CN1193998A - 以二肽基础的化合物生产的生物方法 - Google Patents

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Abstract

公开了可产自二肽中间物的化合物的生产的生物方法。该方法包括含二肽中间物的重组多肽的生产。二肽中间物被进一步处理以最终提供终产品。

Description

以二肽基础的化合物生产的生物方法
发明背景
以二肽中间物为基础或至少部分为基础的化合物的大规模生产需要很容易以很低的代价获取大量的二肽中间物。实际上为此目的任何氨基酸的二肽都可以通过合成制备，但是合成二肽耗费时间，这将降低产品生产的效率并提高产品的价格。这些不利条件尤其对以二肽中间物为基础的化合物的大规模生产尤其重要。
发明概述
以下是生产二肽中间化合物的方法。这些二肽中间化合物由重组DNA技术生产，并从合成的DNA序列或自然产生的DNA序列中生产出来。这两个序列都编码含有特定重复二肽序列的蛋白质或多肽。这些二肽中间物通过酶解作用从大的蛋白质或多肽中释放出来，然后进一步加工以提供最终的化合物。发明详述
本发明描述了一个生产二肽中间化合物的方法。这些中间化合物进一步加工用以生产最终化合物。这些二肽中间物可以通过重组DNA分子的表达在重组宿主细胞中得到生产，这些重组DNA分子至少编码一个二肽中间物。重组DNA分子可以是合成的DNA分子或自然产生的DNA序列。编码二肽的DNA被克隆进一个表达载体，在重组的宿主细胞中表达。在宿主细胞中表达以后，二肽被纯化出来做进一步加工。在二肽被纯化以前，把二肽从更大的多肽中分离出来是必须的。含有二肽中间物的一个稍大的多肽可以含有多个二肽序列的重复或者二肽做为稍大蛋白质的一部分以一个或多个拷贝出现，此蛋白质可以含有不是二肽序列的氨基酸序列。二肽序列的重复可以用酶切或者化学切割的方法分成单个二肽。单个二肽可以纯化做进一步加工。
用于生产二肽的重组宿主细胞可以是能够表达重组DNA分子的任何宿主细胞。实际上适用于本发明方法的任何重组的宿主细胞对于本领域的那些技术人员是显而易见的，优选的宿主细胞包括，但不限于，细菌和真菌细胞，包括酵母细胞，适用于本发明的和现在商业上可以得到的细菌和真菌宿主细胞包括，但不限于，啤酒糖酵母，巴斯德毕赤酵母，大肠杆菌，黑曲霉，变青链霉菌，枯草芽孢杆菌。
用于表达编码二肽DNA的表达载体可以是适用于所选择宿主细胞的任何表达载体。这一点对于本领域的技术人员是显而易见的。优选的载体包括，但不限于，那些适用于细菌真菌细胞并包括酵母的载体。适用于本发明的细菌和真菌表达载体和目前商业上可得到的包括，但不限于在此所列出的。
通过使用酶在合适的位置切开多肽而不损害二肽中间物，把二肽从剩余的非二肽中分离出来或把单个二肽从二肽重复序列中分离出来。适用于本发明方法中的酶可以是商业上得到的或者由那些拥有适合酶活力的组织所产生的。合适的酶的选择依赖于所表达的特定的二肽序列。
二肽可以在它从多肽的剩余物或从二肽重复序列中分离之前或分离之后纯化出来。标准的层析技术适用于本发明的方法用以纯化单个二肽或含有二肽的多肽。标准的层析技术包括，但不限于盐分级分离。离子交换层析，大小排阻层析，羟磷灰石吸附层析，疏水相互作用层析。
通过在此描述的方法，得到的克隆DNA可以重组表达。此方法是把分子克隆进含有适合启动子或其它转录调控元件的表达载体，并转移进原核或真核宿主细胞以产生重组肽。此技术的操作在Sambrook J，等，supra中得到详尽描述，也是在本领域中熟知的。
在此定义的表达载体即这样的DNA序列，在合适的宿主中它可以转录克隆基因的拷贝，并翻译它们的mRNA。这样的载体可以在各种各样的宿主中表达真核基因，例如细菌，蓝绿藻，植物细胞，昆虫细胞，真菌细胞，动物细胞。
特定设计的载体允许DNA在宿主之间的穿梭，例如细菌-酵母或细菌-动物细孢或细菌-真菌细胞，或细菌-无脊椎动物细胞。一个合适构建的真核表达载体应该包括：一个在宿主细胞中自主复制的制备起点，选择性标记，限定数目的有用的限制酶切位点，一个有潜在能力高拷贝的有活力的启动子。启动子定义为这样的DNA序列，它能指导RNA多聚酶连结到DNA上并启动RNA的合成。一个强启动子即它能以很高的频率启动mRNA的合成。表达载体可以包括，但不限制于克隆载体，修饰的克隆载体，特定设计的质粒或病毒。
一系列哺乳动物表达载体可以在哺乳细胞中表达重组多肽。商业上可以得到的适合于重组多肽表达的哺乳动物表达载体包括，但不限于，pcDNA3(Invitrogen)，pMClneo(Stratagene)，pXT1(Stratagene)，pSG5(Stratage-ne)，EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)，pBPV-1(8-2)(ATCC37110)，pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224)，pRSVgpt(ATCC37199)，pRSVneo(ATCC 37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)，和λZD35(ATCC 37565).
各种细菌表达载体也可以用于在细菌细胞中表达重组多肽。商业上可以得到的适合于重组多肽表达的细菌表达载体包括，但不限于，pETlla(Novagen)，λgtll(Invitrogen)，pcDNAII(Invitrogen)，pKK223-3(Pharmacia)。
许多真菌细胞表达载体也可以用于在真菌细胞中表达重组多肽。商上可以得到的适合于重组多肽表达的真菌细胞表达载体包括，但不限于，pYES2(Invitrogen)，毕赤酵母属表达载体(Invitrogen)。
许多昆虫细胞表达载体也可以用于在昆虫细胞中表达重组多肽。商业上可以得到的适合于重组多肽表达的昆虫细胞表达载体包括，但不限于，pBlueBacIII(Intvitrogen)。
一个含有编码二肽中间物DNA的表达载体可以用于在一个重组宿主细胞中表达多肽。重组的宿主细胞可以是原核或真核细胞，包括但不限于，细菌例如大肠杆菌，真菌细胞例如酵母，哺乳类细胞，包括但不限于，人、牛、猪、猴、啮齿动物起源的细胞系，昆虫细胞包括但不限于，果蝇属和蚕起源的细胞系，起源于哺乳类的细胞系适合的并且商业上可得到的包括，但不限于，L细胞L-M(TK-)(ATCC CCL1.3)，L细胞L-M(ATCC CCL 1.2)，293(ATCC CRL1573)，Raji(ATCC CCL 86)，CV-(ATCC CCL 70)，COS-1(ATCC CRL 1650)，COS-7(ATCC CRL 1651)，CHO-KI(ATCC CCL 61)，3T3(ATCC CCL 92)，NIH/3T3(ATCC CRL1658)，Hela(ATCC CCL 2)，C127I(ATCC CRL 1616)，BS-C-1(ATCC CCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。
表达载体可以通过下列许多种技术中的任一种导入宿主细胞，包括但不限于，转化，转染，脂质体，原生质体融合，和电穿孔。含有表达载体的细胞经过克隆繁殖，单个分析去决定它们是否可以产生蛋白。产生多肽的宿主细胞克隆的确定可以通过以下方法，包括但不限于采用抗-肽抗体的免疫反应，或者出现宿主细胞相关的B1反应，例如肽-特异性的配体连结或信号传导，即定义为B1-特异性配体在受体上的相互作用所介导的反应。
DNA的表达也可以用体外产生的合成mRNA或天然mRNA来进行。合成的mRNA或从产生多肽的细胞中分离的mRNA能有效地在各种无细胞体系中翻译，包括但不限于，小麦胚提取物和网状细胞提取物，也能够有效地在以细胞为基础的系统翻译，包括但不限于，微注射入蛙卵母细胞，优选的是微注射入蛙卵母细胞。
为了确定产生最佳蛋白水平的DNA序列，可构建包括，但不限于下列的DNA分子：DNA全长开读框架和几个含有编码蛋白的DNA部分的结构。
蛋白表达的水平可以通过把这些结构单独或联合导入合适的宿主细胞以后来确定。确定DNA盒产生最佳水平的表达以后，例如，在瞬时表达实验中，DNA结构被转移到一系列表达载体中，在宿主细胞中表达，宿主细胞包括，但不限于，哺乳类细胞，昆虫细胞，大肠杆菌和酵母细胞，例如：啤酒糖酵母。
宿主细胞转染子和微注射的卵母细胞可以通过下面方法测试蛋白水平。经过一段适宜的时间以允许表达，然后测定多肽水平。一个测定多肽水平的方法包括在整个细胞中或从转染DNA的宿主细胞制备的细胞裂解液中直接测定多肽的水平。
二肽丙氨酰脯氨酸，Ala-Pro，是合成ACE抑制剂，enalapril的起始物质。二肽赖氨酰脯氨酸是合成ACE抑制剂Lysinopril的起始物质。商业上可得到的二肽目前是化学合成的。已经开发了一个新的生物方法，它成功地消除了化学生产Ala-Pro或Lys-Pro的需要，此方法利用一个重组宿主来过量表达一个含有Ala-Pro或Lys-Pro二肽重复的多肽，然后此多肽用细菌的脯氨酰肽酶类(prolylpoptidases)水解成它的Ala-Pro或Lys-Pro组成单位。选择大肠杆菌做为宿主是由于表达载体的可获得性。化学合成的编码Ala-Pro重复和合适连结位点的寡核苷酸被克隆进商业上可得到的表达载体，pMAL。发酵含有重组结构的重组大肠杆菌产生所需的融合产物，此产物由蛋白质凝胶来确定。然后采用酶切方法释放Ala-Pro单位。尽管脯氨酰肽酶类酶切作用也很好，商业上可获得的因子X被用来释放(Ala-Pro)n-20肽。预选筛选脯氨酰肽酶类导致确认了瑞士乳杆菌和嗜麦芽黄单孢菌菌种，这些菌种具抗Ala-Pro-pNA和合成的(Ala-Pro)n底物的活性。每种培养物的粗提取物部显示能成功地把(Ala-Pro)n-20分解成Ala-Pro，此方法可以由HPLC分析来确认。当两种培养物的提取物合并时，可观察到协同效应。瑞士乳杆菌的脯氨酰肽酶的活性被认为是由于外肽酶活性，相对于嗜麦芽黄单孢菌显示的则是内肽酶活性。在此所描述的生物方法有着能避免化学合成中所用有毒物质的优点，并适用于其它肽类。
二肽中间物在重组宿主细胞中表达以后，重组蛋白可以回收并以纯化的形式提供二肽中间物。几种纯化方法可以得到并适于应用。在此所描述的是，重组二肽中间物通过下面的单个技术或多个技术的组合从细胞裂解液或提取物中得到纯化，这类技术有盐分级分离，离子交换层析，大小排阻层析，羟磷灰石吸附层析，疏水相互作用层析。
二肽中间物经过在此描述的一个或多个技术的纯化以后，这些技术对于多肽纯化领域的技术人员是熟知的，二肽中间物被进一步加工成最终产物，二肽中间物Ala-Pro进一步加工成最终产物，即已知的enalapril和相关化合物，此方法在美国专利号4,374,829和4,555,502中得到描述，这两者为此目的在此引入作为参考。二肽中间物Lys-Pro进一步加工成最终产物，即已知的Lisinopril和相关化合物，此方法在美国专利号4,374,829和4,555,502中得到描述，这两者为此目的在此引入作为参考。
下面的实例用以提供说明本发明，然而并不仅限于此。
             实施例1构建二肽表达的载体
一个质粒被选择做为构建表达二肽重复的DNA序列的载体。选择的载体应含有适于所选宿主的复制起点，相应的载体也可含有适于在多于一种生物种类中表达的起点以使它做为穿梭载体。抗生素抗性基因/或营养缺陷型标志在质粒上也是必要的，它用于确认载体转化或进入细胞已经完成并通过选择压力用于维持载体的稳定性。一个强的启动子，例如可诱导的tac启动子允许最大限度表达下游基因。还要包括一个共有的核糖体连接位点，能被优选的宿主所识别。下游翻译终止序列和终止密码子也应包括以确保重组肽的合适长度。
相应的，可以在表达载体中编码一个融合蛋白。目的载体可以编码一个截断的肽，它总能在优选的宿主中从它的天然启动子或另一个强启动子得到高表达。编码多肽中间物，比如Ala-Pro或Lys-Pro和重复的基因或寡核苷酸的克隆位点，可以由合成技术得到设计或依据重复的5′或3′DNA序列来放入。产生的DNA组建物在表达时可以产生一个蛋白，它或者含有截断酶，或者含有连结蛋白，例如从大肠杆菌中得到的麦芽糖结合蛋白融合到二肽中间物序列中。利用融合部分，分离可以很容易完成，接下来的加工可以去除5′肽。在某些宿主中，信号肽或引导肽允许正确的细胞外转运，用于分泌所要产物。
在宿主组织中密码子的优先性得到应用以加强表达。在宿主细胞中，密码子的应用总是有偏向性以致于在某些特定基因的表达中，主要使用一个或多个密码子。产生高水平的蛋白或多肽的高表达的基因总是由被优先使用或比别的更高频率使用的密码子来编码。在大肠杆菌中，得到赖氨酸的两个密码子是AAA和AAG，四个密码子有可能得到脯氨酸，CCA，CCC，CCG和CCU，CCG的密码子序列是一个更高频率使用的密码子，这样在合成的Lys-Pro寡核苷酸中Pro残基设计成CCG。Lys只被两个密码子编码，这两个密码子没有明显的优先性，因此当设计寡核苷酸时AAA和AAG都可选用，这些寡核苷酸会变成Lys-Pro的重复表达为Lys-Pro多肽。对于Ala-Pro寡核苷酸，GCT和GCA是优先的密码子序列，因此在大肠杆菌中被选用以最大限度的表达。
                   实施例2把DNA克隆进大肠杆菌表达载体
把肽表达盒转入大肠杆菌表达载体以后，重组肽在大肠杆菌中产生，大肠杆菌表达载体包括，但不限于，pET系列(Novagen)、pET载体把肽置于噬菌体T7启动子的严格调控之下。把此重组物导入大肠杆菌宿主以后，此宿主含有T7 RNA聚合酶基因的一个染色体拷贝，此基因由可诱导的lac启动子驱动。当把合适的lac底物(IPTG)加入培养基，多肽的表达可从诱导。多肽表达的水平由在此描述的实验来确定。
编码多肽的整个开读框架的cDNA插入pET11a的NdeI位点。正方向的重组物由序列分析来确认，然后用以转化表达宿主菌种BL21。转化物接着用以孵育培养物以产生蛋白。培养物可以在M9或ZB培养基中生长，它们的配方对于本领域的技术人员是熟知的。当生长到OB600＝1.5以后，肽的表达用1mM IPTG在37℃下诱导3小时。
                     实施例3把DNA克隆进能在昆虫细胞中表达的载体
杆状病毒载体，它来源于AcNPV病毒的基因组，被设计用于在昆虫细胞系Sf9(ATCC CRL#1711)中提供cDNA的高表达。表达编码二肽中间物DNA的重组杆状病毒通过以下标准方法产生(InVitrogenMaxbac手册中)，DNA组建物被连入一系列杆状病毒转移载体的多角体蛋白基因中，这些转移载体包括pAC360和Blue Bac载体(InVitrogen)。重组的杆状病毒是通过同源重组得到的，即把杆状病毒转移载体和线性化的AcNPV基因组DNA〔kitts，P.A.，《核酸研究》18，5667(1990)〕共转染进入Sf9细胞。重组PAC360病毒是经过在感染细胞中内含物的缺失来确认，重组pBlue Bac病毒是依据β-半乳糖苷酶的表达(Summers，M.D。和Smith，G.E.，得克萨斯农业实验站公报号1555)来确认。斑状纯化后，肽的表达由在此描述的实验来测定。
编码肽整个开读框架的cDNA插入pBlue BacII的BamHI位点。正方向的重组物经序列分析来确认，并和线性化AcNPV野生型DNA一起转染Sf9细胞。
真正的肽被发现与感染的细胞有关。多肽通过低渗或去污剂的裂解从感染的细胞中抽取出来。
可替代地，肽可以在果蝇的Schneider2细胞系中通过两个载体共转染Schneider2细胞来表达，一个载体含有肽DNA下游并在可诱导的金属硫蛋白启动子调控下，另一个载体编码有G418抗性新霉素基因。在G418中生长以后，可以得到抗性细胞，并通过加入硫酸铜诱导肽的表达。
                 实施例4把DNA克隆进一个酵母表达载体
把最佳DNA顺反子插入到用于异源蛋白细胞内或细胞外表达的表达载体以后，可以在酵母的啤酒糖酵母中生产重组多肽。当细胞内表达时，载体例如EmBLyex4或类似的可以连结到顺反子上〔Rinas，U.et al《生物技术》8，543-545(1990)；Holowitz B.等，《生物化学杂志》265，4189-4192(1989)〕。对于细胞外表达，顺反子可以连结到酵母表达载体，它融合一个分泌信号。表达多肽的水平由在此描述的实验来确定。
                   实施例5重组肽的纯化
重组产生的肽可以由抗体亲合性层析来纯化。
肽抗体亲和柱的制备是把抗-肽抗体加到Affigel-10(Biorad)上，它是用N-羟基琥珀酰亚胺酯预活化的凝胶支持物以便抗体能和琼脂糖凝胶珠支持物形成共价抗体连结。抗体通过酰氨键用空间臂偶联到凝胶上。剩余的活性酯用1M乙醇胺盐酸(pH8)灭活。此柱在用0.23M甘氨酸盐酸去除任何非-连结抗体或外来蛋白以后用水冲洗。此柱然后用磷酸缓冲盐水(pH7.3)和合适的膜溶解剂比如去污剂一起来平衡，含有溶解肽的细胞培养物上清或细胞抽提物慢慢通过此柱。此柱用磷酸缓冲盐水和去污剂一起冲洗直至光密度(A280)降到背景，然后蛋白用0.23M甘氨酸-盐酸(pH2.6)加上去污剂一起洗脱。纯化的蛋白然后从磷酸缓冲盐水中透析出来。
                    实施例6重组生产Ala-Pro二肽Ala-Pro的表达
在大肠杆菌中生产一个Ala-Pro多肽的策略包含克隆一个编码Ala-Pro重复的序列。一系列商业上可得到的系统可以使用。为了减少开发时间，从新英格兰生物实验室购买了商业上可得到的表达系统pMAL。此系统利用了一个含有麦芽糖结合蛋白基因的载体，此基因毗邻一个多克隆位点，在此目的DNA序列例如Ala-Pro重复密码子可以克隆进去。把含有上述载体的克隆导入后，会表达一个融合蛋白(麦芽糖-Ala-Pron)，麦芽糖结合结构域用于连结到一个麦芽糖柱上，麦芽糖结构域被下面分离的因子X切去。
为了此目标，两个互补的寡核苷酸得到设计(87聚体和91聚体)，以编码14个Ala-Pro单位和一个终止密码子。寡核苷酸通过标准方法进行分析。寡核苷酸通过SDS-PAGE纯化，并从胶中抽提出来。一个定向性的克隆策略，用一个平末端和一个粘末端，以确保ala-pro基因正确排列和连入质粒。转化大肠杆菌后选择克隆。在一个克隆AP/2上，蛋白分析和诱导实验表明诱导后产生了融合蛋白。在SDS-PAGE凝胶上带的大小表示不止一个融合产物，然而融合蛋白的诱导和产生是明确的。
存在对克隆序列的重排以及设计进寡核苷酸的终止密码子的正确识别的疑虑，导致对插入DNA进行测序。使用M13通用引物对来源于克隆的DNA进行测序。有趣的是，插入序列编码了20个ALA-PRO重复而不是14个Ala-Pro重复。终止密码子出现在20个重复的末端。(Ala-Pro)20的出现被认为是两个寡核苷酸以摇摆的方式退火，产生的裂口在重组方法中由聚合酶补平。由于高度重复的序列，退火并非少见。在此情况下，由于它产生了一个更长的基因(因此有更长的Ala-Pro重复)，它可能是有利的。水解Ala-Pro底物
从ATCC得到三种细菌培养物，瑞士乳杆菌，LSP和嗜麦芽黄单孢菌在文献上报导能产生脯氨酰肽酶的活性。培养物在250ml烧瓶中生长并用商业上可得到的比色底物，Ala-Pro-pNA(来源)来检测水解活性。三种培养物都能提供脯氨酰肽酶活性，且大部分是和细胞相关的(表1)。接下来培养物的储存做在斜面上并冻存在FVM′s中。为了最佳生长，乳酸杆菌对于斜面培养需要一个微型需气小室，在烧瓶中则静止液体培养。表1在(ALA-PRO)2上脯氨酰肽酶的特异活性
培养物4 特异活性(U/mg)1 U/升1 最佳pH2 最佳温度3
瑞士乳杆菌 .156 8 5.6 50℃
Lunk.sp. .085 14.7 6.0 40℃
嗜麦芽黄单孢菌 .446 107 6.6 45℃
1.其中U指在37℃和最佳pH下每分钟释放的ALA-PRO(μmol)。2.在最佳温度时的柠檬酸盐磷酸盐缓冲液3.在pH8.0进行4.来自Virtis匀浆细胞的酶提取物
想要得到底物，它能反应大肠杆菌生长方法中实际的低聚Ala-Pro底物。为此目的，由生物合成公司合成了用于脯氨酰肽酶底物的肽寡聚物。发展了一个分离低分子量肽和游离氨基酸的HPLC的方法以估计对Ala-Pro底物的酶的活性。接下来使用HPLC方法纯化了从生物合成而来的肽聚合酶。从HPLC分部收集以后，可得到2，4，6重复的Ala-Pro肽。肽的温度和最佳pH对每一个粗提取物都已确定(表2)。瑞士乳杆菌提供最高的酶活和特异性活性。从文献(ref)中推荐的复杂的培养基用于所有研究，没有做培养基的优化与筛选。依据水解产物出现的差异，很明显乳酸杆菌产生一个内-脯氨酰二肽酶(endo-propyldipeptidase)，而黄单孢菌产生一个外肽酶，通过合并两种酶得到(Ala-Pro)6水解的协同效应显示出此项观察的益处。
酶来源                蛋白质U/升1        特异性活性(U/mg)1(mg/ml) (A-P)2瑞士乳杆菌                            (A-P)2  (A-P)4  (A-P)62.04      186      1.82    2.15    0.94Lactobacillus unk.  3.02      156      1.53    1.53    0.87species嗜麦芽黄单孢菌      0.07      28       0.17    0.35    0.43
1.单位定义为在35℃，pH7.0下每分钟所释放ALA-PRO的mmol数2.来自“珠打浆机”匀浆细胞的酶提取物。
已发现当过量的酶(是正常实验条件浓度的600倍)，引入Ala-Pro底物水解成丙氨酸和脯氨酸。金属和半胱氨酸蛋白酶抑制剂对于抑制Ala-Pro的水解是有效的，却对(Ala-Pro)6的水解无任何效果，这表明是不同的酶作用于Ala-Pro的分解。部分的纯化应从这些粗提取物中除去不需要的活性。
在此情况中，二肽中间物Ala-Pro进一步加工成终产物，已知为enalapril和相关的化合物，这个方法在美国专利号4,374,829和4,555,502中得到描述,此两者在此引用作为参考。
实施例7从重组的植物蛋白中重组产生Lys-Pro二肽
富含Lys-Pro编码序列的天然发生的序列可以在大豆(甘氨酸最多)〔从：Hong et al，《生物化学杂志》1990〕的细胞壁蛋白基因家族中发现。大豆三个富含脯氨酸的蛋白基因是SbPRP1，SbPRP2和SbPRP3它们三个在长度上分别是256，230和90个氨基酸。这些蛋白的氨基酸组成表明残基的34％至40％是脯氨酸，18％至25％是赖氨酸。由于特殊的目的，SbPRP1在肽序列中含有37个Lys-Pro氨基酸对，因此是Lys-Pro二肽的极好来源。SbPRP3编码12个Lys-Pro二肽序列，它包含两个Lys-Pro-Lys-Pro重复，编码在此基因的183和195碱基处。
依据报导的DNA序列(文献)产生PCR引物，富含Lys-Pro的SbPRP1基因的克隆得以完成。用引物和含有大豆DNA的文库产生含有目的序列的DNA片段。产生的富含Lys-Pro密码子的DNA，连入表达载体的合适的限制性内切酶位点。使用大肠杆菌宿主，大豆肽得到表达并从裂解细胞中回收。用瑞士乳杆菌和起源于此菌种的脯氨酰肽酶，蛋白水解成组成氨基酸和含有Lys-Pro残基的小肽。层析或抽提将提供较纯的Lys-Pro。
替代的方法是合成对应于SbPRP3中Lys-Pro-Lys-Pro重复的寡核苷酸(或把这两段背靠背放在一起，而这两段在天然序列中是不连续)，再加上设计的合适的限制性位点即可插入目的表达载体，在合适宿主中的表达会产生大量的寡肽形式的Lys-Pro。使用瑞士乳杆菌或起源于此菌种的脯氨酰肽酶，赖氨酸和脯氨酸富含的肽水解成Lys-Pro残基。相应地，一来源于脑膜脓毒性金黄杆菌〔Yoshimoto，T，等，《农业的生物化学》，42：2417，1978〕的脯氨酸特异性蛋白酶用于水解肽，层析或抽提可以提供较纯的Lys-Pro。
二肽中间物Lys-Pro进一步加工成终产物，即Lysinopril和相关的化合物，此方法在美国专利号4,374,829或4,555,502中得到描述，此两者在此引入作为参考。
                   实施例8来源于重组两栖类蛋白的Ala-Pro二肽的重组生产
在爪蟾皮肤腺体的储存小颗粒中发现了一个大约75KDa的酸性多肽，被认为是APEG蛋白，富含Ala-Pro二肽〔Gmachl，M.等，《欧洲生物化学学会联合会公报》260：145-148〕此物质的至少80％是以比率2∶2∶1∶1出现的丙氨酸，脯氨酸，谷氨酸和甘氨酸。
用从发表的序列中得到的探针筛选存在于λ起源的载体中的cDNA表达文库，以分离目的片段。相应的，对APEG的抗体可以用来筛选这样一个cDNA表达文库。目的片段从目的克隆中分离出来，插入一表达载体(得到的多肽的加工与例6一样即水解Ala-Pro底物)。
一个优选的方法是对应于Ala-Pro-Ala-Pro-Ala-Pro(CAC CAG CTC CAG CAC CAG)的天然APEG DNA序列合成-寡核苷酸。再加上寡核苷酸上的合适的限制性位点，象上面一样，DNA可以克隆进一表达载体中在重组宿主细胞中表达。象上述描述一样，含有二肽中间物重复的肽可以水解，二肽中间物Ala-Pro可以分离出来进一步加工成终产物。
二肽中间物Ala-Pro进一步加工成终产物，即已知的enalapril和相关化合物，此方法在美国专利号4,374,829和4,555,502中得到描述，这两者在此引入作为参考。

Claims (3)

1.生产以二肽为基础的化合物的二肽中间物的方法，包括：
a)在重组宿主细胞中表达重组的DNA分子，该DNA分子编码了以多肽形式出现的二肽中间物的多个重复；
b)用一个酶把步骤a)的多肽切割成游离的二肽中间物；
c)分离和纯化步骤b)的二肽中间物；和
d)修饰二肽中间物以产生以二肽为基础的化合物。
2.权利要求1的方法，其中二肽中间物选自Ala-Pro和Lya-Pro。
3.权利要求1的方法，其中步骤1)的重组DNA分子选自SbPRP1，SbPRP2，SbPRP3和APEG。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100420746C (zh) * 2005-06-24 2008-09-24 北京化工大学 重组降压肽的设计与发酵生产
CN101512000B (zh) * 2006-04-28 2016-08-03 埃西斯创新有限公司 生产寡肽的方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1590917B1 (en) * 2003-01-28 2010-12-15 Cellport Systems, Inc. A system and a method for controlling use by applications of proprietary resources within a secure telematics system in a vehicle
WO2014159247A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Di-amino acid repeat-containing proteins associated with als
WO2016196324A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 University Of Floridia Research Foundation, Inc. Methods for diagnosing huntington's disease
WO2017176813A1 (en) 2016-04-04 2017-10-12 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Manipulation of eif3 to modulate repeat associated non-atg (ran) translation
JP2020516674A (ja) 2017-04-17 2020-06-11 ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファンデーション， インク． ＰＫＲおよびｅＩＦ２Ａ−Ｐ経路によるＲＡＮタンパク質翻訳の調節
EP3688021A4 (en) 2017-09-26 2021-12-29 University of Florida Research Foundation, Incorporated Use of metformin and analogs thereof to reduce ran protein levels in the treatment of neurological disorders

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL58849A (en) 1978-12-11 1983-03-31 Merck & Co Inc Carboxyalkyl dipeptides and derivatives thereof,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
GB2068971B (en) * 1980-01-30 1983-06-08 Searle & Co Recombinant dna techniques
EP0036258A3 (en) * 1980-03-14 1982-02-10 Cetus Corporation Process for producing aspartame
US4555502A (en) 1982-09-30 1985-11-26 Merck & Co., Inc. Aminoacyl-containing dipeptide derivatives useful as antihypertensives
DD248961A1 (de) * 1984-05-22 1987-08-26 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung wundheilungsfoerdernder praeparationen
US5089406A (en) 1987-01-07 1992-02-18 Allied-Signal Inc. Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences
NL8700767A (nl) 1987-04-01 1988-11-01 Groningen Science Park Dipeptidase, isolering daarvan uit melkzuurbacterien, antilichamen tegen het dipeptidase, gebruik van het dipeptidase en van de antilichamen daartegen.
JPH07108232B2 (ja) * 1990-10-09 1995-11-22 エム・ディ・リサーチ株式会社 ペプチド又は蛋白質の製造方法
ATE373096T1 (de) * 1991-07-24 2007-09-15 Novartis Pharma Gmbh Expressionsvektor für prolylendopeptidase von flavobacterium meningosepticum
ATE253639T1 (de) 1991-08-19 2003-11-15 Daiichi Suntory Pharma Co Ltd Verfahren zur herstellung von peptiden
WO1994016082A1 (en) * 1992-12-30 1994-07-21 Communaute Economique Europeenne (Cee) X-prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase from lactobacillus delbrückii ssp. lactis, nucleic acids coding for the same and its use in fermented foodstuff preparation processes

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100420746C (zh) * 2005-06-24 2008-09-24 北京化工大学 重组降压肽的设计与发酵生产
CN101512000B (zh) * 2006-04-28 2016-08-03 埃西斯创新有限公司 生产寡肽的方法

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Publication number Publication date
AR001594A1 (es) 1997-11-26
ATE247129T1 (de) 2003-08-15
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WO1996032468A2 (en) 1996-10-17
EP0820465B1 (en) 2003-08-13
AU5445596A (en) 1996-10-30

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