DE69233710T2

DE69233710T2 - Expressionsvektor für Prolylendopeptidase von Flavobacterium meningosepticum

Info

Publication number: DE69233710T2
Application number: DE69233710T
Authority: DE
Inventors: Tetsuya Takatsuki-shi Inaoka; Toshio Sanda-shi Kokubo; Daisuke Nagasaki-shi Tsuru; Tadashi Nagasaki-shi Yoshimoto
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1991-07-24
Filing date: 1992-07-15
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2012-07-16
Also published as: ES2293701T3; EP0524906A1; IE922409A1; ATE237689T1; DE69233710D1; ATE373096T1; EP0967285A1; US5521081A; EP0967285B1; DE69233005D1; MX9204291A; PT967285E; CA2074401A1; PT524906E; DE69233005T2; EP0524906B1; ES2197143T3; JP3401271B2; DK0524906T3; JPH05219962A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die für eine Prolylendopeptidase kodiert und ein Verfahren zur Herstellung dieser DNA, einen Wirt, der mit der rekombinanten DNA transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung dieses transformierten Wirts, ein Verfahren zur Herstellung der Prolylendopeptidase mittels des transformierten Wirts und die Verwendung der Prolylendopeptidase zur Herstellung eines physiologisch aktiven N-terminal amidierten Peptids.
Hintergrund der Erfindung
Die Prolylendoeptidase wurde zuerst im humanen Uterus von Walter et al 1971 als spezifische Endopeptidase gefunden, die ein Peptid an der carboxyterminalen Seite eines Prolinrests spaltet (R. Walter et al., Science 1971 173, 827-829) und seitdem wurde das Enzym kontinuierlich im Hinblick auf seine physiologische Rolle untersucht.
Andererseits wurde eine Endopeptidase mit einer sehr ähnlichen Spezifität zur Säugerprolylendopeptidase in einem Bacterium, nämlich Flavobacterium miningosepticum 1978 gefunden (T. Yoshimoto et al., Agric. Biol. Chem. 1978, 42, 2417-2419). Diese Feststellung ermöglicht die Herstellung einer größeren Menge (aber immer noch Labormaßstab) des Enzyms und die Prolylendopeptidase wurde für eine spezifische Spaltung von Proteinen und Peptiden verfügbar (T. Yashimoto et al., J. Biol. Chem. 1980, 255, 4786-4792). Die einzigartige Spezifität zur Erkennung von Prolinresten macht das Enzym ziemlich brauchbar als Grundwerkzeug der Proteintechnik und zieht mehr Aufmerksamkeit auf die Untersuchung der Struktur-Funktionsbeziehung. Die Herstellung der Prolylendopeptidase aus F. meningosepticum hat jedoch zwei entscheidende Nachteile, die aus dem Bacterium resultieren. 1) Das Bacterium ist pathogen (T. Yoshimoto et al., 1978, siehe obige Literaturstelle, R.E. Buchanan et al., "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Ausgabe, 1974, The Williams & Wilkins Co., Baltimore) und 2) es bildet nicht nur Prolylendopeptidase, sondern auch signifikante Mengen an anderen spezifischen oder unspezifischen Peptidasen (T. Yoshimoto et al., 1978, siehe obige Literaturstelle). Diese Probleme haben eine industrielle Herstellung der Endopeptidase trotz eines steigenden Bedarfs für das Enzym verhindert.
Die japanische Patentanmeldung (KOKAI) Nr. H2-5880 beschreibt die Klonierung eines Postprolinpeptidasegens, das von Bacterioides gingivalis stammt, aber das Enzym unterscheidet sich deutlich vom vorliegenden Enzym dadurch, dass das erstere Glycyl-prolin-4-methoxy-β-napthylamid spaltet, das nicht von der vorliegenden Prolylendopeptidase gespalten werden kann.
Yoshimoto et al., J. Biol. Chem. 255 (10), 4786-4792, 1980 beschreiben die Isolierung und Charakterisierung einer Prolin-spezifischen Endopeptidase von Flavobacterium meningosepticum. Yoshimoto et al. beschreiben nicht die Isolierung oder Expression des Gens, das für die Prolylendopeptidase kodiert.
D. Rennex et al., Biochemistry 30, 2195-2203, 1991 beschreiben die Klonierung der cDNA für Prolylendopeptidase aus dem Schweinehirn, beschreiben aber nicht die Expression der cDNA.
Man glaubt, dass die Prolylendopeptidase zur Modifizierung von Peptiden brauchbar ist, beispielsweise der C-terminalen Amidierung von biologisch aktiven Peptiden, wie LH-RH, Oxytocin, Calcitonine oder dergleichen, aber für diesen Zweck ist es notwendig, große Mengen an Enzym zu erhalten. Darüberhinaus sollte die Enzympräparation frei sein von anderen Peptidasen, um eine gewünschte Reaktion sicherzustellen. Daher ist die Herstellung des Enzyms durch einen Genrekombinationsprozess essentiell.
Zusammenfassung der Erfindung
Demnach liefert die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Expressionsvektor, der eine DNA Sequenz, die für die Flavobacterium meningosepticum Prolylendopeptidase kodiert, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, welche von der Nukleotidposition 317 bis 2374 reicht und eine Signalsequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, die von der Nukleotidposition 260 bis 316 reicht, kloniert in ein Multikopienplasmid unter der Kontrolle des E. coli tac Promotors umfasst, wie auch einen Wirt, der mit dem rekombinanten DNA Molekül transformiert ist und ein Verfahren zur Herstellung derselben.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Expressionsvektors, umfassend eine DNA Sequenz, die für die Flavobacterium meningosepticum Prolylendopeptidase kodiert, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, welche von der Nukleotidposition 317 bis 2374 reicht und eine Signalsequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, die von der Nukleotidposition 260 bis 316 reicht, kloniert in ein Multikopienplasmid unter der Kontrolle des E. coli tac Promotors, das die folgenden Schritte umfasst
Herstellung von cDNA oder genomischer DNA, die für die Flavobacterium meningosepticum Prolylendopeptidase kodiert, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist oder Herstellung der DNA durch chemische Synthese
Insertion der DNA in einen Multikopienplasmidklonierungsvektor unter der Kontrolle des E. coli tac Promotors,
Selektion eines Hybridexpressionsvektors, der die DNA enthält und exprimiert, die für die Flavobacterium meningosepticum Prolylendopeptidase kodiert, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Wirtsorganismus, insbesondere E. coli, der einen rekombinanten Expressionsvektor gemäß der Erfindung umfasst, das die Transformation des Wirtsorganismus mit einem rekombinanten Expressionsvektor gemäß der Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner einen Wirt, der mit dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert ist, der das Gen umfasst, welches für Prolylendopeptidase jeden Ursprungs kodiert und der zur Herstellung der Prolylendopeptidase fähig ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Herstellung des Gens, das für die Prolylendopeptidase kodiert
Hierin soll der Ausdruck Prolylendopeptidase eine Prolylendopeptidase umfassen, die aus Flavobacterium meningosepticum, am bevorzugtesten von F. meninosepticum Stamm IFO 12535 (ATCC 13253) stammt.
Demnach kann eine DNA der vorliegenden Erfindung, die für eine Prolylendopeptidase kodiert, aus einem Bacterium kloniert werden, das zu Flavobacterium meningosepticum, am bevorzugtesten F. meningosepticum Stamm IFO 12535 (ATCC 13253) gehört.
Da DNA, die von einem Prokaryonten stammt, wie einem Bacterium, beispielsweise F. meningosepticum, keine Introns umfasst, kann eine genomische DNA zur Klonierung einer für Prolylendopeptidase kodierenden DNA verwendet werden, falls eine prokaryontische Zelle als Quelle verwendet wird. In diesem Fall werden Bakterienzellen von F. meningosepticum, die Prolylendopeptidase bilden, homogenisiert und die gesamte genomische DNA wird gemäß einem herkömmlichen Verfahren extrahiert (H. Saito et al., Biochim. Biophys. Acta, 1963, 72, 619-629). Die extrahierte DNA wird dann vollständig oder teil weise mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut, wie BgIII, EcoRI, HincII, HindIII, PstI oder BamHI. Das Produkt des Verdaus wird dann vorzugsweise einer präparativen Elektrophorese auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt unterzogen, um DNA Fraktionen einer bestimmten Länge anzureichern. Dies soll DNA Fragmente anreichern, die für Prolylendopeptidase kodieren. Als nächstes werden die DNA Fragmente in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert. Der Klonierungsvektor kann von jedem Vektor stammen, der in der Gentechnik brauchbar ist, wie von Viren, Phagen, Cosmiden, Plasmiden oder chromosomaler DNA, beispielsweise Derivaten von SV40, Herpesviren, Papillomaviren, Retroviren, Baculoviren, λ Phagen, beispielsweise NM 989 oder EMBL4 oder M13 Phagen, beispielsweise Plasmiden, wie pBR322, pUC18, pSF2124, pBR317 oder pPLMu oder Hefeplasmiden, beispielsweise Hefe 2µ Plasmid, oder auch von chromosomaler DNA, die einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS) enthält. Vorzugsweise ist der Klonierungsvektor ein bakterieller Vektor, wie pBR322, pUC18, pUC19 oder dergleichen.
Alternativ dazu kann eine cDNA Bank aus einer F. meningosepticum Zelle hergestellt werden, die Prolylendopeptidase exprimiert, vor allem F. meningosepticum Stamm IFO 12535 (ATCC 13253). Als nächstes wird eine cDNA Bank gemäß einem herkömmlichen Verfahren konstruiert, wie dem Okayama-Berg Verfahren (H. Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 1982, 2, 161-170), dem Verfahren von Gubler und Hoffman (U. Gubler et al., Gene, 1983, 25, 263-270) oder dergleichen.
Es ist eine Vielzahl an Verfahren zum Einbau einer doppelsträngigen cDNA oder einer genomischen DNA in einen geeigneten Vektor bekannt. Beispielsweise können komplementäre Homopolymerabschnitte an die doppelsträngige DNA und die Vektor DNA durch die Inkubation in Gegenwart der entsprechenden Desoxynukleosidtriphosphate und eines Enzyms, wie der terminalen Desoxynukleotidyltransferase angefügt werden. Der Vektor und die doppelsträngige DNA werden dann durch Basenpaarung zwischen den komplementären Homopolymerschwänzen zusammengebracht und schließlich durch spezifische verbindende Enzyme, wie Ligasen, ligiert. Andere Möglichkeiten sind die Anfügung von synthetischen Linkern an die Enden der doppelsträngigen DNA oder der Einbau der doppelsträngigen DNA in den Vektor durch eine Ligation mit stumpfen oder abgestuften Enden.
Das Screening der genomischen DNA Bank oder der cDNA Bank wird vorzugsweise mit einer DNA Hybridisierungssonde erreicht. Geeignete DNA Sonden sind DNAs mit bekannter Nukleotidsequenz, die aus mindestens 17 Nukleotiden bestehen, beispielsweise synthetische DNAs, cDNAs, die von einer mRNA stammen, die für Prolylendopeptidase kodiert oder genomischen DNA Fragmenten, die beispielsweise benachbarte DNA Sequenzen enthalten, die aus einer natürlichen Quelle oder von einem genetisch veränderten Mikroorganismus isoliert wurden.
Um synthetische DNA Sonden zum Screening der oben erwähnten genomischen DNA Bank oder cDNA Bank zu entwerfen, wird die Prolylendopeptidase, für die eine kodierende DNA Region kloniert werden soll, gereinigt und die partielle Aminosäuresequenz wird gemäß einem herkömmlichen Verfahren bestimmt. Als nächstes werden DNA Sequenzen auf der Basis der so bestimmten partiellen Aminosäuresequenz entworfen. Wenn die exakte Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz kodiert, nicht bekannt ist, kann eine Kombination aus Nukleotidsequenzen, die die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes vorkommenden möglichen Nukleotidsequenzen teilweise oder vollständig abdecken, verwendet werden. Alternativ dazu kann das dritte Nukleotid in einem Codon durch Inosin ersetzt werden.
Synthetische DNA Sonden werden gemäß bekannter Verfahren synthetisiert, beispielsweise durch schrittweise Kondensation unter Verwendung des Festphasenphosphotriester-, Phosphittriester- oder Phosphoramiditverfahrens, beispielsweise der Kondensation der Dinukleotidkupplungseinheiten durch das Phosphotriesterverfahren. Diese Verfahren werden an die Synthese von Gemischen der gewünschten Oligonukleotide durch die Verwendung von zwei, drei oder vier Nukleotiden dA, dC, dG und/oder dT in geschützter Form oder der entsprechenden Dinukleotidkupplungseinheiten im geeigneten Kondensationsschritt angepaßt, wie dies von Y. Ike et al beschrieben ist (Nucleic Acids Research 11, 477, 1983).
Zur Hybridisierung werden die DNA Sonden markiert, beispielsweise durch die gut bekannte Kinasereaktion radioaktiv markiert. Die Hybridisierung wird gemäß bekannter Verfahren ausgeführt, das heißt in Puffer und Salzlösungen, die Zusätze enthalten, beispielsweise Calciumchelatbildner, Viskositäts-regulierende Verbindungen, Proteine, nicht-homologe DNA und dergleichen, bei Temperaturen, die eine selektive Hybridisierung favorisieren, beispielsweise zwischen 0°C und 80°C, wie zwischen 25°C und 50°C.
In der bevorzugten Ausführungsform wird die DNA Bank von F. meningosepticum zur Transformation einer geeigneten Wirtszelle, wie E. coli Zellen verwendet, die dann auf festem Medium plattiert und kultiviert werden, um Kolonien zu entwickeln und positive Klone werden durch ein Koloniehybridisierungsverfahren mittels der oben erwähnten DNA Sonden selektiert. Die Transformation von geeigneten Wirtszellen mit der DNA Bank und die Selektion und Vermehrung von transformierten Wirtszellen sind in der Technik gut bekannt. Beispiele für solche Verfahren sind im folgenden angeführt.
Die Nukleotidsequenz von DNA, die wie oben beschrieben ausgewählt wurde, kann durch an sich bekannte Verfahren bestimmt werden, beispielsweise durch das Maxam-Gilbert Verfahren mittels endmarkierter DNA oder durch das Didesoxykettenabbruchverfahren von Sanger.
Eine Nukeotidsequenz der genomischen DNA aus Flavobacterium meningosepticum Ursprung, die für Prolylendopeptidase kodiert und eine entsprechende Aminosäuresequenz sind in der Sequenzliste SEQ ID Nr. 1 gezeigt.
Wenn eine Nukleotidsequenz, die für eine Prolylendopeptidase kodiert oder eine Aminosäuresequenz hiervon bestimmt wurde, kann eine DNA, die für das Enzym kodiert, durch eine in vitro Synthese gemäß herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Geeignete Verfahren zur DNA Synthese wurden in einer Zusammenfassung von S.A. Narang (Tetrahedron 39, 3, 1983) präsentiert. Die bekannten Synthesetechniken erlauben die Herstellung von Polynukleotiden mit einer Länge von bis zu 120 Basen in guter Ausbeute, hoher Reinheit und in relativ kurzer Zeit. Geeignet geschützte Nukleotide werden miteinander durch das Phosphotriesterverfahren (K.L. Agarwal et al., Angew. Chemie 84, 489, 1972), dem effizienteren Phosphotriesterverfahren (C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143, 1978), dem Phosphittriesterverfahren (R.L. Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 98, 3655, 1976) oder dem Phosphoramiditverfahren (S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859, 1981) verbunden.
Eine Vereinfachung der Synthese der Oligonukleotide und Polynukleotide wird durch das Festphasenverfahren ermöglicht, worin die Nukleotidketten an ein geeignetes Polymer gebunden sind. H. Rink et al (Nucl. Acids Research 12, 6369, 1984) verwenden Trinukleotide anstelle von einzelnen Nukleotiden und verbinden sie durch das Phosphotriesterverfahren in der Festphasensynthese. Ein Polynukleotid kann so in einer kurzen Zeit und mit guten Ausbeuten hergestellt werden. Die doppelsträngige DNA wird enzymatisch aus chemisch hergestellten überlappenden Oligonukleotiden aus beiden DNA Strängen aufgebaut, die in korrekter Anordnung durch Basenpaarung gehalten werden und dann chemisch durch das Enzym DNA Ligase verbunden werden. Eine weitere Möglichkeit umfasst die Inkubation von überlappenden einzelnen Oligonukleotiden von den zwei DNA Strängen in Gegenwart der vier erforderlichen Desoxyrinbonukleotidtriphosphate mit einer DNA Polymerase, beispielsweise DNA Polymerase I, dem Klenowfragment der Polymerase I oder T4 DNA Polymerase oder der reversen Transkriptase von AMV (Vogelmyoblastosevirus). Die zwei Oligonukleotide werden hierbei in der korrekten Anordnung durch Basenpaarung zusammengehalten und mit den erforderlichen Nukleotiden durch das Enzym aufgefüllt, um eine vollständige doppelsträngige DNA zu ergeben (Scarpulla et al., Anal. Biochem. 121, 56, 1982).
Hybridvektor enthaltendes Gen, das für Prolylendopeptidase kodiert
In der vorliegenden Erfindung umfassen Hybridvektoren einen Hybridvektor zur Klonierung oder Amplifizierung eines gewünschten Prolylendopeptidasegens und Expressionsvektoren. Ein Hybridexpressionsvektor der Erfindung umfasst eine DNA Sequenz, die für die hierin vorher definierte Prolylendopeptidase kodiert.
Die Hybridexpressionsvektoren stammen von jedem Vektor ab, der in der Gentechnik brauchbar ist, wie von Viren, Phagen, Cosmiden, Plasmiden oder chromosomaler DNA, beispielsweise Derivaten von SV40, Herpesviren, Papillomaviren, Retroviren, Baculoviren, λ Phagen, beispielsweise NM 989 oder EMBL4 oder M13 Phagen, bakteriellen Plasmiden, wie pBR322, pUC18, pSF2124, pBR317 oder pPLMu oder Hefeplasmiden, beispielsweise Hefe 2µ Plasmid, oder auch von chromosomaler DNA, die einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS) enthalten, oder von einem defekten Virus, Phagen oder Plasmid in Gegenwart eines Helfervirus, -phagen oder -plasmids oder eines Plasmids, das die Replikation des defekten Virus, Phagen oder Plasmids erlaubt, beispielsweise der M13(+)KS Vektor in Gegenwart beispielsweise des M13K07 Helferphagen. Die Baculoviren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise Autographs californica Kernpolyhedrosevirus (AcMNPV), Trichoplusia ni MNPV, Rachiplusia ou MNPV, Galleria mellonella MNPV, Bombyx mori Kernpolyhedrosevirus (BmNPV) und dergleichen. Ein Kit, der eine Kombination eines Autographe californica Kernpolyhedrosevirus und die Baculovirustransfervektoren pAc700, pAc701, pAc702, pVL1392 und pVL1393 umfasst, ist von Invitrogen im Handel erhältlich.
Ein geeigneter Expressionsvektor der Erfindung ist ein Vektor, der in der mikrobiellen Wirtszelle funktionsfähig ist, die zur Vermehrung des Hybridvektors zur Expression der Prolylendopeptidase ausgewählt wurde. Geeignete Vektoren enthalten ein vollständiges Replikon und ein Markergen, das die Selektion und Identifizierung der Mikroorganismen, die durch Expressionsplasmide transformiert wurden, mittels eines phänotypischen Merkmals ermöglicht.
Daher sorgen die erfindungsgemäßen Hybridexpressionsvektoren für die Replikation einer gewünschten Prolylendopeptidase DNA in einer geeigneten Wirtszelle entweder als extrachromosomales Element oder durch die Integration in das Wirtschromosom. Es sind mehrere mögliche Vektorsysteme zur Integration und Expression der klonierten DNA der Erfindung verfügbar. Im Prinzip sind alle Vektoren geeignet, die replizieren und/oder ein rekombinantes Gen umfassen, das in der gewählten Wirtszelle exprimiert werden kann. Der Vektor wird in Abhängigkeit der zur Transformation ausgewählten Wirtszelle ausgewählt. Im allgemeinen können solche Wirtszellen prokaryontische oder eukaryontische Mikroorga nismen sein, wie Bakterien, Pilze, wie Hefen oder filamentöse Pilze oder Zellen höheren eukaryontischen Ursprungs, wie tierische Zellen, beispielsweise Säuger- oder Insektenzellen. Geeignete Wirtszellen werden später im Detail diskutiert. Im Prinzip umfassen die erfindungsgemäßen Hybridvektoren eine DNA, die für Prolylendopeptidase kodiert, einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz, wahlweise dominante Markersequenzen und wahlweise zusätzliche Restriktionsschnittstellen.
Ein Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ein DNA Element, das extrachromosomalen Elementen autonom replizierende Fähigkeiten verleiht) wird entweder durch die Konstruktion eines Vektors, der einen exogenen Ursprung aufweist, wie er vom Simianvirus (SV 40) oder einer anderen viralen Quelle stammen kann oder durch die chromosomalen Mechanismen der Wirtszelle bereitgestellt.
Ein erfindungsgemäßer Hybridexpressionsvektor kann auch in Abhängigkeit des zu transformierenden Wirts selektiert und kloniert werden. Es kann jedes Markergen verwendet werden, das die Selektion von Transformanden aufgrund der phänotypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind insbesondere Gene, von denen ein Polypeptid exprimiert werden kann, das eine Resistenz gegenüber Verbindungen verleiht, die für den Empfängerorganismus toxisch sind oder das das Enzymsystem einer Mutante vervollständigt, der ein solches essentielles Polypeptid fehlt, beispielsweise einer auxotrophen Mutante. Geeignete Markergene exprimieren beispielsweise eine Antibiotikumresistenz, beispielsweise gegenüber Tetracyclin, Ampicillin oder Cycloheximid oder sorgen für die Prototrophie in einer auxotrophen Mutante, beispielsweise in einer Hefe, der das ura3, leu2, his3 oder das trp1 Gen fehlt. Es ist auch möglich, Strukturgene als Marker zu verwenden, die mit einem autonom replizierenden Segment assoziiert sind, vorausgesetzt, dass der zur transformierende Wirt für das durch den Marker exprimierte Produkt auxotroph ist.
Innerhalb der Bedeutung der Hybridvektoren der Erfindung befinden sich auch Hybridexpressionsvektoren zur Expression der Prolylendopeptidase. Sie haben im allgemeinen dieselben Merkmale wie die vorher beschriebenen Hybridvektoren und umfassen zusätzlich Expressionskontrollsequenzen, die die Bildung und wahlweise die Sekretion der Prolylendopeptidase erlauben. Der erfindungsgemäße Hybridvektor umfasst eine tac Promotorregion, die operativ mit einem Strukturgen verbunden ist, das für die Prolylendopeptidase kodiert und wahlweise ein DNA Fragment, das ein Leader- oder Signalpeptid kodiert, einen Transkriptionsenhancer, eine Ribosomenbindungsstelle, eine Transkriptionsterminatorregion und/oder weitere regulatorische Sequenzen.
Zur Expression brauchbare Enhancer sind Transkriptions-stimulierende DNA Sequenzen, die beispielsweise von Viren stammen, wie Simianvirus, Cytomegalievirus, Polyomavirus, Rinderpapillomavirus oder Moloneysarcomavirus oder aus genomischem Ursprung. Eine Enhancersequenz kann auch von der extrachromosomalen, ribosomalen DNA von Physarum polycephalum ( WO 86/00089 ) stammen oder es kann die stromaufwärts liegende Aktivierungsstelle des Saurephosphatasegens PHO5 ( EP 0 213 593 B ) oder des Promotors von PHO5, trp, PHO5-GAPDH Hybrid ( EP 0 213 593 B ) oder eines ähnlichen Promotors sein.
Die Signalsequenz, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, erstreckt sich von Aminosäure 1 bis 19 der in der Sequenzliste unter SEQ ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Diese Signalsequenz alleine wie auch ein DNA Molekül, das dieselbe kodiert, vorzugsweise das durch die Nukleotide 260 bis 316 der SEQ ID Nr. 1 repräsentierte DNA Molekül wird auch von der vorliegenden Erfindung abgedeckt.
Eine Ribosomenbindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz) ist entweder natürlich an den verwendeten Promotor gebunden oder kann auf einer kurzen Nukleotidsequenz liegen, die kovalent an das 5'-Ende der für Prolylendopeptidase kodierenden Region gebunden ist. Ribosomale Bindungsstellen sind in der Technik bekannt.
Der für die Konstruktion eines erfindungsgemäßen Hybridexpressionsvektors ausgewählte tac Promotor kann durch ein regulatorisches Protein reguliert werden und die Bildung der Prolylendopeptidase in der transformierten Wirtszelle kann dann induzierbar oder dereprimierbar sein. Das Gen für das regulatorische Protein kann entweder im Genom des Wirtsstamms liegen oder auf einem zusätzlichen Plasmidvektor, mit dem der Wirtsstamm cotransformiert werden kann oder auf dem Hybridvektor der Erfindung. Die Selektion eines geeigneten Gens für ein regulatorisches Protein hängt vom verwendeten Promotor ab. Die Bedingungen für die Induktion oder Derepression der Produktion der Prolylendopeptidase hängen auch vom Promotor und dem regulatorischen Protein ab. Ein regulatorisches Protein, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist beispielsweise ein Repressorprotein, beispielsweise ein Produkt des trpR, lacl, λcro oder λcl Gens oder eine temperatursensitive Mutante hiervon.
Bevorzugte Hybridexpressionsvektoren der Erfindung sind Expressionsvektoren, die zur Expression der reifen Prolylendopeptidase in E. coli geeignet sind, welche durch die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz repräsentiert wird und die Signalsequenz des Prolylendopeptidasegens, das unter SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, funktionsfähig mit dem für die reife Prolylendopeptidase kodierenden Gen verbunden enthalten.
Die bevorzugtesten Expressionsvektoren sind die Plasmide pFPH5-KD50, pUK-FPEP-a und pUK-FPEP-b, die in den begleitenden Beispielen charakterisiert sind.
Transformierte Wirte und Präparationen hiervon
Die Erfindung betrifft eine transformierte Wirtszelle zur Vermehrung von rekombinanten DNA Molekülen der Erfindung oder insbesondere zur Expression eines Prolylendopeptidasestrukturgens, das in einem rekombinanten DNA Molekül der Erfindung enthalten ist.
Die transformierten, mikrobiellen Wirtsstämme werden in einem flüssigen Medium kultiviert, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, die durch die mikrobielle Zelle assimiliert werden können und anorganische Salze, wobei in der Technik bekannte Verfahren angewendet werden. Die Kultivierung der Wirtszellen wird in einem herkömmlichen Nährmedium ausgeführt, das mit chemischen Verbindungen versetzt sein kann oder dem diese fehlen, was eine negative oder positive Selektion von Transformanden erlaubt, das heißt von Wirten, die das gewünschte DNA Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker enthalten von den nicht transformierten Zellen, das heißt Wirten, denen das gewünschte DNA Molekül fehlt.
Es können alle transformierbaren in der Technik brauchbaren Wirte verwendet werden, beispielsweise Bakterien, wie E. coli, Pilze, wie Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, oder filamentöse Pilze, wie Aspergillus spec., beispielsweise A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori oder A. niger. Jedoch ist die Verwendung von geeigneten Wirten vorteilhaft, die keine oder wenige Restriktionsenzyme oder Modifikationsenzyme aufweisen. Beispiele für solche Wirte sind Bakterien, beispielsweise Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Hämophilus, Streptococcus, und andere und Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae und insbesondere Stämme von Escherichia coli, beispielsweise E. coli X1776, E. coli Y1090, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E.coli JA 221, E. coli DH5α oder vorzugsweise E. coli DH5αF', JM109, MH1 oder HB101 oder E. coli K12 Stämme. Weitere geeignete Wirtszellen sind Zellen höherer Organismen, insbesondere etablierte kontinuierliche humane oder tierische Zellinien, beispielsweise humane, embryonale Lungenfibroblasten L132, humane, maligne Bowes Melanomzellen, HeLa Zellen, mit SV40 transformierte Nierenzellen der afrikanischen Meerkatze COS-7 oder Ovarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO). Andere geeignete Wirtszellen sind etablierte Insektenzellinien, beispielsweise Spodoptera frugiperda, wie Sf21 oder vorzugsweise Sf9 (ATCC CRL 1711), Mamestra brassicae, Bombyx mori Zellsysteme mittels Bombyx mori Kernpolyhedrosevirus (BmNPV) und dergleichen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung solcher transformierter Wirte, das die Behandlung einer geeigneten Wirtszelle unter transformierenden Bedingungen mit einem rekombinenten DNA Molekül der vorliegenden Erfindung, speziell einem erfindungsgemäßen Hybridvektor, wahlweise zusammen mit einem Selektionsmarkergen und wahlweise die Selektion der Transformanden umfasst.
Die Transformation von Mikroorganismen wird gemäß herkömmlicher Verfahren ausgeführt, wie sie in der Literatur beschrieben sind, beispielsweise für S. cerevisiae (A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978), für B. subtilis (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741, 1961) und für E. coli (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159, 1970).
Demnach umfasst das Transformationsverfahren für E. coli Zellen beispielsweise eine Ca²⁺ Vorbehandlung der Zellen, um die DNA Aufnahme zu ermöglichen, und die Inkubation mit dem Hybridvektor. Die anschließende Selektion der transformierten Zellen kann beispielsweise durch den Transfer der Zellen in ein selektives Wachstumsmedium erreicht werden, das die Trennung der transformierten Zellen von den Ausgangszellen in Abhängigkeit der Art der Markersequenz der Vektor DNA erlaubt. Vorzugsweise wird ein Wachstumsmedium verwendet, das nicht das Wachstum von Zellen erlaubt, die keinen Vektor enthalten. Die Transformation von Hefen umfasst beispielsweise Schritte der enzymatischen Entfernung der Hefezellwand durch Glucosidasen, die Behandlung der so erhaltenen Spheroplasten mit dem Vektor in Gegenwart von Polyethylenglycol und Ca²⁺ Ionen und die Regeneration der Zellwand durch das Einbetten der Spheroplasten in Agar. Vorzugsweise wird der Regenerationsagar auf eine Weise hergestellt, die die Regeneration und Selektion der wie oben beschrieben transformierten Zellen zur selben Zeit erlaubt.
Die Transformation von Zellen höheren eukaryontischen Ursprungs, wie Säugerzellinien, wird vorzugsweise durch Transfektion erreicht. Die Transfektion wird durch herkömmliche Techniken ausgeführt, wie Calciumphosphatfällung, Mikroinjektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, das heißt Einführung der DNA durch einen kurzen elektrischen Impuls, der vorübergehend die Permeabilität der Zellmembran erhöht oder in Gegenwart von Hilfsverbindungen, wie Diethylaminoethyldextran, Dimethylsulfo xid, Glycerin oder Polyethylenglycol und dergleichen. Nach dem Transfektionsverfahren werden die transfizierten Zellen identifiziert und beispielsweise durch Kultivierung in einem geeigneten Selektivmedium in Abhängigkeit der Art des Selektionsmarkers selektiert, beispielsweise durch Standardkulturmedien, wie Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), Mimimal Essential Medium, RPMI 1640 Medium und dergleichen, die beispielsweise das entsprechende Antibiotikum enthalten.
Die transformierten Wirtszellen werden durch in der Technik bekannte Verfahren in einem Flüssigmedium kultiviert, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose oder Lactose, Stickstoff, beispielsweise Aminosäuren, Peptide, Proteine oder ihre Abbauprodukte, wie Peptone, Ammoniumsalze und dergleichen und anorganische Salze, beispielsweise Sulfate, Phosphate und/oder Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium enthält. Das Medium enthält ferner wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, beispielsweise Eisen, Zink, Mangan und dergleichen.
Das Medium wird vorzugsweise so ausgewählt, dass es einen Selektionsdruck ausübt und das Wachstum der Zellen verhindert, die nicht transformiert wurden oder den Hybridvektor verloren haben. Daher wird beispielsweise ein Antibiotikum zum Medium gegeben, falls der Hybridvektor ein Antibiotikumresistenzgen als Marker enthält. Falls beispielsweise eine Wirtszelle verwendet wird, die für eine essentielle Aminosäure auxotroph ist, während der Hybridvektor ein Gen enthält, das für ein Enzym kodiert, welches den Wirtsdefekt komplementiert, wird ein Minimalmedium, dem diese Aminosäure fehlt, zur Kultivierung der transformierten Zellen verwendet.
Zellen höheren eukaryontischen Ursprungs, wie Säugerzellen, werden unter Gewebekulturbedingungen mittels im Handel erhältlicher Medien angezogen, wie beispielsweise Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), Minimal Essential Medium, RPMI 1640 Medium und dergleichen, wie sie oben erwähnt sind, die wahlweise mit wachstumsfördernden Substanzen und/oder Säugerseren supplementiert sind. Die Techniken zur Zellkultivierung unter Gewebekulturbedingungen sind in der Technik gut bekannt und umfassen die homogene Suspensionskultur, beispielsweise in einem Airliftreaktor oder in einem kontinuierlichen Rührreaktor oder einer immobilisierten oder eingeschlossenen Zellkultur, beispielsweise in Hohlfasern, Mikrokapseln, auf Agarosemikrokugeln, porösen Glaskügelchen, Keramikkartuschen oder anderen Mikroträgern.
Die Kultivierung wird durch Verfahren bewirkt, die in der Technik bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so ausgewählt, dass ein maximaler Expressionsspiegel des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Derivats erhalten wird. Daher wird ein E. coli oder Hefestamm vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durch submerse Kultur mit Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20°C bis 40°C, vorzugsweise bei etwa 30°C und einem pH Wert von 4 bis 8, vorzugsweise etwa 7, für etwa 4 bis 30 Stunden geschüttelt oder gerührt, vorzugsweise bis maximale Ausbeuten des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Derivats erreicht sind.
Herstellung von Prolylendopeptidase
Zur Expression von Prolylendopeptidase können entweder prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen verwendet werden, beispielsweise E. coli Stämme, die in Proteasegenen, beispielsweise im Ion Proteasegen und Genen, die in der Regulation der durch Hitzeschock induzierten Proteinsynthese defekt sind, beispielsweise dem htpR Gen ( US 4 758 512 A , G. Buell et al., Nucleic Acids Res. 13: 1923-1938, 1985).
Vorzugsweise wird die Prolylendopeptidase in E. coli hergestellt. In diesem Fall wird zur Verbesserung der Expression eine 5'-terminale nicht-kodierende Region der klonierten DNA vorzugsweise entfernt, während die volle Länge der kodierenden Region beibehalten wird, insbesondere die kodierende Region des unter SEQ ID Nr. 1 gezeigten reifen Polypeptids. Die kodierende Region ist am bevorzugtesten funktionell mit einer Signalsequenz verbunden, die die Sekretion der Prolylendopeptidase erlaubt. Darüberhinaus ist das Strukturgen funktionell mit einer Promotorregion verbunden, die in E. coli funktionsfähig ist und entweder heterolog oder nativ mit der für Prolylendopeptidase kodierenden Region verbunden ist. Die Verbindung wird gemäß einem herkömmlichen Verfahren ausgeführt, beispielsweise mittels einer geeigneten Restriktionsenzymschnittstelle oder Deletion durch Verdau mit Exonuklease, wie eine E. coli Exonuklease III und anschließendes stumpfendig machen mit einer Nuklease, beispielsweise Mung-Bean-Nuklease.
In einer der am meisten bevorzugten Ausführungsformen wird eine genomische DNA mit einer Linkersequenz unmittelbar stromaufwärts einer für Prolylendopeptidase kodierenden Region voller Länge mit einem tac-Promotor in einem Expressionsvektor verbunden, beispielsweise einem auf pUC119 basierenden Plasmid. Genauer gesagt kodiert eine kodierende Region in der genomishen DNA von Flavobacterium meningosepticum für eine Proform von Prolylendopeptidase, die beispielsweise aus einer reifen Form des Enzyms, die beispielsweise aus dem Aminosäurerest 1 bis zum Ende der unter SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besteht und einem Signalpeptid besteht, beispielsweise den Aminosäureresten –19 bis –1 der unter SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz. Wenn ein solcher Typ eines Expressionsplasmids zur Transformation eines E. coli Wirts verwendet wird und die Transformanden kultiviert werden, dann wird die Prolylendopeptidase in E. coli Zellen gebildet und in die periplasmatische Region sekretiert. Bei der Sekretion wird das Signalpeptid unter Bildung der reifen Form des Enzyms entfernt, das nicht in Einschlußkörperchen eingebaut wird und daher kann die gebildete Prolylendopeptidase leicht gewonnen werden.
Die exprimierte Prolylendopeptidase kann durch herkömmliche Verfahren aus mikrobiellen Zellen extrahiert werden, wie E. coli Zellen oder einem Überstand einer Zellkultur, die die Homogenisierung der Zellen, eine Chromatographie, wie Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie oder Größenausschlußchromatographie, Fällung, beispielsweise mit Ammoniumsulfat oder Säure, präparative Elektrophorese, wie Polyacrylamidgelelektrophorese oder isoelektrische Fokussierung und dergleichen umfassen. Insbesondere wird die Prolylendopeptidase aus Flavobacterium meningosepticum, die in E. coli exprimiert wird, leicht und selektiv aus den Zellen mit einem osmotischen Schockverfahren extrahiert, falls das Enzym in den periplasmatischen Raum sekretiert wird. Das erhaltene Rohenzym kann ferner mit gewöhnlichen Verfahren weiter gereinigt werden, die beispielsweise Chromatographie, wie Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie oder Größenausschlußchromatographie, präparative Elektrophorese, wie Polyacrylamidgelelektrophorese oder isoelektrische Fokussierung und dergleichen umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die in den Beispielen beschriebenen Ausführungsformen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter durch Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt.
In den Beispielen werden die folgenden Materialien und Verfahren herkömmlich verwendet.

Die verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in Tabelle I angegeben. Tabelle I: Stämme und Plasmide

Stämme oder Plasmide	Relevanter Genotyp
Stämme
E. coli
JM83	ara, Δ(lac-proAB), rpsL(= strA), ∅80^r, lacZΔM15
JM109	recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relA1, λ^–, Δ(lac-proAB), F'[proAB⁺, lacl^q, lacZΔM15, traD36]
HB101	F^–, hsdS20 (r^– _B, m^– _B), recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20, (Sm^r), xyl-5, mtl-1, supE44, λ^–, mcrA⁺, mcrB^–
TG1	supE, hsdΔ5, thi, Δ(lac-proAB), F'[proAB⁺, lacl^q, lacZΔM15, traD36]
F. meningosepticum	IFO 12535 (ATCC 13253)
Plasmide
pUC19	Amp^r, lacl', lacZ'
pUC118	Amp^r, lacl', lacZ', M13IG
pUC119	Amp^r, lacl', lacZ', M13IG

Die Transformation, Restriktionskartierung, Praparation von Plasmiden und andere molekulare Klonierungsverfahren werden durch Standardverfahren ausgeführt. (J. Sambrook et al., "Molecular cloning: A laboratory manual", 2. Ausgabe 1989, Cold Spring Harbor Laborstory, Corld Spring Harbor, T.J. Silhavy et al., "Experiments with gene fusions", 1984, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor). Restriktionsenzyme und DNA-modifizierende Enzyme werden gemäß den Empfehlungen der Hersteller verwendet. Die Deletion mit Exonuklease III wird durch die Verwendung eines Kilo-Sequence Deletion Kits ausgeführt (C. Yanish-Perron et al., Gene, 1985, 33, 103-119, S. Henikoff, Gene, 1984, 28, 351-359). Die Nukleotidsequenzen werden durch das Didesoxyverfahren mittels eines Sequenasekits bestimmt. Genomische DNA aus F. meningosepticum wird durch das Verfahren von Saito und Miura (H. Saito et al., Biochim. Biophys. Acta, 1963, 72, 619-629) isoliert.
Restriktionsenzyme, DNA-modifizierende Enzyme, der Kilo-Sequenz-Deletionskit und der MEGALABEL Kit werden von Takara Shuzo Co. Ltd (Kyoto) bezogen. Der Sequenasekit Version 2.0 ist das Produkt der US Biochemical Corp. (Cleveland, Ohio). Prolylendopeptidase von F. meningosepticum und Endoproteinase Asp-N werden jeweils von Seikagaku Corp. (Tokyo) und Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co. Ltd. (Tokyo) bezogen. Die Enzymsubstrate Z-Gly-Pro-β-Naphthylamid und Z-Gly-Pro-p-Nitroanilid werden von Novabiochem AG (Laeufelfingen, Schweiz) bezogen. Radioaktive Isotope werden von Amersham Japan Co. Ltd. (Tokyo) bezogen und andere Biochemikalien erhält man von Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri), Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka) und Nacalai Tesque Inc (Kyoto).
Beispiel 1: Herstellung von DNA Sonden
Im Handel erhaltene Prolylendopeptidase wird durch Umkehrphasen HPLC auf einer 4,6 × 35 mm TSKgel Octadecyl NPR Säule (Tosoh Co. Ltd.) gereinigt. Die Säule wird mit 0,01 % TFA in Wasser und einem 3:1 Gemisch aus CH₃CN und i-PrOH bei einer Flußrate von 1 ml/min eluiert. Der Gradient von 35-70 % des organischen Lösemittelgemisches wird über 40 Minuten angewendet und der Hauptpeak wird gewonnen.
Da der N-Terminus der Endopeptidase blockiert ist, muß das Enzym einer proteolytischen Spaltung unterzogen werden, um dessen partielle Primärstruktur zu bestimmen. Die herkömmlich für diese Spaltung verwendeten Proteasen, wie Trypsin, ergeben keine befriedigenden Ergebnisse. Daher werden Proteasen und die Bedingungen zur hydrolytischen Spaltung systematisch untersucht und es wird festgestellt, dass die Endoproteinase Asp-N das beste Ergebnis ergibt.
Das gereinigte Enzym (0,5 mg) in 10 mM Ammoniumcarbonat mit pH 7,9, worin 4 mM Harnstoff enthalten sind, wird durch 1 µg Endoproteinase Asp-N bei 37°C für 24 Stunden hydrolysiert. Das durch diesen Verdau erhaltene Peptidgemisch wird durch Umkehrphasen HPLC auf einer 4,6 × 250 mm Vydac C18 Säule (Separations Group Corp.) mit einer mobilen Phase von 0,01 % TFA in Wasser und einem 3:1 Gemisch aus CH₃CN und i-PrOH aufgetrennt. Die Flußrate beträgt 1 ml/min. Die isolierten Peptide werden weiter durch erneute Chromatographie gereinigt. Die Aminosäuresequenzen der gereinigten Peptide werden durch manuellen Edman Abbau mittels der von Kobayashi und Tarr beschriebenen Verfahren bestimmt (R. Kobayashi et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso, 1986, 31, 991-1002, G.E. Tarr, "Methods in Protein sequencing analysis" (Herausgeber M. Elzinga, 1982, 223-232, Humana Press, New Jersey).

Die Nukleotidsequenzen für die Sonden werden aufgrund der multiplen Codonverwendung nicht einheitlich aus den Aminosäuresequenzen bestimmt. Aus den 23 partiellen Aminosäuresequenzen werden sechs, die relativ wenig Kombinationen von möglichen Nukleotidsequenzen ergeben, zur Herstellung von DNA Sonden ausgewählt (Tabelle II). Die bevorzugte Codonverwendung in F. meningosepticum war nicht bekannt und die zwei folgenden Richtlinien wurden beim Entwurf der Nukleotidsonden übernommen. 3 der 6 Sonden (A-12, 13 und 19) werden so entworfen, dass sie aus einer einzelnen Oligonukleotidsequenz bestehen, wobei das wahrscheinlichste Codon für jeden Aminosäurerest auf der Annahme ausgewählt wird, dass die genomische DNA von F. meningosepticum GC reich ist. Die anderen 3 (A-3, 9 und 18) sind Gemische aus Oligonukleotiden der möglichen Sequenzen. Um weiter die Anzahl der möglichen Sequenzen im Gemisch zu reduzieren, wird Inosin (I) an die Position gesetzt, die eine der vier Basen A, G, C und T sein kann, da Inosin mit allen vier eine stabile Basenpaarung bildet. Tabelle II Bestimmte partielle Aminosäuresequenzen der Fragmente der Prolylendopeptidase, die durch den Endoproteinase Asp-N Verdau erhalten wurden (gezeigt durch die Aminosäurerestnummer in SEQ ID Nr. 1) und die entsprechenden Nukleotidpositionen in SEQ ID Nr. 1 der aus den Aminosäuresequenzen entworfenen Sonden

Fragment Nr.	Aminosäurerest in SEQ ID Nr. 1	Sonden Nr.	Entsprechende Nukleotidposition in SEQ ID Nr. 1
3	499-509	A-3	1811-1833
9	352-364	A-9	1370-1407
12	28-34	A-12	398-414
13	182-190	A-13	860-877
18	380-391	A-18	1454-1485
19	268-276	A-19	1118-1137

Die Oligonukleotide werden mit einem Applied Biosystems Modell 381A DNA Synthesegerät synthetisiert. Nach der Entfernung der Dimethoxytritylgruppe am Ende der synthetischen Sequenz werden die Oligonukleotide von den Schutzgruppen befreit und gemäß den Protokollen des Herstellers von den Trägern abgespalten. Die synthetisierte DNA wird dann einer präparativen Elektrophorese auf einem 8 % Polyacrylamidgel in 7 M Harnstoff unterzogen. Die gereinigten Oligonukleotide werden aus den getrennten Banden extrahiert und durch die Verwendung von Waters Sep-Pack C-18 Säulen entionisiert.
Beispiel 2: Evaluierung der Sonden
Die chromosomale DNA wird aus F. meningosepticum isoliert und durch 4 Arten an herkömmlich verwendeten Restriktionsenzymen verdaut, die eine Hexanukleotidsequenz erkennen, das heißt PstI, HindIII, EcoRI und BgIII.
Die Oligonukleotidsonden werden durch die Verwendung eines MEGALABEL Kits mit [γ-³²P] ATP unter Bildung einer spezifischen Aktivität von 1 × 10⁶ CPM/pmol radioaktiv markiert. Die chromosomalen Fragmente werden auf einem 0,7 % Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und durch das von Sambrook et al. beschriebene Verfahren (Sambrook et al., 1989, siehe obige Literaturstelle) auf Millipore Nitrocellulosefilter überführt.
Nach einer Prähybridisierung gemäß einem Standardprotokoll (Sambrook et al., 1989, siehe obige Literaturstelle) wird die Hybridisierung in 6 × SSC Hybridisierungslösung mit 0,2 pmol/ml der markierten Sonde bei 45°C für 16 Stunden ausgeführt. Das Filter wird mit 6 × SSC dreimal für 3 Minuten bei Raumtemperatur und dann für 1 Minute bei 45°C gewaschen. Es wird eine Autoradiographie mit einem Fuji Bio-Image Analyser BAS 2000 ausgeführt. Nur die A-3 Sonde gibt ein deutliches und spezifisches Signal mit jeder verdauten DNA.
Beispiel 3: Herstellung einer Genbank und Screening derselben
Das Molekulargewicht der Prolylendopeptidase wird mit 76 000 durch SDS Polyacrylamidgelelektrophorese als ziemlich groß bestimmt (Yoshimoto et al., 1980, siehe obige Literaturstelle). Die Größe des Enzyms entspricht 2 kb der kodierenden Region im Genom. Je größer das klonierte DNA Fragment ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit die volle Länge des offenen Leserahmens einzuschließen. Daher ist ein ziemlich großes Fragment, das aber klein genug ist, um eine hohe Transformationseffizienz zu erhalten, erwünscht und es werden 7 kb Fragmente mit BgIII ausgewählt. Die mit BgIII verdaute genomische DNA wird daher einer präparativen Elektrophorese mit bei niedrigen Temperaturen schmelzender Agarose unterzogen und der Teil des Gels wird ausgeschnitten, der die 7 kb Fragmente enthält. Das ausgeschnittene Gelstück wird in einem Ligationsgemisch gelöst und die extrahierten chromosomalen Fragmente werden in die BamHI Schnittstelle von pUC19 kloniert. Mit diesem Ligationsgemisch wird E. coli HB101 unter Bildung einer Genbank von etwa 4000 Rekombinanten transformiert.
Die Genbank wird mit der A-3 Sonde durch Koloniehybridisierung gescreent und man erhält 119 positive Klone. Sechzehn positive Klone werden ausgewählt und weiter durch Restriktionsendonukleaseverdau und Enzymtest analysiert. Ein Klon mit einem 7 kb Insert zeigt eine vergleichbar hohe Prolylendopeptidaseaktivität. Das Plasmid wird pFPEP02 genannt und weiter charakterisiert.
Beispiel 4: Restriktionskartierung und DNA Sequenzierung der isolierten Klone
Die Restriktionskarte des Inserts von pFPEP02 ist in 1 gezeigt. Um die kodierende Region zu lokalisieren, wird die Insert DNA durch geeignete Restriktionsenzyme geschnitten und in pUC118 oder pUC119 kloniert. Der Klon, der ein 2,6 kb HincII-EcoRI Fragment (pFPH6) aufweist, zeigt die höchste enzymatische Aktivität. Um die gesamte Nukleotidsequenz dieses Fragments zu bestimmen wird eine Reihe an Deletionssubklonen von jedem Ende eines größeren Fragments erzeugt, das das 2,6 kb Fragment enthält (pFPEP03, hinterlegt als FERM BP-3466). Aus den Deletionsmutanten und den subklonierten Restriktionsfragmenten wird die gesamte Sequenz des 2,6 kb Fragments durch das Didesoxyverfahren bestimmt (SEQ ID. Nr. 1).
Das Prolylendopeptidasegen wird durch das leere Rechteck in 1 dargestellt. Das Gen hat einen offenen Leserahmen von 2118 bp, dem eine putative Promotorsequenz vorausgeht, die durch 28 bp vom ATG Startcodon getrennt ist. Die Endopeptidase, die aus der Nukleotidsequenz abgeleitet wird, besteht aus 705 Aminosäureresten mit einem berechneten Molekulargewicht von 78 700 in guter Übereinstimmung mit dem Wert von 77 500, der durch Gleichgewichtssedimentation bestimmt wurde (T. Yoshimoto et al., Agric. Biol. Chem. 1982, 46, 2157-2158). Das Enzym wurde auf der Grundlage der Inhibitorstudie als Serinprotease klassifiziert (Yoshimoto et al., 1980, siehe obige Literaturstelle). In Übereinstimmung mit dieser Annahme befindet sich eine Konsensussequenz für ein katalytisches Zentrum einer Serinprotease, nämlich Gly-X-Ser-X-Gly in der C-terminalen Region. Der G-C Gehalt des klonierten HincII-EcoRI Fragments beträgt 38,4 % und ist im Gegensatz zu den Annahmen ziemlich gering. In den Proteindatenbanken NBRF-PIR und SWISS-PROT findet sich kein Protein, das eine signifikante Homologie mit der Prolylendopeptidase aufweist.
Beispiel 5: Expression der Prolylendopeptidase
Zur Expression der Prolylendopeptidase wird E. coli, der mit einem Plasmid transformiert ist, in TV Medium bei 37°C unter Schütteln in einem Rundschüttler (120 Upm) kultiviert. Das zur Expression der Prolylendopeptidase in E. coli verwendete TV Medium enthält 1 % Bacto Trypton, 0,1 % Bacto Hefeextrakt, 0,1 % Glucose und 0,8 % NaCl bei pH 7. F. meningosepticum wird in einem Polypeptonmedium angezogen, das 1 % Polypepton, 0,2 % Bacto Hefeextrakt, 0,1 % MgSO₄ × 7 H₂O und 2,5 % NaCl (pH 7) gemäß den Anleitungen einer Kulturensammlung enthält.
Es werden zwei Tests (A und B) jeweils für die qualitative Abschätzung und die quantitative Evaluierung der Enzymaktivität verwendet. Im Verfahren A wird Z-Gly-Pro-β-Naphthylamid (Z = N-Benzyloxycarbonyl) als Substrat verwendet. Zu 0,8 ml 20 mM Tris-HCl Puffer mit pH 7,0 werden 0,1 ml E. coli Kultur oder verdünnte Zellsuspension gegeben und das Gemisch wird für 3 Minuten bei 37°C vorinkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 0,1 ml der Substratlösung (5 mM) in 40 % Dioxan gestartet und nach 10 Minuten durch die Zugabe von 0,5 ml Fast Garnet GBC Lösung (1 mg/ml) gestoppt, die 10 % Triton X-100 in 1 M Acetatpuffer mit pH 4,0 enthält. Das Reaktionsgemisch wird für 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und bei 12 000 × g für 5 Minuten zentrifugiert. Die Absorption des Überstands wird bei 550 nm gemessen.
Im quantitativen Test (B) werden die E. coli Zellen durch Zentrifugation geerntet, mit 0,1 M HE-PES (pH 7,4) gewaschen und im selben Volumen HEPES Lösung wie die Kultur suspendiert. Die Zellsuspension wird für 60 Sekunden mit Intervallen über 3 Minuten unter Bildung eines Zellysats ultrabeschallt. Zu 0,94 ml an 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 werden 0,05 ml 4 mM Z-Gly-Pro-p-Nitroanilid in 40 % Dioxan gegeben. Nach 3 Minuten Vorinkubation bei 30°C werden 0,01 ml des verdünnten Lysats zum Gemisch gegeben und die Veränderung der Absorption wird bei 410 nm mit einem Hitachi Spektrophotometer U-3210 bei 30°C verfolgt. Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Menge an Enzym definiert, die 1 µmol p-Nitroanilid pro Minute in diesem Standardverfahren freisetzt, was 8,87 OD/min entspricht.
Obwohl der Klon mit dem HincII-EcoRI Fragment (pFPH6) deutlich die höchste Aktivität an Prolylendopeptidase zeigt, ist die Aktivität viel geringer als im ursprünglichen Bakterium. Um den Expressionsspiegel zu verbessern, wird ein weiterer Satz an Deletionsmutanten aus dem Klon mit dem HincII-BamHI Fragment (pFPH5) hergestellt. Wenn die Deletion vom 5'-Ende des Fragments ausgedehnt wird, erhöht sich die Enzymaktivität stufenweise, um bei pFPH5-KD50 (1) ein Maximum zu erreichen. Dann nimmt die Aktivität ab, ist aber immer noch leicht vorhanden (pFPFH5-KD7), wenn die Deletion den anfänglichen Teil des Leserahmens erreicht. Es wird eine sehr geringe Aktivität von einem Klon mit einer weiterreichenden Deletion detektiert (pFPH5-KD6). Daher wird die Expression des Enzyms in KD50 weiter im Detail untersucht.
Das Plasmid pFPH5-KD50 enthält 120 bp der stromaufwärts nicht-kodierenden Region, die die putative Promotorsequenz enthält, zusammen mit der vollen Länge des offenen Leserahmens. E. coli (JM83), der mit diesem Plasmid transformiert ist, wird in TV Medium angezogen und der Zeitverlauf der Expression der Prolylendopeptidase wird mit der Enzymaktivität des gesamten Proteins im Homogenat der gewaschenen Zellen verfolgt (Tabelle III). Nach etwa 6 bis 12 Stunden stoppt das Wachstum der Bakterien, die Gesamtaktivität des Enzyms nimmt rapide zu und erreicht einen Maximalwert von 3371 Einheiten/l, was dem Zehnfachen der in F. meningosepticum erhaltenen Enzymaktivität entspricht (346 Einheiten/l). Die gesamte Aktivität bleibt bis 24 Stunden konstant und nimmt dann langsam ab. Andererseits zeigt die spezifische Aktivität die schnelle Zunahme der Aktivität nach 6 bis 12 Stunden ähnlich zur Gesamtaktivität, aber sie steigt sogar nach 24 Stunden graduell an. Eine maximale spezifische Aktivität von 10,6 Einheiten/ml Protein wird nach etwa 36 Stunden erreicht. Da die spezifische Aktivität der Prolylendopeptidase etwa 115 Einheiten/mg Protein beträgt, beträgt die Expressionsmenge der Prolylendopeptidase in diesem Klon etwa 1/10 des Gesamtproteins.
Eine solch hohe Expressionsmenge an Prolylendopeptidase zeigt sich auch in der SDS-PAGE Analyse. Die Probe für die SDS-PAGE wird durch Mischen der vorher beschriebenen Lysate mit einem gleichen Volumen an Probenpuffer gemischt, der SDS und β-Mercaptoethanol enthält, und für 5 Minuten bei 96°C inkubiert. Die Elektrophorese wird mittels einer vorgegossenen Platte (12,5 %, 84 × 90 × 1,0 mm) und einem Gerät, das von Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd. (Tokyo) erhalten wurde, gemäß den Angaben des Herstellers ausgeführt. Das Gel wird mit Coomassie Brilliant Blau R250 gefärbt.
Nach 12 Stunden wird eine neue Bande an derselben Position wie der Standard der Prolylendopeptidase von F. meningosepticum deutlich unterschieden. Die Intensität dieser Bande ist nach 12-24 Stunden gleichzeitig mit der Veränderung der gesamten Enzymaktivität des Enzyms am höchsten.

Die Bildung der Prolylendopeptidase wird in der folgenden Tabelle III gezeigt. Tabelle III Expression der Prolylendopeptidase in E. coli (JM83), der pFPH5-KD50 enthält

Zeit (h)	Absorption bei 550 nm in Kulturmedium	Gesamtaktivität (Einheiten/l)	Spezifische Aktivität (Einheiten/mg Protein)
0	0,12	0	0
6	4,14	572	2,2
12	6,06	3371	8,8
24	5,75	3388	9,7
36	5,20	3003	10,6
48	4,69	2494	10,5

Beispiel 6: Weitere Verbesserung der Expression
Die Expression in E. coli JM83, der pFPH5-KD50 enthält, hat ein ziemlich hohes Maß erreicht, für eine industrielle Produktion der Prolylendopeptidase wäre ein noch höheres Maß bevorzugt. Bei pFPH5KD findet sich eine putative Promotorsequenz, die von F. meningosepticum stammt und in E. coli funktionsfähig sein sollte. Um den Expressionsspiegel weiter zu verbessern wird der native Promotor durch den starken trp-lac Hybridpromotor (oder tac Promotor) folgendermaßen ersetzt.
Das Plasmid pFPEP02 wird mit HincII unter Bildung eines 3,1 kb HincII Fragments verdaut, das das Prolylendopeptidasegen enthält, das dann in die SmaI Schnittstelle von pUC118 durch stumpfendige Ligation unter Bildung von pFPEP04 subkloniert wird. Nach der Ligation sind die Insertionspunkte an beiden Enden des Fragments weder durch HincII noch durch SmaI (2) schneidbar. Um die ScaI und PvuII Schnittstellen in der kodierenden Region zu deletieren, wird das synthetische, doppelsträngige Oligonukleotidfragment, das der Sequenz zwischen den SmaI und PvuII Schnittstellen entspricht, aber an zwei Positionen mutiert ist (Synthetisches Fragment I, siehe SEQ ID Nr. 2) durch die Annelierung des oberen und des unteren Strangs hergestellt, deren 5'-Ende vorher durch die T4 Polynukleotidkinase phosphoryliert wurde.
Andererseits wird das Plasmid pFPEP04 an der SmaI Einzelschnittstelle geschnitten, die im offenen Leserahmen vorkommt, und das oben erwähnte mutierte SmaI-PvuII Fragment wird mit dem linearisierten Plasmid an beiden terminalen SmaI Schnittstellen ligiert. Das Ligationsprodukt wird dann durch SacI geschnitten und das längere Fragment, das den 5'-Teil der kodierenden Region umfasst, wird durch Agarosegelelektrophorese isoliert. Nach dem Phosphorylieren des isolierten Fragments wird das fehlende Stück zwischen den PvuII und SacI Schnittstellen, das getrennt von pFPEP04 hergestellt wurde, unter Bildung von Plasmid pFPEP04' ligiert. Da ein Nukleotid an dem durch PvuII erzeugten Ende im synthetischen Fragment geändert wurde, wird die PvuII Schnittstelle nicht durch diese Cyclisierung regeneriert.
Als nächstes wird eine EcoRI Schnittstelle unmittelbar stromaufwärts des Startcodons des Prolylendopeptidasegens folgendermaßen erzeugt (siehe 3). Das synthetische Fragment II (SEQ ID Nr. 3) wird durch Ligation der vier Oligonukleotide U1, U2, L1 und L2 (siehe jeweils SEQ ID. Nr. 4, 5, 6 und 7) hergestellt, worin zwei von ihnen (U2 und L1) an ihren 5'-Enden phosphoryliert wurden. Das hergestellte Fragment entspricht vom Startcodon bis zur PvuII Schnittstelle der stromaufwärts liegenden Region und hat einen überstehenden 5'-Terminus unmittelbar stromaufwärts der Startstelle zur Einführung einer EcoRI Schnittstelle nach einer Ligation. Zur folgenden Ligation werden beide 5'-Enden des hergestellten Fragments durch T4 Polynukleotidkinase phosphoryliert.
Das Plasmid pFPEP04', worin eine der vier PvuII Schnittstellen deletiert wurde, wird mit PvuII geschnitten und das Fragment, das das meiste der kodierenden Region enthält, wird durch Agarosegelelektrophorese isoliert und mit dem zweiten oben beschriebenen synthetischen Fragment ligiert. Das durch die Ligation erhaltene Produkt wird mit EcoRI verdaut, um den vollständigen offenen Leserahmen mit den 5'-überhängenden, klebrigen Enden an beiden Termini zu isolieren, das dann in die EcoRI Schnittstelle von pUC119 subkloniert wird. Die zwei synthetischen Regionen im erhaltenen Plasmid pFPEP-EE werden sequenziert und die mutierten Nukleotidsequenzen werden bestätigt. Das entstehende Plasmid ist pFPEP-EE.
Im nächsten Schritt der Vektorkonstruktion, wie sie in 4 gezeigt ist, wird die gesamte kodierende Region zusammen mit einer kurzen stromabwärts liegenden nicht-kodierenden Region durch EcoRI aus pFPEP-EE ausgeschnitten. Das Fragment wird dann in die EcoRI Schnittstelle des Expressionsvektors pKK223-3 unter Bildung von pKK-FPEP inseriert, worin die Transkription des Prolylendopeptidasegens unter der Kontrolle des tac-Promotors liegt.
Der Replikationsursprung von pKK223-3 stammt von pBR322 und die Kopiezahl dieses Expressionsvektors in einer einzelnen Zelle ist gewöhnlich niedrig. Aufgrund des höheren Dosiseffekts des Gens ist ein Plasmid mit hoher Kopiezahl als Expressionsvektor für eine stärkere Expression bevorzugt. Daher wird a) ein Satz des Promotors und der kodierenden Region oder b) ein Satz des Promotors, der kodierenden Region und des Terminators jeweils durch BamHI oder BbiII ausgeschnitten und in das Plasmid pUC119 mit hoher Kopiezahl eingesetzt. Da das Peptidasegen aus pKK-FPEP zusammen mit dem tac-Promotor transferiert wird, wird der ursprüngliche lac-Promotor von pUC119 durch PvuII entfernt, um einen doppelten Promotor zu vermeiden. Zwischen den stumpfen Enden, die durch diesen PvuII Verdau erzeugt wurden, wird entweder der Gensatz a) oder der Satz b), der durch T4 DNA Polymerase stumpfendig gemacht wurde, jeweils unter Bildung von pUK-FPEP-a oder pUK-FPEP-b eingesetzt (4).
Zur Überexpression der Prolylendopeptidase wird E.coli JM109 mit pUK-FPEP-a oder pUK-FPEP-b transformiert. Die Transformanden werden auf LB Platten selektiert, die 50 µg/ml Ampicillin enthalten, und über Nacht in LB Medium mit dem Ampicillin angezogen. Zur Expression der Prolylendopeptidase werden 100 ml CIRCLEGROW Medium (BIO 101 Inc. Vista, California) (ohne Ampicillin) mit 2 ml der Übernachtkultur angeimpft und bei 37°C geschüttelt. In einem vorläufigen Experiment ist der maximale Expressionsspiegel in den pUK-FPEP-a enthaltenden Transformanden (13 500 Einheiten/l) zweimal so hoch, wie der für pUK-FPEP-b (6 600 Einheiten/l) wenn die Expression mit 1 mM IPTG einen halben Tag nach der Beimpfung geboostert wird. Ohne IPTG ist der Grundspiegel für beide Klone immer noch recht hoch, im Fall von pUK-FPEP-b sogar höher (8 060 Einheiten/l) als der durch die Zugabe von IPTG erhaltene Spiegel.
Da pUK-FPEP-a den höchsten Expressionsspiegel zeigt, der das 39-fache der durch F. meningosepticum erhaltenen Enzymaktivität und das vierfache des mit pFPH5-KD50 erhaltenen Expressionsspiegels zeigt, wird der Zeitverlauf der Expression mit und ohne der Zugabe von IPTG verfolgt (Tabelle IV). Wenn das Wachstum, wie es durch die Absorption der Kulturbrühe bei 550 nm verfolgt wird, 4 Stunden nach der Beimpfung langsamer wird, erhöht sich die Aktivität des Enzyms linear mit dem Zeitverlauf. Ohne dem Boostern der Expression durch das IPTG erhöht sich die Aktivität weiter linear bis zu 20 Stunden, um die maximale Menge von 7 400 Einheiten/l nach 24 Stunden zu ergeben und nimmt dann ab. Die spezifische Aktivität der Endopeptidase bleibt nach 12 Stunden um die 11 Einheiten/mg Protein konstant. Wenn andererseits 1 mM IPTG nach 12 Stunden zugegeben wird, wird die Steigerung deutlich unmittelbar nach der Zugabe erhöht und erreicht den höchsten Expressionsspiegel von 13 500 Einheiten/l nach 28 h. Es wird auch eine signifikante Zunahme der spezifischen Aktivität gleichzeitig mit dem starken Anstieg der Expressionsmenge beobachtet und die maximale spezifische Aktivität von 40 Einheiten/mg Protein wird nach 28 h und später beobachtet, was deutlich die Wirkung der IPTG Induktion auf den tac-Promotor zeigt. Da eine typische reine Präparation der Prolylendopeptidase von F. meningosepticum bekanntermaßen eine spezifische Aktivität von 115 Einheiten/mg Protein aufweist (T. Yoshimoto et al., 1978, siehe obige Literaturstelle) macht das exprimierte Enzym über 30 % des insgesamt aus E. coli extrahierten Proteins aus.

Eine solch hohe Expression der Prolylendopeptidase wird auch in der SDS-PAGE Analyse gezeigt. Bereits 6 Stunden nach der Beimpfung taucht eine neue Bande an derselben Position auf, wie der Standard der Prolylendopeptidase und die Ausdehnung dieser Bande zeigt deutlich die Zunahme des Expressionsspiegels während dem Zeitverlauf von 12 Stunden bis 28 Stunden gleichzeitig mit der Veränderung der Gesamtaktivität des Enzyms. Tabelle IV Expression der Prolylendopeptidase in E. coli (JM109), der pUK-FPEP-a enthält^a

	Ohne IPTG			Mit IPTG^b
Zeit (h)	Absorption bei 550 nm	Gesamtaktivität (Einheiten/l)	Spezifische Aktivität (Einheiten/mg Protein)	Absorption bei 550 nm	Gesamtaktivität (Einheiten/l)	Spezifische Aktivität (Einheiten/mg Protein)
0	0,15	14,5	17,7	0,15	14,5	17,7
4	2,17	369	2,3	2,8	351	2,5
8	3,92	2206	7,1	3,90	1977	8,3
12	4,63	3601	11,1	4,71	2915	8,6
14	5,12	4119	10,7	4,87	4762	14,8
16	5,86	5038	11,3	5,06	7708	24,7
20	6,24	7129	13,6	4,88	11340	35,2
24	6,35	7416	12,7	4,79	12850	37,5
28	6,60	6120	11,0	5,13	13490	39,8
36	5,60	4683	10,9	4,86	10400	40,4

^a Der transformierte E. coli wird in CIRCLEGROW Medium bei 37°C unter Schütteln in einem Rundschüttler (120 Upm) kultiviert. Das Wachstum der Zellen wird durch die Absorption bei 550 nm verfolgt und die spezifische Aktivität und die Gesamtaktivität werden über 36 Stunden nach dem Beimpfen verfolgt.
^b Um die Expression zu boostern wird 1 mM IPTG nach 12 Stunden zugegeben

Beispiel 7: Herstellung der rekombinanten Prolylendopeptidase
Da Prolylendopeptidase in E. coli in einer löslichen und wirksamen Form exprimiert wird und der Expressionsspiegel so hoch ist (mehr als 30 % des gesamten extrahierten Proteins) ist die Isolierung des exprimierten Enzyms ziemlich unkompliziert.
E. coli Zellen, die mit dem Expressionsplasmid pUK-FPEP-a transformiert sind, werden in CIRCLEGROW Medium und einem Booster mit IPTG für 28 Stunden bei 37°C kultiviert. Die E. coli Zellen werden durch Zentrifugation (3000 × g für 10 Minuten) geerntet und mit kaltem 0,1 M HEPES Puffer mit pH 7,4 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in 0,1 M HEPES resuspendiert und intermittierend durch Ultrabeschallung über 20 Minuten mit einem SONIFIER 450 (Branson Sonic Power Co.) zerstört. Das Lysat wird dann mit einer Ammoniumsulfatfällung fraktioniert. Das bei 65-90 % Ammoniumsulfatsättigung gefällte Protein wird in 20 mM Phosphatpuffer, pH 6,2 gelöst und gegen denselben Puffer dialysiert. Das Dialysat wird auf eine CM52 Säule aufgetragen (Whatman BioSystems Ltd.), die mit demselben Puffer äquilibriert ist. Das Enzym wird durch einen linearen Gradienten aus NaCl eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, durch Ultrafiltration mit einer Amicon Zelle und einer YM30 Membran (Amicon Div. W.R. Grace & Co.) konzentriert und gegen 20 mM Phosphatpuffer mit pH 6,8 dialysiert. Die Pro lylendopeptidase wird weiter auf einer Mono S HR 10/10 Säule (Pharmacia LKB Biotechnology AB) gereinigt. Mit einem NaCl Gradienten (0-0,075 M) wird die Endopeptidase in einem scharfen Peak um 0,035 M NaCl eluiert. Das gereinigte Enzym scheint homogen zu sein und gibt auf der SDS-PAGE nur eine einzelne Bande.
Beispiel 8: Herstellung des das luteinisierende Hormon freisetzenden Hormons (LH-RH)
Da LH-RH (ein Decapeptid) einen Prolinrest an der vorletzten Position aufweist, kann es aus einem Nonapeptidvorläufer und Glycinamid hergestellt werden. In Gegenwart einer katalytischen Menge an Prolylendopeptidase (0,08 µM werden 1 mM des Vorläufers und 2,0 M Glycinamid in 60 % Glycerin bei pH 7,0 und 30°C inkubiert. Nach 48 Stunden kommt die Kupplung zu einem Gleichgewicht mit der Hydrolyse und man erhält LH-RH in einer Konversion von 67 % in quantitativer Ausbeute (97 % Isolierungsausbeute). Der Rest der Vorläufers wird in einer HPLC Reinigung gewonnen und es wird keine Nebenreaktion beobachtet.
Beispiel 9: Herstellung von Oxytocin
Oxytocin, ein Nonapeptid mit einem Prolinrest an der dritten Position von dessen C-Terminus aus erhält man durch Kuppeln des Vorläufers der ersten sieben Reste an Leucylglycinamid mit Prolylendopeptidase. In einem typischen Beispiel werden 1 mM des Oxytocinvorläufers [1-7] und 0,8 M Leucylglycinamid mit 0,13 µM Prolylendopeptidase in 60 % Glycerin bei pH 6,5 und 30°C inkubiert. Die Kupplung läuft bis sie ein Gleichgewicht nach 48 Stunden erreicht hat und 55 % des Vorläufers werden zu Oxytocin in quantitativer Ausbeute (91 % Isolierungsausbeute) umgewandelt. Es wird kein Nebenprodukt detektiert und 43 % des Ausgangsmaterials werden gewonnen.
Beispiel 10: Alternatives Verfahren zur Reinigung der rekombinanten Prolylendopeptidase
E. coli Zellen, die Prolylendopeptidase exprimieren, werden durch Zentrifugation (10 000 × g für 10 Minuten) geerntet und mit kaltem 0,1 M Tris-HCl Puffer pH 8,0 gewaschen. Die gewaschenen Zellen werden in 0,5 M Saccharoselösung, die 5 mM EDTA enthält und mit 0,1 M Tris-HCl auf pH 8,0 gepuffert ist, resuspendiert. Lysozym (160 mg/ml) wird zur Suspension gegeben und das Gemisch wird für 2 Minuten auf Eis stehengelassen, bevor es mit demselben Volumen an eiskalten Wasser verdünnt wird. Die verdünnte Zellsuspension wird für 30 Minuten auf Eis stehengelassen und dann bei 10 000 × g für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird erneut mit demselben Volumen eiskaltem Wasser verdünnt und der pH wird mit 1 N NaOH auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene rohe Enzymlösung (eine Periplasmafraktion) wird direkt auf eine CM52 Säule (Whatman BioSystems Ltd.) aufgetragen, die mit 20 mM Phosphatpuffer mit pH 6,8 äquilibriert ist. Das Enzym wird in einem einzigen Peak mit einem lineaen Gradienten (0-0,25 M) NaCl eluiert. In diesem alternativen Reinigungsverfahren mit dem osmotischen Schockverfahren wird die Prolylendopeptidase mit einem einzigen chromatographischen Schritt bis zur Homogenität gereinigt, wie dies durch SDS-PAGE Analyse beurteilt wird.
Beispiel 11: Eigenschaften der rekombinanten Prolylendopeptidase aus Flavobacterium meningosepticum, die in E. coli exprimiert wird
Das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren (B) wird modifiziert, um die gereinigte Prolylendopeptidase zu testen. DTT (1 mM) und BSA (100 µg/ml) werden in die Pufferlösung aus 0,1 M Phosphat (pH 7,0) für den Test eingearbeitet, um die Reproduzierbarkeit und die Genauigkeit der kinetischen Messung zu verbessern. Zu 0,94 ml dieser Pufferlösung werden 0,05 ml an 4 mM Z-Gly-Pro-p-Nitroanilid in 40 % Dioxan gegeben. Nach 3 Minuten Vorinkubation bei 30°C werden 0,01 ml der in Beispiel 10 erhaltenen Enzymlösung zum Gemisch gegeben und die Absorption bei 410 nm wird bei 30°C verfolgt.
In einer typischen Reinigung erhält man das Enzym mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 120 Einheiten/mg Protein. Das Molekulargewicht wird mit 71 000 und 74 000 jeweils durch Gelfiltration mit einer TSK-GEL G3000 SW Säule (Tosoh Corp.) und SDS-PAGE abgeschätzt. Das Enzym zeigt einen Extinktionskoeffizienten E (1 %/280 nm) von 15,5. Es kommen gemäß abgeleiteter Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 zwei Cysteinreste vor, es ist aber keine freie Sulfhydrylgruppe durch eine Titration mit p-Chlormercuribenzoesäure unter einer denaturierenden Bedingung mit 8 M Harnstoff detektierbar.
Die N-terminale Sequenz der rekombinanten Prolylendopeptidase beginnt mit Ala und wird gefolgt durch Gin, Asn, Ser, Asn, X (unbekannt), Leu, Lys, Tyr und Pro, was zeigt, dass die ersten 19 Aminosäurereste, die in der SEQ ID Nr. 1 gezeigt sind, für eine Signalsequenz kodieren und am N-Terminus des reifen Enzyms fehlen.
Hinterlegte Mikroorganismen
E. coli TG1/pFPEP03 wurde gemäß dem Budapester Vertrag beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan am 5. Juli 1991 als FERM BP-3466 hinterlegt.
Sequenzliste

Claims

Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine DNA Sequenz, die für die Flavobacterium meningosepticum Prolylendopeptidase kodiert, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, die von der Nukleotidposition 317 bis 2374 reicht und eine Signalsequenz wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, die von der Nukleotidposition 260 bis 316 reicht, kloniert in ein Multikopienplasmid unter der Kontrolle des E. coli tac Promotors.
Wirtsorganismus, der mit einem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 1 transformiert ist.
Wirtsorganismus nach Anspruch 2, der E. coli ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Expressionsvektors, umfassend eine DNA Sequenz, die für die Flavobacterium meningosepticum Prolylendopeptidase kodiert, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, welche von der Nukleotidposition 317 bis 2374 reicht und eine Signalsequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, die von der Nukleotidposition 260 bis 316 reicht, kloniert in ein Multikopienplasmid unter der Kontrolle des E. coli tac Promotors, das die folgenden Schritte umfasst Herstellung von cDNA oder genomischer DNA, die für die Flavobacterium meningosepticum Prolylendopeptidase kodiert, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist oder Herstellung der DNA durch chemische Synthese Insertion der DNA in einen Multikopienplasmidklonierungsvektorunter der Kontrolle des E. coli tac Promotors, Selektion eines Hybridexpressionsvektors, der die DNA enthält und exprimiert, die für die Flavobacterium meningosepticum Prolylendopeptidase kodiert, wie sie in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Wirtsorganismus nach Anspruch 2, das die Transformation dieses Wirtsorganismus mit einem rekombinanten Expressionsvektor nach Anspruch 1 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, worin der Wirt E. coli ist.