対して、再度ランダムな変異導入を行った。すなわち、変異体２の遺伝子に対し、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩ ＥＺＣｌｏｎｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アジレント社）を用いて上記と同様のドメインへのランダムな変異導入を行った。

そして、上記と同様にコロニーを形成させ、発光を撮像した。変異体２よりも高い輝度で発光するコロニーを取得し、そのルシフェラーゼ遺伝子を解析した。この遺伝子の１つを、「変異体３」と称する。変異体３の塩基配列を配列番号４３に示す。また、その塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号４２に示す。配列番号４２に示されるように、変異体３では、Ｓ２８３ＧおよびＶ２５６Ａの変異に加えて、アミノ酸配列上のＮ末端側から１１１番目のアルギニン残基がヒスチジン残基に置換される変異（Ｒ１１１Ｈ）が生じていた。アミノ酸配列上のＮ末端側から１１１番目の残基における変異は、当初意図していなかった変異であり、ＰＣＲにおいて偶然に置換されたものと考えられる。

［実施例４：ＨｅＬａ細胞内における発光観察、発光強度および発光スペクトルの測定］
１．発現ベクターの作製
以下の通り、実施例１から３において取得したクロイワボタルの野生型ルシフェラーゼおよび変異型ルシフェラーゼ（変異体１から３）のそれぞれについてＨｅＬａ細胞内での発光強度を測定し、これらを、イリオモテボタルＲｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｏｈｂａｉ由来の橙色ルシフェラーゼ（ＳＬＯルシフェラーゼ：東洋紡株式会社）と比較した。

各遺伝子に対してＫｏｚａｋ配列を付与した。なお、これら４種の配列とも哺乳細胞における発現に対してコドン最適化されている。その後、これら配列をそれぞれ、ｐＦ９Ａ ＣＭＶ ｈＲＬｕｃ ｎｅｏ Ｆｌｅｘｉ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。ｐＦ９Ａベクターは内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ｈＲＬｕｃ）をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子による発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度との比として算出することが可能である。

同様の手順に従って、比較のためのルシフェラーゼであるＳＬＯルシフェラーゼ遺伝子に対してＫｏｚａｋ配列を付与した後、ｐＦ９Ａベクターのマルチクローニングサイトに挿入した。

２．発光観察
そのように作製した５種の発現ベクターの各々を、４８穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にリポフェクション法で遺伝子導入した。遺伝子が発現した段階で、２ｍＭのＤ−ルシフェリンを基質として添加し、ＤＰ７０カラーＣＣＤ（オリンパス株式会社製）を用いて露光時間１分間（ＩＳＯ１６００）で撮影した。なお、細胞の培養温度は約３７℃とした。

撮影により取得した画像を図１にまとめる。図１では、上から順に変異体１、変異体２、変異体３、野生型３およびＳＬＯについての、４つの隣接したウェルにおける結果が示されている。なお、図１は、カラーで取得した観察結果をモノクロで表示したものである。

図１に示されるように、野生型クロイワボタルルシフェラーゼおよびＳＬＯルシフェラーゼでは、上述の撮影条件では、顕著な発光像を得ることができなかった。一方、変異体１から３では、十分な発光像を得ることができた。そして、カラーの結果によると、変異体１における発光は赤みがかった光であるのに対して、変異体２および３による発光はオレンジ色の光であった。

３．発光強度の比較
次に、発光強度の比較を行った。これは、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（米国プロメガ社製、製品番号Ｅ２９４０）を用いて実施した。５種の発現ベクターを、４８穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、２２時間後ＰＢＳで細胞を洗浄した。４８穴プレートの各ウェルに２ｍＭ Ｄ−ルシフェリン／ＣＯ２ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２００μｌずつ添加し、３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を用いて６０分間発光強度を測定した。６０分経過時点の発光強度を５種のルシフェラーゼの発光強度とした。その後、マニュアルに従ってセレンテラジンを添加し、内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度を３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒを用いて１５分間発光強度を測定した。クロイワボタル野生型ルシフェラーゼ、変異体１から３、ＳＬＯルシフェラーゼによる発光強度をウミシイタケルシフェラーゼによる発光強度でそれぞれ除算した値を算出し、その値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。

結果を図２に示す。図２に示されるように、ＨｅＬａ細胞においてクロイワボタルルシフェラーゼを発現させた場合、ＳＬＯルシフェラーゼによる発光強度を基準とすると、野生型では１．２倍、変異体１では１７．１倍、変異体２では２０．６倍および変異体３では２９．１倍となった。すなわち、従来のオレンジ色ルシフェラーゼと比較して、変異体２および３によれば、非常に高輝度のオレンジ色の発光を得られることがわかった。

４．発光スペクトルの測定
次に、発光スペクトルを測定した。

測定のための装置としてＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）（スリット幅０．５ｍｍ、露光時間１分）を用い、２ｍＭ Ｄ−ルシフェリン／ＣＯ２ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む溶液で、各種ルシフェラーゼをそれぞれ遺伝子発現するＨｅＬａ細胞を懸濁し、細胞内で発光させて発光スペクトルを３７度の環境下で測定した。なお、このＨｅＬａ細胞はトリプシン処理して浮遊させた細胞である。

測定された発光スペクトルを図３に示す。また、各ルシフェラーゼの最大発光波長を以下の表１にまとめる。なお、「最大発光波長」とは、ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光を測定することによって得られるスペクトルにおいて、発光強度が最大となる波長を意味する。

図３および表１より、野生型クロイワボタルルシフェラーゼは、約３７度の培地中で浮遊するＨｅＬａ細胞内において、約５８５ｎｍの最大発光波長を示した。また、同じ条件において、変異体１では約６０６ｎｍ、変異体２では約５９０ｎｍ、変異体３では約５９０ｎｍおよびＳＬＯルシフェラーゼ（東洋紡社）では約５９４ｎｍの最大発光波長を示した。

変異体１では、やや長波長側に最大発光波長がシフトしているのに対し、変異体２および３では、ＳＬＯルシフェラーゼとほぼ同様の最大発光波長を示した。

また、図３から、変異体１から３によるスペクトルは、１つのピークから成るシャープなものであることがわかった。

以上より、クロイワボタルルシフェラーゼ変異体２および３はＳＬＯルシフェラーゼと同様な最大発光波長を示しながら、ＳＬＯルシフェラーゼによる発光強度の２０．６倍および２９．１倍の発光強度を有するものであることがわかった。

このような、従来にないほど高輝度なオレンジ色ルシフェラーゼである変異体２および３を、レポーターとしてマルチカラーアッセイを実施することで、オレンジ色領域のシグナルを効果的に得ることが可能になると考えられる。

Claims (10)

1. 配列番号３８のアミノ酸配列に対して変異が導入されたアミノ酸配列を有するルシフェラーゼであって、
   前記ルシフェラーゼは、５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒し、前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有するルシフェラーゼ。
2. 導入される前記変異は、配列番号３８のアミノ酸配列におけるＮ末端側から２５６番目のバリン残基がアラニン残基に置換される変異を含む請求項１に記載のルシフェラーゼ。
3. 導入される前記変異は、配列番号３８のアミノ酸配列におけるＮ末端側から１１１番目のアルギニン残基がヒスチジン残基に置換される変異を含む請求項１または２に記載のルシフェラーゼ。
4. 配列番号４０のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ。
5. 配列番号４０のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｎ末端側から２８３番目および２５６番目のアミノ酸残基が、それぞれグリシン残基およびアラニン残基であるアミノ酸配列を有し、
   ５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒し、前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有するルシフェラーゼ。
6. 配列番号４２のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ。
7. 配列番号４２のアミノ酸配列との間で８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｎ末端側から１１１番目、２８３番目および２５６番目のアミノ酸残基が、それぞれヒスチジン残基、グリシン残基およびアラニン残基であるアミノ酸配列を有し、
   ５７０ｎｍから６１０ｎｍの最大発光波長を有する発光を生じる発光反応を触媒し、前記発光は、配列番号４８のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに触媒される発光反応の発光と比較して、１０倍以上の強度を有するルシフェラーゼ。
8. 請求項１から７の何れか１項に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を有する核酸。
9. 配列番号４１の塩基配列を有する請求項８に記載の核酸。
10. 配列番号４３の塩基配列を有する請求項８に記載の核酸。

Images