JP5875762B2 - 甲虫類ルシフェラーゼ - Google Patents
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Description
まず、本発明者が本発明に至った経緯を説明する。
上述のように、非特許文献6では、基質結合部位付近に変異を導入した結果、ATPに対するKMが上昇すると同時にkcatが低下、あるいはD−ルシフェリンに対するKMが上昇している。本発明者は、このような現象について、基質結合部位付近に変異を導入することで基質が反応に好ましい配置を採ることを妨げられ、ATPに対するKMを上昇させるという好ましい変化と同時に、発光活性(kcat)の低下およびD−ルシフェリンに対するKMの上昇が起こったと考察した。
次に、本発明の態様について説明する。
本発明の一態様は、酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ATPに対するミカエリス定数KMが0.3mM以上であり、且つkcatが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのkcatの50%以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼである。
本発明の別の態様は、変異型甲虫類ルシフェラーゼタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。このような塩基配列は、甲虫類に由来する塩基配列であってよい。ここにおける「由来する」とは、ここに規定される塩基配列には、甲虫類に属す生物が本来有する野生型の塩基配列だけでなく、それに変異が生じた塩基配列が含まれることを意味する。また、ここにおける変異とは、塩基配列中の特定の塩基の置換、欠失および/または付加等を指す。塩基配列の変異には、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない変異をも含む。また、核酸とは、特に、DNAまたはRNAを指す。
本発明の別の態様は、上述のような核酸を含む形質転換体または形質導入体である。形質転換体とは、外部から核酸を取り込んだ生物(特に細胞)を意味する。当該細胞は、本発明の一態様に係る変異型甲虫類ルシフェラーゼの遺伝子を含んだ核酸が導入され、その結果、そのような遺伝子を含む核酸を保持している。そのような細胞とは、例えば、動物細胞、植物細胞、酵母細胞であってよい。形質転換体は、関連する技術分野において一般的な方法によって作製することが可能であり、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクションまたはエレクトロポレーション等によって、細胞等に核酸を導入することができる。また、形質導入体とは、バクテリオファージの感染によって、外部から核酸が導入された細菌を意味する。形質導入体は、関連する技術分野において一般的な方法によって作製することが可能であり、例えば、予め目的とする核酸を保有するバクテリオファージを作製し、それを細菌に感染させることで導入することができる。そのような細菌とは、例えば大腸菌である。
本発明の別の態様は、変異型甲虫類ルシフェラーゼの製造方法である。当該製造方法は、上述のような形質転換体もしくは形質導入体にて変異型甲虫類ルシフェラーゼを発現させる工程、または無細胞発現系にて変異型甲虫類ルシフェラーゼを合成する工程を含む。形質転換体または形質導入体を用いる場合、それらをタンパク質の発現に適した条件下で培養することで変異型甲虫類ルシフェラーゼを発現させる。その後、必要に応じて、変異型甲虫類ルシフェラーゼを精製する。これらの具体的な方法は、関連する技術分野において一般的なものを使用することができる。また、無細胞発現系においても、関連する技術分野において一般的なものを使用することができ、例えば、翻訳に必要となるリボソームやアミノ酸等を含む緩衝液に、変異体ルシフェラーゼをコードするRNAを添加してルシフェラーゼを合成する。
種々の変異型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼを作製し、ATPに対する応答性および発光活性を調べた。
文献(Sambrook, J and Russell, D. W. (2001), Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)に記載の方法に従って、cDNAライブラリからクローニングしたヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ(YaeLUC)をコードする塩基配列(配列番号2)(国際公開第2009/075306号)を含むDNAを、pRSET−Bベクター(Invitrogen)のBamHIおよびEcoRIサイト間に挿入することで、YaeLUC発現ベクターを作製した。当該発現ベクターからは、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼ(配列番号1)が発現する。
次に、上記の通り作製した発現ベクターを用いて、大腸菌内にて変異型ルシフェラーゼタンパク質を作製した。
精製した各ルシフェラーゼについて発光活性を測定した。
ATP溶液は、以下の様に調製した。ATP二ナトリウム塩三水和物(Roche #519979)0.3gを3.5mLの水に溶かし、pHを測定しながら1M NaOH溶液を加え、pHを7.0に調整した。259nmにおける吸光度を測定し、ATPの消光係数ε=15400(M−1cm−1)を用いて濃度が100mMになるように水を加えて最終調整した。黒色の96穴アッセイプレート(Thermo Fisher Scientific)のウェル中に、25μLの基質溶液(100mM Tris−HCl、20mM MgSO4、800μM D−(−)−ルシフェリン、0〜20mM ATP、pH8.0)を入れておき、ルシフェラーゼ溶液(2μg/mL ルシフェラーゼ、100mM Tris−HCl、pH8.0)を75μL加えた時点から、発光強度を経時的に測定した。25μLの基質溶液に75μLのルシフェラーゼ溶液を加えた直後の100μLの反応溶液は、100mM Tris−HCl、5mM MgSO4、200μM D−(−)−ルシフェリン、1.5μg/mL(25nM)ルシフェラーゼを含み、ATPは連続する8ウェルにそれぞれ0mM、0.001mM、0.005mM、0.02mM、0.1mM、0.5mM、2.5mMおよび5mM含まれるように調製した。ルシフェラーゼ溶液の自動分注および発光強度の測定は、自動分注器および光電子増倍管を備えたATTO社製Luminescencer JNR−IIを用いた。
ATPに対するルシフェラーゼの酵素学的パラメータを算出するために、式3に示したミカエリス・メンテンのモデルによって発光活性データを評価した。KM値およびVmax値の導出には、各ATP濃度での発光強度の経時変化のピーク付近の値をv0として、異なるATP濃度に対するv0値のデータに式3を当てはめてパラメータを導出した。式の当てはめには、レベンバーク−マーカート法による非線形最小二乗法を用いた。
各変異体において求めたKM値および相対kcat値を表3にまとめる。さらに、図3に、KMを横軸とし相対kcatを縦軸としてプロットする。図3中、横軸に平行な破線は相対kcat値が50%である線を意味し、縦軸に平行な破線はKM値が0.3mMである線を意味する。
GL3ルシフェラーゼの変異体を作製し、ATPに対する応答性および発光活性を調べた。なお、GL3ルシフェラーゼは、北米ボタルルシフェラーゼに対して、N50D/N119G/S548I/K549A/L550Vの変異を導入して性質を改変したものであるから、以下の実施例は、北米ボタルルシフェラーゼ変異体に対して追加の変異を導入した実施例でもある。
pGL3−Basic(Promega)ベクターに組み込まれているルシフェラーゼをコードする遺伝子部分(配列番号25)を実施例1と同様の方法で、pRSET−Bベクター(Invitrogen)のBamHIおよびEcoRIサイト間に挿入して、GL3発現ベクターを作製した。当該発現ベクターからは、GL3ルシフェラーゼ(配列番号26)が発現する。
上記GL3および変異型GL3発現ベクターを用いて、実施例1に記載の方法でルシフェラーゼタンパク質を作製し、精製を行った。
精製したGL3および変異型GL3タンパク質について、実施例1に記載の方法で発光活性を測定した。25μLの基質溶液に75μLのルシフェラーゼ溶液を加えた直後の100μLの反応溶液は、100mM Tris−HCl、5mM MgSO4、200μM D−(−)−ルシフェリン、1.5μg/mL(25nM)ルシフェラーゼを含み、ATPは二列の隣り合う16のウェルにそれぞれ0mM、0.0002mM、0.0005mM、0.001mM、0.002mM、0.005mM、0.01mM、0.04mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、4mMおよび5mM含まれるように調製した。
図4に、上記ATP濃度条件におけるGL3ルシフェラーゼおよびその変異体の発光強度をまとめる。また、式3を測定結果に当てはめた結果を図4の実線で示した。式の当てはめによって得られたパラメータを表4にまとめた。
Claims (6)
- 酵素反応をミカエリス−メンテンのモデルによって解析したときに、ATPに対するミカエリス定数KMが0.3mM以上であり、且つkcatが野生型または変異導入前の甲虫類ルシフェラーゼのkcatの50%以上の値である変異型甲虫類ルシフェラーゼであって、相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの447位のリジン残基に相当するアミノ酸残基、535位のリジン残基に相当するアミノ酸残基、及び/又は538位のアルギニン残基に相当するアミノ酸残基が酸性アミノ酸残基に置換されている、変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
- タンパク質の立体構造において、基質結合部位から5Å以上離れた部位に変異が導入されている請求項1に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
- 相同性に基づく配列比較において、野生型ヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの447位のリジン残基に相当するアミノ酸残基、535位のリジン残基に相当するアミノ酸残基および538位のアルギニン残基に相当するアミノ酸残基から成る群から選択される2以上のアミノ酸残基が酸性アミノ酸残基に置換されている、請求項1に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼ。
- 請求項1から3の何れか1項に記載の変異型甲虫類ルシフェラーゼタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
- 請求項4に記載の核酸を含む形質転換体。
- 請求項4に記載の核酸を含む形質導入体。
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