ES2341429T3 - Mejoras en las respuestas inmunitarias al vih o relacionadas con las mismas. - Google Patents
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Abstract
Inmunógeno en forma estéril apto para la administración a un sujeto humano que comprende: (1) una parte del 55 al 95% de la secuencia de aminoácidos de la proteína gag de VIH, procediendo dicha proteína gag de un clado de VIH o una parte del 55 al 95% de la secuencia de aminoácidos de una proteína gag procedente de una secuencia de consenso para uno o más clados de VIH; (2) polipéptidos de p17 y p24 en orden inverso en comparación con la proteína gag vírica y que comprende por lo menos un epítopo de clase I de MHC y por lo menos epítopo de clase II de MHC que estimula las células colaboradoras CD4+; y (3) un polipéptido sintético que comprende por lo menos 10 epítopos de CTL humanos CD8+ de una proteína del VIH enumerada en la Tabla 1, y estando representada una diversidad de proteínas del VIH en el polipéptido sintético, estando seleccionados dichos epítopos de CTL para estimular una respuesta inmunitaria a uno o más clados de VIH de interés.
Description
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Mejoras en las respuestas inmunitarias al VIH o
relacionadas con las mismas.
La presente invención se refiere a un inmunógeno
diseñado para provocar una respuesta inmunitaria
anti-VIH en un sujeto humano (en particular, una
respuesta mediada por células), a una molécula de ácido nucleico que
codifica el inmunógeno, a las composiciones que comprenden el
inmunógeno y/o a la molécula de ácido nucleico y a la utilización
del inmunógeno y/o a la molécula de ácido nucleico en la preparación
de un medicamento destinado a prevenir y/o tratar la infección por
VIH en un sujeto humano.
El desarrollo de vacunas eficaces contra el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es uno de los principales
objetivos de la investigación actual del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA). A pesar del avance en la
prevención y de las potentes combinaciones de fármacos para tratar
la infección contra el VIH, se estima que cada día se infectan unas
16.000 personas. Más del 90% de las nuevas infecciones se producen
en países en desarrollo para los cuales los recientes avances
médicos no son aplicables o posibles inmediatamente. La mejor
expectativa para estos países es el desarrollo de una vacuna eficaz
y accesible contra el VIH. Actualmente, existe un optimismo
creciente entre los científicos de que puede ser posible una vacuna
contra el SIDA (McMichael y Hanke 1999 Nat. Med. 5,
612-614; Gold 1999 IAVI Report 4, páginas
1-2, 8-9, 15-16 y
18).
Una teórica vacuna profiláctica provocaría
inmunidad esterilizadora, de modo que tras la exposición, el virus
no se detectaría nunca en el cuerpo. Sin embargo, esto es
probablemente un objetivo irrealista. En su lugar, un objetivo
alcanzable puede ser una inmunidad provocada por la vacuna que dé
cómo resultado una replicación limitada y transitoria del virus
tras la cual el virus se vuelve indetectable, no existen signos de
enfermedad ni ninguna transmisión a otros individuos.
Alternativamente, una vacuna potencialmente lograda puede provocar
respuestas inmunitarias que por lo menos mantienen al virus en
comprobación a niveles tan bajos, que tanto la evolución para el
SIDA como la transmisión se evitan completa o sustancialmente.
Para provocar inmunidad esterilizadora, puede
necesitarse una vacuna profiláctica para provocar respuestas
inmunitarias tanto humorales como mediadas por las células. Ya que
el VIH fue aislado y secuenciado, se ha realizado un considerable
esfuerzo para desarrollar vacunas basadas en la envoltura que
produzcan anticuerpos neutralizantes (nAb). Sin embargo, esto ha
demostrado ser sumamente difícil (Heilman y Baltimore 1998 Nat.
Med. 4 (4 Supl.) 532-534). Aunque se
publicó algún logro en la producción de nAb contra cepas de VIH de
laboratorio (Berman et al. 1990 Nature 345,
622-625; Fultz et al. 1992 Science
256, 1687-1690), ha sido sumamente difícil
neutralizar cepas primarias (Trkola et al. 1998 J.
Virol. 72, 1876-1885; Haynes 1996 Lancet
34, 933-937). Una explicación para los primeros 15
años de insuficiencia relativa ha sido proporcionada por la
estructura cristalina del núcleo gp 120, que puso de manifiesto
múltiples mecanismos mediante los cuales el VIH evita la producción
eficaz de nAb (Wyatt et al. 1998 Nature 393,
705-711; Kwong et al. 1998 Nature
393, 638-659). Como resultado de estas dificultades,
el énfasis de muchos diseñadores de vacunas se ha desplazado a la
producción de respuestas inmunitarias mediadas por células, que son
mediadas (fundamentalmente) por linfocitos T citotóxicos.
Los linfocitos T citotóxicos (CTL) son
normalmente células CD8^{+} y participan en una defensa del
organismo por lo menos de dos maneras diferentes: destruyen las
células infectadas por virus; y segregan una variedad de citocinas
y quimiocinas que contribuyen directa o indirectamente a la
supresión de la replicación vírica. La protección mediada por CTL
tras la vacunación puede depender de las concentraciones de CTL
presentes en la circulación y, quizás, específicamente de las
proteínas expresadas inicialmente (proteínas reguladoras) en lugar
de las últimas (proteínas estructurales), en el ciclo de
replicación.
La provocación y mantenimiento de las respuestas
de los linfocitos T CD8^{+} requieren la "ayuda"
proporcionada por los linfocitos T CD4^{+} (linfocitos T
colaboradores). En algunos individuos infectados por el VIH, se han
detectado elevadas concentraciones de respuesta de colaborador
específico para el VIH.
La identificación de los procedimientos para la
provocación de respuestas potentes a linfocitos T CD8^{+}
proporcionaría las herramientas para estudiar su función o funciones
en el dimensionamiento del curso de la infección por VIH y puede
estimular la evolución hacia una vacuna eficaz contra el VIH.
Previamente, se construyó una vacuna prototipo contra el VIH como
una serie de epítopos parcialmente solapantes reconocidos por los
CTL murino, de macaco y humano, que fueron administrados por los
vehículos de la vacuna que eran seguros y aceptables para su
utilización en seres humanos, un vector de ADN y el vector Ankara
del virus de la vacuna modificado (MVA) (Hanke et al. 1998
Vaccine 16, 426-435; Hanke et al. 1998
J. Gen. Virol. 79, 83-90). En ratones, el
protocolo más potente para la producción de CTL se observó que era
el cebado con ADN seguido de refuerzo con MVA (Hanke et al.
1998 Vaccine 16, 439-445; Schneider et
al., 1998 Nat. Med. 4, 397-402) es
decir, cebando ratones con el ácido nucleico que codifica el
polipéptido adecuado, seguido del refuerzo de los ratones mediante
inoculación con un vector Ankara del virus de la vacuna modificado
("MVA") que expresan los epítopos adecuados.
El documento WO 98/56919 da a conocer una
estrategia de vacunación de "cebado-refuerzo",
que implica (i) cebar con una composición que comprende una fuente
de uno o más epítopos de linfocitos T de un antígeno diana, junto
con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y (ii) reforzar con una
composición que comprende una fuente de uno o más epítopos de
linfocitos T del antígeno diana, incluyendo por lo menos un epítopo
de linfocito T que es el mismo que un epítopo del linfocito T de la
composición de cebado.
El objetivo de la presente invención es,
inter alia, proporcionar inmunógenos que pueden ser útiles
para provocar una respuesta específica contra VIH en seres
humanos.
En un primer aspecto, la invención proporciona
un inmunógeno en forma estéril adecuado para la administración a un
sujeto humano que comprende: (1) una parte del 55 al 95% de la
secuencia de aminoácidos de la proteína gag de VIH, procediendo
dicha proteína gag de un clado de VIH o una parte del 55 al 95% de
la secuencia de aminoácidos de una proteína gag procedente de una
secuencia de consenso para uno o más clados de VIH; (2)
polipéptidos de p17 y p24 en orden inverso en comparación con la
proteína gag vírica y que comprende por lo menos un epítopo de
clase I de MHC y por lo menos epítopo de clase II de MHC que
estimula las células colaboradoras CD4^{+}; y (3) un polipéptido
sintético que comprende por lo menos 10 epítopos de CTL humanos
CD8^{+} de una proteína del VIH enumerada en la Tabla 1, y en la
que una diversidad de proteínas del VIH están representadas en el
polipéptido sintético, seleccionándose dichos
\hbox{epítopos de
CTL para estimular una respuesta inmunitaria a uno o más clados de
VIH de interés.}
Para los presentes fines "estéril" se
refiere a la ausencia general de virus, bacterias, hongos,
levaduras, clamidia, micoplasma y esporas de alguno de los
anteriores (especialmente microbios patógenos en seres humanos).
Sin embargo, el inmunógeno puede comprender uno o más vectores
microbianos específicos conocidos (por ejemplo víricos o
bacterianos) que sirven para expresar la proteína gag y/o el
polipéptido sintético en un sujeto humano. Dichos vectores son bien
conocidos por los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo,
virus tales como adenovirus y virus aviares que son intrínsecamente
no patógenos en seres humanos o que han estado sometidos a
manipulación genética o a otra modificación para hacerlos no
patógenos en seres humanos. Se prefiere particularmente el virus de
vacuna, especialmente el virus Ankara de vacuna modificado (MVA).
Otros vectores víricos específicos preferidos incluyen el virus de
Semliki Forest (SFV) y el virus de Sindbis (véase Smerdon y
Liljeström 2000, Gene Ther. Regul. 1,
1-31). Los vectores bacterianos adecuados incluyen
BCG, y cepas atenuadas de Salmonella Spp. (especialmente
mutantes "doble aro" de Salmonella que están siendo
desarrollados como vacunas para enfermedades diarreicas), y
Shigella (véase Shata et al. 2000 Mol. Med.
Today 6, 66-71).
Otros sistemas de expresión, que pueden ser
útiles para producir el inmunógeno incluyen un vector de expresión
del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Palmer et al. 1999
Arch. Virol. 144, 1345-60) y los túbulos NS1
del virus de la lengua azul (Adler et al. 1998 Med.
Microbiol. Immnunol. (Berl.) 187, 91-96).
El término "sintético" tal como se utiliza
en la presente memoria, pretende referirse a un polipéptido que no
está presente, en su totalidad, en ninguna cepa de VIH natural. El
término "sintético" no pretende indicar que el polipéptido se
sintetiza necesariamente por técnicas químicas convencionales de
síntesis de péptidos en fase sólida. Aunque esto representa una
posibilidad, se prefiere generalmente que el polipéptido se
sintetice por transcripción y/o traducción de una molécula de ácido
nucleico apropiada que codifica el polipéptido sintético. Dichos
procedimientos de síntesis son bien conocidos por los expertos en la
materia y no forman parte de la invención.
Se prefiere que el 55 al 95% de la secuencia de
aminoácidos de la proteína gag y el polipéptido sintético se unan
de alguna manera en una sola entidad. Por ejemplo, un vector vírico
puede expresar tanto la proteína gag como el polipéptido sintético
como componentes independientes del inmunógeno. Alternativamente,
ambos componentes del inmunógeno pueden acoplarse por enlace
covalente o conjugarse entre sí o a una entidad portadora común
(tal como un liposoma, ISCOM o molécula). En formas de realización
preferidas, tanto la proteína gag como los componentes del
polipéptido sintético del inmunógeno están presentes en un solo
polipéptido o proteína de fusión. En dicha proteína de fusión, la
proteína gag y el polipéptido sintético pueden ser esencialmente
los únicos componentes presentes. Alternativamente, la proteína de
fusión puede comprender otros componentes que pueden corresponder a
otros antígenos de VIH (o partes de los mismos) o pueden proceder de
otras fuentes. De este modo, en algunas formas de realización, el
polipéptido comprenderá una parte de la proteína gag sustancialmente
adyacente al polipéptido sintético (es decir, con menos de 10
restos de aminoácidos intermedios). En otras formas de realización,
la parte de la proteína gag y el polipéptido sintético pueden estar
separados por uno o más componentes intermedios (es decir, con 10 o
más restos de aminoácidos intermedios), que por lo general
comprenderán uno o más antígenos adicionales de VIH.
Entre el 55 y el 95% de la proteína gag estará
presente, preferentemente entre el 65 y el 85%, aún más
preferentemente aproximadamente el 75%.
La proteína gag del VIH natural se sabe que está
constituida por tres partes denominadas p17, p24 y p15. Éstos se
sintetizan en las células infectadas como una sola poliproteína, con
p17 y en el terminal N. Normalmente, en las células infectadas por
VIH, el terminal N de p17 está miristilado.
Es deseable que la parte gag del inmunógeno
comprenda por lo menos parte de p17 y p24, pero se prefiere
generalmente que el componente p17 esté modificado de alguna manera
para impedir la miristilación. Convenientemente, esto puede
realizarse invirtiendo el orden de los componentes p17 y p24 en el
inmunógeno, de modo que p17 no esté ya en el terminal N libre y por
consiguiente no pueda ser miristilado. Los inventores creen que esto
puede mejorar la eficacia de presentación de los péptidos,
procedentes del inmunógeno, para el sistema inmunitario del
paciente.
La proteína gag componente del inmunógeno
generalmente comprenderá por lo menos un linfocito T colaborador,
HLA de clase II restringido, epítopo de péptido y preferentemente
comprenden muchos de dichos epítopos (preferentemente de modo que
numerosos alelos restringidos de HLA de clase II diferentes están
representados en el componente gag). El componente de la proteína
gag comprenderá también por lo general uno o más epítopos del
péptido limitado a HLA de clase I de CTL.
El componente del polipéptido sintético del
inmunógeno tendrá convenientemente la forma de una serie de epítopos
de CTL, representado cada uno por una secuencia respectiva de
aproximadamente 8 a 12 aminoácidos o contenido en la misma.
Deseablemente por lo menos alguno (preferentemente la mayoría) de
los epítopos será parcialmente solapante (de modo que uno o más
aminoácidos de un epítopo también estará contenido dentro de la
secuencia de un epítopo adyacente). Alguna secuencia "no
epitópica" de aminoácidos puede estar presente entre los epítopos
adyacentes, pero generalmente esto debe evitarse.
La secuencia no epitópica de aminoácidos entre
epítopos adyacentes es preferentemente inferior a 20 restos de
aminoácidos, más preferentemente inferior a 10 restos y aún más
preferentemente 1 a 5 restos de aminoácidos. Es evidente que dicha
secuencia de aminoácidos no epitópicos pueden comprender
enlazadores, espaciadores y similares que optimizan los niveles de
expresión del polipéptido sintético u optimizan su
inmunogenicidad.
Por lo tanto, en una forma de realización
extrema, todos los epítopos CTL humanos en el polipéptido sintético
pueden ser solapantes y, en el otro extremo cada epítopo puede estar
separado de sus adyacentes por lo menos por alguna secuencia de
aminoácidos no epitópicos. Se prefiere generalmente que por lo menos
el 50 de los epítopos de CTL humanos sean solapantes.
Además de los epítopos solapantes el polipéptido
sintético puede comprender por lo menos algunos "epítopos
adyacentes". La expresión "epítopos adyacentes" se refiere a
los epítopos que no son solapantes pero que no están separados por
ninguna secuencia de aminoácidos no epitópicos intermedios.
Por lo tanto, en las formas de realización
preferidas el polipéptido sintético comprende un mosaico de piezas
juntas de pequeños fragmentos (por lo general, aproximadamente de 10
a 20 residuos de aminoácidos) de diferentes proteínas de VIH,
fragmentos que comprenderán por lo general uno, dos o tres epítopos
adyacentes conocidos y/o epítopos de CTL humanos solapantes. Cuando
una pluralidad de fragmentos están presentes en el polipéptido
sintético procedentes de la misma proteína del VIH, los fragmentos
por lo general se han seleccionado de entre partes discontinuas de
la proteína, de modo que es improbable que el polipéptido sintético
comprenda una secuencia correspondiente a más de 20 a 25 restos de
aminoácidos consecutivos de una proteína específica de VIH.
Generalmente, el polipéptido sintético se diseña para que omita
esencialmente las partes de proteínas de VIH no conocidas que
contienen algunos epítopos de CTL humanos.
Muchas proteínas diferentes de VIH
preferentemente estarán representadas en el polipéptido sintético.
El polipéptido sintético puede contener epítopos presentes en algún
antígeno de VIH, pero preferentemente comprenderá por lo menos un
epítopo presente en uno o más de los siguientes: p24; pol; gp41;
gp120; y nef. En una forma de realización preferida, el polipéptido
sintético comprende por lo menos un epítopo CTL presente en cada una
de las proteínas VIH mencionadas anteriormente. El polipéptido
sintético puede comprender además por lo menos un epítopo de CTL
presente en cada una de las siguientes proteínas del VIH: vpr, vpu,
vif (y especialmente) tat y rev.
Debe sobreentenderse que la expresión "epítopo
de CTL humano" tal como se utiliza en la presente memoria se
refiere no al origen de la proteína de la que procede el epítopo,
sino que indica que el epítopo es reconocido y respondido por el
CTL de por lo menos una parte de la población humana. Por lo general
un epítopo de CTL humano será reconocido por lo menos por el 0,01%,
preferentemente el 0,1%, y más preferentemente por lo menos por el
1% de la población humana del mundo.
En una forma de realización específica, el
inmunógeno excluye específicamente cualquier epítopo de la proteína
env generalmente reconocido por el sistema inmunitario humano. Las
pruebas de diagnóstico más utilizadas actualmente se basan en la
detección de una respuesta inmunitaria específica para VIH, por eso
excluyendo componentes env del inmunógeno es posible distinguir
entre las respuestas inmunitarias que aparecen en la infección con
el virus y la inoculación con el inmunógeno.
En una forma de realización, los epítopos del
CTL presentes en el polipéptido sintético se seleccionan de modo
que se genere una respuesta inmunitaria al clado A del VIH.
Preferentemente sin embargo, el polipéptido sintético es lo
bastante grande y los epítopos del CTL se seleccionan de manera
apropiada, de modo que se estimulará una respuesta inmunitaria que
es reactiva en cruz frente a diferentes clados de VIH. Esto puede
conseguirse convenientemente incluyendo uno o más epítopos de CTL
que se conservan entre diferentes clados de VIH. Varios de dichos
epítopos son conocidos por los expertos en la materia (véase la
Tabla 1 a continuación).
En una forma de realización preferida, el
inmunógeno comprende por lo menos un epítopo (convenientemente un
epítopo de CTL) que es reconocido por uno o más mamíferos del ensayo
de laboratorio, (por ejemplo ratón y/o mono) dicho epítopo puede
incorporarse fácilmente en el polipéptido sintético. La inclusión de
un epítopo de esta clase permite que se ensaye la calidad,
reproducibilidad y/o estabilidad de diferentes lotes del inmunógeno
en un ensayo de potencia utilizando el manual de ensayo de
laboratorio (tal como un ratón o mono macaco). Ejemplos de dichos
epítopos incluyen la secuencia de aminoácidos ACTPYDINQML (SEC. ID.
nº 1; que contiene un epítopo dominante procedente de un virus de
inmunodeficiencia de simio, SIV, gag p27, reconocido por los CTL
del mono macaco rhesus) y RGPGRAFVTI (SEC. ID. nº 2; un epítopo de
ratón con CTL restringidos por H-2D^{d} derivado
de la proteína env del VIH).
Una lista de 23 epítopos de CTL humano apropiada
para la inclusión en el polipéptido sintético se muestra en la
Tabla 1. La lista no es exhaustiva. El inmunógeno preferido
comprenderá por lo menos 10 de dichos epítopos de CTL humanos, más
preferentemente por lo menos 15, aún más preferentemente por lo
menos 20. En una forma de realización específica cada uno de los 23
epítopos de CTL humanos enumerados en la Tabla 1 estará representado
en el polipéptido sintético,
\hbox{opcionalmente junto con los
epítopos de macaco y murinos enumerados también en la Tabla
1.}
Deseablemente, el inmunógeno puede comprender
además una pequeña etiqueta o marcador. Dicha etiqueta o marcador
debería ser tan pequeña como fuera posible, para minimizar la
cantidad de material extraño presente en el inmunógeno. Una
etiqueta o marcador conveniente permite la detección de la expresión
y/o la cuantificación de la cantidad de inmunógeno. Dichas
etiquetas incluyen epítopos reconocidos por el anticuerpo monoclonal
Pk (Hanke et al. 1992 J. Gen. Virol. 73,
653-660).
El inmunógeno de la invención estará mezclado
convenientemente con otras sustancias para proporcionar una
composición de la vacuna. Por ejemplo, una composición de la vacuna
puede comprender además uno o más de los siguientes: un adyuvante
(por ejemplo alúmina), liposoma o complejo inmunoestimulante
(ISCOM). Una vacuna comprenderá también generalmente un diluyente,
excipiente o vehículo estéril, tal como un líquido fisiológicamente
aceptable (por ejemplo soluciones salinas o salinas tamponadas con
fosfato). La vacuna puede presentarse en forma de líquido o, más
preferentemente, en forma de un sólido liofilizado, que está en
suspensión o disuelto en un líquido fisiológicamente aceptable
antes de la administración.
Los procedimientos de administración del
inmunógeno a un sujeto humano resultarán evidentes para los expertos
en la materia. Dichos procedimientos incluyen, en particular,
inyección intramuscular, inyección subcutánea, o administración a
través de la piel mediante dispositivos de inyección sin aguja.
Alternativamente, las vacunas (especialmente las que comprenden
vectores bacterianos, por ejemplo Salmonella o
Shigella spp. atenuadas) pueden administrarse por vía oral,
intranasal o por cualquier otra vía adecuada. Una dosis adecuada de
inmunógeno puede estar comprendida por lo general entre 1 y 500 mg,
por lo general entre 10 y 100 mg, dependiendo del tamaño del
inmunógeno, de la masa corporal del receptor, etc. Una dosis
adecuada puede, si es necesario, determinarse por prueba y error de
rutina con diferentes grupos de pacientes a los que se administran
diferentes dosis de inmunógeno, y la respuesta inmunitaria de los
pacientes al inmunógeno ensayado para determinar el tamaño de la
dosis óptima. La respuesta inmunitaria de los pacientes puede
ensayarse por técnicas inmunológicas convencionales (por ejemplo
ensayo de liberación de cromo, utilizando los linfocitos de la
sangre periférica extraídos de muestras de sangre de los pacientes,
que actúan en células diana marcadas con cromo pulsadas con péptidos
o infectadas con virus).
En un segundo aspecto, la invención proporciona
una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión,
comprendiendo la proteína de fusión un inmunógeno según el primer
aspecto de la invención definido anteriormente.
La molécula de ácido nucleico está
preferentemente en forma aislada y esterilizada, apta para la
administración a un sujeto humano. La molécula de ácido nucleico
está preferentemente "humanizada" es decir emplea codones para
codificar aminoácidos específicos, codones que se utilizan
frecuentemente en genes humanos muy expresados (Andre et al.
1998 J. Virol, 72, 1497-1503), en lugar de
los codones utilizados por el VIH.
Convenientemente, la molécula de ácido nucleico
está contenida dentro de un vector, estando la secuencia que
codifica el inmunógeno operativamente unida a una secuencia de
activador activa en las células humanas. Convenientemente, el
activador es un activador vírico potente tal como el activador del
citomegalovirus humano (CMV). El vector preferentemente comprenderá
además un potenciador y señales de poliadenilación, que son
funcionales en las células humanas. Teóricamente, para seguridad
máxima, el vector no debería contener ningún origen de replicación
funcional en células humanas, para evitar la replicación indeseable
del vector.
El vector puede administrarse al paciente en
aislamiento, como ácido nucleico esencialmente "desnudo"
(preferentemente ADN), o además puede estar relleno en un medio de
administración, tal como un virus, bacteria, liposoma o partículas
recubiertas de oro y similares. Un medio de administración adecuado
es el virus de vacuna Ankara modificado (MVA): el gen inmunógeno o
marco de lectura abierto (ORF) puede estar insertado en el MVA, por
ejemplo, en el locus de la timidina cinasa.
Los expertos en la materia observarán que un
vector pueda comprender un ácido nucleico que codifica un inmunógeno
(estando por consiguiente el ácido nucleico de acuerdo con el
segundo aspecto de la invención), y que el vector pueda poseer
también, en su superficie o internamente, el polipéptido inmunógeno
de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
Si se administra como ácido nucleico desnudo, o
relleno dentro de un medio de administración, por lo menos alguno
de los ácidos nucleicos administrados se introduce en las células
del paciente y se transcribe (si es necesario) y se traduce, dando
como resultado la síntesis in situ del inmunógeno en el
paciente, quien desarrolla a continuación una respuesta inmunitaria
al inmunógeno.
Como en el caso de la preparación del inmunógeno
por sí misma, un ácido nucleico que codifica el inmunógeno puede
administrarse a un sujeto humano por alguna de las numerosas vías
conocidas por ejemplo inyección subcutánea o intramuscular,
administración oral, o administración a través de la piel mediante
inyector sin aguja. Ejemplos específicos de administración mediante
un dispositivo de inyección sin aguja se dan a conocer en los
documentos WO 97/34652 y WO 97/48485. Una dosis adecuada de ácido
nucleico puede estar comprendida entre 10 \mug y 10 mg, por lo
general entre 100 \mug y 1 mg, dependiendo del tamaño de la
molécula de ácido nucleico, de la vía de administración, de la masa
corporal del receptor, etc. De nuevo, una prueba de rutina y error
(con la utilidad de la presente enseñanza) permitirá a los expertos
en la materia determinar una dosis óptima de ácido nucleico.
La administración con éxito del ADN al tejido
animal se ha conseguido mediante liposomas catiónicos [Watanabe
et al., Mol. Reprod. Dev. 38: 268-274
(1994); Sharkey et al. documento WO 96/20013], inyección
directa de ADN desnudo en el tejido de músculo animal [Robinson
et al., Vacc. 11: 957-960 (1993); Hoffman
et al., Vacc. 12: 1529-1533 (1994); Xiang
et al. Virol. 199: 132-140 (1994); Webster
et al., Vacc. 12: 1495-1498 (1994); Davis
et al., Vacc. 12: 1503-1509 (1994); y Davis
et al., Hum. Molec. Gen. 2: 1847-1851
(1993)], y embriones [Naito et al., Mol. Reprod. Dev. 39:
153-161 (1994); y Burdon et al., Mol. Reprod.
Dev. 33: 436-442 (1992)], o inyección
intradérmica de ADN utilizando la tecnología del "cañón
génico" [Johnston et al., Meth. Cell Biol. 43:
353-365 (1994)].
Para la vacunación basada en ADN, la
administración mediante inyección de ADN plásmido desnudo ha
demostrado potencial en modelos de ratón para provocar respuestas
inmunitarias tanto humorales como celulares. Sin embargo, en los
animales superiores, la utilización de la administración de ADN para
la vacunación se ha impedido por requerir grandes cantidades de ADN
o provocar la expresión persistente de un antígeno con potencial
para desarrollar tolerancia al antígeno. Berglund describió una
estrategia para provocar o potenciar una respuesta inmunitaria
inyectando a ratones ADN plásmido que contenía un vector de
expresión de ADN de alfavirus que tiene un replicón recombinante de
virus Semliki Forest (SFV) en un casete de expresión eucariótica
[Berglund et al. Nature Biotechnol. 16:
562-565 (1998)]. El casete de expresión eucariótica
controló la expresión de la transcripción nuclear primaria del
replicón SFV. Este transcrito del replicón de SFV, que codifica el
antígeno heterólogo, fue transportado al citoplasma y ampliado por
el complejo de la replicasa de SFV autocodificado. El replicón del
ARN ampliado condujo a un alto nivel de producción de un ARNm que
codifica al antígeno heterólogo. Similares resultados fueron
descritos por Polo y su grupo [Polo et al., Nature
Biotechnol. 16: 517-518 (1998); Hariharan et
al., J. Virol. 72: 950-958 (1998)]. Ambos grupos
observaron que podrían provocarse respuestas inmunitarias potentes
utilizando pequeñas cantidades de aporte de ADN plásmido.
Alternativamente, un procedimiento para
administrar ADN a animales que supera los inconvenientes de los
procedimientos de administración convencional consiste en la
administración de bacterias atenuadas, invasoras que contienen un
vector de ADN bacteriano con un casete de expresión eucariótica que
codifica al gen que va a expresarse. Por ejemplo, la patente US nº
5.877.159 de Powell et al., describe bacterias vivas que
pueden invadir células animales sin crear una infección productiva
o dar lugar a enfermedad para introducir de este modo un casete de
expresión eucariótica que codifica a un antígeno capaz de ser
expresado por las células animales.
En un tercer aspecto, la invención proporciona
la utilización de un inmunógeno de acuerdo con el primer aspecto de
la invención, o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el
segundo aspecto de la invención en la preparación de un medicamento
para prevenir o tratar la infección por VIH en un sujeto humano.
Convenientemente, puede administrarse tanto el
inmunógeno como la molécula de ácido nucleico. En particular,
preferentemente una o más administraciones de la molécula de ácido
nucleico ("cebado") seguido de un intervalo adecuado (por
ejemplo 1 semana a 4 meses) por una o más administraciones de
inmunógeno ("refuerzo"). El refuerzo puede realizarse, por
ejemplo, administrando un vector de replicación competente (por
ejemplo virus o bacteria atenuado) o no replicador que comprende el
inmunógeno y/o una molécula de ácido nucleico que codifica al
inmunógeno. Preferentemente, el refuerzo se consigue administrando
el inmunógeno como parte de una partícula vírica de MVA, partícula
que puede comprender ventajosamente un ácido nucleico que codifica
al inmunógeno.
En formas de realización preferidas, la
utilización dará como resultado la generación en el paciente de una
respuesta inmunitaria protectora de modo que el sujeto
posteriormente estaría expuesto a la infección por el VIH, el
paciente no comenzará a desarrollar los síntomas del SIDA asociados
a la infección por el VIH.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona
una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de
aminoácidos mostrada en la figura 8A. Convenientemente, el ácido
nucleico comprende o consiste esencialmente en la secuencia
nucleotídica mostrada en la figura 8B.
En un quinto aspecto, la invención proporciona
un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada
en la figura 8A.
El ácido nucleico del cuarto aspecto y/o el
polipéptido del quinto aspecto pueden utilizarse en composiciones
de inmunógeno/vacuna como se describe en relación con los demás
aspectos de la invención, y dichos inmunógenos y vacunas se
consideran de acuerdo con el alcance de la invención, y pueden
comprender vectores, etc. (especialmente MVA) como se dijo
anteriormente. La invención proporciona además, en un sexto aspecto,
la utilización de un ácido nucleico según un cuarto aspecto de la
invención y/o un polipéptido según el quinto aspecto de la invención
en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la
infección por VIH en un paciente.
La invención se describirá con más detalle a
continuación a título de ejemplo ilustrativo y haciendo referencia
a los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1A es una representación esquemática
de inmunógenos, VIHA, VIHTA y VIHAeT según la invención; y un PPA
inmunógeno;
La figura 1B presenta la secuencia de
aminoácidos del inmunógeno VIHA (SEC. ID. nº 26);
La figura 2A presenta la secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº 27) de un ácido nucleico (denominado "gen de
VIHA") que codifica el inmunógeno VIHA;
La figura 2B es una representación esquemática
del procedimiento utilizado para construir el gen VIHA;
La figura 3 es una representación esquemática de
una molécula del vector del ADN (pTHr.VIHA) según la invención, y
del procedimiento de su construcción;
La figura 4 es una microfotografía que muestra
la detección inmunofluorescente de la expresión del VIHA por
células de ratón después de la transfección con pTHr. VIHA;
Las figuras 5A, B y C son unos gráficos que
muestran los resultados de los ensayos de liberación de cromo
utilizando esplenocitos extraídos de ratones inoculados con una
molécula de ADN o un inmunógeno según la invención;
La figura 6A muestra la secuencia de aminoácidos
del inmunógeno VIHTA (SEC. ID. nº 28);
La figura 6B muestra la secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº 29) de una molécula de ácido nucleico que codifica el
inmunógeno TA del VIH;
La figura 7A muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC. ID. nº 30) del polipéptido tat presente en el inmunógeno
VIHAeT;
La figura 7B muestra la secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº 31) de una molécula de ácido nucleico que codifica el
inmunógeno VIHAeT;
La figura 8A muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC. ID. n. 32) del inmunógeno PPA que está de acuerdo con el
sexto aspecto de la invención; y
La figura 8B muestra la secuencia nucleotídica
(SEC. ID. nº. 33) de una molécula de ácido nucleico (según el
quinto aspecto de la invención) que codifica el inmunógeno PPA.
Ejemplo
1
Este ejemplo se refiere a un inmunógeno para su
utilización en una vacuna que se centra en la provocación de
respuestas inmunitarias celulares mediadas por una acción concertada
de linfocitos T CD4^{+} colaboradores y CD8^{+} efectores. El
inmunógeno, denominado VIHA (Hanke y McMichael Nat. Med. 6,
951-955), se diseñó para una prueba de eficacia en
fase III en Nairobi, Kenia. La figura 1A es una representación
esquemática de varios inmunógenos, incluyendo el VIHA. El VIHA
procede de las secuencias del clado A del VIH-1,
clado del VIH predominante en Nairobi y está constituido por
aproximadamente el 73% de la proteína gag fusionada a una serie de
25 epítopos de CTL parcialmente solapantes. El dominio gag de VIHA
contiene p24 y p17 en un orden inverso a la poliproteína vírica gag
p17-p24-p15. Esta transposición
impide la miristilación del terminal N de p17, que podría dirigir
la proteína recombinante a la membrana celular, impidiendo de este
modo la degradación eficaz en péptidos necesaria para la
presentación del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) de
clase I.
La figura 1B muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC. ID. nº 26) del inmunógeno VIHA. Los aminoácidos
correspondientes a las secuencias de la endonucleasa de restricción
utilizadas para montar el gen se presentan en letra negrita (GS
corresponde a Bam HI, GT corresponde a kpnI y EF
corresponde a EcoRI).
La secuencia de aminoácidos del dominio gag
procedía de la secuencia de consenso en la base de datos de la
proteína del clado A de VIH-1 (Korber et al.
"Human retroviruses and AIDS; a compilation and analysis of
nucleic acid and amino acid sequences" 1997). A falta de las
secuencias disponibles de la cepa keniata, las zonas sin
preferencia del clado A de aminoácido fuerte se dirigieron hacia las
cepas ugandesas. La proteína gag del VIH-1 contenía
no solamente la clase I de MHC importante sino también los epítopos
restringidos de clase II que estimulan los linfocitos T CD4^{+}
colaboradores.
El terminal C de la proteína VIHA se diseñó como
un polipéptido sintético del epítopo multi-CTL. Los
epítopos de CTL incluidos en VIHA fueron reconocidos por los CTL en
los pacientes infectados con las cepas del clado A del
VIH-1 circulantes en Kenia, eran proteínas de 8 a 10
aminoácidos de longitud y se originan a partir de las proteínas
gag, pol, nef o env (Rowland-Jones et al.
1998 J. Clin. Invest. 102, 1758-1765; Dorrell
et al. 1999 J. Virol. 73, 1708-1714).
Muchos de estos epítopos son inmunodominantes y están relativamente
conservados entre otros clados de VIH-1 (Tabla 1) (y
por consiguiente deberían poder provocar una respuesta inmunitaria
que reacciona en cruz con los virus VIH de otros clados a parte del
clado A). Están representados por diecisiete alelos de HLA
diferentes que incluyen tanto los alelos africanos frecuentes así
como los alelos comunes en la mayoría de las poblaciones étnicas.
Se ha estimado que los epítopos óptimamente seleccionados
presentados por los nueve alelos de HLA más comunes podrían abarcar
la población general con independencia de la descendencia étnica
(Sydney et al. 1996 Immunol. Today 17,
261-266). Por lo tanto, dada esta mayoría de
donantes infectados por VIH que hacen buenas las respuestas de los
CTL a gag p17/p24, cada vacuna tendría potencial para responder a
por lo menos dos o tres epítopos de CTL presentes en la proteína de
VIHA.
El polipéptido sintético VIHA comprendía además
los epítopos gag del SIV y env del VIH reconocidos por los CTL de
macaco y murino, respectivamente, de modo que la calidad,
reproducibilidad y estabilidad de los lotes clínicos podría
evaluarse fácilmente en un ensayo de potencia en el ratón (o macaco
si es necesario). Un epítopo Pk del anticuerpo monoclonal (Hanke
et al. 1992 J. Gen. Virol. 73,
653-660) se añadió al terminal C del VIHA para la
fácil detección de la proteína completa y la estimación del nivel de
expresión. No hay razones para creer que los tres epítopos que no
son del HLA representan un riesgo para la salud para los individuos
vacunados.
\vskip1.000000\baselineskip
- a -
- Los epítopos están enumerados (SEC. ID. nº 3 a nº 25, 1, 2) en el orden en que aparecen en el poliepítopo.
- b -
- Una secuencia de epítopo específica está presente en aproximadamente el 50% (letra minúscula) o el 90% (letra mayúscula) de las cepas secuenciadas del clado de VIH.
- c -
- "=" indica que los epítopos están presenten en el dominio gag del clado A del terminal N.
- d -
- Epítopo dominante procedente de gag p27 del SIV flanqueado por Ala y Leu en sus terminales N y C, respectivamente, reconocido por los CTL de macaco rhesus que puede utilizarse para estudios de potencia en macacos rhesus.
- e -
- Epítopo de CTL presentado por la clase I de MHC murino utilizado para el ensayo de potencia en ratón.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Después de intentar adoptar un protocolo de
"cebado/refuerzo" en el que se consiguió el cebado
administrando ácido nucleico, era deseable diseñar la secuencia del
ácido nucleico que codifica el inmunógeno de VIHA para aumentar la
expresión de VIHA en células humanas. En primer lugar, para asegurar
un inicio eficaz de la traducción a partir del primer codón de
metionina, el marco de lectura abierto (ORF) de VIHA estaba
precedido por una secuencia de consenso de Kozak de 12 nucleótidos
de longitud (Kozak 1987 Nucl. Acids Res. 15,
8125-8148). En segundo lugar, se optimizó la
traducción del ARNm resultante sustituyendo la mayoría de los
codones procedentes del VIH-1 con los codones
utilizados frecuentemente en los genes humanos muy expresados (Andre
et al. 1998, citado anteriormente). El ORF del VIHA forma
parte de un fragmento HindIII-XbaI de ADN bicatenario
de 1.608 pares de bases de longitud. (La figura 2A muestra la
secuencia nucleotídica de la inserción HindIII-XbaI
que contiene el ORF del VIHA; SEC. ID. nº 27). En la figura 2A, se
incluyen las secuencias de la endonucleasa utilizadas para montar
los productos parciales de la PCR (nucleótidos 1-6 =
HindIII; 319-324 = BamHI;
712-717 = Kpn I; 1135-1140 =
EcoRI; y 1603-1608 = XbaI).
Se preparó el ADN plásmido y se trató utilizando
los protocolos convencionales (Sambrook et al. "Molecular
Cloning. A Laboratory Manual" 2ª Edición; Cold Spring Harbor). Se
construyó el gen de VIHA (como se indica en la figura 2B) in
vitro en cuatro piezas. Cada pieza se preparó mediante el
montaje de los oligodesoxinucleótidos solapantes con cadena
positiva y negativa de 70 a 90 bases de longitud. Se purificaron los
oligodesoxinucleótidos sintéticos utilizando el kit
EconoPure^{TM} (Perkin Elmer) según las instrucciones del
fabricante, se hibridaron y se ligaron, seguido del montaje por
PCR. Los productos de la PCR se purificaron en gel después de cada
etapa hasta que se obtuvieron los fragmentos con las secuencias
esperadas y exclusivas de la endonucleasa de restricción terminal.
Estos cuatro productos se clonaron y secuenciaron, y se ligaron para
generar el gen completo del VIHA. El gen del VIHA se insertó a
continuación en el montaje pTHr y el vector de vacuna MVA, como se
describe a continuación.
Vector pTHr. Un vector pTHr para una
transferencia génica directa se diseñó con el objetivo de minimizar
el número de elementos funcionales y por consiguiente la calidad
del ADN requerido que debe administrarse.
La construcción del pTH se describió
anteriormente (Hanke et al. 1998 Vaccine 16,
426-435). Éste contiene un casete A de
potenciador/activador/intrón con expresión eficaz del genoma de la
cepa Ad 169 del citomegalovirus humano (CMVh) (Whittle et
al. 1987 Protein Eng. 1, 499-505;
Bebbington 1991 Methods 2, 136-145). La zona
del activador está seguida por el polienlazador procedente de
pRc/CMV (Invitrogen) y la señal de poliadenilación del gen de la
hormona de crecimiento bovina. Tanto el gen de
\beta-lactamasa que proporciona resistencia a la
ampicilina a las bacterias transformadas como el origen procariótico
de la replicación CoIE1 del ADN bicatenario proceden del plásmido
pUC19. El pTH no contiene un origen para la replicación en células
de mamífero. Tras la inserción del ADN del VIHA en el polienlazador
pTH, se eliminó el fragmento del gen de
\beta-lactamasa entre las secuencias MluI
y DraI y el montaje pTHr.VIHA resultante (Fig. 3) se propagó
en las bacterias que utilizan el sistema de valoración del represor
desarrollado por Cobra Pharmaceuticals Ltd. (Keele, UK), que
selecciona las bacterias que transportan el plásmido sin necesidad
de la presencia de un gen con resistencia a antibióticos en el
plásmido (Williams et al. 1998 Nucl. Acids Res. 26.
2120-2124). Por consiguiente, la vacunación con ADN
no introduce en la vacuna humana muchas copias de un gen con
resistencia a antibióticos. La construcción de pTHr.VIHA se ilustra
esquemáticamente en la figura 3 (CMV e/p/i = casete del
potenciador/activador/intrón A del CMV humano; BGHpA = señal de
poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino; CoIE1 = origen
de replicación del ADNds en bacterias; los símbolos de la cabeza de
flecha indican secuencias de unión al represor). Las células 293T,
y los fibroblastos de embrión de pollo [CEF] se mantuvieron en medio
de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Gibco) enriquecido con
suero bovino fetal al 10% (FBS; Gibco); L-glutamina
2 mM y penicilina/estreptomicina. Se cultivaron las células en una
incubadora humidificada en 5% de CO_{2} a 37ºC. Las células 293T
se transfectaron temporalmente con pTHr.VIHA utilizando el
procedimiento con
DEAE-dextrano-cloroquina (Hanke
et al. 1998 Vaccine 16, 426-435). En
resumen, se cultivaron 2,5 x 10^{5} células 293T sobre
cubreobjetos en placas de cultivo tisular de 6 pocillos durante la
noche. Al día siguiente, se transfectaron las células con 5 g de
ADN por pocillo. Después de 48 horas, se fijaron las células
transfectadas, se permeabilizaron sus membranas y se utilizaron mAb
de SV5-P-k seguido de anticuerpos
conjugados por FITC anti-murino para detectar las
proteínas recombinantes expresadas.
En la figura 4, se muestra una microfotografía
que ilustra los resultados de la muestra. La figura muestra tres
células transfectadas y una célula no transfectada de referencia
(parte superior izquierda).
El refuerzo se consiguió administrando un vector
MVA que expresa el inmunógeno VIHA. MVA es un virus de vacuna
atenuado seguro para aplicación clínica, que ha perdido casi su
capacidad para replicarse en células humanas (Mayr et al.
1975 Infection 105, 6-14). La utilización de
MVA como vehículo de la vacuna y sus propiedades que le hacen una
elección atractiva entre los vectores de virus de la viruela
atenuados (Véase, por ejemplo Sutter et al. 1994
Vaccine 12, 1032-1040; y Moss et al.
1996 Adv. Exp. Med. Biol. 397, 7-13) se han
descrito extensamente.
El gen del VIHA se ligó en el plásmido pSC11,
que se dirigió al gen en el locus de timidina cinasa del MVA
precursor (Carroll y Moss 1995 Biotechniques 19,
352-356). Se cultivaron soluciones madre de relleno
del MVA recombinante en CEF primario obtenido de los huevos de una
paloma específica exenta de patógenos. Se purificó MVA por
centrifugado de los extractos citoplásmicos a través de un relleno
de sacarosa al 36% (p/v) en un agitador SW28 de Beckman a 13.500
rpm durante 80 minutos. Aprovechando el gen de
\beta-galactosidasa insertado conjuntamente, se
determinaron los títulos de la solución madre del virus procedentes
de numerosas placas azules después de la incubación de las
monocapas de células infectadas con el sustrato apropiado.
Ensayo de potencia de la vacuna. Se
determinaron las potencias de los vectores de ADN y MVA en grupos de
ratones Balb/c aprovechando la presencia del epítopo restringido
por H-2D^{d} (Takahashi et al. 1993 Int.
Immunol. 5, 849-857). Para la vacuna con ADN
pTHr.VIHA, se inyectó 100 \mug de ADN con aguja por vía
intramuscular a ratones o se inmunizó dos veces tres semanas aparte
por vía intradérmica con un total de 2 \mug de ADN utilizando el
dispositivo de administración génica Dermal XR de PowderJect
Vaccines Inc. (Madison, WI, US). Se sacrificaron los ratones 10 ó
21 días después de la última inmunización. Se extirparon los bazos
de los ratones inmunizados y se presionaron individualmente a
través de un filtro de células (Falcon) utilizando un émbolo de
goma de jeringuilla de 2 ml. Se lavaron los esplenocitos y se
dividieron en dos mitades. Una mitad se congeló para el análisis
del tetrámero y la segunda mitad se puso en suspensión en
5 ml de medio de linfocitos (R10, HEPES 20 mM y
\beta-mercaptoetanol 15 mM) y se volvieron a
estimular in vitro por incubación con 2 \mug/ml del
péptido RGPGRAFVTI (SEC. ID. nº 2) en una incubadora humidificada en
5% de CO_{2} a 37ºC durante 5 días.
Las células efectoras se diluyeron 2 veces en
pocillos con fondo en U (placa de 96 pocillos; Costar) partiendo
con la relación efector a diana 100:1. Cinco mil células diana P815
marcadas con ^{51}Cr en un medio sin o enriquecido con péptido
10^{-6} M se añadió a continuación a los efectores y se incubó a
37ºC durante 5 horas. Se estimaron las liberaciones espontanea y
total de cromo de los pocillos, en las que las células diana se
mantuvieron en un medio solo o con Triton X-100 al
5%, respectivamente. El porcentaje de lisis específica se calculó
como [(liberación de muestra - liberación espontanea)/(liberación
total - liberación espontanea)] x 100. La liberación espontanea fue
inferior al 5% de la c.p.m. total.
Los resultados de los análisis típicos se
presentan en las figuras 5A-C, que son gráficos del
% de lisis específica frente a la relación Effector:Diana. La
figura 5A presenta los resultados de los esplenocitos obtenidos de
ratones inmunizados una vez con 100 \mug de ADN pTHr.VIHA. La
figura 5B presenta los resultados de los ratones inmunizados dos
veces por vía intradérmica con ADN pTHr.VIHA. La figura 5C presenta
los resultados obtenidos en ratones inmunizados por vía
intramuscular con 10^{7} pfu de MVA.VIHA. En cada una de las
figuras 5A-5C, cada línea representa un solo ratón.
La lisis de las dianas pulsadas con péptido está indicada por los
símbolos negros, las dianas no pulsadas por los símbolos
blancos.
Ambos modos de administración del vector
pTHr.VIHA eran muy inmunógenos y provocaban actividades muy
citolíticas en todos los animales inmunizados (véase las Fig. 5A y
B). Asimismo, una sola inyección intramuscular con aguja de
10^{7} unidades formadores de placa de MVA.VIHA produjo todas las
actividades líticas específicas para el péptido potentes de las
vacunas medidas después de una reestimulación del cultivo (Fig.
5C).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se prepararon más montajes de ácido nucleico que
codificaban inmunógenos de poliproteína basados en VIHA, pero que
comprendían más componentes del antígeno VIH. Estos montajes
adicionales y sus inmunógenos codificados se denominaron VIHTA y
VIHAeT, como se muestra en la figura 1A. También se muestra un
montaje/inmunógeno denominado PPA. En las figuras 6
A/B-8 A/B respectivamente se muestran, las
secuencias adecuadas de ADN/aminoácidos, aunque la figura 7A
presenta solamente la parte de secuencia de aminoácidos en VIHAeT
(atribuible a tat) que es adicional a ésta en VIHTA. (Obsérvese que
la secuencia de las secuencias HindIII y XbaI en los
extremos 5' y 3' de las secuencias de ADN no se muestran en las
figuras 6B, 7B y 8B). Se prepararon montajes de una manera similar
a la descrita anteriormente para VIHA.
VIHTA y VIHAeT comparten el mismo diseño lógico
con VIHA, pero además incluyen la secuencia tat del clado A del
VIH-1, expresada como parte de una proteína de
fusión con gag y el polipéptido poliepitópico sintético (en el caso
de VIHTA, estando colocada la secuencia tat entre gag y el
polipéptido sintético), o que está presente en el mismo montaje
pero se expresa como un el polipéptido separado (en el caso de
VIHAeT), en virtud de la inclusión de una secuencia interna de
introducción del ribosoma (IRES).
Cada una de las moléculas de ácido nucleico
puede utilizarse para inmunizar pacientes, de manera similar a la
descrita anteriormente en relación con el ADN de VIHA. Así mismo,
las moléculas pueden introducirse en los vectores apropiados,
especialmente MVA, de nuevo como se describió anteriormente en el
Ejemplo 1, y el vector resultante utilizado para inmunizar
pacientes.
El significado de la diversidad genética entre
cepas individuales de VIH y su implicación para el diseño de
vacunas ha sido muy debatido. El clado del VIH-1
predominante en Europa y América del Norte es el clado B, que es
también el más estudiado. En África central y oriental, la cepa de
VIH-1 circulante predominante es el clado A,
mientras que el clado C es dominante en Sudáfrica, India y China. En
general, un diseño de vacuna específico para el clado requiere una
consideración más cuidadosa para la producción de nAb que para CTL.
Aunque existen algunas importantes diferencias entre clados en los
epítopos de CTL, muchos epítopos se conservan a través de los
clados debido en parte a limitaciones de la estructura/función. Sin
embargo, para facilitar la interpretación de estudios de eficacia,
las vacunas deberían intentar igualar las cepas locales frecuentes
en la población de la prueba con vistas a que alguna estrategia con
éxito pueda ser adaptada por otros clados si no se consigue la
protección cruzada.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Medical Research Council
\hskip1cmInternational Aids Vaccine Initiative
\hskip1cmUniversity of Nairobi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Mejoras en las respuestas
inmunitarias al VIH o relacionadas con las mismas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJL/C1248'1/M
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
simia
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip0,8cm
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<210> 2
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 2
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\hskip0,8cm
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<210> 3
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 3
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\hskip0,8cm
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<210> 4
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 4
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\hskip0,8cm
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<210> 5
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 5
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\hskip0,8cm
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 6
\hskip0,8cm
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 7
\hskip0,8cm
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<210> 8
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 8
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 9
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 11
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 12
\hskip0,8cm
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 13
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 14
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\hskip0,8cm
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 15
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 16
\hskip0,8cm
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 17
\hskip0,8cm
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 18
\hskip0,8cm
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<210> 19
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 19
\hskip0,8cm
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<210> 20
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 22
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 24
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
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<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 527
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Polipéptido quimérico
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<400> 26
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
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<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1608
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Polinucleótido quimérico
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 633
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Polipéptido quimérico
\newpage
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<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\newpage
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<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1914
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Polinucleótido quimérico
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<400> 29
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\hskip0,8cm
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<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Polipéptido quimérico
\newpage
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<400> 30
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2493
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Polinucleótido quimérico
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<400> 31
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1445
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: polipéptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 32
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\hskip0,8cm
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<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4350
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Polinucleótido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 33
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Claims (38)
1. Inmunógeno en forma estéril apto para la
administración a un sujeto humano que comprende: (1) una parte del
55 al 95% de la secuencia de aminoácidos de la proteína gag de VIH,
procediendo dicha proteína gag de un clado de VIH o una parte del
55 al 95% de la secuencia de aminoácidos de una proteína gag
procedente de una secuencia de consenso para uno o más clados de
VIH; (2) polipéptidos de p17 y p24 en orden inverso en comparación
con la proteína gag vírica y que comprende por lo menos un epítopo
de clase I de MHC y por lo menos epítopo de clase II de MHC que
estimula las células colaboradoras CD4^{+}; y (3) un polipéptido
sintético que comprende por lo menos 10 epítopos de CTL humanos
CD8^{+} de una proteína del VIH enumerada en la Tabla 1, y estando
representada una diversidad de proteínas del VIH en el polipéptido
sintético, estando seleccionados dichos epítopos de CTL para
estimular una respuesta inmunitaria a uno o más clados de VIH de
interés.
2. Inmunógeno según la reivindicación 1, en el
que dicha proteína gag y el polipéptido sintético están presentes
como una proteína de fusión.
3. Inmunógeno según la reivindicación 1 ó la
reivindicación 2, en el que está presente del 65 al 85% de la
secuencia de aminoácidos de la proteína gag.
4. Inmunógeno según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos alguno de los
epítopos de CTL humanos presentes en el polipéptido sintético son
solapantes.
5. Inmunógeno según la reivindicación 4, en el
que por lo menos el 50% de epítopos de CTL humanos presentes en el
polipéptido sintético son solapantes.
6. Inmunógeno según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos alguno de los
epítopos de CTL humanos presentes en el polipéptido sintético son
adyacentes.
7. Inmunógeno según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos alguno de los
epítopos de CTL humanos están separados por la secuencia de
aminoácidos no epitópicos.
8. Inmunógeno según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende por lo menos un epítopo
que es reconocido por uno o más mamíferos del ensayo de
laboratorio.
9. Inmunógeno según la reivindicación 10, en el
que dicho epítopo reconocido por uno o más mamíferos del ensayo de
laboratorio es un epítopo de CTL.
10. Inmunógeno según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido sintético
comprende por lo menos 10 de los epítopos de CTL humanos
identificados en la Tabla 1.
11. Inmunógeno según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido sintético
comprende por lo menos 20 de los epítopos de CTL humanos
identificados en la Tabla 1.
12. Inmunógeno según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido sintético
comprende todos los 23 epítopos de CTL humanos identificados en la
Tabla 1.
13. Inmunógeno de VIH para un sujeto humano que
comprende: (1) una parte del 55 al 95% de la secuencia de
aminoácidos de la proteína gag, procediendo dicha proteína gag de
un clado de VIH o una parte del 55 al 95% de la secuencia de
aminoácidos de una proteína gag procedente de uno o más clados de
VIH de interés; (2) polipéptidos de p17 y p24 en orden inverso en
comparación con la proteína gag vírica y que comprende por lo menos
un epítopo de clase I de MHC y por lo menos un epítopo de clase II
de MHC que estimula las células colaboradoras CD4^{+}; y (3) un
polipéptido sintético que comprende por lo menos 10 epítopos de CTL
humanos CD8^{+} de una pluralidad de proteínas del VIH diferentes
enumeradas en la Tabla 1, presentando el epítopo de CTL entre 8 y 12
aminoácidos, y seleccionándose dichos epítopos de CTL para
estimular una respuesta inmunitaria al clado de interés.
14. Inmunógeno de VIH según la reivindicación
13, en el que dicho polipéptido sintético tiene por lo menos un
epítopo inmunógeno reconocido por un animal de laboratorio.
15. Inmunógeno según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende la secuencia de
aminoácidos representada en la SEC. ID. nº 26.
16. Inmunógeno según la reivindicación 15,
constituido por la secuencia de aminoácidos representada en la
figura SEC. ID. nº 26.
17. Inmunógeno según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho clado de interés se
selecciona de entre el grupo constituido por el clado A, B, C, D,
E, F, G y H del VIH.
18. Inmunógeno según la reivindicación 17, en el
que dicho clado de interés es el clado A del VIH.
19. Inmunógeno según la reivindicación 17, en el
que dicho clado de interés es el clado B del VIH.
20. Inmunógeno según la reivindicación 17, en el
que dicho clado de interés es el clado C del VIH.
21. Inmunógeno según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dichos epítopos de CTL
humanos incluyen por lo menos un epítopo de entre cada una de las
proteínas nef, p24, p17, pol, gp41y gp120 del VIH.
22. Inmunógeno según la reivindicación 21, en el
que dichos epítopos de CTL humanos incluyen por lo menos un epítopo
de entre cada una de las proteínas nef, p24, p17, pol, gp41, gp120,
tat y rev del VIH.
23. Inmunógeno según la reivindicación 21, en el
que dichos epítopos de CTL humanos incluyen por lo menos un epítopo
de entre cada una de las proteínas nef, p24, p17, pol, gp41, gp120,
tat, rev, vpr, vpu y vif del VIH.
24. Molécula de ácido nucleico que codifica un
inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
25. Ácido nucleico según la reivindicación 24,
en el que el inmunógeno es codificado como proteína de fusión.
26. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 24 ó 25, que comprende la secuencia nucleotídica
representada en la SEC. ID. nº 27.
27. Vector que comprende una molécula de ácido
nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 24, 25 ó 26.
28. Vector en partículas según la reivindicación
27, que comprende además un inmunógeno según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23.
29. Utilización de un inmunógeno según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 y/o una molécula de ácido
nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en la
preparación de un medicamento destinado a prevenir o a tratar la
infección por VIH en un sujeto humano.
30. Bacteria que comprende un inmunógeno según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, o que comprende una
molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones
24 a 26.
31. Bacteria según la reivindicación 30 que es
un patógeno atenuado apto para su administración a un sujeto
humano.
32. Molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada
en la SEC. ID. nº 32.
33. Molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos
representada en la SEC. ID. nº 32.
34. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 32 ó 33, que comprende la secuencia de aminoácidos
representada en la SEC. ID. nº 33.
35. Polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos representada en la SEC. ID. nº 32.
36. Polipéptido constituido por la secuencia de
aminoácidos representada en la SEC. ID. nº 32.
37. Vector en partículas que comprende la
secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 32 ó 33 y/o el
polipéptido según la reivindicación 35 ó 36.
38. Utilización de una molécula de ácido
nucleico según la reivindicación 32 ó 33 y/o de un polipéptido según
la reivindicación 35 ó 36, en la preparación de un medicamento
destinado a prevenir o a tratar la infección por VIH en un sujeto
humano.
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