CN101512000B - 生产寡肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种合成预定氨基酸序列的寡肽家族的方法，所述寡肽家族共同构成靶蛋白的7个氨基酸至完整氨基酸序列，所述方法包括：合成编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含来自靶蛋白的目标部分的重叠肽，其中间插编码蛋白酶酶切位点的区域，在适当的表达载体中表达所述核酸构建体，收获与核酸序列相应的融合蛋白，并用对所述酶切位点有选择性的蛋白酶消化所述融合蛋白，产生寡肽。所述寡肽可以在体内或体外产生，可作为对抗病毒感染的疫苗及用于表位作图中。

Description

生产寡肽的方法
本发明涉及生产重组的重叠肽(overlappingpeptides)的方法，特别涉及用于制备疫苗的重组的重叠肽，所述疫苗用于预防和治疗病毒感染及肿瘤。
国际申请WO01/16163披露了寡肽混合物，包括10至30个氨基酸的寡肽的混合物，每个所述寡肽带有跨越(span)病毒(例如乙型肝炎病毒)蛋白的氨基酸序列的相邻重叠肽的5至25个氨基酸重叠。根据这项专利申请，一种肽的混合物能激活特异性T细胞，而不考虑识别经专职抗原呈递细胞(APCs)处理后的天然蛋白宿主的MHC/HLA基因型，所述肽混合物包含跨越乙肝核心抗原(HbcAg)的1-183位氨基酸的17个20-23氨基酸寡肽。所例示的重叠肽可以使用标准的化学技术用自动合成仪合成。所述技术是缓慢的、低产率的并且不能适用于迅速扩增(scaleup)。国际申请WO2004/002415也描述了将重叠或连续的短肽片段作为疫苗的应用。
我们现在已经发现了一种新的合成寡肽的方法，所述寡肽用于上述的接种方法，本发明的方法克服了与传统化学合成相关的问题，并为商业规模的快速生产寡肽家族(family)提供了可能性。
根据本发明的一个方面，我们提供了一种合成预定氨基酸序列的寡肽家族的方法，其共同构成(makeup)7个氨基酸至蛋白的完整氨基酸序列，所述方法包括：合成编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含(composedof)来自蛋白的目标部分的重叠肽，并在其中间插(intersperse)编码蛋白酶酶切位点的区域，在适当的表达载体中表达核酸序列，收获与核酸序列相应的蛋白，并用针对酶切位点有选择性的蛋白酶消化蛋白，产生所述寡肽。
根据本发明的第二个方面，我们提供了一种合成预定氨基酸序列的寡肽家族的方法，其共同构成7个氨基酸至靶蛋白的完整氨基酸序列，所述方法包括：合成编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含来自靶蛋白的目标部分的重叠肽，并在其中间插编码蛋白酶酶切位点的区域，将所述核酸构建体导入合适的载体中，通过宿主细胞诱导融合蛋白的表达，由此所表达的融合蛋白在细胞内被宿主细胞的蛋白酶或被由同样或不同的载体所编码的非宿主蛋白酶所酶切(所述蛋白酶针对酶切位点有选择性)，产生所述寡肽，并收获所述寡肽。
通过本发明的方法产生的寡肽可作为人或动物的疫苗而施用。
根据本发明的第三个方面，提供了一种融合蛋白，其包含来自靶蛋白的目标部分的重叠肽，其中间插编码蛋白酶酶切位点的区域。其可被单独或与蛋白酶结合作为疫苗施用给人类或动物。
构成靶蛋白的目标序列的寡肽可以是连续的或重叠的。优选的寡肽包括10至30个氨基酸的寡肽的混合物，每个寡肽带有与跨越靶蛋白的氨基酸序列的邻近重叠肽的5至25个氨基酸重叠，。
所述寡肽优选的是相同长度的，但也可以是不同长度的。
所述蛋白酶酶切位点可以是被蛋白酶选择性消化的任何氨基酸序列。所述酶切位点可以是任何长度。优选的酶切位点长度小于10个氨基酸，更优选小于8个氨基酸，最优选小于6个氨基酸。特别优选的蛋白酶酶切位点是Xa因子消化位点，也就是，序列Ile-Glu-Gly-Arg-。这一序列在精氨酸(Arg)后被酶切。其他蛋白酶可以包括：HRV3C蛋白酶，其在谷氨酰和甘氨酰残基之间酶切序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro-；HIV蛋白酶；金属蛋白酶；类胰蛋白酶(tryptases)；及其他蛋白酶，例如组织蛋白酶(S、L和B等)CD13(人氨肽酶N)。
组织蛋白酶及其作为蛋白酶的特异性的相关出版物包括：
Ruckrich，T.，J.Brandenburg，A.Cansier，M.Muller，S.Stevanovic，K.Schilling，B.Wiederanders，A.Beck，A.Melms，M.Reich，C.Driessen，andH.Kalbacher.2006.SpecificityofhumancathepsinSdeterminedbyprocessingofpeptidesubstratesandMHCclassII-associatedinvariantchain.BiolChem387：1503.
Choe，Y.，F.Leonetti，D.C.Greenbaum，F.Lecaille，M.Bogyo，D.Bromme，J.A.Ellman，andC.S.Craik.2006.Substrateprofilingofcysteineproteasesusingacombinatorialpeptidelibraryidentifiesfunctionallyuniquespecificities.JBiolChem281：12824.
除了上述文献，组织蛋白酶S的序列TVQ/L(“/”代表切割位点)是特别优选的。
所述靶蛋白可以是任何蛋白，可例如根据所治疗或预防的疾病进行选择。通常情况下，所述靶蛋白是引起待治疗疾病的病毒的特征性蛋白，例如是病毒的外壳蛋白或病毒特有的酶。
例如，在HIV感染中，HIVNef蛋白或者HIVGag蛋白可被选为靶蛋白；在流感中，靶蛋白可以是凝血素、神经氨酸酶、核蛋白或基质蛋白；在结肠癌中，靶蛋白可以是癌胚抗原；在乳腺癌中，是Her2/neu抗原。
优选的寡肽家族共同构成100％的完整氨基酸序列，但也可以少至靶蛋白的7个氨基酸。一般来说，优选的寡肽家族构成靶蛋白的完整氨基酸序列的至少50％，更优选75％。编码靶蛋白的目标部分并在其中间插编码蛋白酶酶切位点区域的核酸构建体，可以通过商业上可获得的技术进行合成，例如：GeneArtTM、GeneMakerTM、GenScriptTM。
当Xa因子被用于蛋白消化时，优选的用于扩增构建体的适当表达媒介(vehicles)是原核表达载体pET16。其他的表达系统可以是其他原核表达载体，例如其他pET系列载体、pGEX、pGEMT7，哺乳动物表达载体，例如pEGFP、pcDNA3、pCDM7，或昆虫表达载体，例如Bac-To-Bac、BaculoDirect。
表达由构建体编码的靶蛋白的适当媒介因而可以是，例如：用于原核表达的大肠杆菌BL21，用于哺乳动物表达的HEK293T细胞、HeLa细胞等，用于昆虫表达的sf9细胞等。
根据本发明的第一个方面，可以通过标准方法收获并纯化融合蛋白，例如：对于pET16原核系统，用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导蛋白表达，并通过亲和层析法(优选Ni-NTA柱)从细胞裂解液中纯化蛋白。经过特异性的蛋白酶(通常商业上可获得，例如：Xa因子(MerckNovagen))消化，所述寡肽通过标准技术(例如：高效液相色谱法(HPLC)、离子交换层析、凝胶过滤)被进一步纯化。
更具体地说，所述寡肽可通过如下方法在体外制备：
1.合成基因的设计及产生
来自原始目标基因的20元(20mer)重叠肽的合成基因可被设计为在20元肽之间加入蛋白酶Xa因子的酶切位点。由此产生的人工基因可被优化以适于大肠杆菌表达，并且在商业上合成后被克隆到原核表达载体，例如pET16。
2.体外蛋白表达、消化及纯化
带有人工基因的构建体可以在大肠杆菌BL21中以包涵体的形式表达并纯化，并且所述蛋白完全被蛋白酶Xa因子所消化。由此产生的24元肽(来自目标疫苗基因的20元加上4元Xa因子识别位点)可以被纯化，例如通过高效液相色谱(HPLC)。
或者，包含蛋白酶酶切位点的融合蛋白可作为疫苗直接施用。其可以被体内的蛋白酶，或单独施用的或与融合蛋白共同施用的蛋白酶所酶切。
根据本发明的第二个方面，所述核酸序列可使用上述的任何表达载体及表达系统在宿主细胞中表达。
或者，所述核酸序列可在已感染了病毒或细菌的宿主细胞中，被细菌载体或病毒载体表达。优选的细菌载体是李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌。优选的病毒载体是腺病毒、痘病毒、慢病毒和甲病毒等。特别优选的是李斯特菌载体，因为其能特异性地感染抗原呈递细胞(例如巨噬细胞和树突状细胞)。所述病毒载体可以是减毒的或不减毒的。所述核酸序列可以通过穿梭载体(例如pKSV7(1))被转化到所述病毒载体或细菌载体中。
“宿主细胞”是指能够表达所述构建体编码的靶蛋白并且能在细胞内将所述靶蛋白进行酶切的细胞。因此，所述宿主细胞可以是体外的哺乳动物细胞或昆虫细胞，例如HEK293T细胞、HeLa细胞、sf9细胞。或者所述宿主细胞可以是体内的人或动物细胞，其已经被病毒载体或细菌载体感染，所述病毒载体或细菌载体包含编码融合蛋白的构建体，作为一种疫苗。
表达的融合蛋白在细胞内被宿主蛋白酶，或由质粒载体编码的蛋白酶，或在病毒载体或细菌载体中的蛋白酶所酶切。所述蛋白酶对酶切位点有选择性。所述载体也可以编码蛋白酶的激活因子，所述蛋白酶对酶切位点有选择性。例如，宿主蛋白酶在正常条件下可以是未激活的，只有在激活因子被表达后才能被激活。
根据一个实施方案，所述蛋白酶可以是病原体特异性的。因此，所述核酸可以设计为蛋白酶酶切位点仅被病原体特异性蛋白酶切割。因而，表达的融合蛋白只有在宿主细胞被病原体感染后才被酶切，所述病原体产生对酶切位点有特异性的蛋白酶。
更具体地说，所述寡肽可以通过如下方法在体内制备：
1、合成基因的设计及产生
来自原始目标基因的20元重叠肽的合成基因可被设计为在20元肽之间加入蛋白酶Xa因子的位点。由此产生的人工基因可被优化以适于细菌表达，并且在商业上合成后被克隆到原核表达载体，例如pET16；或穿梭载体，例如pKSV7。编码蛋白酶Xa因子的基因也被克隆到表达载体上。
2、编码目标基因和/或编码可切割融合蛋白的蛋白酶的基因的载体的生产
带有人工基因和蛋白酶基因的构建体被转化到减毒或未减毒的李斯特菌载体上。其可以作为疫苗施用。如果病毒载体不包含蛋白酶基因，则所述载体可以与蛋白酶组合作为疫苗施用。
本发明还提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含来自靶蛋白的目标部分的重叠肽，其中间插编码蛋白酶酶切位点的区域；以及编码融合蛋白的核酸序列。
编码融合蛋白的核酸序列或融合蛋白本身可用于生产药物，所述药物用于预防性治疗病毒感染，例如HIV、丙型肝炎病毒、疱疹病毒等，或肿瘤，例如黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、肝癌等。药物也可用于治疗病原体所引起的疾病，所述病原体能产生对酶切位点有特异性的蛋白酶。
本发明还提供了一种在患者中治疗疾病的方法，包括：
用编码融合蛋白的核酸序列来治疗患者，所述融合蛋白包含来自靶蛋白的目标部分的重叠肽，其中间插编码蛋白酶酶切位点的区域，
诱导所述融合蛋白在患者中表达，由此被表达的融合蛋白被蛋白酶细胞内酶切，所述蛋白酶对酶切位点有特异性；
以及一种在患者中治疗疾病的方法，包括：用融合蛋白来治疗患者，所述融合蛋白包含来自靶蛋白的目标部分的重叠肽，其中间插编码蛋白酶酶切位点的区域，由此被表达的融合蛋白被蛋白酶细胞内酶切，所述蛋白酶对酶切位点有特异性。
待治疗疾病可以是病毒感染，例如：HIV、丙型肝炎病毒、疱疹病毒等，或肿瘤，例如黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、肝癌等。或者，所述疾病可能由病原体所引起，所述病原体产生对酶切位点有特异性的蛋白酶。
例如，可以给感染了HIV的患者施用HIV融合蛋白(例如，Nef)，所述蛋白在重叠肽序列之间带有HIV蛋白酶底物位点。患者体内的HIV蛋白酶将融合蛋白切割成重叠肽，所述重叠肽将刺激免疫系统杀死HIV感染的细胞。
本发明还提供了一种表位作图(epitopemapping)的方法，其包括合成预定氨基酸序列的寡肽家族，其共同构成从7个氨基酸至靶蛋白的完整氨基酸序列，所述方法包括：
合成编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含来自靶蛋白的目标部分的重叠肽，其中间插编码蛋白酶酶切位点的区域，在适当的表达载体中表达所述核酸构建体，收获与核酸序列相应的融合蛋白，并用对酶切位点有特异性的蛋白酶消化所述融合蛋白，产生寡肽，并将所述寡肽应用于寡肽表位作图方法中。
实施例1
本发明通过下述实施例进行说明，采用HIVNef蛋白。
方法：
1.DNA的设计
合成的基因采用这样一种方式进行设计，它包含(becomposedof)一系列的包含10个氨基酸重叠的20元肽，其中间插蛋白酶Xa因子的酶切位点(Ile-Glu-Gly-Arg-；I-E-G-R-)，覆盖了全长为206个氨基酸的Nef蛋白，所述Nef蛋白来自人类免疫缺陷病毒(HIV)的赖型钩端螺旋体(Laistrain)(图1)。由此产生的人工基因被优化以适于大肠杆菌中表达，并且在其末端加入限制性酶位点NdeI和Bam的酶切位点，用于随后在pET16b载体中亚克隆以及表达。
2.基因合成
基因由GeneArt公司(德国雷根斯堡)进行商业上的合成。
3.将目标基因亚克隆到pET16b表达载体
将pPCR-Script克隆载体中的合成的目标基因用NdeI和BamHI进行限制性消化。经过琼脂糖电泳后，与目标基因相应的电泳条带在紫外光下被切下，并且用凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)纯化DNA。与此同时，用相同的限制性酶消化pET载体，用虾碱性磷酸酶(罗氏公司，英国)对末端去磷酸化，并用同样的方式进行凝胶纯化。用T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs，英国)将载体DNA与目标基因相连，并将连接产物转化到DH5α细菌中。从过夜培养LB琼脂板培养物中接种集落，在含有100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养。经过过夜培养，用QIAprepSpinMiniprep试剂盒(Qiagen，德国)提取质粒DNA，并进行测序以确认插入的序列正确。
4.蛋白表达
将MiniprepDNA转化到BL21(DE3)细菌中，将集落接种到低盐LB培养液中并于37℃或28℃过夜培养。在低盐LB培养液中1:100稀释培养物并在37℃振荡培养几个小时，直到通过测定OD600＝0.3～0.5判断细菌达到指数增长阶段。加入1mmol的IPTG诱导蛋白的表达。于37℃或28℃振荡培养3～5小时，通过4000rpm离心收集菌体，然后在磷酸缓冲液中重悬，并通过超声裂解细胞。通过离心收集含有表达蛋白的包涵体。
5.蛋白纯化
所表达的蛋白通过B-per(Pierce，英国)进行纯化，然后根据操作手册通过Ni-NTA纯化试剂盒(Qiagen，德国)进行纯化。简单地说，在变性缓冲液(8M尿素的Tris缓冲液)中重悬所述包涵体，通过Ni-NTA纯化柱，组氨酸标记的蛋白结合到柱子上。经过充分的洗涤，蛋白被洗脱缓冲液洗脱下来，将缓冲液更换成Xa因子消化缓冲液(含有5mMCaCl2的Tris缓冲液)，方法是通过PD-10纯化柱(SephadexG-25)。
6.蛋白酶消化
消化缓冲液中的蛋白用CentriprepYM10(Millipore，美国)浓缩，并且用蛋白酶Xa因子(NewEnglandBiolabs，英国)在室温下约20分钟完全消化。通过苯甲脒琼脂糖(AmershamBiosciences，美国)或仅通过YM10过滤管除去蛋白酶，并且用Ni-NTA琼脂糖除去游离的组氨酸标记。由此得到的寡肽混合物被浓缩并将缓冲液更换为磷酸缓冲液备用。
7.质谱分析
用质谱分析蛋白酶消化产物，以确定酶切结果是目标重叠肽。将样品加到AppliedBiosystems4700蛋白组学分析仪中，所述分析仪装有飞行时间/飞行时间电离光学质谱和二极管泵浦Nd:YAG激光，200赫兹重复频率。一般来说，质量窗口(masswindow)的宽度被设置为50Da，因为先驱(precursor)离子的质量小于5000Da，通过仪器缺省校正来获得质谱/质谱数据，而不使用内标或外标。
8.小鼠及免疫
用重组的重叠肽免疫近交系小鼠BALB/c(H-2d)和C57BL/10(H-2b)，每只小鼠加入100μl的磷酸缓冲液中5μg的每种肽，并加入MLP+TDM佐剂系统(adjuvantsystem)。对照小鼠仅加入佐剂。分别在0、3、6周进行免疫。完成最后一次免疫的3周后，处死小鼠并进行CTL及辅助性T细胞增殖实验。
或者，可用重组重叠肽通过皮下(s.c.)免疫随机繁殖系(randomlybred)、远交系(outbred)NMRI小鼠，每只小鼠加入100μl的磷酸缓冲液中5μg的每种肽，同时加入或不加入MLP+TDM佐剂系统，每隔3周免疫3次。对照组可仅仅给予佐剂或磷酸缓冲液。最后一次加强免疫(boost)的3周之后，收集脾细胞并且进行IFN-γ-特异性酶联免疫斑点实验和细胞内的IFN-γ染色。
9.胞浆内细胞因子染色和流式细胞分析
在24孔培养板中，用含有或不含有1μM重组的重叠肽的白介素-2(20U/ml)在5×106个细胞/ml的条件下培养小鼠脾细胞6小时。在收获前的4个小时，根据制造商的方案用Golgistop(BDPharMingen)处理细胞。然后用藻红蛋白-(PE)-结合的单克隆兔抗鼠CD8或CD4抗体(BDPharMingen)或同种型免疫球蛋白对照将脾细胞染色20分钟。用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BDPharMingen)对脾细胞进行细胞内细胞因子染色，并根据制造商的说明加入FITC结合的抗-IFN-γ抗体(20μg/ml)。样品可通过EpicsXL流式细胞仪(BeckmanCoulter，Fullerton，美国加利福尼亚)获得，并使用Expo32软件(BeckmanCoulter)进行数据分析。
10.酶联免疫斑点实验(ELISPOT)
酶联免疫斑点实验使用来自BDPharminGen公司的酶联免疫斑点实验试剂盒进行。简而言之，IFN-γ-预涂板上的脾细胞用1μM的重组的重叠肽重刺激(restimulate)过夜。弃去细胞，加入生物素化的抗IFN-γ抗体37℃培养1小时，然后用酶标记的抗生物素抗体在37℃下再温育1小时。颜色稳定后，在显微镜下进行斑点计数。结果表示为SFU/106个细胞。
11.淋巴细胞增殖实验
分离脾细胞，在HIVNef蛋白(15μg/ml)、重组的重叠肽(3μg/ml)或OVA(15μg/ml)存在下，在RPMI1640加15％FCS加抗生素中，2×106/ml培养5天。在收获细胞前的4个小时，每孔细胞可用1μCi的3H-胸腺嘧啶进行脉冲。收获细胞后，可通过β-计数仪(Beckman，Fullerton，美国加利福尼亚)测定3H-胸腺嘧啶的掺入。结果表示为刺激指数(SI)，即，被刺激细胞的每分钟计数(cpm)与仅在培养基中培养的细胞的每分钟计数的比值。
12.恒河猴实验
开始时使用四只猴子，加入不同剂量的重组的重叠肽。通过IFN-γ-酶联免疫斑点实验和增殖实验来确定诱导细胞免疫应答的最佳剂量。
在实验中使用三组恒河猴，被分别给予重组的重叠肽(最佳剂量)、重组蛋白(能以与重组的重叠肽等效剂量产生重叠肽)、及磷酸缓冲液。用IFN-γ-酶联免斑点实验和增殖实验来验证所述重叠肽是否能诱导灵长类动物模型产生免疫应答。
实施例1的结果
附图的简要说明
图1：一种重组蛋白，包含20个重叠肽，所述重叠肽覆盖Nef蛋白，在每个肽之间插入了Xa因子的底物序列(粗体表示)，重叠的氨基酸残基用下划线表示。
图2：纯化的(右)和未纯化的(左)重叠的重组肽(ROP)融合蛋白(55kd)；
图3：ROP蛋白经Xa因子消化后得到的ROP肽的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及质谱谱图
(a)：Xa因子的滴定。100μl的ROP蛋白(2.2mg/ml)与一系列两倍稀释的Xa因子一起培养。Ln0：没有Xa因子；Ln1:1μl(2单位/μl)；Ln2:1/2μl；Ln3:1/4μl；....Ln9:1/256μl；
(b)经过消化的ROP的质谱。响应在4℃，1小时。
图4：ROP肽和ROP蛋白被DC2.4细胞的摄取，显示出寡肽早于蛋白被摄取。
图5：经过DC2.4细胞摄取的ROP肽(左)和ROP蛋白(右)，ROP肽和ROP蛋白用绿色荧光进行标记，而溶酶体用LysoTracker-red进行染色。注：在右图中，绿色标记的蛋白与红色染色的溶酶体共定位。
图6：用ROP肽免疫两种不同品系小鼠，产生针对所述肽的免疫应答，在不同品系小鼠中免疫应答靶向重叠肽合并物(pool)中的不同的单独肽。
图7：肽ASNENMDAMTQV/LASNENMETH与5mU的组织蛋白酶S(Calbiochem)在37℃温育30分钟。通过在100℃加热5分钟终止酶反应。产物经过MilliporeMicrocon离心式过滤器(YM-10)过滤从酶中分离出肽，通过质谱分析所述肽。所述肽被酶切成两个肽：ASNENMDAMTVQ和LASNENMETH。
结果：
制得包含覆盖Nef蛋白的20个重叠肽的重组蛋白(ROP蛋白)，在每个肽之间插入蛋白酶Xa因子的短底物序列(图1)。
经过纯化(图2)，ROP蛋白被Xa因子酶切成重叠肽(ROP肽)，如质谱所示(图3)。
比较小鼠的树突状细胞(DC)摄取ROP蛋白和ROP肽(两者都用绿色荧光进行标记)的方式。可以看出，ROP肽比ROP蛋白更快地(从5分钟开始)被树突状细胞所摄取(图4)，并且多数的肽(用绿色荧光标记)直接进入细胞质；而ROP蛋白(用绿色荧光标记)则进入到溶酶体(用红色染色)(图5)。
用ROP肽免疫两种不同品系小鼠，在两种品系的小鼠中产生针对所述肽以及针对ROP蛋白的免疫应答。然而，在不同品系的小鼠中，免疫应答靶向重叠肽合并物中的不同的单独肽(图6)。
ROP鉴定的表位与数据库中的表位的比较
将ROP表位与HIV分子免疫数据库(http://hiv-vacdb.lan1.gov/content/immunology/table/st1_summary.html)中的表位进行对比。3个来自H-2b小鼠的表位与已知的表位完全相同或者重叠(显示为粗体、斜体或下划线)。
这些结果表明，用重组的重叠肽(ROP)(包含IEGR)进行免疫，产生了针对HIVNef的免疫应答。换而言之，在小鼠体内重组的重叠肽(包含IEGR)免疫的细胞对含Nef的病毒元件产生应答，通过重叠合成寡肽对其进行了检测。
通过这种方式鉴定的表位可与HIV分子免疫学数据库(http://hiv-vacdb.lan1.gov/content/immunology/tables/ctlsummary.html)中的表位相同；部分相同；或完全不同。与Sigma-Genosys提供的合成肽(覆盖NefLai序列的重叠合成肽)进行活性对比，所示合成肽不包含IEGR序列。
可以得出结论，IEGR不会影响重组的重叠肽(ROP)刺激Nef特异性免疫应答的能力。
在进一步的实验中，在肽序列中引入组织蛋白酶S的酶切位点(TQV/L)。在常规条件下，在体外用组织蛋白酶S成功地进行酶切，并且通过质谱表征两个片段(图7)。
实施例2
本发明通过下述实施方案进行说明，采用HIVNef蛋白。
方法：
1.DNA的设计
合成基因采用这样一种方式进行设计：它包含一系列10个氨基酸重叠的20元肽，其中插入类胰蛋白酶或组织蛋白酶S的酶切位点，覆盖Nef蛋白202个氨基酸的全长，所述Nef蛋白来自人类免疫缺陷病毒的赖型钩端螺旋体(Laistrain)。
2.基因合成
基因由GeneArt公司(德国雷根斯堡)进行商业上的合成。
3.生产活的减毒载体疫苗
构建重组的活的减毒载体疫苗，李斯特菌重叠Nef(Listeria-overlappingNef)，方法是利用穿梭载体pKSV7(1)以及改进的Camillietal.(2)(如前所述(3))的方案，将其染色体稳定地修饰，在单增李斯特菌(L.monocytogenes)的sepA基因中插入HIV-gag。
4.小鼠及免疫
用减毒的李斯特菌重叠Nef在皮下(s.c.)免疫不同品系的近交系和/或远交系的小鼠，每只小鼠106-107pfu，每隔2-4周免疫1或2次。对照组仅仅给予李斯特菌或磷酸缓冲液。最后1次加强免疫的1-2周后，收集脾细胞并进行IFN-γ-特异性酶联免疫斑点实验并在细胞内对IFN-γ进行染色。
5.胞浆内细胞因子染色和流式细胞仪分析
在24孔培养板中，用含有或不含有1μM重组的重叠肽的白介素-2(20U/ml)在5×106个细胞/ml的条件下培养小鼠脾细胞6小时。在收获前的4个小时，根据制造商的方案用Golgistop(BDPharMingen)处理细胞。然后用藻红蛋白-(PE)-结合的单克隆兔抗鼠CD8或CD4抗体(BDPharMingen)或同种型免疫球蛋白对照将脾细胞染色20分钟。用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BDPharMingen)对脾细胞进行细胞内细胞因子染色，并根据制造商的说明加入FITC结合的抗-IFN-γ抗体(20μg/ml)。样品可通过EpicsXL流式细胞仪(BeckmanCoulter，Fullerton，美国加利福尼亚)获得，并使用Expo32软件(BeckmanCoulter)进行数据分析。
6.酶联免疫斑点实验(ELISPOT)
酶联免疫斑点实验使用来自BDPharminGen公司的酶联免疫斑点实验试剂盒进行。简而言之，IFN-γ-预涂板上的脾细胞用1μM的重组的重叠肽重刺激过夜。弃去细胞，加入生物素化的抗IFN-γ抗体37℃培养1小时，然后用酶标记的抗生物素抗体在37℃下再温育1小时。颜色稳定后，在显微镜下进行斑点计数。结果表示为SFU/106个细胞。
7.淋巴细胞增殖实验
分离脾细胞，在HIVNef蛋白(15μg/ml)、重组的重叠肽(3μg/ml)或OVA(15μg/ml)存在下，在RPMI1640加15％FCS加抗生素中，2×106/ml培养5天。在收获细胞前的4个小时，每孔细胞可用1μCi的3H-胸腺嘧啶进行脉冲。收获细胞后，可通过β-计数仪(Beckman，Fullerton，美国加利福尼亚)测定3H-胸腺嘧啶的掺入。结果表示为刺激指数(SI)，即，被刺激细胞的每分钟计数与仅在培养基中培养的细胞的每分钟计数的比值。
8.恒河猴实验
开始时使用四只猴子，加入不同剂量的重组的李斯特菌重叠Nef(表达Nef的李斯特菌和李斯特菌本身(Listeriaonly))。通过IFN-γ-酶联免疫斑点实验和增殖实验来确定诱导细胞免疫应答的最佳剂量。
在实验中使用三组恒河猴，被分别给予李斯特菌重叠Nef(最佳剂量)、李斯特菌Nef、及李斯特菌本身。用IFN-γ-酶联免斑点实验和增殖实验来验证所述重叠肽是否能诱导灵长类动物模型产生免疫应答。
9.树突状细胞(DC)摄取肽和蛋白的实验。
应用小鼠的树突状细胞系DC2.4观察树突状细胞如何摄取重组的重叠肽(ROP肽)及其相应的重组蛋白(ROP蛋白)。所述ROP肽和蛋白均使用Invitrogen公司的可固定死细胞染色试剂盒(绿色荧光活性染料-目录号L23101)进行标记。所述绿色荧光染料可以结合到肽或蛋白的氨基上。游离的荧光染料不能透入活细胞。然而，与荧光染料结合的肽或蛋白可以被活的树突状细胞摄取，成为绿色。这可以通过流式细胞仪进行测量或通过共聚焦显微镜进行观察。
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Claims (24)

1.一种合成预定氨基酸序列的寡肽家族的方法，所述寡肽家族共同构成靶蛋白的7个氨基酸至完整氨基酸序列，所述方法包括：
合成编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含来自靶蛋白的目标部分的重叠肽，其中间插编码蛋白酶酶切位点的区域，在适当的表达载体中表达所述核酸构建体，收获与核酸序列相应的融合蛋白，并用对酶切位点有选择性的蛋白酶消化所述融合蛋白，产生寡肽；
其中所述寡肽家族是长度为10至30个氨基酸的寡肽的混合物，每个寡肽带有与跨越靶蛋白的氨基酸序列的邻近重叠肽的5至25个氨基酸重叠；
其中，所述蛋白酶酶切位点是因子Xa消化位点或组织蛋白酶S酶切位点。
2.权利要求1的方法，其中所述寡肽是连续的，构成靶蛋白的目标序列。
3.权利要求1的方法，其中所述寡肽是重叠的，构成靶蛋白的目标序列。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述寡肽具有相同的长度。
5.权利要求1的方法，其中所述因子Xa消化位点是IEGR；所述组织蛋白酶S酶切位点是TVQ/L，其中，“/”代表切割位点。
6.一种融合蛋白，其包含来自靶蛋白的目标部分的重叠寡肽，其中间插编码蛋白酶酶切位点的区域；其中所述寡肽的长度为10至30个氨基酸，每个寡肽带有与跨越靶蛋白的氨基酸序列的邻近重叠肽的5至25个氨基酸重叠；
其中，所述蛋白酶酶切位点是因子Xa消化位点或组织蛋白酶S酶切位点。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，其中所述因子Xa消化位点是IEGR；所述组织蛋白酶S酶切位点是TVQ/L，其中，“/”代表切割位点。
8.编码权利要求7的融合蛋白的核酸序列。
9.一种合成预定氨基酸序列的寡肽家族的方法，所述寡肽家族共同构成靶蛋白的7个氨基酸至完整氨基酸序列，所述方法包括：
合成编码融合蛋白的核酸构建体，所述融合蛋白包含来自靶蛋白的目标部分的重叠肽，其中间插编码蛋白酶酶切位点的区域，将所述核酸构建体导入合适的载体，宿主细胞诱导所述融合蛋白的表达，由此所表达的融合蛋白被宿主细胞蛋白酶或载体编码的非宿主蛋白酶细胞内酶切，所述蛋白酶对酶切位点有选择性，产生寡肽，并收获所述寡肽；
其中所述寡肽家族是长度为10至30个氨基酸的寡肽的混合物，每个寡肽带有与跨越靶蛋白的氨基酸序列的邻近重叠肽的5至25个氨基酸重叠；
其中，所述蛋白酶酶切位点是因子Xa消化位点或组织蛋白酶S酶切位点。
10.权利要求9的方法，其中所述寡肽是连续的，构成靶蛋白的目标序列。
11.权利要求9的方法，其中所述寡肽是重叠的，构成靶蛋白的目标序列。
12.权利要求9-11中任一项的方法，其中所述寡肽具有相同的长度。
13.权利要求9的方法，其中所述因子Xa消化位点是IEGR；所述组织蛋白酶S酶切位点是TVQ/L，其中，“/”代表切割位点。
14.权利要求9-11中任一项的方法，其中所述载体还编码蛋白酶激活因子，所述蛋白酶对酶切位点有选择性。
15.权利要求9-11中任一项的方法，其中所述蛋白酶酶切位点被病原体特异性蛋白酶所酶切。
16.权利要求9-11中任一项的方法，其中所述载体是选自李斯特菌(Listeria)、沙门氏菌(Salmonella)和志贺氏菌(Shigella)的细菌载体。
17.权利要求8的核酸序列在制备用于预防性治疗病毒感染或癌的药物中的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述病毒感染是HIV、丙型肝炎病毒或疱疹病毒感染，并且所述癌是肿瘤。
19.权利要求18的用途，其中所述肿瘤是黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、肝癌。
20.权利要求8的核酸序列在制备用于治疗由病原体引起的疾病的药物中的用途，所述病原体产生对酶切位点有特异性的蛋白酶。
21.权利要求6或7的融合蛋白在制备用于预防性治疗病毒感染或癌的药物中的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述病毒感染是HIV、丙型肝炎病毒或疱疹病毒感染，并且所述癌是肿瘤。
23.权利要求22的用途，其中所述肿瘤是黑色素瘤、乳腺癌、肾癌、肝癌。
24.权利要求6或7的融合蛋白在制备用于治疗病原体引起的疾病的药物中的用途，所述病原体产生对所述酶切位点有特异性的蛋白酶。
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