DE69837612T2

DE69837612T2 - Mutiertes bioluminiszenz-protein und verfahren für seine herstellung.

Info

Publication number: DE69837612T2
Application number: DE69837612T
Authority: DE
Inventors: Kozo Noda-shi HIROKAWA; Naoki Noda-Shi Kajiyama; Seiji Noda-shi MURAKAMI
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1997-07-08
Filing date: 1998-06-30
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2018-07-01
Also published as: DK1020524T3; WO1999002697A1; EP1020524A4; JP4222636B2; DE69837612D1; DE69841951D1; EP1020524A1; DE69841292D1; DK1707621T3; EP1020524B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein biolumineszierendes Protein vom Mutanttyp und ein Verfahren zur Produktion des biolumineszierenden Proteins vom Mutanttyp.
Fachlicher Hintergrund
Als herkömmliche Glühwürmchen-Luciferasen vom Wildtyp sind jene bekannt, die vom Genji-Glühwürmchen (Luciola cruciata), Heike-Glühwürmchen (Luciola lateralis), dem nordamerikanischen Glühwürmchen (Photinus pyralis), osteuropäischen Glühwürmchen (Luciola mingrelica), dem Tuchi-Glühwürmchen (Lampyris noctiluca) etc. abstammen.
Weiters sind auch Luciferasen vom Mutanttyp (mit Mutationen der Thermostabilität, Lumineszenzfarbe etc.) aus diesen Wildtyp-Glühwürmchen-Luciferasen als Quelle gewonnen worden.
WO 96/22376 offenbart mutierte Luciferasen von Photinus pyralis, Luciola cruciata und Luciola lateralis, die Substitutionen an den Aminosäureresten 215 und/oder 217, 270 und/oder 272 und 354 und/oder 356 umfassen.
EP 0 524 448 und Kajiyama et al., Biochemistry 32, 13795–13799 (1993), offenbaren Luciferasen vom Mutanttyp des Glühwürmchens Luciola cruciata und Luciola lateralis, worin der Threoninrest an Position 217 der Aminosäuresequenz in eine hydrophobe Aminosäure konvertiert ist.
EP 0 449 621 offenbart eine mutierte Luciferase von Luciola cruciata, worin der Valinrest an Position 239 der Aminosäuresequenz durch ein isoleucin ersetzt ist.
Die Verbesserung der katalytischen Wirksamkeit und Stabilität dieses Enzyms durch seine Mutation ist sehr wichtig. Das ist darauf zurückzuführen, dass die Verbesserung der katalytischen Wirksamkeit zu einer Reduktion des verwendeten Enzyms führt, während die Verbesserung der Stabilität das Enzym unter Reaktionsbedingungen nutzbar macht, unter welchen das Wildtypenzym nicht verwendet werden konnte.
Jedoch ist bis jetzt von keinen Luciferasen berichtet worden, die exzellente Stabilität, wie z.B. Thermostabilität etc., und hohe katalytische Wirksamkeit aufweisen.
Offenbarung der Erfindung
Demzufolge ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, Luciferasen vom Mutanttyp bereitzustellen, die exzellente Stabilität und hohe katalytische Wirksamkeit bereitstellen. Als Ergebnis ihres eifrigen Studiums zur Erreichung des oben beschriebenen Ziels stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung fest, dass Mutant-Typ-Luciferasen mit Verbesserungen der katalytischen Wirksamkeit und/oder Thermostabilität durch das Ersetzen, Alternieren, Entfernen und die Addition von zumindest einer Aminosäure und Fusion einer Vielzahl von Luciferasen erhalten werden.
Das heißt, die vorliegende Erfindung umfasst ein biolumineszierendes Protein, das Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität aufweist und eine Mutation an einem Aminosäurerest besitzt, welcher der Position 219 von Genji-Glühwürmchen-(Luciolia-cruciata-) Luciferase entspricht.
Die Erfindung stellt weiters Folgendes bereit:

(1) Das biolumineszierende Protein mit Verbesserungen der katalytischen Wirksamkeit oder Stabilität.
(2) Biolumineszierendes Protein nach (1), worin die Verbesserungen zumindest eine von 5 Arten von Verbesserungen der Substratspezifität und maximalen Reaktionsgeschwindigkeit hinsichtlich der katalytischen Wirksamkeit und thermischen Stabilität, pH-Stabilität und Stabilität bei geringer ionenkonzentration hinsichtlich Stabilität umfassen.
(3) Biolumineszierendes Protein nach (1) oder (2), das eine Luciferase ist, die von Käfern (Coleoptera) abstammt.
(4) Biolumineszierendes Protein nach (1) oder (2), das eine Luciferase ist, die von Glühwürmchen abstammt.

Hierin ist Folgendes beschrieben:

(5) Verfahren zur Produktion des biolumineszierenden Proteins aus (1) oder (2), das Modifikationen eines biolumineszierenden Proteinvorläufers umfasst.
(6) Verfahren zur Produktion des biolumineszierenden Proteins aus (1) oder (2), worin die Modifikationen das Ersetzen, Alternieren, Entfernen und die Addition von zumindest einer Aminosäure und die Fusion einer Vielzahl von Proteinen umfassen.
(7) Biolumineszierendes Protein nach (1) oder (2), das eine Glühwürmchen-Luciferaseaktivität aufweist und eine Vielzahl von darin fusionierten Glühwürmchen-Luciferasen umfasst.
(8) Biolumineszierendes Protein nach (1) oder (2), das eine Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität aufweist und darin fusionierte Luciferasen des Genji-Glühwürmchens (Luciola cruciata) und des amerikanischen Glühwürmchens (Photinus pyralis) umfasst.
(9) Biolumineszierendes Protein nach (1) oder (2), das Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität aufweist und darin fusionierte Luciferasen des Heike-Glühwürmchens (Luciola lateralis) und amerikanischen Glühwürmchens (Photinus pyralis) umfasst.
(10) Biolumineszierendes Protein nach (1) oder (2), das Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität aufweist und darin fusionierte Luciferasen des Genji-Glühwürmchens (Luciola cruciata) und Heike-Glühwürmchen (Luciola lateralis) umfasst.

Hierin ist ebenfalls Folgendes beschrieben:

(i) Biolumineszierendes Protein, das Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität aufweist und eine Mutation an einem Aminosäurerest besitzt, welcher der Position 239 von Luciola-cruciata-Luciferase entspricht.
(ii) Biolumineszierendes Protein, das Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität aufweist und eine Mutation an einem Aminosäurerest besitzt, welcher der Position 290 der Luciola-cruciata-Luciferase entspricht.

Hierin nachstehend ist die Erfindung detailliert beschrieben. Der Ausdruck „Luciferase mit Verbesserungen der pH-Stabilität" bezieht sich wie hierin verwendet auf das Enzym mit beliebigen der folgenden Eigenschaften: (1) mit einem erweiterten pH-Bereich, in welchem verglichen mit der herkömmlichen Luciferase 80 % oder mehr Restaktivität aufrechterhalten wird, (2) mit im Vergleich zur herkömmlichen Luciferase erhöhter Restaktivität in einem spezifischen pH-Puffer, (3) mit 75 % oder mehr Restaktivität nach Behandlung in 100 mM Acetatpuffer (pH 5,5) bei 25 °C über einen Zeitraum von 22 Stunden und (4) mit 10 % oder mehr Restaktivität nach Behandlung in 100 mM CHES-Puffer (pH 9,0) bei 25 °C über einen Zeitraum von 22 Stunden.
Zur Bereitstellung von Luciferase mit Verbesserungen der katalytischen Wirksamkeit oder Stabilität durch Modifikation eines Gens in der vorliegenden Erfindung ist es notwendig, ein Wildtyp-Luciferase-Gen und seine rekombinante DNA herzustellen.
Das Wildtyp-Luciferase-Gen kann ein beliebiges Gen sein, das von Käfern (Coleoptera) abstammt, und umfasst z.B. Gene, die vom Genji-Glühwürmchen (Luciola cruciata), Heike-Glühwürmchen (Luciola lateralis), dem nordamerikanischen Glühwürmchen (Photinus pyralis), osteuropäischen Glühwürmchen (Luciola mingrelica), dem Tuchi-Glühwürmchen (Lampyris noctiluca) etc. abstammen.
Das Wildtyp-Luciferase-Gen, das von Luciola cruciata abstammt, und seine rekombinante DNA können mithilfe eines in z.B. den offengelegten japanischen Patentveröf fentlichungen Nr. 34289/1989 und 51086/1989 beschriebenen Verfahrens erhalten werden, und das von Luciola lateralis abstammende Wildtyp-Luciferase-Gen und seine rekombinante DNA können durch ein Verfahren erhalten werden, das z.B. in den offengelegten japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 13379/1990 und 65780/1990 beschrieben ist.
Dann wird ein resultierendes Wildtyp-Coleoptera-Luciferase-Gen modifiziert, um ein Luciferase-Gen vom Mutanttyp zu ergeben. In dieser Modifikation kann das Coleoptera-Luciferase-Gen als solches modifiziert werden, oder das Gen wird in Vektor-DNA, wie z.B. Plasmidvektor-, Bakteriophagenvektor-DNA etc., integriert, und die resultierende rekombinante DNA kann modifiziert werden. Durch diese modifizierten Luciferase-Gene werden die Luciferasen vom Mutanttyp, in welchen zumindest eine Aminosäure der Coleoptera-Luciferase ersetzt, geändert, entfernt oder hinzugefügt worden ist und eine Vielzahl von Coleoptera-Luciferasen darin fusioniert worden ist, hergestellt.
Erstens kann das Ersetzen, Alternieren, Entfernen und die Addition von zumindest einer Aminosäure in der Coleoptera-Luciferase unter Einsatz einer Vielzahl von Verfahren durchgeführt werden, z.B. durch Kontaktieren des Coleoptera-Luciferase-Gens oder seiner rekombinanten DNA mit Chemikalien als Mutagen, Bestrahlung mit UV-Licht, gentechnologische Mittel oder Mittel zur gentechnischen Änderungen von Proteinen.
Die Chemikalien, die als das Mutagen in Mutagenese verwendet werden, umfassen z.B. Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), Nitrit, Sulfit, Hydrazin, Ameisensäure, 5-Bromuracil etc. Die Bedingungen zum Kontaktieren der Chemikalien können abhängig von z.B. der Art der verwendeten Chemikalien variieren und sind insofern nicht beschränkt, als dass die gewünschte Mutation im Wildtyp-Luciferase-Gen tatsächlich induziert werden kann. Für gewöhnlich kann die gewünschte Mutation durch Kontaktieren des Gens mit den Chemikalien, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5 bis 12 M bei einer Reaktionstemperatur von 20 bis 80 °C 10 Minuten lang oder länger, bevorzugt 10 bis 180 Minuten, induziert werden. Zur Bestrahlung mit UV-Licht können wie zuvor beschrieben herkömmliche Verfahren eingesetzt werden [„Gendai Kagaku" (Modern Chemistry), 24–30 (Juni 1989)].
Als Verfahren zur Verwendung von gentechnologischer Proteinherstellung kann im Allgemeinen ein Verfahren verwendet werden, das als ortsspezifische Mutagenese bekannt ist. Beispiele sind das Kramer-Verfahren [W. Kramen et al., Nucl. Acids Res. 12, 9441–9456 (1984); W. Kramen et al., Methods in Enzymol. 154, 350–367 (1987); C.E. Bauer et al., Gene 37, 73–81 (1985)], das Eckstein-Verfahren [J.W. Taylor et al., Nucleic Acids Res. 13, 8749–8764 (1985); J.W. Taylor et al., Nucleic Acids Res. 13, 8765–8785 (1985); K. Nakamaye et al., Nucleic Acids Res. 14, 9679–9698 (1986)] und das Kunkel-Verfahren [T.A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 488–492 (1985); T.A. Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367–382 (1987)].
Die Fusion einer Vielzahl von Coleoptera-Luciferasen kann mithilfe der folgenden Verfahren durchgeführt werden: ein Verfahren, das die Einführung (einer) gewünschten/r Restriktionsenzymstelle(n) in eines oder mehrere Luciferasegene mittels ortsspezifischer Mutagenese, dann Spaltung dieser mit einem geeigneten Restriktionsenzym und Bindung der resultierenden Fragmente aus einer Vielzahl von Luciferase-Genen umfasst; ein Verfahren, das die Herstellung eines oder mehrerer Luciferase-Genfragmente durch Polymerasekettenreaktion mit spezifischen Primern und Bindung dieser umfasst; und das DNA-Neukombinationsverfahren [P. Willem und C. Stemmer, 370, 389–391 (1994)].
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Genmodifikationsverfahren können organische Synthese- oder Enzymsyntheseverfahren zur direkten Synthese des gewünschten modifizierten Luciferase-Gens verwendet werden. Die Nucleotidsequenz des gewünschten Luciferase-Gens, das durch die obigen Verfahren erhalten wird, kann unter Einsatz der chemischen Modifikationsverfahren von Maxam-Gilbert [Maxam und Gilbert, Methods in Enzymol. 65, 499–560 (1980)], das Didesoxynucleotidkettenterminationsverfahren unter Einsatz eines M13-Phagen [Messing et al., Gene 19, 269–276 (1982)] etc. bestimmt und nachgewiesen werden. Natürlich kann die gewünschte Luciferase unter Einsatz einer Kombination von Ersetzen, Abwechseln, Entfernen und Hinzufügen von zumindest einer Aminosäure und Fusion einer Vielzahl von Coleoptera-Luciferasen erhalten werden.
Durch diese Mutationsmittel kann das Luciferase-Gen vom Mutanttyp, das für chimäre Luciferase kodiert, d.h. die aus einer Vielzahl von Coleoptera-Luciferasen besteht, die darin fusioniert sind, sowie das Luciferase-Gen vom Mutanttyp, das für ein Polypeptid kodiert, das durch Mutationen in Aminosäureresten gekennzeichnet ist, die den Positionen 219, 239 und 290 von Luciferase von Luciola cruciata und Luciola lateralis entsprechen, erhalten werden. Die Mutationen der Aminosäuren an Positionen 219, 239 und 290 umfassen z.B. jene, die in Tabelle 4 dargestellt sind.
Zum Beispiel die Positionen 219, 239 und 290 von Luciferase von Luciola cruciata und Luciola lateralis, die 217-Val, 237-Ile und 288-Val von Luciferase von Photinus pyralis entsprechen.
Das Luciferase-Gen vom Mutanttyp, das auf die oben beschriebene Art und Weise erhalten wird, wird auf eine gewöhnliche Art und Weise in die Vektoren, wie z.B. Bakteriophage, Cosmid oder Plasmid, eingeführt, die zur Transformation von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen verwendet werden, und diese Vektoren können verwendet werden, um Wirte zu transformieren oder zu transduzieren, die damit kompatibel sind. Die hierin verwendeten Wirte umfassen Mikroorganismen, die der Gattung Escherichia angehören, z.B. E. coli JM101 (ATCC33876), E. coli DH1 (ATCC33849), E. coli HB101 (ATCC33694), E. coli XL1-blue (käuflich von Funakoshi K.K. bezogen) etc., und wenn diese Mikroorganismen ausgewählt sind, werden sie mithilfe des Hana-han-Verfahrens [DNA cloning 1, 109–135 (1985)] etc. transformiert oder mithilfe jenes Verfahrens transduziert, das in Molecular Cloning, 256–268, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), etc. beschrieben ist, sodass transformierte oder transduzierte Mikroorganismen erhalten werden können.
Der resultierende Stamm wird auf einen Stamm gescreent, der über die Fähigkeit verfügt, die Luciferase vom Mutanttyp zu produzieren, wodurch der gewünschte transformierte oder transduzierte Mikroorganismus, d.h. der Stamm mit der Fähigkeit, die Luciferase vom Mutanttyp durch rekombinante DNA zu produzieren, die über das Luciferase-Gen vom Mutanttyp verfügt, das in Vektor-DNA eingeführt ist, erhalten werden kann. Zur Reinigung der neuen rekombinanten DNA aus dem so erhaltenen Stamm kann Current Protocols in Molecular Biology [Wiley Interscience, Kapitel 1.7 (1989)] usw. verwendet werden. Aus der so erhaltenen rekombinanten DNA kann DNA, die das Luciferase-Gen vom Mutanttyp enthält, z.B. dadurch erhalten werden, dass einem Restriktionsenzym, wie z.B. EcoRI, ermöglicht wird, bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C, vorzugsweise etwa 37 °C, 1 bis 24 Stunden lang, vorzugsweise etwa 2 Stunden, auf die Plasmid-DNA einzuwirken und die Reaktionslösung einer Agarose-Gel-Elektrophorese [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 150 (1982)] unterworfen wird.
Dann ist das Verfahren zur Produktion der Luciferase vom Mutanttyp der vorliegenden Erfindung beschrieben. Die Luciferase vom Mutanttyp der vorliegenden Erfindung wird durch Kultivieren des so erhaltenen transformierten oder transduzierten Mikroorganismus und anschließendes Reinigen der Luciferase aus der resultierenden Kultur erhalten. Obwohl der Mikroorganismus in einem herkömmlichen festen Medium kultiviert werden kann, ist es bevorzugt, ein flüssiges Medium zum Kultivieren zu verwenden.
Das Medium zur Verwendung zum Kultivieren des obigen Stamms umfasst jene, die zumindest ein anorganisches Salz, wie z.B. Natriumchlorid, Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Eisen(III)-chlorid, Eisen(III)-sulfat, Mangansulfat etc., enthalten, die zu zumindest einer Stickstoffquelle, wie z.B. Hefeextrakt, Trypton, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Exsudat von Sojabohnen oder Weizenkleie etc., zugegeben werden, und wenn notwendig kann eine geeignete Menge von Zuckern (oder Kohlenhydraten), Vitaminen etc. dazu hinzugefügt werden.
Der anfängliche pH des Mediums wird vorzugsweise so angepasst, dass er zwischen pH 7 und 9 liegt. Der Mikroorganismus wird bei 30 bis 42 °C kultiviert, vorzugsweise etwa 37 °C, 4 bis 24 Stunden lang, vorzugsweise 6 bis 20 Stunden, vorzugsweise unter Einsatz einer Submersbelüftungskultur, Schüttelkultur oder stationären Kultur. Zur Gewinnung der Luciferase vom Mutanttyp aus der Kultur können herkömmliche Enzymreinigungsmittel verwendet werden. Zum Beispiel wird der Mikroorganismus auf übliche Art und Weise durch Ultraschallbehandlung oder Zermahlen zerstört, oder das vorliegende Enzym wird mit einem lytischen Enzym, wie z.B. Lysozym etc., extrahiert, oder der Mikroorganismus wird in Gegenwart von Toluol autolysiert, optional unter Schütteln, um das vorliegende Enzym daraus freizusetzen.
Dann wird diese Lösung filtriert, zentrifugiert etc., um unlösliche Stoffe zu entfernen, und wenn notwendig wird Nucleinsäure durch Zugabe von Streptomycinsulfat, Protaminsulfat, Mangansulfat etc. entfernt. Die Lösung wird dann mit Ammoniumsulfat, Alkohol, Aceton etc. fraktioniert, und das Präzipitat wird gewonnen, wodurch eine rohe Enzymlösung erhalten wird. Die rohe Enzymlösung wird verschiedenen Formen von Chromatographie, Elektrophorese etc. unterworfen, um eine gereinigte Enzymformulierung zu ergeben. Zum Beispiel können Verfahren, wie z.B. Gelfiltration unter Einsatz von Sephadex, Ultrogel, Bio-Gel etc., Adsorption-Elution unter Einsatz von Ionenaustauschern, Elektrophorese unter Einsatz von Polyacrylamidgel etc., Adsorptionselution unter Einsatz von Hydroxyapatit, Sedimentation, wie z.B. Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation etc., Affinitätschromatographie und Fraktionierung unter Einsatz von Molekularsiebmembran, Hohlfasermembran etc. geeignet ausgewählt oder kombiniert werden, um die gereinigte Enzymformulierung zu ergeben.
Ob die gereinigte Luciferase vom Mutanttyp die Aminosäuresequenz mit der gewünschten Mutation aufweist oder nicht, kann mithilfe herkömmlicher Aminosäureanalyse, wie z.B. automatischer Aminosäuresequenzierung durch Edman-Abbau etc., bestimmt werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Restaktivität der gereinigten Formulierung (HLKI-Luciferase) nach Behandlung in verschiedenen Puffern im Vergleich zu jener vom Wildtyp.
Der beste Modus zur Durchführung der Erfindung
Hierin nachstehend ist die vorliegende Erfindung unter Verweis auf die Beispiele detaillierter beschrieben.
Beispiel 1
10 μg Plasmid pT3/T7-LUC (von Clontech erhalten) zur Expression von Luciferase, die von einem amerikanischen Glühwürmchen (Photinus pyralis) abstammte, wurden zu 50 μl Restriktionsenzympuffer K [20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM MgCl₂, 100 mM KCl, 1 mM Dithiothreit] zugegeben und dann mit 20 U jedes der Restriktionsenzyme SphI und SmaI (Takara Shuzo Co., Ltd.) bei 37 °C 2 Stunden lang gespalten. Diese Reaktionslösung wurde einer Gelelektrophorese mit 0,8 % niedrigschmelzendem Agarose-Gel unterworfen, und es wurde ein Gel, das ein etwa 1,1-kb-DNA-Fragment enthielt, welches einen C-terminalen Abschnitt eines Luciferase-Gens enthielt, das von Photinus pyralis abstammte, abgeschnitten und dann durch 5-minütige Erwärmung auf 65 °C geschmolzen. Zu dem geschmolzenen Gel wurde ein zweifaches Volumen von TE-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA] zugegeben, und nachdem ein gleich großes Volumen von Phenol, das mit TE-Puffer gesättigt war, dazu gegeben wurde, wurde das Gemisch gerührt. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 12.000 U/min wurde die wässrige Phase gewonnen und dann mit einem zweifachen Volumen von kaltem Ethanol präzipitiert, um das DNA-Fragment zu gewinnen, das den C-terminalen Abschnitt des Luciferase-Gens enthielt, das von Photinus pyralis abstammte.
Getrennt davon wurden synthetische DNAs (Seq.-ID Nr. 1, CTC TAG CAT GCG AAA ATC TAG; Seq.-ID Nr. 2, CTG CAG GCC TGC AAG CTT GG) [unter Einsatz eines System-1-Plus-DNA-Synthesegeräts, Beckman, hergestellt] zur Expression von Luciferase, die vom Genji-Glühwürmchen (Luciola cruciata) abstammt, zu Plasmid pGLf37 zugegeben (in der japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 244.942/1993 beschrieben), und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde wie folgt durchgeführt.
50 μl PCR-Reaktionslösung enthielten 20 μg Plasmid pGLf37, 50 pmol jede der synthetischen DNAs, 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 6 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM KCl, 2,5 mM MgSO₄, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 mM jedes von dATP, dGTP, dCTP und dTTP und 2,5 U von KOD-DNA-Polymerase (Toyoba Co., Ltd.). Dieses Gemisch wurde 25 Zyklen von PCR unterworfen, wobei jeder Zyklus aus Inkubation bei 98 °C 15 Sekunden lang, 65 °C 2 Sekunden lang und 74 °C 30 Sekunden lang im Perkin-Elmer-Thermozyklierer PJ2000 bestand. Zum Reaktionsgemisch wurde ein gleich großes Volumen von Phenol zugegeben, das mit TE-Puffer gesättigt war, und das Gemisch wurde gerührt. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 12.000 U/min wurde die wässrige Phase gewonnen und dann mit einem zweifachen Volumen von kaltem Ethanol präzipitiert, um das DNA-Fragment zu gewinnen. Es wurde wieder in TE-Puffer gelöst, dann mit SPh1 gespalten und Elektrophorese mit niedrigschmelzendem Agarose-Gel unterworfen, um ein etwa 3,4-kb-DNA-Fragment zu gewinnen, das einen N-terminalen Abschnitt des Luciferase-Gens enthielt, das von Luciola cruciata abstammte.
50 ng des obigen SphI-SmaI-Fragments von pT3/T7-LUC und 50 ng des obigen SphI-gespaltenen Fragments von pGLf37 wurden bei 15 °C 16 Stunden lang in 20 μl DNA-Ligasepuffer in Gegenwart von 300 U von T4-DNA-Ligase inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli JM109 (Toyobo Co., Ltd.) mithilfe des Hana-han-Verfahrens (DNA Cloning 1, 109–135 (1985)] zu transformieren, und es wurden ampicillinresistente Kolonien ausgewählt.
Ein Plasmid wurde mithilfe des Alkali-SDS-Verfahrens aus den gebildeten Kolonien entfernt, und es wurde die Struktur des Plasmids nachgewiesen. Dieses Plasmid wurde mit einem Dye-Primer-Taq-Sequenzierungsset (Applied Biosystems) einer Reaktion unterworfen und durch Elektrophorese mit einem ABI-373A-DNA-Sequenzierer (Applied Biosystems) analysiert, um seine Nucleotidsequenz zu bestimmen. Die bestimmte Nucleotidsequenz ist in Seq.-ID Nr. 6 dargestellt, und die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das aus der Nucleotidsequenz translatiert wurde, ist in Seq.-ID Nr. 5 dargestellt. Das so erhaltene Plasmid wurde pGA1 genannt.
Plasmid pGA1 wurde dazu verwendet, E. coli JM109 auf die oben beschriebene Art und Weise zu transformieren, um E. coli JM109 (pGA1) zu ergeben. E. coli JM109 (pGA1) wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, als FERM BP-5990 hinterlegt.
E. coli JM109 (pGA1) wurde auf einer LB-amp-Agarplatte inokuliert [1 % (Gew./Vol.) Bactotrypton, 0,5 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 0,5 % (Gew./Vol.) NaCl, (50 μg/ml) Ampicillin und 1,4 % (Gew./Vol.) Agar] und bei 37 °C kultiviert. Die Koloniemikroorganismen, die 16 Stunden danach erschienen, wurden in 10 ml eines LB-amp-Mediums inokuliert [1 % (Gew./Vol.) Bactotrypton, 0,5 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 0,5 % (Gew./Vol.) NaCl und (50 μg/ml) Ampicillin] und bei 37 °C 18 Stunden lang unter Schütteln kultiviert. Diese Kultur, 10 ml, wurde zu 2 l des obigen LB-amp-Mediums inokuliert und bei 30 °C 6 Stunden lang unter Schütteln kultiviert und dann bei 8.000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert, um 30 g nasse Mikrobenpellets zu ergeben. Der gewonnene Mikroorganismus wurde in 20 ml Puffer suspendiert, der aus 0,1 M KH₂PO₄ (pH 7,8), 2 mM EDTA, 1 mM Dithiothreit und 0,2 mg/ml Protaminsulfat bestand, und 2 ml von 10 mg/ml Lysozymlösung wurden weiters hinzugefügt, und das Gemisch wurde auf Eis 15 Minuten lang stehen gelassen.
Dann wurde diese Suspension in einem Ethanol/Trockeneisbad gefroren und dann bei einer Temperatur von 25 °C stehen gelassen, bis es vollständig aufgetaut war. Weiters wurde sie bei 12.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert, wodurch 20 ml rohes Enzym als Überstand erhalten wurden. Die so erhaltene rohe Enzymlösung wurde gemäß dem in der japanischen Patentoffenlegungsschrift 141592/1989 beschriebenen Verfahrens gereinigt, und das gereinigte Enzym wurde GA1-Luciferase genannt. Es wurde der Km-Wert dieser gereinigten Formulierung für das Substrat ATP bestimmt. Der Peak der Lichtemission, die durch die Verwendung des Enzyms mit der Konzentration von ATP zwischen 0 und 2 mM in einer Lösung, die 50 mM HEPES (pH 7,5), 0,2 mM Luciferin und 10 mM MgSO₄ enthielt, erzeugt wurde, wurde in einem Luminometer ML3000 (Dynatech) gemessen, und das Ergebnis ist in Tabelle 1 nachstehend dargestellt. Die so bestimmte Affinität der GA1-Luciferase für ATP war etwa 5,73-mal höher als die der Wildtyp-Photinus-pyralis-Luciferase und etwa 11,4-mal höher als die der Wildtyp-Luciola-cruciata-Luciferase. Diese Verbesserung der Affinität der GA1-Luciferase für ATP im Vergleich zu jener der Wildtypluciferasen zeigte, dass die GA1-Luciferase ein höchst nützliches Enzym ist. Tabelle 1
Beispiel 2
10 μg Plasmid pT3/T7-LUC (von Clontech erhalten) zur Expression von Luciferase, die vom amerikanischen Glühwürmchen abstammt (Photinus pyralis), wurden zu 50 μl Puffer N [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 100 mM NACl, 1 mM Dithiothreit] hinzugegeben und dann mit 20 U jedes der Restriktionsenzyme EcoRV und SalI (Takara Shuzo Co., Ltd.) bei 37 °C 2 Stunden lang gespalten. Diese Reaktionslösung wurde Elektrophorese mit 0,8 % niedrigschmelzendem Agarose-Gel unterworfen, und ein Gel, das ein etwa 0,5-kb-DNA-Fragment enthält, das einen C-terminalen Abschnitt eines Luciferase-Gens enthält, der von Photinus pyralis abstammte, wurde abgeschnitten und dann durch 5-minütige Erwärmung auf 65 °C geschmolzen. Zum geschmolzenen Gel wurde eine doppeltes Volumen von TE-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA] hinzugefügt, und nachdem ein gleich großes Volumen von Phenol, das mit dem TE-Puffer gesättigt war, zugegeben worden war, wurde das Gemisch gerührt. Nach Zentrifguation (12.000 U/min, 15 Minuten lang) wurde die wässrige Phase gewonnen und dann mit einem doppelten Volumen von kaltem Ethanol präzipitiert, um ein DNA-Fragment zu gewinnen, das eine Region enthielt, die für den C-Terminus von Luciferase von Photinus pyralis kodierte.
Getrennt davon wurden synthetische DNAs (Seq.-ID Nr. 3, ATC CTT TGT ATT TGA TTA AAG; Seq.-ID Nr. 4, TCT AGA GTC GAC CTG CAG GC) (mit dem System-1-Plus-DNA-Synthesegerät, Beckman, hergestellt] zur Expression von thermostabiler Luciferase, die vom Genji-Glühwürmchen (Luciola cruciata) abstammte, zu Plasmid pGLf37 T-M-2 zugegeben (in der japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 244.942/1993 beschrieben), und es wurde wie folgt Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt. 50 μl PCR-Reaktionslösung enthielten 20 μg Plasmid pGLf37 T-M-2, 50 pmol jeder der synthetischen DNAs, 120 mM Tris-HCl (pH 8,0), 6 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM KCl, 2,5 mM MgSO₄, 0,1 % Triton X-100, 0,001 % BSA, 0,2 M jedes dATP, dGTP, dCTP und dTTP und 2,5 U von KOD-DNA-Polymerase (Toyobo Co., Ltd.). Dieses Gemisch wurde 25 PCR-Zyklen unterworfen, wobei jeder Zyklus aus Inkubation bei 98°C 15 Sekunden lang, 65 °C 2 Sekunden lang und 74 °C 30 Sekunden lang in Perkin-Elmer-Thermozyklierer PJ2000 bestand. Zum Reaktionsgemisch wurde ein gleich großes Volumen Phenol zugegeben, das mit TE-Puffer gesättigt war, und das Gemisch wurde gerührt. Nach Zentrifugation (12.000 U/min 15 Minuten lang) wurde die wässrige Phase gewonnen und dann mit einem doppelten Volumen von kaltem Ethanol präzipitiert, um das DNA-Fragment zu gewinnen. Es wurde wieder in TE-Puffer gelöst, dann mit SalI gespalten und Elektrophorese mit niedrigschmelzendem Agarose-Gel unterworfen, um ein DNA-Fragment zu gewinnen, das eine Region enthielt, die für den N-Terminus von Luciferase kodierte, die von Luciola cruciata abstammte. In dieser Region war eine thermostabile Mutation enthalten (Thr217Ile), die von pGLf37 T-M-2 abgeleitet war.
50 ng des obigen etwa 0,5-kbp-EcoRV-SalI-Fragments, das von pT3/T7-LUC abstammte, und 50 ng des obigen etwa 4-kbp-SalI-gespaltenen Fragments, das von pGLf37 T-M-2 abstammte, wurden bei 15 °C 16 Stunden lang in 20 μl DNA-Ligasepuffer in Gegenwart von 300 U T4-DNA-Ligase inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde dazu verwendet, E. coli JM109 (Toyobo Co. Ltd.) mithilfe des Hana-han-Verfahrens [DNA Cloning 1, 109–135 (1985)] zu transformieren, und es wurden ampicillinresistente Kolonien ausgewählt.
Ein Plasmid wurde mithilfe des Alkali-SDS-Verfahrens aus den gebildeten Kolonien entfernt. Dieses Plasmid wurde einer Reaktion mit einem Dye-Primer-Taq-Sequenzierungsset (Applied Biosystems) unterworfen und durch Elektrophorese mit einem ABI-373A-DNA-Sequenzierer (Applied Biosystems) analysiert, um seine Nucleotidsequenz zu bestimmen. Die bestimmte Nucleotidsequenz ist in Seq.-ID Nr. 8 dargestellt, und die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das aus der Nucleotidsequenz translatiert wurde, ist in Seq.-ID Nr. 7 dargestellt. Das so erhaltene Plasmid wurde pGGA1 genannt.
Plasmid pGGA1 wurde dazu verwendet, E. coli JM109 auf die oben beschriebene Art und Weise zu transformieren, um E. coli JM109 (pGGA1) zu ergeben. E. coli JM109 (pGGA1) wurde als FERM BP-5989 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt.
E. coli JM109 (pGGA1) wurde auf einer LB-amp-Agarplatte inokuliert [1 % (Gew./Vol.) Bactotrypton, 0,5 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 0,5 % (Gew./Vol.) NaCl, (50 μg/ml) Ampicillin und 1,4 % (Gew./Vol.) Agar] und bei 37 °C kultiviert. Die Kolonien, die 16 Stunden danach erschienen, wurden bei 37 °C 18 Stunden lang unter Schütteln in 10 ml eines LB-amp-Mediums [1 % (Gew./Vol.) Bactotrypton, 0,5 % (Gew./Vol) Hefeextrakt, 0,5 % (Gew./Vol.) NaCl und (50 μg/ml) Ampicillin] kultiviert. Diese Kultur, 10 ml, wurde zu 2 l des obigen LB-amp-Mediums inokuliert und bei 30 °C 6 Stunden lang unter Schütteln kultiviert und dann bei 8000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert, um 30 g eines nassen Mikrobenpellets zu ergeben. Der gewonnene Mikroorganismus wurde in 20 ml Puffer suspendiert, der aus 0,1 M KH₂PO₄ (pH 7,8), 2 mM EDTA, 1 mM Dithiothreit und 0,2 mg/ml Protaminsulfat bestand, und 2 ml von 10 mg/ml Lysozymlösung wurden dazu hinzugefügt, und das Gemisch wurde auf Eis 15 Minuten lang stehen gelassen. Dann wurde diese Suspension in einem Ethanol/Trockeneisbad gefroren und dann bei einer Temperatur von 25 °C stehen gelassen, bis es vollständig aufgetaut war. Weiters wurde es bei 12.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert, wodurch 20 ml des rohen Enzyms als Überstand erhalten wurden. Die so erhaltene rohe Enzymlösung wurde gemäß dem in der japanischen Patentof fenlegungsschrift 141592/1989 beschrieben Verfahren gereinigt, und das gereinigte Enzym wurde GGA1-Luciferase genannt.
Es wurde der Km-Wert dieses gereinigten GGA1-Enzyms für das Substrat ATP bestimmt (Tabelle 2). Das Ergebnis zeigte, dass die Affinität der GGA1-Luciferase für ATP etwa 1,46-mal höher war als die der Wildtyp-Photinus-Pyralis-Luciferase und etwa 2,89-mal höher als die der Wildtyp-Luciola-cruciata-Luciferase. Diese Verbesserung der Affinität der GGA1-Luciferase für ATP im Vergleich zu jener der Wildtypluciferase zeigt, dass die GGA1-Luciferase ein sehr nützliches Enzym ist. Tabelle 2
Dieses gereinigte Enzym wurde auf thermische Stabilität untersucht, wobei die verbleibende Aktivität nach Behandlung bei 50 °C in 0,05 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,8) mit 10 % Ammoniumsulfatsättigung bestimmt wurde. Das Ergebnis zeigte, dass dieses Enzym 80 % oder mehr der ursprünglichen Aktivität beibehielt, sogar nach 20-minütiger Behandlung bei 50 °C, und es wurde daher festgestellt, dass die thermische Stabilität dieses Enzyms sich im Vergleich zu jener der Wildtyp-Photinus-pyralis-Luciferase und der thermostabilen Luciola-cruciata-Luciferase verbessert hat.
Beispiel 3
10 μg Plasmid pT3/T7-LUC (von Clontech bezogen) zur Expression von Luciferase, die vom amerikanischen Glühwürmchen (Photinus pyralis) abstammte, wurde zu 50 μl Restriktionsenzympuffer N [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM Dithiothreit] zugegeben und dann mit 20 U Restriktionsenzym EcoRV (Takara Shuzo Co., Ltd.) bei 37 °C 2 Stunden lang gespalten. Diese Reaktionslösung wurde Elektrophorese mit 0,8 % niedrigschmelzendem Agarose-Gel unterworfen, und ein Gel, das ein etwa 500-bp-DNA-Fragment enthielt, das eine Region enthielt, die für den C-Terminus der Luciferase aus Photinus pyralis kodierte, wurde abgeschnitten und dann durch 5-minütiges Erwärmen auf 65 °C geschmolzen. Zum geschmolzenen Gel wurde ein doppeltes Volumen des TE-Puffers [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA] zugegeben, und nachdem ein gleich großes Volumen von Phenol zugegeben worden war, das mit TE-Puffer gesättigt war, wurde das Gemisch gerührt. Nach Zentrifugation (12.000 U/min, 15 Minuten lang) wurde die wässrige Phase gewonnen und dann mit einem doppelten Volumen von kaltem Ethanol präzipitiert, um das DNA-Fragment zu gewinnen, das eine Region enthielt, die für den C-Terminus der Photinus-pyralis-Luciferase kodierte.
Getrennt davon wurden 10 μg Plasmid pHLf7-217Leu (japanische Patentanmeldungsoffenlegungsschrift Nr. 244942/93) zur Expression von Luciferase, die vom Heike-Glühwürmchen (Luciola lateralis) abstammte, zu 50 μl Restriktionsenzympuffer T [33 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,5 mM Dithiothreit] zugegeben und dann mit 20 U jedes der Restriktionsenzyme EcoRV und Nael (Takara Shuzo Co., Ltd.) bei 37 °C 2 Stunden lang gespalten. Diese Reaktionslösung wurde Elektrophorese mit 0,8 % niedrigschmelzendem Agarose-Gel unterworfen, und ein Gel, das ein etwa 4,3-kbp-DNA-Fragment enthielt, das den N-Terminus der Luciferase aus Luciola Lateralis enthielt, wurde abgeschnitten und dann durch 5-minütige Erwärmung auf 65 °C geschmolzen. Zum geschmolzenen Gel wurde ein doppeltes Volumen von TE-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM EDTA] zugegeben, und nachdem ein gleich großes Volumen Phenol, das mit TE-Puffer gesättigt war, zugegeben worden war, wurde das Gemisch gerührt. Nach Zentrifugation (12.000 U/min, 15 Minuten lang) wurde die wässrige Phase gewonnen und dann mit einem doppelten Volumen von kaltem Ethanol präzipitiert, um das DNA-Fragment zu gewinnen, das eine Region enthielt, die für den N-Terminus der Luciola-lateralis-Luciferase kodierte.
50 ng des obigen EcoRV-EcoRV-Fragments von pT3/T7/LUC und 50 ng des obigen EcoRV-Nael-Fragments von pHLf7-217Leu wurden bei 15 °C 16 Stunden lang in 20 μl DNA-Ligasepuffer in Gegenwart von 300 U T4-DNA-Ligase inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde dazu verwendet, E. coli JM109 mithilfe des Hana-han-Verfahrens [DNA Cloning 1, 109–135 (1985)] zu transformieren, und es wurden ampicillinresistente Kolonien ausgewählt. Ein rohes Enzym wurde aus den ausgewählten Kolonien im Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt, und ein Plasmid wurde durch das Alkali-SDS-Verfahren aus jenen entfernt, die Lumineszenzaktivität aufweisen, und die Struktur des Plasmids wurde nachgewiesen. Dieses Plasmid wurde einer Reaktion mit einem Dye-Primer-Taq-Sequenzierungsset (Applied Biosystems) unterworfen und durch Elektrophorese mit einem ABI-373A-DNA-Sequenzierer (Applied Biosystems) analysiert, um seine Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 9) zu bestimmen. Die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das aus der Nucleotidsequenz translatiert werden soll, ist in Seq.-ID Nr. 10 dargestellt. Das so gewonnene Plasmid wurde pHHA1 genannt.
Plasmid pHHA1 wurde dazu verwendet, E. coli JM109 im obigen Verfahren zu transformieren, um E. coli JM109 (pHHA1) zu ergeben. Das E. coli JM109 (pHHA1) ist als FERM BP-6203 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt worden.
Weiters wurde seine rohe Enzymlösung unter Einsatz des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens hergestellt, und das Enzym wurde in einem in der japanischen Patentanmeldungsoffenlegungsschrift Nr. 141592/89 beschriebenen Verfahren gereinigt. Das gereinigte Enzym wurde HHA1-Luciferase genannt. Es wurde die Affinität von HHA1-Luciferase für das Substrat ATP bestimmt. Der Peak der Emission von Licht, die durch die Verwendung des Enzyms mit der Konzentration von ATP zwischen 0 und 2 mM in einer Lösung, die 50 mM Tricinpuffer (pH 7,8), 0,2 mM Luciferin und 10 mM MgSO₄ enthielt, erzeugt wurde, wurde in einem Luminometer ML3000 (Dynatech) gemessen. So wurde die Affinität (Km-Wert) der HHA1-Luciferase für ATP bestimmt (Tabelle 3). Die Affinität der HHA1-Luciferase für ATP wurde im Ver gleich zu jenen von Photinus-pyralis- und Luciola-lateralis-Luciferasen verbessert, was zeigte, dass die HHA1-Luciferase ein höchst nützliches Enzym ist. Tabelle 3
Beispiel 4
Zur Einführung einer willkürlichen Mutation in das Luciferase-Gen wurde in Beispiel 2 beschriebenes Plasmid pGGA1 bei 65 °C 2 Stunden lang in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,0), der 0,8 M Hydroxylamin und 1 mM EDTA enthielt, gemäß dem Verfahren von Kironde et al. [Biochem. J. 259, 421–426 (1989)] behandelt. Das Plasmid, das so Mutagenese unterworfen worden ist, wurde durch Durchleiten durch eine G60-DNA-Grad-Nick-Säule (Pharmacia) entsalzt, und dann wurde E. coli JM109 mit diesem Plasmid transformiert.
Die resultierende Transformante wurde auf einer LB-amp-Platte inokuliert [1,0 % (Gew./Vol.) Bactotrypton, 0,5 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 0,5 % (Gew./Vol.) NaCl, 1,5 % (Gew./Vol.) Agar und 50 μg/ml Ampicillin] und bei 37 °C 12 Stunden lang kultiviert. Die resultierenden Kolonien wurden auf einen Nitrozellulosefilter transferiert, und der Filter wurde in 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 5,0) eingetaucht, der 0,5 mM Luciferin enthielt [Wood & DeLuca, Anal. Biochem. 161, 501–507 (1987)]. Die Emission von Licht aus den Kolonien wurde überwacht, und es konnten 3 Stämme mit erhöhter Emission erhalten werden. Diese Stämme wurden E. coli JM109 (pGGA2-1), E. coli JM109 (pGGA1-4) bzw. E. coli JM109 (pGGA2-4) genannt. Die so erhaltenen E. coli JM109 (pGGA2-1), E. coli JM109 (pGGA1-4) und E. coli JM109 (pGGA2-4) sind als FERM BP-6206, FERM BP-6205 bzw. FERM BP-6204 beim National Institute of Bi oscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt worden. Aus diesen Stämmen wurden mithilfe des Alkali-SDS-Verfahrens Plasmide wurden entfernt. Diese Plasmide wurden mit einem Dye-Primer-Taq-Sequenzierungsset (Applied Biosystems) einer Reaktion unterworfen und durch Elektrophorese mit einem ABI-373A-DNA-Sequenzierer (Applied Biosystems) analysiert, um ihre Mutationsstellen zu bestimmen (Tabelle 4). Tabelle 4
Aus E. coli JM109 (pGGA2-1), E. coli JM109 (pGGA1-4), E. coli JM109 (pGGA2-4), wurden ihre rohen Enzymlösungen durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren extrahiert, und diese mutierten Enzyme wurden im in der japanischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 141592/1989 beschriebenen Verfahren gereinigt. Die gereinigten Enzyme wurden GGA1-T219l-Luciferase, GGA1-V290l-Luciferase bzw. GGA1-V239l-Luciferase genannt. Diese Enzyme wurden aufgrund ihrer Wirksamkeit als Katalysatoren (V_max/Km) gegenüber Substrat ATP bestimmt. Die Lumineszenzreaktion wurde durch Mischung eines Substratgemischs, das ATP in einer Konzentration von 0 bis 1,0 × 10^–3 mM in 50 mM Tricinpuffer (pH 7,8), 2,0 mM Luciferin und 10 mM MgSO₄ enthielt, mit jedem Enzym durchgeführt. Die Emission von Licht 5 Sekunden bis 15 Sekunden nach Beginn der Reaktion wurde in Luminometer ML3000 (Dynatech) integriert, um die Wirksamkeit als Katalysator zu bestimmen (Vmax/Km). Wie in der Tabelle nachstehend beschrieben wurde nachgewiesen, dass im Vergleich zur GGA1-Luciferase die katalytische Wirksamkeit durch Mutation jeder der Aminosäuren an den 219-, 290- und 239-Positionen verbessert wurde.
Tabelle 5
Beispiel 5
Um eine mutierte Luciferase mit Verbesserungen der pH-Stabilität zu erhalten, wurde eine willkürliche Mutation in das Wildtyp-Luciferasegen eingeführt.
Zur Mutation wurde PCR in Gegenwart von 0,5 mM Mn²⁺ durchgeführt, von dem berichtet worden ist, dass es häufige Mutationen verursacht (A Journal of Methods in Cell and Molecular Biology, Band 1, Nr. 1, 11–15 (1989)), wo Plasmid pHLf7 zur Expression von Luciferase, die von Heike-Glühwürmchen (Luciola lateralis) abstammt (in der japanischen Patentanmeldungsoffenlegungsschrift Nr. 171189/90), als Matrize verwendet wurde und die in Seq.-ID Nr. 11 (AGAGATCCAA TTTATGGAAA C) und 12 (AGCGTGAGAA AATCTGATCA C) dargestellten Oligonucleotide als Primer verwendet wurden. Nach der Reaktion wurde die Reaktionslösung mit einem doppelten Volumen von kaltem Ethanol präzipitiert. Die resultierende DNA wurde wieder in TE-Puffer gelöst, 10 U von T4-Polynucleotidkinase (Takara Shuizo Co., Ltd.) in T4-Polynucleotidkinasepuffer wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37 °C 30 Minuten lang umgesetzt. Diese Reaktionslösung wurde dann Elektrophorese mit 0,8 % niedrigschmelzendem Agarose-Gel unterworfen, und ein Gel, das ein etwa 5-kbp-DNA-Fragment enthielt, wurde abgeschnitten und dann durch 5-minütiges Erwärmen auf 65 °C geschmolzen. Zum geschmolzenen Gel wurde ein doppeltes Volumen von TE-Puffer [10 mM Tris-HCL (pH 8,0), 0,5 mM EDTA] zugegeben, und nachdem ein gleich großes Volumen von Phenol, das mit TE-Puffer gesättigt war, dazugegeben worden war, wurde das Gemisch gerührt. Nach Zentrifugation (12.000 U/min, 15 Mi nuten lang) wurde die wässrige Phase gewonnen und dann mit einem doppelten Volumen von kaltem Ethanol präzipitiert, um das etwa 5-kbp-DNA-Fragment zu gewinnen. 50 ng des so gewonnenen etwa 5-kbp-DNA-Fragments wurden bei 15 °C 16 Stunden lang in 20 μl DNA-Ligasepuffer in Gegenwart von 10 U T4-DNA-Ligase (Toyobo) inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli JM 109 durch das Hana-han-Verfahren inkubiert [DNA Cloning 1, 109–135 (1985)], und ampicillinresistente Kolonien wurden auf einer LB + Amp-Platte selektiert [1,0 % (Gew./Vol.) Bactotrypton, 0,5 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt, 0,5 % (Gew./Vol.) NaCl, 1,4 % (Gew./Vol.) Bacto-Agar und 50 g/ml Ampicillin].
Die resultierenden Kolonien wurden in LB-Medium kultiviert, und ihr rohes Enzym wurde mithilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens hergestellt. Das rohe Enzym wurde in 100 mM Acetatpuffer (pH 5,5) bei 25 °C 22 Stunden lang behandelt, um einen Stamm mit der nicht gesenkten Aktivität zu screenen. Als Ergebnis wurde, im Gegensatz zum Wildtyp, der die Aktivität auf ein Ausmaß von etwa 70 % oder weniger verlor, ein Stamm, der kaum Aktivität verlor, erhalten. Ein Plasmid wurde mithilfe des Alkali-SDS-Verfahrens aus diesem Stamm entfernt, wobei das Plasmid mit einem Dye-Primer-Taq-Sequenzierungsset (Applied Biosystems) einer Reaktion unterworfen wurde, und durch Elektrophorese mit einem ABI-373A-DNA-Sequenzierer (Applied Biosystems) analysiert, um seine Nucleotidsequenz zu bestimmen (Seq.-ID Nr. 13). Die Aminosäuresequenz, die von dieser Nucleotidsequenz abgeleitet wurde, ist in Seq.-ID Nr. 14 dargestellt. Das so erhaltene Plasmid wurde pHLKI genannt.
Plasmid PHLKI wurde dazu verwendet, E. coli JM109 in dem oben beschriebenen Verfahren zu transformieren. Das resultierende E. coli J109 (pHLKI) ist als FERM BP-6347 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt worden.
Es wurde in LB-Medium kultiviert, seine rohe Enzymlösung wurde dann mithilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens hergestellt, und das Enzym wurde in dem in der japanischen Patentanmeldungsoffenlegungsschrift Nr. 141592/89 beschriebenen Verfahren gereinigt. Diese gereinigte Formulierung (HLKI-Luciferase) wurde in ver schiedenen Puffern bei 25 °C 22 Stunden lang behandelt und auf seine Restaktivität gemessen (1). Wie aus 1 ersichtlich ist, zeigt die resultierende HLK1-Luciferase eine höhere Restaktivität im breiten Bereich von pH 5,0 bis 10,0 als jene des Wildtypstamms. Als spezifisches Beispiel ist ihre Restaktivität in den Bereichen pH 5,0 bis 6,0 und pH 9,0 bis 10,0 in Tabelle 6 dargestellt.
In Tabelle 6 zeigte HLKI-Luciferase eine 2,5fache oder höhere Restaktivität in 100 mM Acetatpuffer, pH 5,0, im sauren Bereich als das Luciola-lateralis-Wildtypgegenstück. Weiters zeigte sie 6fache oder höhere Restaktivität in 100 mM Mes-Puffer, pH 5,5. Im alkalischen Bereich zeigte HLKI-Luciferase 2,5fache oder höhere Restaktivität in 100 mM CHES-Puffer, pH 9,0, bzw. 13fache oder höhere Restaktivität in 100 mM CHES-Puffer, pH 9,5, als das Luciola-lateralis-Wildtypgegenstück. Dieser Vergleich zwischen HLKI-Luciferase und dem Luciola-lateralis-Wildtypgegenstück bei der Restaktivität in Puffern bei spezifischen pH-Werten zeigt, dass die Restaktivität der HLKI-Luciferase erhöht ist.
Es versteht sich weiters, dass HLKI-Luciferase 80 % oder mehr Restaktivität im Bereich von pH 6,0–6,5 (100 mM Mes-Puffer) bis pH 9,0 (100 mM TAPS-Puffer) beibehält, im Gegensatz zum Luciola-lateralis-Wildtypgegenstück, das 80 % oder mehr Restaktivität im Bereich von pH 6,5 (100 mM Mes-Puffer) bis pH 8,5 (100 mM TAPS-Puffer) beibehält. Dies zeigt, dass der pH-Bereich, in welchem HLKI-Luciferase 80 % oder mehr Restaktivität beibehält, breiter ist als jener des Luciola-lateralis-Wildtypgegenstücks.
Diese Ergebnisse zeigen, dass HLKI-Luciferase eine höhere pH-Stabilität als das Enzym des Wildstamms aufweist, und gemäß dieser Eigenschaft kann es auch in jenem pH-Bereich umgesetzt werden, der nicht für das Enzym des Wildtypgegenstücks anwendbar ist, es ist daher extrem nützlich.
Tabelle 6
Wirkung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Luciferase mit exzellenter Thermostabilität etc. und mit hoher Wirksamkeit als Katalysator bereitgestellt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Biolumineszierendes Protein, das Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität aufweist und eine Mutation an einem Aminosäurerest besitzt, welcher der Position 219 von Genji-Glühwürmchen-(Luciola-cruciata-) Luciferase entspricht.