JP2013081459A - ホタル由来ルシフェラーゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】実施形態に係るルシフェラーゼは、シブイロヒゲボタル(Stenocladius flavipennis)に由来し、特定のアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼおよびその変異体、並びにキベリヒゲボタル(Stenocladius yoshikawai)に由来し、特定のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。
【選択図】図3
Description
また、実施形態は、変異体2などの赤色変異体に対して更なる変異を導入した改良型赤色変異体も含む。例えば、変異体2などの赤色変異体に対して、さらなる発光強度の向上を目的として、さらなる変異を導入した改良型赤色変異体を含む。あるいは、別の実施形態は、変異体2などの赤色変異体に対して、発光強度の向上とは別の目的、例えば、可溶性の向上、分解に対する耐性の向上等を目的として、さらなる変異を導入した改良型赤色変異体を含む。具体的には、実施形態は、変異体2のアミノ酸配列(配列番号34)との間で一定の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる改良型赤色変異体を含む。
(1)配列番号1のアミノ酸配列の282番目のフェニルアラニンをチロシンに置換する変異(F282Y);
(2)配列番号1のアミノ酸配列の293番目のセリンをフェニルアラニンに置換する変異(S293F);
(3)配列番号1のアミノ酸配列の387番目のアスパラギンをセリンに置換する変異(N387S);
(4)配列番号1のアミノ酸配列の400番目のシステインをチロシンに置換する変異(C400Y);
(5)配列番号1のアミノ酸配列の432番目のイソロイシンをバリンに置換する変異(I432V);
(6)配列番号1のアミノ酸配列の451番目のバリンをイソロイシンに置換する変異(V451I);
(7)配列番号1のアミノ酸配列の486番目のアラニンをアスパラギン酸に置換する変異(A486D);
(8)配列番号1のアミノ酸配列の517番目のセリンをシステインに置換する変異(S517C);および
(9)配列番号1のアミノ酸配列の520番目のリジンをアルギニンに置換する変異(K520R)。
(1)配列番号1のアミノ酸配列に、S293F、N387S、C400Y、I432V、V451I、A486D、S517CおよびK520Rの8つの変異を有する変異体(配列番号39);
(2)配列番号1のアミノ酸配列に、F282Y、S293F、N387S、C400Y、A486D、S517CおよびK520Rの7つの変異を有する変異体(配列番号41);および
(3)配列番号1のアミノ酸配列に、S293F、N387S、C400Y、A486D、S517CおよびK520Rの6つの変異を有する変異体(配列番号43)。
Asako Sawano and Atsushi Miyawaki, Nucleic Acids Research,2000, Vol.28, No.16。
1.材料
材料として沖縄県久米島で採集したシブイロヒゲボタル(Stenocladius flavipennis)の幼虫を用いた。
ホタルの幼虫からハサミを用いて発光器を切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるLysing Matrix Dチューブ(MP−Biomedicals社)に、採取した発光器および1mLのトータルRNA抽出試薬TRIzol Reagent(インビトロジェン社)を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置FastPrep 24(MP−Biomedicals社)またはFastPrep FP100A(MP−Biomedicals社)に装着し、振動速度6.5m/sおよび振動時間45秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、30分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕を実施した。
3−1.Rapid Amplification of cDNA End(RACE)法に用いるプライマーの作製
シブイロヒゲボタルのルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをPolymerase chain reaction(PCR)法によって行った。このPCRに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。
flexLuc5−ATA(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTA AT−3’:配列番号7)、
flexLuc5−ATG(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTG AT−3’:配列番号8)、
flexLuc5−ATT(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAT TTT AT−3’:配列番号9)、
flexLuc5−ACA(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTA AT−3’:配列番号10)、
flexLuc5−ACG(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTG AT−3’:配列番号11)、
flexLuc5−ACT(5’−ACY TGR TAN CCY TTA TAC TTT AT−3’:配列番号12)、
flexLuc5−GTA(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTA AT−3’:配列番号13)、
flexLuc5−GTG(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTG AT−3’:配列番号14)、
flexLuc5−GTT(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAT TTT AT−3’:配列番号15)、
flexLuc5−GCA(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTA AT−3’:配列番号16)、
flexLuc5−GCG(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTG AT−3’:配列番号17)、
flexLuc5−GCT(5’−ACY TGR TAN CCY TTG TAC TTT AT−3’:配列番号18)。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。
上述の通り作製したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した12種類の特異的混合プライマーおよび5’末端特異的プライマーであるGeneRacer5’Primer(5’−CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA−3’:配列番号19)およびGeneRacer5’Nested Primer(5’−GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA−3’:配列番号20)を用いて5’−RACE PCRを行った。GeneRacer5’ PrimerおよびGeneRacer5’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれているものを使用した。5’−RACE PCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
5’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
4−1.3’Race PCRに用いるプライマーの設計
5’Race PCRの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の5’末端側非翻訳領域の配列を基にして、3’RACEに用いるプライマー(配列番号24)およびNested PCRに用いるプライマー(配列番号25)を作成した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。
上述の通り作成したホタル完全長cDNAライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの5’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーSteno(kume)-Full-F1(TTTTCGTTCATCCATTCAAGTTAGG):配列番号24)およびGeneRacer3’ Primer(5’−GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G−3’:配列番号26)およびGeneRacer3’ Nested Primer(5’−CGC TAC GTA ACG GCA TGA CAG TG−3’:配列番号27)を用いて3’−RACE PCRを行った。GeneRacer3’ PrimerおよびGeneRacer3’ Nested Primerは、完全長cDNA合成試薬GeneRacerキット(インビトロジェン社)に含まれているものを使用した。3’−RACE PCRによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度PCRによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるnested PCRを行った。PCRにはポリメラーゼEx−Taq(タカラバイオ株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
3’−RACEで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるPCR産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
ATGCCGTCATCGATGATGAGCAAAAAGGATCTAGAAGATAAAAATGTCGTGCATGGACCCGATCCTTATTACCTAGTCGATGAAGGTAACGCTGGACAACAACTACACAAAACAATTTTGAGATATGCACAACTACCTGATACCATCGCTTTTACGGATGGACATACAAAACGAGATGTGACCTACGCCCACTATTTTGATCTTACTTGTAGATTAGCAGAAAGCTTGAAGAGATATGGGCTTAATCTACAATCCAGAATTGCAGTTTGTAGTGAAAATAATGTTGAATTTTTCATACCTGTAGTTGCATCTCTGTATTTAGGAGTCGGTGTTGCTCCAACGAATGATATTTATAATGAAACTGAATTATTCAACAGTCTAAACATATCGCAACCAACTATTGTTTTTGTTTCAAAAAGAGCACTGCATAAAATTTTGGAAGTAAAAAAGAGGATACCAATTATTAAGACGGTCGTGGTATTAGATACCGAAGAAGACTTTATGGGATACCACTGCCTCCATTCATTTATGAAACATTACCTACCACCAAATTTCGATATAATGTCCTATAAACCTGAGGAGTTTGCAAGGGATGGCCAACTCGCTCTCATAATGAACTCTTCTGGATCAACGGGATTACCAAAAGGCGTAATGTTAGCCCATAGAAGTGTAGTTGTGCGATTTTCGCACTGCAAGGATCCGGTATTTGGCAATCAAATCATCCCAGATACTGCTATATTAACAGTAATACCATTTCATCATGGTTTTGGTATGTTTACAACTTTAGGATACCTAACCTGCGGTTTTCGCATTGTACTATTGAGAAAATTTGATGAACATTACTTTTTGAAATGCTTACAAGACTATAAAATTCAAAGTGCATTACTAGTACCAACCCTATTCTCTTTCTTTGCAAAAAGTACTTTAGTTGACCAATATGATTTATCAAATTTAAAAGAAATAGCATCCGGTGGAGCTCCTCTTGCAAAAGAAGTTGGAGAAGCTGTCGCAAAAAGATTCAAGCTACCAGGAATAAGACAAGGATACGGTTTAACAGAAACCACCTCAGCTGTAATAATTACACCAGAGGGTGAAGATAAACCTGGATCAACTGGGAAAGTTGTTCCGTTCTTTTCAGCTAAAATAGTTGATCTTAATAATGGAAAATCTGTGGGACCACACCAACGCGGTGAATTATGCCTTAAAGGCGATATGATTATGATGGGATATTGCAATAATAAAGCAGCAACAGATGAAATGATTGATAAAGATGGTTGGTTACATTCCGGCGATATTGCTTATTACGATGAAGATGGGCACTTCTTTATTGTAGATCGCTTAAAATCTTTAGTTAAATATAAAGGCTACCAGGTGGCACCTGCTGAATTAGAGGCTGTACTATTACAACATCCATGTATTTTTGACGCCGGTGTTACTGGTGTTCCTGATGACGTTGCTGGAGAGCTTCCAGGAGCTTGCGTCGTACTTGAAAAGGGCAAACATGTAACAGAACAGGAAGTTATGGATTACGTTGCAGGTCAACTTTCATCGTACAAAAAACTCCGAGGCGGAGTACGCTTCATAGATGAAATACCTAAGGGTCTTACTGGGAAAATTGATAGAAAGGCATTGAAAGAAATTCTTAAAAAACCGCAATCCAAAATGTAA
MPSSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNNGKSVGPHQRGELCLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVAGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSSYKKLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM
以下、この新規のルシフェラーゼ遺伝子にコードされるタンパク質を野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼと称する。
1.野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現
野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、pRSET−Bベクター(インビトロジェン)に導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。
上述の通り決定した塩基配列によれば、野生型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼ遺伝子はBamHIおよびEcoRIの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」(羊土社、2001年発行、p.17−25)に示される方法に従った。変異導入後の配列は、配列番号3に示される塩基配列である。
ATGCCGTCATCGATGATGAGCAAAAAGGATCTAGAAGATAAAAATGTCGTGCATGGACCCGATCCTTATTACCTAGTCGATGAAGGTAACGCTGGACAACAACTACACAAAACAATTTTGAGATATGCACAACTACCTGATACCATCGCTTTTACGGATGGACATACAAAACGAGATGTGACCTACGCCCACTATTTTGATCTTACTTGTAGATTAGCAGAAAGCTTGAAGAGATATGGGCTTAATCTACAATCCAGAATTGCAGTTTGTAGTGAAAATAATGTTGAATTTTTCATACCTGTAGTTGCATCTCTGTATTTAGGAGTCGGTGTTGCTCCAACGAATGATATTTATAATGAAACTGAATTATTCAACAGTCTAAACATATCGCAACCAACTATTGTTTTTGTTTCAAAAAGAGCACTGCATAAAATTTTGGAAGTAAAAAAGAGGATACCAATTATTAAGACGGTCGTGGTATTAGATACCGAAGAAGACTTTATGGGATACCACTGCCTCCATTCATTTATGAAACATTACCTACCACCAAATTTCGATATAATGTCCTATAAACCTGAGGAGTTTGCAAGGGATGGCCAACTCGCTCTCATAATGAACTCTTCTGGATCAACGGGATTACCAAAAGGCGTAATGTTAGCCCATAGAAGTGTAGTTGTGCGATTTTCGCACTGCAAAGATCCGGTATTTGGCAATCAAATCATCCCAGATACTGCTATATTAACAGTAATACCATTTCATCATGGTTTTGGTATGTTTACAACTTTAGGATACCTAACCTGCGGTTTTCGCATTGTACTATTGAGAAAATTTGATGAACATTACTTTTTGAAATGCTTACAAGACTATAAAATTCAAAGTGCATTACTAGTACCAACCCTATTCTCTTTCTTTGCAAAAAGTACTTTAGTTGACCAATATGATTTATCAAATTTAAAAGAAATAGCATCCGGTGGAGCTCCTCTTGCAAAAGAAGTTGGAGAAGCTGTCGCAAAAAGATTCAAGCTACCAGGAATAAGACAAGGATACGGTTTAACAGAAACCACCTCAGCTGTAATAATTACACCAGAGGGTGAAGATAAACCTGGATCAACTGGGAAAGTTGTTCCGTTCTTTTCAGCTAAAATAGTTGATCTTAATAATGGAAAATCTGTGGGACCACACCAACGCGGTGAATTATGCCTTAAAGGCGATATGATTATGATGGGATATTGCAATAATAAAGCAGCAACAGATGAAATGATTGATAAAGATGGTTGGTTACATTCCGGCGATATTGCTTATTACGATGAAGATGGGCACTTCTTTATTGTAGATCGCTTAAAATCTTTAGTTAAATATAAAGGCTACCAGGTGGCACCTGCTGAATTAGAGGCTGTACTATTACAGCATCCATGTATTTTTGACGCCGGTGTTACTGGTGTTCCTGATGACGTTGCTGGAGAGCTTCCAGGAGCTTGCGTCGTACTTGAAAAGGGCAAACATGTAACAGAACAGGAAGTTATGGATTACGTTGCAGGTCAACTTTCATCGTACAAAAAACTCCGAGGCGGAGTACGCTTCATAGATGAAATACCTAAGGGTCTTACTGGGAAAATTGATAGAAAGGCATTGAAAGAAATTCTTAAAAAACCGCAATCCAAAATGTAA
ルシフェラーゼ遺伝子を、pRSET−Bベクターの制限酵素サイトBamHI−EcoRI間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素BamHI認識配列GGATCCを含むプライマー、並びに終止コドンおよびその後ろに制限酵素EcoRI認識配列GAATTCを含むプライマーを作成した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。PCRにはポリメラーゼKOD−Plus−(東洋紡績株式会社)を用いて、マニュアルに従って実施した。
JM109(DE3)を含む大腸菌溶液50μlにルシフェラーゼ発現ベクター0.5μlを添加し、氷上で10分、その後42℃で1分、最後に氷上で2分インキュベートした。その後、大腸菌溶液50μlをSOC培地200μlに加えた。その大腸菌/SOC培地混合溶液を37℃で20分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル100μlをLB培地プレート(100μg/mlアンピシリンを含む)にストリークし、37℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、500mlスケールのLB培地で培養した。培養は37℃で24時間、18℃で24時間行った。合計48時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、0.1M Tris−HCl溶液(pH8.0)に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離(15000rpm、10分)し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム2mlのカラムにNi−Agar懸濁液500μlと0.1M Tris−HCl2mlを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て4℃の条件で行った。25mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液2mlでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに500mMイミダゾール/0.1M Tris−HCl溶液を2ml加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムPD−10(GEヘルスケア)でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをVivaspin6(ザルトリウス)で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、50%グリセリン溶液とした。保存は−20℃で行った。
測定のための装置としてLumiFlSpectroCapture(ATTO)を用い、0.1Mクエン酸/0.1M Na2HPO4 buffer(pH6.0−8.0)に1mM D−ルシフェリン、2mM ATPおよび4mM MgCl2を含む溶液に、精製酵素を1μg/mlから10μg/mlの間の最終濃度で添加し、酵素添加後15秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果を図1に示す。
4−1.D−ルシフェリンおよびATPの濃度の決定
D−ルシフェリン溶液中のD−ルシフェリン濃度およびATP溶液中のATP濃度を以下の通りに決定した。
D−ルシフェリン:λmax 328nm、ε18200、pH5.0
ATP:λmax 259nm、ε15400、pH7.0。
様々なD−ルシフェリン濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、D−ルシフェリンに対するKm値を決定した。
様々なATP濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ATPに対するKm値を決定した。
1.変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼの作製
下記のとおり、変異型シブイロヒゲボタルルシフェラーゼを発現する変異型遺伝子を作製した。
配列番号4のアミノ酸配列上363番目のグルタミン酸をリジンに置換する変異(E363K)
配列番号4のアミノ酸配列上293番目のセリンをフェニルアラニンに置換する変異(S293F)。
ATGCCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAACGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTGCCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGCTGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCAGCTACAAGAAACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCATCGACGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA
E363K変異:(GTGATCATCACCCCCnnnGGCGAGGATAAGCCTG:配列番号30)
S293F変異:(GACTACAAGATCCAGnnnGCCCTGCTGGTGCC:配列番号31)
変異体1:E363K
変異体2:S293F
変異体1および2は、更に、P2A(Kozak配列の付与による変異)の変異を有する。
MASSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPKGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNNGKSVGPHQRGELCLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVAGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSSYKKLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM
ATGGCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCAAAGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAACGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTGCCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGCTGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCAGCTACAAGAAACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCATCGACGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA
MASSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQFALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNNGKSVGPHQRGELCLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVAGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSSYKKLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM
ATGGCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGTTTGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAACGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTGCCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGCTGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCAGCTACAAGAAACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCATCGACGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA
次に、野生型、変異体1および2のルシフェラーゼによる細胞内での発光強度を測定し、これらを、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ(プロメガ社)およびヒカリコメツキムシ(Pyrophorus plagiophthalamus)由来の赤色発光のルシフェラーゼCBR(プロメガ社)と比較した。
沖縄県西表島にて採集した西表産ヒゲボタルから実施例1と同様の手法を用いて,西表産キベリヒゲボタル(Stenocladius yoshikawai)を由来とするルシフェラーゼ遺伝子のクローニングを実施した。
ATGCCGTCATCGATGATGAGCAAAAAGGATCTAGAAGATAAAAATGTCGTGCATGGACCCGATCCTTATTACCTAGTCGATGAAGGTAACGCTGGACAACAACTACACAAAACAATTTTGAGATATGCACAACTACCTGATACCATCGCTTTTACRGATGGACATACAAAACGAGATGTGACCTACGCCCACTATTTTGATCTTACTTGTAGATTAGCAGAAAGCTTGAAGAGATATGGGCTTAATCTACAATCCAGAATTGCAGTTTGTAGTGAAAATAATGTTGAATTTTTCATACCTGTAGTTGCATCTCTGTATTTAGGAGTCGGTGTTGCTCCAACGAATGATATTTATAATGAAACTGAATTATTCAACAGTCTAAACATATCGCAACCAACTATTGTTTTTGTTTCAAAAAGAGCACTGCATAAAATTTTGGAAGTAAAAAAGAGGATACCAATTATTAAGACGGTCGTGGTATTAGATACCGAAGAAGACTTTATGGGATACCACTGCCTCCATTCATTTATGAAACATTACCTACCACCAAAYTTCGATATAATGTCCTATAAACCTGAGGAGTTTGCAAGGGATGGCCAACTCGCTCTCATAATGAACTCTTCTGGATCAACGGGATTACCAAAAGGCGTAATGTTAGCCCATAGAAATGTAGTTGTGCGATTTTCRCACTGCAAGGATCCGGTATTTGGCAATCAAATCATCCCAGATACTGCTATATTAACAGTAATACCATTTCATCATGGTTTTGGTATGTTTACAACTTTAGGATACCTAACCTGCGGTTTCCGTATTGTACTATTGAGAAAATTTGATGAACATTACTTTTTGAAATGCTTACAAGACTATAAAATTCAAAGTGCATTACTCGTACCAACCCTATTCTCTTTCTTTGCAAAAAGTACTTTAGTTGACCAATATGATTTATCAAATTTAAAAGAAATAGCATCCGGTGGAGCTCCTCTTGCAAAAGAAGTTGGAGAAGCTGTCGCAAAAAGATTCAAGCTACCAGGAATAAGACAAGGATACGGTTTAACAGAAACCACTTCAGCTGTAATAATTACACCAGAGGGTGAAGATAAACCTGGATCAACTGGGAAAGTTGTTCCGTTCTTTTCAGCTAAAATAGTTGATCTTAATAATGGAAAATCTGTGGGACCACACCAACGCGGTGAATTATGCCTTAAAGGCGATATGATTATGATGGGRTATTGCAATAATAAAGCAGCAACAGATGAAATGATTGATAAAGATGGTTGGTTACATTCCGGTGATATTGCTTATTACGATGAAGATGGGCACTTCTTTATTGTAGATCGCTTAAAATCTTTGGTTAAATATAAAGGCTACCAGGTGGCACCTGCTGAATTAGAGGCTGTACTATTACAACATCCATGTATTTTTGACGCCGGTGTTACTGGTGTTCCTGATGACGTTGCTGGAGAGCTTCCAGGAGCTTGCGTTGTACTTGAAAAGGGCAAACATGTAACAGAACAGGAAGTTATGGATTACGTTGCAGGTCAACTTTCATCGTACAAAAAACTCCGTGGCGGAGTACGCTTCATAGATGAAATACCTAAGGGTCTTACTGGAAAAATTGATAGAAAGGCATTGAAAGAAATTCTTAAAAAACCGCAATCCAAAATGTAA(配列番号36)
MPSSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRNVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNNGKSVGPHQRGELCLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVAGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSSYKKLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM*(配列番号37)
ATGCCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGAaaCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAACGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTGCCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGCTGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCAGCTACAAGAAACTGAGAGGCGGCGTGCGCTTCATCGACGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA(配列番号38)
1.改良型赤色変異体の作製
下記のとおり、実施例3で作製された変異体2に更なる変異を導入することにより、改良型赤色変異体を発現する変異型遺伝子を作製した。
実施例3で作製された変異体2(配列番号34)をコードする遺伝子(配列番号35)に対し、下記(a)〜(h)の変異を更に導入した:
(a)配列番号34のアミノ酸配列の387番目のアスパラギンをセリンに置換する変異(N387S);
(b)配列番号34のアミノ酸配列の400番目のシステインをチロシンに置換する変異(C400Y);
(c)配列番号34のアミノ酸配列の432番目のイソロイシンをバリンに置換する変異(I432V);
(d)配列番号34のアミノ酸配列の451番目のバリンをイソロイシンに置換する変異(V451I);
(e)配列番号34のアミノ酸配列の486番目のアラニンをアスパラギン酸に置換する変異(A486D);
(f)配列番号34のアミノ酸配列の517番目のセリンをシステインに置換する変異(S517C);および
(g)配列番号34のアミノ酸配列の520番目のリジンをアルギニンに置換する変異(K520R)。
また、実施例3で作製された赤色変異体(配列番号34)をコードする遺伝子(配列番号35)に対し、下記(h)〜(m)の変異を更に導入した:
(h)配列番号34のアミノ酸配列の282番目のフェニルアラニンをチロシンに置換する変異(F282Y);
(i)配列番号34のアミノ酸配列の387番目のアスパラギンをセリンに置換する変異(N387S);
(j)配列番号34のアミノ酸配列の400番目のシステインをチロシンに置換する変異(C400Y);
(k)配列番号34のアミノ酸配列の486番目のアラニンをアスパラギン酸に置換する変異(A486D);
(l)配列番号34のアミノ酸配列の517番目のセリンをシステインに置換する変異(S517C);および
(m)配列番号34のアミノ酸配列の520番目のリジンをアルギニンに置換する変異(K520R)。
また、実施例3で作製された赤色変異体(配列番号34)をコードする遺伝子(配列番号35)に対し、下記(n)〜(r)の変異を更に導入した:
(n)配列番号34のアミノ酸配列の387番目のアスパラギンをセリンに置換する変異(N387S);
(o)配列番号34のアミノ酸配列の400番目のシステインをチロシンに置換する変異(C400Y);
(p)配列番号34のアミノ酸配列の486番目のアラニンをアスパラギン酸に置換する変異(A486D);
(q)配列番号34のアミノ酸配列の517番目のセリンをシステインに置換する変異(S517C);および
(r)配列番号34のアミノ酸配列の520番目のリジンをアルギニンに置換する変異(K520R)。
変異導入後、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌JM109(DE3)株に形質転換して寒天培地上にコロニーを形成させた。このコロニーに対して最終濃度2mMのD-Luciferinを噴霧後、CCDカメラDP-70(オリンパス)にて発光を撮像した。他のコロニーよりも明るく、赤い発光を呈するコロニーを拾い上げ、シーケンサーを用いて配列を確認した。
MASSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQFALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNSGKSVGPHQRGELYLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDVAYYDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVDGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSCYKRLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM*
ATGGCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGTTTGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAGCGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTACCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACGTTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGACGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCTGCTACAAGAGACTGAGAGGCGGTGTGCGCTTCATCGATGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA
MASSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYYLKCLQDYKIQFALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNSGKSVGPHQRGELYLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVDGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSCYKRLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM*
ATGGCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGTACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGTAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTAACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACTCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTACTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTATCTGAAATGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGTTTGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAGCGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTACCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGACGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCTGCTACAAGAGACTGAGAGGCGGTGTGCGCTTCATCGATGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA
MASSMMSKKDLEDKNVVHGPDPYYLVDEGNAGQQLHKTILRYAQLPDTIAFTDGHTKRDVTYAHYFDLTCRLAESLKRYGLNLQSRIAVCSENNVEFFIPVVASLYLGVGVAPTNDIYNETELFNSLNISQPTIVFVSKRALHKILEVKKRIPIIKTVVVLDTEEDFMGYHCLHSFMKHYLPPNFDIMSYKPEEFARDGQLALIMNSSGSTGLPKGVMLAHRSVVVRFSHCKDPVFGNQIIPDTAILTVIPFHHGFGMFTTLGYLTCGFRIVLLRKFDEHYFLKCLQDYKIQFALLVPTLFSFFAKSTLVDQYDLSNLKEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFKLPGIRQGYGLTETTSAVIITPEGEDKPGSTGKVVPFFSAKIVDLNSGKSVGPHQRGELYLKGDMIMMGYCNNKAATDEMIDKDGWLHSGDIAYYDEDGHFFIVDRLKSLVKYKGYQVAPAELEAVLLQHPCIFDAGVTGVPDDVDGELPGACVVLEKGKHVTEQEVMDYVAGQLSCYKRLRGGVRFIDEIPKGLTGKIDRKALKEILKKPQSKM*
ATGGCCAGCAGCATGATGAGCAAGAAGGACCTGGAAGATAAGAACGTGGTGCACGGCCCCGACCCCTACTACCTGGTGGATGAGGGCAATGCCGGCCAGCAGCTGCACAAGACCATCCTGAGATACGCCCAGCTGCCCGACACAATCGCCTTCACCGACGGCCACACCAAGCGGGATGTGACCTACGCCCACTACTTCGACCTGACCTGCAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATACGGCCTGAACCTGCAGAGCCGGATCGCCGTGTGCAGCGAGAACAACGTGGAATTTTTCATCCCCGTGGTGGCCAGCCTGTACCTGGGAGTGGGAGTGGCCCCCACCAACGACATCTACAACGAGACAGAGCTGTTCAACAGCCTGAACATCAGCCAGCCCACCATCGTGTTCGTGTCCAAGCGGGCCCTGCACAAGATCCTGGAAGTGAAGAAGCGCATCCCCATCATCAAGACCGTGGTGGTGCTGGACACCGAAGAGGACTTCATGGGCTACCACTGCCTGCACAGCTTTATGAAGCACTACCTGCCCCCCAACTTCGACATCATGAGCTACAAGCCCGAAGAGTTCGCCCGGGATGGACAGCTGGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCTAAAGGCGTGATGCTGGCCCACAGATCCGTGGTCGTGCGGTTCAGCCACTGCAAGGACCCCGTGTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTGACCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGACCTGTGGCTTCCGGATCGTGCTGCTGCGGAAGTTCGACGAGCACTACTTTCTGAAGTGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGTTTGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACCCTGGTGGACCAGTACGACCTGAGCAACCTGAAAGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCTAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTTAAGCTGCCCGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGAGGATAAGCCTGGCTCTACAGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGATCGTGGACCTGAACAGCGGCAAGAGCGTGGGCCCTCACCAGAGGGGAGAACTCTACCTGAAGGGCGACATGATCATGATGGGCTACTGCAACAACAAGGCCGCCACCGACGAGATGATCGACAAGGATGGCTGGCTGCACTCCGGCGACATTGCCTACTACGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGGTCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAACTGGAAGCTGTGCTGCTGCAGCATCCCTGCATCTTCGATGCCGGCGTGACCGGCGTGCCAGATGATGTGGACGGCGAACTGCCTGGCGCCTGTGTGGTCCTGGAAAAGGGCAAGCACGTGACCGAGCAGGAAGTGATGGACTACGTCGCCGGCCAGCTGAGCTGCTACAAGAGACTGAGAGGCGGTGTGCGCTTCATCGATGAGATCCCTAAGGGCCTGACCGGCAAGATCGACCGGAAGGCCCTGAAAGAAATCCTGAAGAAACCCCAGAGCAAGATGTGA
次に、改良型赤色変異体A〜CによるHeLa細胞内での発光強度を測定し、これらを、北米産ホタル(Photinus pyralis)由来のルシフェラーゼLuc2(プロメガ社より入手)およびコメツキムシ由来の赤色発光のルシフェラーゼCBR(プロメガ社のCBRルシフェラーゼ)と比較した。
Claims (17)
- シブイロヒゲボタル(Stenocladius flavipennis)またはキベリヒゲボタル(Stenocladius yoshikawai)に由来するルシフェラーゼ。
- シブイロヒゲボタル(Stenocladius flavipennis)に由来し、以下の(a)、(b)および(c)からなる群より選択されることを特徴とする請求項1に記載のルシフェラーゼ:
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼ、
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、ルシフェリンを発光させる活性を有する変異型ルシフェラーゼ、および
(c)配列番号32または34に示される変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、ルシフェリンを発光させる活性を有する変異型ルシフェラーゼ。 - キベリヒゲボタル(Stenocladius yoshikawai)に由来し、配列番号37に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項1に記載のルシフェラーゼ。
- 前記ルシフェラーゼが、配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較してより高い強度でルシフェリンを発光させる活性を有する変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。
- 前記ルシフェラーゼが、前記野生型ルシフェラーゼに対して、1.8倍以上の強度で前記ルシフェリンを発光させる活性を有することを特徴とする請求項4に記載の変異型ルシフェラーゼ。
- 前記ルシフェラーゼが、
配列番号1に記載されるアミノ酸配列の2番目のプロリンのアラニンへの置換、並びに
配列番号1に記載されるアミノ酸配列の293番目のセリンのフェニルアラニンへの置換または配列番号1に記載されるアミノ酸配列の363番目のグルタミン酸のリジンへの置換
により、配列番号1に示されるアミノ酸配列から誘導された変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。 - 前記ルシフェラーゼが、配列番号32または34に記載のアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。
- 前記ルシフェラーゼが、配列番号32に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度でルシフェリンを発光させる活性を有する変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。
- 前記ルシフェラーゼが、配列番号34に記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ルシフェラーゼと比較して、より高い強度で、より長波長にルシフェリンを発光させる活性を有する変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。
- 前記ルシフェラーゼが、配列番号1に示されるアミノ酸配列において、F282Y、S293F、N387S、C400Y、I432V、V451I、A486D、S517CおよびK520Rから選択される1以上のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列からなり、赤色発光を誘起する変異型ルシフェラーゼであることを特徴とする請求項1または2に記載のルシフェラーゼ。
- 前記ルシフェラーゼが、610±10nmの最大発光波長を有する発光を誘起することを特徴とする請求項10に記載のルシフェラーゼ。
- 前記ルシフェラーゼが、610nm以上の最大発光波長を有する発光を誘起し、ヒカリコメツキ由来の赤色ルシフェラーゼと比較して高い強度でルシフェリンを発光させる活性を有し、かつヒカリコメツキ由来の赤色ルシフェラーゼと比較してD−ルシフェリンに対するKm値が低いことを特徴とする請求項10に記載のルシフェラーゼ。
- 前記ルシフェラーゼが、配列番号39、配列番号41または配列番号43に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項11または12に記載のルシフェラーゼ。
- 請求項1から13の何れか1項に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を含むことを特徴とする核酸。
- 配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号33または配列番号35に示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項14に記載の核酸。
- 配列番号36または38に示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項14に記載の核酸。
- 配列番号40、配列番号42または配列番号44に示される塩基配列を含むことを特徴とする請求項14に記載の核酸。
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Cited By (3)
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JP2015019604A (ja) * | 2013-07-17 | 2015-02-02 | オリンパス株式会社 | オレンジ色の発光を示すルシフェラーゼ |
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011105627A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-09-01 | Olympus Corporation | Firefly luciferase |
JP2011167079A (ja) * | 2010-02-16 | 2011-09-01 | Olympus Corp | ホタル由来ルシフェラーゼ |
-
2012
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Patent Citations (2)
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---|---|---|---|---|
JP2011167079A (ja) * | 2010-02-16 | 2011-09-01 | Olympus Corp | ホタル由来ルシフェラーゼ |
WO2011105627A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-09-01 | Olympus Corporation | Firefly luciferase |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6016007143; International Journal of Industrial Entomology Vol.2, No.2, 2001, p.91-105 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015019604A (ja) * | 2013-07-17 | 2015-02-02 | オリンパス株式会社 | オレンジ色の発光を示すルシフェラーゼ |
WO2016038750A1 (ja) * | 2014-09-10 | 2016-03-17 | オリンパス株式会社 | 分割型組換えルシフェラーゼ及びそれを用いた解析方法 |
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