CZ321497A3 - Způsob vhodný pro produkci látek, jejichž základ tvoří dipeptid - Google Patents

Způsob vhodný pro produkci látek, jejichž základ tvoří dipeptid Download PDF

Info

Publication number
CZ321497A3
CZ321497A3 CZ973214A CZ321497A CZ321497A3 CZ 321497 A3 CZ321497 A3 CZ 321497A3 CZ 973214 A CZ973214 A CZ 973214A CZ 321497 A CZ321497 A CZ 321497A CZ 321497 A3 CZ321497 A3 CZ 321497A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dipeptide
pro
expression
peptide
ala
Prior art date
Application number
CZ973214A
Other languages
English (en)
Inventor
Scott W. Borneman
Anil Goyal
Michael J. Conder
Victor A. Vinci
Original Assignee
Merck And Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck And Co., Inc. filed Critical Merck And Co., Inc.
Publication of CZ321497A3 publication Critical patent/CZ321497A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/463—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from amphibians
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Způsob výroby látek, jejichž meziprodukt je dipeptid.
í
Dosavadní stav techniky k'* Popisuje se produkce látek ve velkém měřítku, které jsou alespoň zčásti založeny na meziproduktu, kterým je dipeptid. Dostupnost velkého množství dipeptidu umožňuje nízké náklady. Pro tento účel se mohou použít dipeptidy vlastně libovolných aminokyselin připravené synteticky, avšak syntéza dipeptidu může být časově náročná a nákladná, což redukuje účinnost produktu výroby a zvyšuje náklady na výrobu. Tyto nevýhody hrají zvláště důležitou úlohu při výrobě látek založených na meziproduktu, kterým je dipeptid, ve velkém měřítku.
Podstata vynálezu
Popisuje se postup výroby látek, jejichž meziprodukt je dipeptid. Uvedené látky se vyrábějí metodami genového inženýrství ze syntetické sekvence DNA nebo z přirozeně se vyskytující sekvence DNA. Oba druhy uvedených sekvencí kódují protein nebo peptid, který má specifické repetice dipeptidové sekvence. Dipeptidové meziprodukty se uvolňují z většího proteinu nebo peptidů, dále se zpracovávají za vzniku konečné látky.
Dipeptidové meziprodukty vznikají v rekombinantních i- hostitelských buňkách expresí rekombinantní molekuly DNA, která kóduje nejméně jeden dipeptidový meziprodukt. Rekombinantní molekula DNA může být buď syntetická molekula DNA nebo přirozeně se vyskytující sekvence DNA. DNA kódující dipeptid se klonuje do expresivního vektoru za účelem exprese v rekombinantní hostitelské buňce. Po expresi v • · · · · · • · ·'· • · · • · · · rekombinantním hostiteli se dipeptid izoluje za účelem dalšího zpracování. Před izolací dipeptidu může být nezbytné oddělit dipeptid od většího polypeptidu. Větší polypeptid, který obsahuje dipeptidový meziprodukt může zahrnovat více repetic sekvence dipeptidu nebo se může vyskytovat v jedné proteinu obsahujícího dipeptidovou sekvencí, rozdělit na jednotlivé Jednotlivé nebo více kopiích, jako část většího aminokyselinové sekvence, které nejsou Repetice dipeptidové sekvence se mohou dipeptidy enzymatickým nebo chemickým štěpením, dipeptidy se pak mohou dále čistit za účelem dalšího zpracování. používáj i hostitelské pak mohou dále
Rekombinantními hostitelskými buňkami, které se k libovolné dipeptidu, mohou být které jsou schopny DNA. Odborníkovi je často prakticky libovolný rekombinantní hostitel je použití v procesu podle vynálezu. Preferované 1 buňky zahrnují, ale nejsou limitovány na bakterie . mezi něž patří kvasinky. Bakteriální a hostitelské buňky hub, které jsou použitelné podle vynálezu a jsou běžně dostupné zahrnují, ale nejsou limitovány na Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Escherichia
Streptomyces lividans a Bacillus
Odborníkům je také zřejmé, rekombinantní produkci buňky, molekuly exprimovat > jasné, že vhodný při hostitelské a buňky hub coli, Aspergillus niger, subtilis.
že expresivní vektory pro expresi DNA kódující dipeptid může být v podstatě libovolný expresivní vektor použitelný ve vybraných hostitelských buňkách. Preferované vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na ty, které jsou použitelné v bakteriích a v buňkách hub, mezi něž patří kvasinky. Bakteriální které jsou vhodné při použití dostupné, zahrnují, ale nejsou uvedeny.
Oddělení dipeptidu od zbývajících dipeptidových sekvencí nebo oddělení jednotlivých dipeptidu od dipeptidových repetic a houbové expresivní vektory, podle vynálezu a jsou běžně omezeny na ty, jež jsou zde ·· ·· ·· ···· ·« ·· • · · ♦ · · · · · · · ,·········· > ·····'*·♦ ··· · · ··· ···· ··· ······ ·· ·· ··'·· proběhlo enzymaticky za použiti enzymu, který štěpí polypeptid ve vhodném místě, aniž dojde k porušení dipeptidového meziproduktu. Enzymy vhodné pro použití v uvedeném procesu podle vynálezu jsou běžně dostupné nebo se produkují v organizmu, který má vhodnou enzymatickou „ aktivitu. Výběr vhodného enzymu závisí na skutečnosti, zda bude exprimována určitá dipeptidová sekvence.
Φ Dipeptid se může izolovat buď před nebo po jeho separaci od zbytku polypeptidů nebo od repetic dipeptidu. V procesu podle vynálezu se mohou za účelem izolace použít standardní chromatografické metody, mezi něž patří, ale nejsou omezeny na frakcionaci solí, iontoměničovou chromatografii, vylučovací chromatografii na základě velikosti, adsorbční chromatografii na hydroxylapatitu a chromatografie na základě hydrofóbních interakcí.
Klonovaná DNA získaná zde popsaným způsobem může být rekombinantně exprimovaná molekulárním klonováním do expresivního vektoru, který obsahuje vhodný promotora jiné vhodné elementy, jež regulují transkripci. Tento vektor se zavede do prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buněk za účelem produkovat rekombinantní peptid. Způsob takových manipulací se popisuje v publikaci Sambrook,J. et al., (citace uvedena shora) a jsou v oboru dobře známy.
Expresivní vektory se zde definují jako sekvence DNA, které jsou nutné pro transkripci klonovaných kopií genů a pro (. translaci jejich mRNA ve vhodném hostiteli. Takové vektory se mohou použít pro expresi eukaryontních genů v různých hostitelích, jako jsou bakterie, sinice, rostlinné buňky, hmyzí buňky, buňky hub a zvířecí buňky.
Specificky vytvořené vektory umožňují přenos DNA mezi hostiteli jako jsou bakterie-kvasinky nebo bakterie-zvířecí buňka nebo bakterie-buňka hub nebo bakterie-buňka obratlovců. Vhodně konstruovaný expresivní vektor by měl obsahovat:
• · • · · · · · · · · « ····*····· ·· ·· počátek replikace pro autonomní replikaci v hostitelských buňkách, selekční markéry, omezený počet použitelných restrikčnich míst, potenciál pro tvorbu vysokého počtu kopii a aktivní promotory. Promotor se definuje jako sekvence DNA, která řídi navázání RNA polymerázy na DNA a inicijuje syntézu ... RNA. Silný promotor je ten, který inicijuje mRNA ve vysoké frekvenci. Expresivní vektory mohou zahrnovat, ale nejsou *2 omezeny na klónovací vektory, modifikované klónovací vektory, specificky vytvořené plazmidy nebo viry.
Různé savčí expresivní vektory se mohou použit k expresi rekombinantniho peptidu v savčích buňkách. Obecně dostupné savčí expresivní vektory, které jsou vhodné pro expresi rekombinantniho peptidu zahrnují, ale nejsou omezeny na pcDNA3 (Invitrogen), pMclneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593 pBPV-l(8-2) (ATCC37110), pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo(ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) a XZD35(ATCC 37565).
Různé bakteriální expresivní vektory se mohou použít pro expresi rekombinantniho peptidu v bakteriálních buňkách. Běžně dostupné bakteriální expresivní vektory, které jsou vhodné pro exprsesi rekombinantniho peptidu zahrnují, ale nejsou omezeny na pETlla (novagen), lambda gtll (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).
Různé expresivní vektory buněk hub se mohou použít pro expresi rekombinantniho peptidu v buňkách hub. Běžně dostupné expresivní vektory buněk hub, které jsou vhodné pro expresi rekombinantniho peptidu zahrnují, ale nejsou omezeny na pYES2 (Invitrogen), expresivní vektor Pichia (Invitrogen).
Různé expresivní vektory hmyzích buněk se mohou použít pro expresi rekombinantniho peptidu v hmyzích buňkách. Běžně dostupné expresivní vektory hmyzích buněk, které jsou vhodné • ♦ •· ···· pro rekombinatní expresi peptidu zahrnují, ale nejsou omezeny na pBlue Bac III (Invitrogen).
Expresivní vektor obsahující DNA kódující dipeptidový meziprodukt se může použít pro expresi peptidu v rekombinantní hostitelské buňce. Rekombinantní hostitelské buňky mohou být prokaryontní nebo eukaryontní, mezi něž patří, ale nejsou omezeny na bakterie, jako jsou E.coli, buňky hub, jako jsou kvasinky, buňky savců, mezi ně patří, ale nejsou omezeny na linie buněk lidského, hovězího, vepřového, opičího původu a buňky hlodavců a hmyzí buňky, mezi ně patří, ale nejsou omezeny na Drosophila a buňky získané z housenky bource morušového. Buněčné linie získané z ze savčích druhů, které jsou vhodné a které jsou obecně dostupné zahrnují, ale nejsou omezeny na L buňky L-M(TK) (ATCC CCL 1.3), L buňky L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Ráji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1(ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-KI (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) a MRC-5 (ATCC CCL 171).
Expresivní vektor se může zavést do hostitelských buněk libovolným způsobem vybraným ze skupiny, která zahrnuje, ale není omezena na transformaci, transfekci, lipofekci, fúzi protoplastů a elktroporaci. Buňky obsahující expresivní vektor se klonálně pomnožují a v jednotlivých buňkách se analyzuje produkce proteinu. Stanovení klonů hostitelských t buněk, které exprimují peptid, se může provést několika způsoby, které zahrnují, ale nejsou omezeny na imunologickou reaktivitu s anti-peptidovými protilátkami a přítomnost Βχ aktivity spojené s hostitelskými buňkami, jako je specifické navázání ligandu na peptid nebo signální transdukce, která se definuje jako odezva zprostředkovaná interakcí Βχ specifických ligandů na receptor.
Exprese DNA se může také uskutečnit použitím in vitro produkované syntetické mRNA nebo nativní mRNA. Syntetická mRNA nebo mRNA izolovaná z buněk, které produkují peptid se může účinně překládat do různých bezbuněčných systémů, které zahrnují, ale nejsou omezeny na extrakry moučných červů a extrakty retikulocytů, stejně jako se mohou účinně překládat do buněčných Systémů, které zahrnují, ale nejsou omezeny na mikroinjekce do žabích oocytů.
Aby se určily sekvence DNA, které nebo která umožňuje získat optimální hladinu proteinu, mohou se konstruovat molekuly DNA, které zahrnují, ale nejsou omezeny na otevřený čtecí rámec DNA v plné délce a několik konstrukcí, které obsahují části DNA kódující protein.
Úroveň exprese proteinu se může určit následným zavedením, jak zavedením jednotlivých konstrukcí, tak i zavedením kombinace uvedených konstrukcí do vhodných hostitelských buněk. Po stanovení kazety DNA, která dosahuje optimální exprese, například tranzientními testy se tato konstrukce DNA přenese do různých expresivních vektorů za účelem exprese v hostitelských buňkách, které zahrnují, ale nejsou omezeny na buňky savců, hmyzí buňky, E.coli a buňky kvasinek, jako jsou S.cerevisiae.
Následujícími metodami se testuje hladina proteinu v hostitelských buněčných transfektantech a oocytech po mikroinjekci. Po vhodném časovém úseku, který umožňuje expresi se měří hladina proteinu. Jeden způsob pro detekci peptidu zahrnuje přímé měření hladiny peptidu v celých buňkách nebo v buněčném lyzátu, který se připravil z hostitelských buněk transfektovaných DNA.
Dipeptid alanyl-prolin, Ala-Pro je počáteční materiál pro syntézu ACE inhibitoru enalaprilu. Dipeptid Lys-Pro je počátečný materiál pro syntézu ACE inhibitoru lysinoprilu. Obecně dostupný dipeptid je současně syntetizován chemicky.
• · • · • · · »4 · ·4 ···· · • · « ···· *·· ·· ···· «· «.· ·· ««
Vyvinul se nový bioproces, který úspěšně eliminuje chemické stupně při produkci Ala-Pro nebo Lys-Pro. Proces využívá rekombinantního hostitele k nadměrné expresi peptidu, který obsahuje repetice dipeptidu Ala-Pro nebo Lys-Pro. Tyto dipeptidy se pak hydrolyzují bakteriální prolypeptidázou na své Ala-Pro nebo Lys-Pro jednotky. Vzhledem k dostupnosti expresivnich vektorů se vybraly jako hostitelský organizmus buňky Escherichia coli. Do běžně dostupného expresivniho vektoru pMAL se klonoval chemicky syntetizovaný oligonukleotid, který kóduje repetice Ala-Pro, a vhodná ligačni místa. Fermentaci rekombinantnich bakterii E.coli, které obsahuji konstrukci, se docílí požadovaného fúzního produktu, který se určí na proteinových gelech. Pro uvolnění Ala-Pro jednotek se použilo enzymatické zpracování. Běžně dostupný faktor X se použil pro uvolněni peptidu (Ala-Pro)n20, ačkoli se . mohou použít i polypeptidázy. Předchozí testování za účelem zjistit přítomnost prolylpeptidázy vedlo k identifikaci kmenů Lactobacillus helveticus a Xanthomonas maltophilia, které vykazují aktivitu proti Ala-Pro-pNA a syntetickým substrátům (Ala-Pro)n. Ukázalo se, že surové extrakty z každé kultury se úspěšně zpracovaly (Ala-Pro) n.2o na Ala-Pro, což se určilo pomocí HPLC analýzy. Jestliže se zkombinovaly extrakty z obou kultur, pozoroval se synergický účinek. Myslelo se, že prolypeptidázová aktivita kmene L. helveticus je způsobena exopeptidázovou aktivitou, jako protiklad endopeptidázové aktivity, kterou vykazuje X. maltophilia. Popsaný bioproces má tu výhodu, že se nepoužívají toxické materiály běžné při chemické syntéze a může se přizpůsobit i pro jiné peptidy.
Po následující expresi dipeptidového meziproduktu v rekombinantní hostitelské buňce se může izolovat rekombinantní protein a získá se čistá forma dipeptidového meziproduktu. Může se použít několik čistících postupů. Jak • · • ·
se zde popisuje, rekombinantní dipeptidové meziprodukty se mohou čistit z buněčných lyzátů a extraktů různými kombinacemi aplikace postupů frakcionace soli, iontoměničové chromatografie, vylučovací chromatografie na základě velikosti, adsorbční chromatografie na hydroxylapatitu a .. chromatografie na základě hydrofóbnich interakcí.
Po čištěni dipeptidového meziproduktu jedním nebo více $ zde popsanými způsoby se peptidové meziprodukty dále zpracovávají na konečný produkt. V případě dipeptidového meziproduktu Ala-Pro vzniká dalším zpracováním konečný produkt známý jako enalapril a jemu příbuzné látky. Proces uvedeného zpracováni se popisuje v U.S. patentu č. 4.374.829 a U.S. patentu č. 4.555.502. V případě dipeptidového meziproduktu Lys-Pro další zpracování vede ke vzniku konečného produktu, který je znám jako lisinopril a příbuzné látky. Postup dalšího zpracování se uskutečnil podle popisu v U.S. patentu č. 4,374,829 a U.S. patentu č. 4,555,502.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1: Konstrukce vektoru pro expresi dipeptidu
Za účelem vytvoření vektoru, který exprimuje sekvenci DNA dipeptidových repetic se vybral plazmid. Vektor bude mít počátek replikace vhodný pro zvoleného hostitele, v jiném případě vektor může obsahovat počátky pro expresi více jak jednoho genu, což umožňuje, že bude fungovat jako pendlující vektor. Geny nesoucí rezistenci na antibiotika a/nebo < auxotrofní markéry jsou na plazmidu nezbytné, aby potvrdily, že proběhla transformace nebo vstup vektoru do buňky a že selektivnímy tlaky se udržuje stabilita vektoru. Silný promotor, jako je indukovatelný promotor tac, umožní maximální expresi genu(ů) po směru transkripce. Zahrne se společné vazebné místo na ribozomu a toto místo je specificky • · ·· rozpoznatelné preferovaným hostitelem. Za účelem zajistit správnou délku rekombinantniho peptidů se můžou do vektoru po směru transkripce umístit terminační sekvence transkripce a terminační kodony.
V jiném případě se může v expresivním vektoru kódovat fúzní protein. Vektor bude kódovat zkrácený peptid, který je obecně silně- exprimován v nativního promotoru nebo Klónovací místa pro gen preferovaném hostiteli z jeho z jiného silného promotoru, nebo oligonukleotid kódující dipeptidový meziprodukt, jako je Ala-Pro nebo Lys-Pro repetice, se může vytvořit syntetickými postupy nebo může být v místě založeném na 5' konci nebo 3'konci sekvencí DNA repetic. Exprimovaná výsledná konstrukce DNA dává vznik proteinu, který obsahuje zkrácený enzym nebo vazebný protein, jako je protein, který váže maltózu z bakterií E.coli, fúzovaný se sekvencí dipeptidového meziproduktu. Separace může jednoduše proběhnout, přičemž se fúzní partner stává použitelným. Následné zpracování odstraní peptid 5'konce. U některých hostitelů se mohou použít k vylučování požadovaného produktu signálně nebo vedoucí peptidy, které umožní správný extracelulární transport.
V hostitelském organizmu se může preferovaný kodon manipulovat za účelem dosažení vyšší exprese. Použitý kodon bude obecně umístěn v hostitelské buňce tak, že jeden nebo více kodonů se použije převážně během exprese specifických genů. Silně exprimované geny dávající vyšší hladiny proteinů nebo peptidů se kódují kodony, které se používají ve srovnání s ostatními častěji. U bakterií E.coli jsou pro lysin dostupné dva kodony AAA a AAG; pro prolin jsou možné čtyři kodony CCA, CCC, CCG a CCU. Sekvence kodonu CCG se používá častěji a tak zbytek Pro v syntetickém oligonukleotidu LysPro se vytvořil jako CCG. Lys je kódován pouze dvěma kodony, které nemají jasnou preferenci. Proto oligonukleotid, který ·· • ·
ίο se stane exprimovanou repeticí Lys-Pro jako Lys-Pro polypeptid, vznikl na základě obouch kodonů AAA a AAG. Pro
Ala-Pro oligonukleotid se preferují sekvence kodonu GCT a GCA a ty také poskytují maxumální expresi v E.coli.
Příklad 2: Klonování DNA do expresivních vektorů E. coli
Produkce ~ rekombinantního peptidu v bakteriích E. coli následuje po zavedení expresívní kazety peptidu do expresivních vektorů E.coli, které zahrnují, ale nejsou omezeny na sérii pET (Novagen). Ve vektorech pET se exprese peptidu řídí přísně regulovaným bakteriofágovým vektorem T7. Pak následuje transfer této konstrukce do hostitele E.coli, který obsahuje chromozomální kopii genu T7 RNA polymerázy řízeného indukovatelným promotorem lac. Exprese peptidu je indukována, když se ke kultuře přidá vhodný substrát (IPTG). Úroveň exprimovaného peptidu se určí zde popsanými testy.
cDNA kódující celý otevřený čtecí rámec peptidu je začleněn do restrikčního místa Ndel plazmidu pETIIa. Konstrukce v pozitivní orientaci se určily sekvenční analýzou a použily se pro tansformaci expresivního hostitelského kmene BL21. Transformanty se pak používají pro inokulaci kultur za účelem produkce proteinu. Kultury se kultivují v mediích M9 nebo ZB, jejichž složení je odborníkům známo. Když se dosáhlo hodnoty OB6oo=l/5/ indukovala se exprese peptidu po dobu 3 hodin při teplotě 37°C lmM IPTG.
Příklad 3: Klonování DNA do vektorů vhodných pro expresi ve hmyzích buňkách.
Bakulovirové vektory, které se získaly z genomu AcNPV viru, jsou vytvořeny tak, aby poskytly silnou expresi cDNA v linii Sf9 hmyzích buněk (ATCC CRL#1711). Rekombinantní bakulovirová exprimující DNA kódující dipeptidový meziprodukt se tvoří následujícími standardními metodami (InVitrogen
Maxbac Manual): konstrukce DNA se ligují do genu polyhedrinu v různých bakulovirových transferových vektorech, které zahrnují vektory pAC360 a BlueBac (Invitrogen). Rekombinantní bakuloviry vznikají homologní rekombinací, po níž následuje kotransfekce bakulovirového transferového vektoru a linearizované genomové DNA AcNPV (Kitts, P.A., Nuc. Acid. Res. 18, 5667-(1990)) do buněk Sf9. Rekombinantní viry pAC360 se určily na základě absence inkluzních tělísek v infikovaných buňkách a rekombunantni viry pBlueBac se určily na základě exprese β-galaktozidázy (Summers, M.D. and Smith, G.E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin No. 1555). Pak následuje izolace plaků a exprese peptidu se měří zde popsaným testem.
cDNA kódující celý otevřený čtecí rámec peptidu se vnese do BamHI restrikčního místa vektoru pBlueBacII. Sekvenční analýzou se určí konstrukce v pozitivní orientaci a použijí se pro transfekci buněk Sf9 za přítomnosti lineární AcNVP DNA divokého typu.
Ve spojení s infikovanými buňkami se našel autentický peptid. Peptid se extrahoval z infikovaných buněk hypotonickou lyží nebo lyží za pomoci detergentu.
V jiném případě se peptid exprimoval v buněčné lini Schneider 2 Drosophila kotransfekcí buněk Schneider 2 vektorem, který obsahuje DNA peptidu po směru transkripce, přičemž tato DNA se řídí indukovatelným metallothioninovým promotorem a vektorem, který nese gen resistence na neomycin G418. Následuje kultivace buněk za přítomnosti G418, přičemž se získaly rezistentní buňky a přidáním CuSO4 se indukovala exprese peptidu.
Příklad 4: Klonování DNA do kvasinkového expresivního vektoru
Rekombinantní peptid se exprimuje v kvasinkách
S.cerevisiae. Optimální DNA cistronu se vnesla do • · · · · · ···· ·· 9 ·
·· ···· ·· ·· *·-% ·· expresivniho vektoru tak, že řídi intracelulárni nebo extracelulárni expresi heterolognich proteinů. V případě intracelulárni expresese vektory, jako jsou EmBLyex4 nebo podobné, se ligují do cistronu (Rinas, U. et al., Biotechnology 8, 543-545 (1900); Horowitz B. et al., J. Biol. Chem. 265, 4189-4192 (1989)). V případě extracelulárni exprese se oistron liguje do kvasinkových expresivních vektorů, které fúzují sekreční signál. Hladiny exprimovaného peptidu se určily zde popsaným testem.
Příklad 5: Izolace rekombinantního peptidu
Rekombinantně produkovaný peptid se může čistit protilátkovou afinitní chromatografii.
Afinitní peptidové protilátkové kolony vznikají přidáním anti-peptidových protilátek k přípravku Affigel-10 (Biorad). Jde o gelové podloží, které se preaktivuje estery Nhydroxysukcinimidu, přičemž protilátky tvoří kovalentní vazbu s lůžkem z agarózového gelu. Protilátky se pak spojují s gelem prostřednictvím amidových vazeb se spacer arm. Zbývající aktivované estery jsou pak deaktivovány 1M etanolaminem HC1 (pH8). Kolona se promývá vodou a pak 0,23M glycinem HC1 (pH2,6), přičemž se odstraní libovolné nekonjugované protilátky nebo volný protein. Kolona se pak ekvilibruje fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (pH7,3) smíchaným s činidlem pro smáčení vhodné membrány, jako je dětergent. Supernatant buněčné kultury nebo buněčné extrakty obsahující rozpuštěný peptid pomalu procházejí kolonou. Kolona se pak promývá fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem, který obsahuje detergenty až do okamžiku, kdy optická hustota (A280) se sníží na hodnotu pozadí, pak se protein vymyje 0,23M glycin-HCl (pH2,6) smíchaným s detergenty. Izolovaný protein se pak dialyzuje proti fyziologickému roztoku pufrovaným fosforečnanem.
Přiklad 6: Rekombinantní produkce dipeptidu Ala-Pro Exprese Ala-Pro
Strategie produkce Ala-Pro polypeptidu v bakteriích E.coli zahrnuje klonování sekvence kódující repetice Ala-Pro. Existuje řada komerčně dostupných systémů. Za účelem minimalizovat _čas vývoje se použil obecně dostupný systém pMAL, který se získal od firmy New England Biolabs. Systém používá vektor obsahující gen proteinu vázající maltózu, který je přilehlý k polylinkru, do kterého se klonuje sekvence DNA, jako je Ala-Pro repetice. Následuje indukce klonu, který obsahuje výše uvedený vektor a exprimuje se fúzní protein (maltóza-Ala-Pron) . Doména vázající maltózu se používá pro navázáni na kolonu s maltózou a pak následuje izolace, kdy maltózová doména se štěpí faktorem X.
Směrem k tomuto konci se navrhly dva komplementární oligonukleotidy (87-mer a 91-mer), které kódují jednotky se 14 Ala-Pro a terminační kodon. Oligonukleotidy se syntetizovaly pomocí standardních metod. Oligonukleotidy se čistily pomocí SDS-PAGE a extrahovaly se z gelu. Aby se dosáhlo správného sestavení a ligace ala-pro genu do plazmidu, provedlo se klonovaní za použití tupého a kohezního konce. Po transformaci do buněk E.coli se vybraly pozitivní klony. Proteinová analýza a indukční experimenty na jednom klonu AP/2 ukazují, že fúzní proteiny se produkují následnou indukcí. Určení velikosti pruhu na SDS-PAGE gelech naznačuje, že vzniká více jak jeden fúzní produkt. Nicméně indukce a produkce fúzního proteinu je jasná.
Obavy o změnu uspořádání klonované sekvence a správné rozpoznání terminačního kodonu, který je umístěn v oligonukleotidu vede ke sekvenování vložené DNA. DNA klonu se sekvenovala za použití M13 univerzálního primeru. Je zajímavé, že sekvence inzertu kóduje 20 repetic Ala-Pro místo
repetic Ala-Pro. Terminační kodon TAG je přítomný na konci 20 repetic. Uvažuje se, že přítomnost (Ala-Pro) 20 je způsobena dvěma nukleotidy, které mají zesílený střídavě uspořádaný patern a výsledné mezery jsou během rekombinace vyplněny polymerázou. Není neobvyklé, že zesílení je způsobeno sekvencí s vysokým počtem repetic. V tomto případě je výhodné, když to vede k vytvoření delšího genu (který obsahuje více repetic Ala-Pro).
Hydrolýza Ala-Pro substrátu
Tři bakteriální kultury Lactobacillus helveticus, L.sp., a Xanthomonas maltophilia vykazující podle literatury prolyldipeptidázovou aktivitu se získaly z ATCC. Kultury se kultivovaly v lahvích o objemu 250 ml a jejich hydrolytická aktivita se testovala proti běžně dostupnému kolorimetrickému substrátu Ala-Pro-pNA (zdroj). Všechny tři kultury vykazují aktivitu, jejíž velká část je spojená s buňkami (tabulka č. 1). Následně se připravily zásobní kultury na šikmém agaru a ve zmrazeném FVM. K optimálnímu růstu na šikmém agaru a ve stacionární kapalné kultuře laktobacili vyžadují mikroaerofilní komoru.
Tabulka č. 1: Specifická aktivita prolyldipeptidáz na (ALAPRO) 2
Kultura4 Specifická aktivita (U/mg)1 U/L1 pH opt.2 opt. Teplota3
L.Helveticus 0,156 8 5,6 50°C
L.unk.sp. 0,085 14,7 6,0 40°C
X.maltophilia 0,446 107 6,6 45°C
1. kde se uvolní U-pmol ALA-PRO za minutu při teplotě 37°C a optimálním pH
v
2. citrát fosforečnanový pufr při optimální teplotě
3. probíhá při pH8,0
4. enzymové extrakty z virtisem homegenizovaných buněk
Bylo vhodné získat substráty, které mohou reflektovat na aktuální oligomérový Ala-Pro substrát, který je dostupný. Následuje kultivace rekombinantních buněk E.coli. S tímto ohledem se syntetizovaly ve firmě Biosynthesis lne. peptidové oligoméry použitelné jako prolylpeptidázové substráty. Za účelem zhodnotit enzymovou aktivitu proti autentickým substrátům Ala-Pro se vyvinula metoda HPLC, kterou se separují peptidy s nízkou molekulovou vahou a volné aminokyseliny. Peptidová polymeráza z Biosynthesis se následovně izolovala za použití metody HPLC. Následuje sběr frakcí z HPLC. Jsou dostupné peptidy s 2,4 a 6 repeticemi. Stanovila se optimální, teplota a hodnota pH pro každý surový substrát (tabulka č. 2). Kultura L. helveticus poskytuje nejvyšší titr enzymu a specifické aktivity. Pro všechny studie se použily literatutou doporučená komplexní media. Neprováděla se žádná optimalizace medií nebo jejich testování. Na základě odlišností ve výskytu hydrolytických produktů se ukázálo, že laktobacili produkují endoprolyldipeptidázu a Xanthomonas produkuje exopeptidázu. Výhodou tohoto pozorování je dosažení synergického účinku při hydrolýze Ala-Pro6 kombinací enzymů.
Zdroj enzymu Protein (mg/ml) U/L1 (A-P)2 Specif. aktivita (U/mg)1 (A-P)2 (A-P)4 (A-P)6
Lactobacill us helveticus 2,04 186 1,82 2,15 0,94
Lactobacill us unk. Species 3,02 156 1,53 1,53 0,87
Xanthomonas 0,70 28 0,17 0,35 0,43
• · • · · ·· ·· maltophilia
1. jednotky teplotě 35°C
2. enzymové beater.
definované jako ALA-Pro uvolněných za minutu při a pH7,0.
extrakty z homegenizovaných buněk na bead zavedl že když porovnání do na alanin a účinné při se nadbytek normálními
Ala-Pro (600x
Ala-Pro,
Inhibitory hydrolýzy Ala-Pro6 prolin.
inhibici enzymu testovacími substrát se metalo a cystein Ala-Pro, zatímco na Ala-Pro, což štěpení Ala-Pro.
Zjistilo _ se, koncentrovaný v podmínkami) hydrolyzoval proteáz jsou mají malý účinek na hydrolýzu naznačuje, že oddělený enzym způsobuje Částečná izolace by také měla odstranit nežádoucí aktivity z těchto surových extraktů.
V tomto případě se dipeptidový meziprodukt Ala-Pro dále zpracovává na konečný produkt, který je známý jako enalapril a příbuzné látky. Proces zpracování se popisuje v U.S. patentu č. 4,374,829 a v U.S. patentu č. 4,555,502.
/ prolin jsou 256, 230 proteinů 25% tvoří
Příklad 7: Rekombinantní produkce dipeptidu Lys-Pro z rekombinantního rostlinného proteinu
Přirozeně se vyskytující sekvence bohaté na sekvence kódující Lys-Pro se nacházejí v genu proteinu buněčné stěny sóji (glycin max) (Hong et al., J.Biol.Chem., 1990). Tři geny SbPRPl, SbPRP2 a a 90 aminokyselinami, indikuje, že 34 až 40% lysin. Zvláště zajímavý v peptidové sekvenci 37 párů se považuje za skvělý zdroj
- - z — proteinu sóji bohatého na SbPRP3, které jsou tvořeny Složení aminokyselin těchto zbytků tvoří je SbPRPl, aminokyselin dipeptidu Lys-Pro. SbPRP3 kóduje 12 peptidových sekvencí Lysprolin a 18 až který obsahuje
Lys-Pro a tak
Pro, které zahrnuji dvě Lys-Pro-Lys-Pro opakující se sekvence kódované 183 a 195 bp v genu.
Klonování genu SbPRPl bohatého na Lys-Pro se provádí generováním primerů PCR založených na uveřejněných sekvencích DNA. Fragmenty DNA obsahující zajímavé sekvence vznikly za použití primerů a knihovny obsahující DNA sóji. Výsledná DNA bohatá na kodony Lys-Pro se ligovala do vhodných restrikčních míst v expresivním vektoru. Za použití hostitele E.coli peptidy sóji se exprimují a izolují z lyžovaných buněk, a použití buněk Lactobacillus helveticus nebo polypetidázy získané z tohoto kmene se protein hydrolyzuje na základní aminokyseliny a malé peptidy, které zahrnují zbytky Lys-Pro. Chromatografie nebo extrakce poskytuje relativně čistý LysPro.
Alternativní způsob je syntéza oligonukleotidů, které odpovídají repeticím Lys-Pro-Lys-Pro v peptidu SbPRP3, umístěným na vhodných restrikčních místech expresivního vektoru. Exprese ve správném hostiteli dá podstatné množství Lys-Pro ve formě oligopeptidů. Za použití Lactobacillus helveticus nebo polypeptidázy získané z tohoto kmene se peptid bohatý na lyzin a prolin hydrolyzuje na zbytky LysPro. V jiném případě peptidáza specifická pro prolin z Flavobacterium menigosepticum (Yoshimoto, T. et al., Agric. Biol. Chem., 42:2417, 1978) se používá pro hydrolýzu peptidu. Chromatografie nebo extrakce poskytuje relativně čistý LysPro .
V tomto případě se dipeptidový meziprodukt Lys-Pro dále zpracovává na konečný produkt, kterým je lysinopril a příbuzné látky. Proces tohoto zpracování se popisuje v U.S. patentech č. 4,374,829 a č. 4,555,502.
Příklad 8: Rekombinantní produkce dipeptidu Ala-Pro z rekombinantního proteinu z obojživelníků
Kyselý polypeptid s molekulovou hmotnosti přibližně 75kDa, který se nachází v zásobních granulích kožních žláz Xenopus laevis, který je znám jako APEG protein je bohatý na dipeptidy Ala-Pro (Gmachl, M. et al., FEBS Letters, 260: 145148). Nejméně 80% hmoty tvoří alanin, prolin, glutamová kyselina a glycin v poměru 2:2:1:1.
Λ cDNA expresívní knihovny ve vektoru odvozeném z vektoru lambda se může testovat pomocí oligonukleotidových sond vytvořených na základě publikované sekvence za účelem izolovat zajímavý fragment. V jiném případě protilátky k APEG se mohou použít za účelem testování takové expresívní knihovny cDNA. Fragment se může izolovat z klonu a může se začlenit do expresivního vektoru. Zpracování výsledného peptidu se provede jako v příkladu 6- hydrolýza substrátu Ala-Pro).
Preferovanou metodou je syntéza oligonukleotidu, který odpovídá přirozené sekvenci ..APEG DNA pro Ala-Pro-Ala-Pro-AlaPro (CACCAGCTCCAGCACCAG). Na základě vhodných restrikčních míst v oligonukleotidu, DNA se klonuje do expresivního vektoru za účelem exprese v rekombinantní hostitelské buňce, jak se uvádí na jiném místě. Polypeptid obsahující repetice dipeptidového meziproduktu je enzymaticky hydrolyzován, jak se popisuje shora, a dipeptidový meziprodukt Ala-Pro se izoluje za účelem dalšího zpracování na konečný produkt. V tomto případě se dipeptidový meziprodukt Ala-Pro dále zpracovává na konečný produkt, který je znám jako enalapril a příbuzné látky. Postup zpracování se provedl podle popisu v U.S. patentech č. 4,374,829 a č. 4,555,502..
·· ····

Claims (3)

1. Způsob produkce dipeptidového meziproduktu látky, jejíž základ tvoří dipeptid, vyznačuj ící * s e t í m, ž e (a) se v rekombinantní hostitelské buňce exprimuje rekombinantní molekula DNA, která kóduje vícenásobné repetice dipeptidového meziproduktu ve formě polypeptidu;
(b) polypeptid podle odstavce (a) se štěpí enzymem na volný dipeptidový meziprodukt;
(c) dipeptidový meziprodukt podle odstavce (b) se izoluje a čistí; a (d) dipeptidový meziprodukt se modifikuje za vzniku látky, jejíž základ· tvoří dipeptid.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dipeptidový meziprodukt se vybral ze skupiny, která zahrnuje Ala-Pro a Lys-Pro.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že rekombinantní molekula DNA podle kroku a.) se vybrala ze skupiny, která zahrnuje SbPRPl, SbPRP2, SbPRP3 a
CZ973214A 1995-04-11 1996-04-08 Způsob vhodný pro produkci látek, jejichž základ tvoří dipeptid CZ321497A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41978795A 1995-04-11 1995-04-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ321497A3 true CZ321497A3 (cs) 1998-06-17

Family

ID=23663762

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ973214A CZ321497A3 (cs) 1995-04-11 1996-04-08 Způsob vhodný pro produkci látek, jejichž základ tvoří dipeptid

Country Status (13)

Country Link
US (1) US6204008B1 (cs)
EP (1) EP0820465B1 (cs)
CN (1) CN1193998A (cs)
AR (1) AR001594A1 (cs)
AT (1) ATE247129T1 (cs)
AU (1) AU5445596A (cs)
BR (1) BR9608278A (cs)
CZ (1) CZ321497A3 (cs)
DE (1) DE69629460T2 (cs)
EA (1) EA000736B1 (cs)
ES (1) ES2203690T3 (cs)
SK (1) SK138197A3 (cs)
WO (1) WO1996032468A2 (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE492085T1 (de) * 2003-01-28 2011-01-15 Cellport Systems Inc Ein system und ein verfahren zum steuern des zugriffs von anwendungen auf geschützte mittel innerhalb eines sicheren fahrzeugtelematiksystems
CN100420746C (zh) * 2005-06-24 2008-09-24 北京化工大学 重组降压肽的设计与发酵生产
GB0608368D0 (en) 2006-04-28 2006-06-07 Isis Innovation Process for making Oligopeptides
WO2014159247A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Di-amino acid repeat-containing proteins associated with als
WO2016196324A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 University Of Floridia Research Foundation, Inc. Methods for diagnosing huntington's disease
CA3019847A1 (en) 2016-04-04 2017-10-12 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Manipulation of eif3 to modulate repeat associated non-atg (ran) translation
CA3060250A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Regulation of ran protein translation by pkr and eif2a-p pathways
JP7350337B2 (ja) 2017-09-26 2023-09-26 ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファンデーション， インク． 神経障害の処置においてｒａｎタンパク質レベルを低下させるためのメトホルミンおよびそのアナログの使用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL58849A (en) 1978-12-11 1983-03-31 Merck & Co Inc Carboxyalkyl dipeptides and derivatives thereof,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
GB2068971B (en) * 1980-01-30 1983-06-08 Searle & Co Recombinant dna techniques
EP0036258A3 (en) * 1980-03-14 1982-02-10 Cetus Corporation Process for producing aspartame
US4555502A (en) 1982-09-30 1985-11-26 Merck & Co., Inc. Aminoacyl-containing dipeptide derivatives useful as antihypertensives
DD248961A1 (de) * 1984-05-22 1987-08-26 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung wundheilungsfoerdernder praeparationen
US5089406A (en) 1987-01-07 1992-02-18 Allied-Signal Inc. Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences
NL8700767A (nl) 1987-04-01 1988-11-01 Groningen Science Park Dipeptidase, isolering daarvan uit melkzuurbacterien, antilichamen tegen het dipeptidase, gebruik van het dipeptidase en van de antilichamen daartegen.
JPH07108232B2 (ja) * 1990-10-09 1995-11-22 エム・ディ・リサーチ株式会社 ペプチド又は蛋白質の製造方法
EP0524906B1 (en) * 1991-07-24 2003-04-16 Novartis AG DNA coding for prolylendopeptidase and use thereof
ATE253639T1 (de) 1991-08-19 2003-11-15 Daiichi Suntory Pharma Co Ltd Verfahren zur herstellung von peptiden
WO1994016082A1 (en) * 1992-12-30 1994-07-21 Communaute Economique Europeenne (Cee) X-prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase from lactobacillus delbrückii ssp. lactis, nucleic acids coding for the same and its use in fermented foodstuff preparation processes

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996032468A2 (en) 1996-10-17
EP0820465B1 (en) 2003-08-13
AU5445596A (en) 1996-10-30
DE69629460T2 (de) 2004-06-24
EA000736B1 (ru) 2000-02-28
AR001594A1 (es) 1997-11-26
EA199700310A1 (ru) 1998-04-30
WO1996032468A3 (en) 1996-11-28
US6204008B1 (en) 2001-03-20
CN1193998A (zh) 1998-09-23
DE69629460D1 (de) 2003-09-18
ATE247129T1 (de) 2003-08-15
SK138197A3 (en) 1998-07-08
EP0820465A2 (en) 1998-01-28
BR9608278A (pt) 1999-10-13
ES2203690T3 (es) 2004-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101004745B1 (ko) 홍합 접착제
KR101526019B1 (ko) 증대된 단백질 발현 및 정제를 위한 방법 및 조성물
WO2007148345A2 (en) A method of producing biologically active polypeptide having insulinotropic activity
US8148508B2 (en) Method for enzymatic production of GLP-2(1-33) and GLP-2(1-34) peptides
CZ321497A3 (cs) Způsob vhodný pro produkci látek, jejichž základ tvoří dipeptid
CA2485695A1 (en) Method for universal enzymatic production of bioactive peptides
Jeong et al. Expression of antihypertensive peptide, His-His-Leu, as tandem repeats in Escherichia coli
JP2007319063A (ja) ジペプチドの製造方法
Nakagawa et al. The His-Pro-Phe motif of angiotensinogen is a crucial determinant of the substrate specificity of renin
EP1015607A1 (en) Dna encoding a ras carboxyl-terminal processing protein
US20050260701A1 (en) Method for enzymatic production of GLP-1 (7-36) amide peptides
IL174588A (en) Methods of cleaving polypeptides
US7098018B2 (en) Aminopeptidase derived from bacillus licheniformis, gene encoding the aminopeptidase, expression vector containing the gene, transformant and method for preparation thereof
JP5614477B2 (ja) Ｓａｒｓ３ｃｌプロテアーゼの組換えタンパク質
KR100818982B1 (ko) 혈압강하 펩타이드를 생산하는 형질전환 대장균 및 이를이용한 혈압강하 펩타이드의 대량 생산 방법
Class et al. Patent application title: METHOD FOR ENZYMATIC PRODUCTION OF GLP-2 (1-33) AND GLP-2 (1-34) PEPTIDES Inventors: Fred W. Wagner (Walton, NE, US) Peng Luan (Omaha, NE, US) Yuannan Xia (Lincoln, NE, US) Daniel Strydom (Lincoln, NE, US) Jin Seog Seo (Brampton, CA) Assignees: NPS PHARMACEUTICALS, INC.
CA2730659A1 (en) Recombinant preparation of bromelain inhibitors and bromelain inhibitor precursor
WO2001051624A2 (en) Carboxypeptidase b free of animal products and contaminating enyzme activity
NO156654B (no) Fremgangsmaate for enzymatisk erstatning av b-30-aminosyren i insuliner.

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic