ES2748864T3

ES2748864T3 - Proteínas ENV lentivíricas mutadas y su uso como fármacos

Info

Publication number: ES2748864T3
Application number: ES12806388T
Authority: ES
Inventors: Thierry Heidmann
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR); Universite Paris Sud Paris 11; Viroxis SAS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR); Universite Paris Sud Paris 11; Viroxis SAS
Priority date: 2011-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2020-03-18
Anticipated expiration: 2032-12-07
Also published as: EP2788372B1; DK2788372T3; KR102059918B1; RU2654673C2; KR20140116091A; BR112014013704A2; IL232926A0; US20140294880A1; BR112014013704B1; US9682137B2; WO2013083799A1; MX350689B; CN104169295B; IL232926B; AU2012350258A8; RU2014127521A; AU2012350258B2; IN2014CN04927A; ZA201403617B; CA2856180C

Abstract

Composición farmacéutica que comprende como sustancia activa: a) una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, resultando dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de la subunidad transmembrana (TM) de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre, teniendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada al menos un 90 % de identidad con una secuencia elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 420 y SEQ ID NO: 421, comprendiendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos: A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416), en la que, X representa cualquier aminoácido, y Xa es A, F, G, L o R, y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es A, F, G o R, o Xa es A, F, G, L o R, y Xb es A, F, G o R, dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada retiene la estructura antigénica de la proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre o b) al menos un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos, comprendiendo dicho fragmento un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos: A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416), en la que, X representa cualquier aminoácido, y Xa es A, F, G, L o R, y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es A, F, G o R, o Xa es A, F, G, L o R, y Xb es A, F, G o R, dicho fragmento retiene la estructura antigénica de la proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada de longitud completa de la que procede en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, pudiendo evaluarse dicha ausencia sustancial de actividad inmunosupresora de la proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada mencionada anteriormente o del fragmento definido anteriormente por el hecho de que en un ensayo in vivo, que implica el rechazo de células tumorales injertadas, dichas células tumorales se transducen para expresar dicha proteína ENV mutada o dicho fragmento (células tumorales ENV mutadas), o dichas células tumorales se transducen para expresar dicha proteína ENV de tipo silvestre o un fragmento de la misma (células tumorales ENV de tipo silvestre), o dichas células tumorales no se transducen (células tumorales normales), siguiendo la relación: índice de inmunosupresión de dicha proteína ENV mutada o de dicho fragmento (ienv mutada)/índice de inmunosupresión de la proteína ENV de tipo silvestre (ienv de tipo silvestre) inferior a 0,5, siendo ienv mutada definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV mutadas - área máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las células tumorales normales), y siendo ienv de tipo silvestre definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV de tipo silvestre - área máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las células tumorales normales).

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas ENV lentivíricas mutadas y su uso como fármacos

La presente invención se refiere a proteínas ENV lentivíricas mutadas y su uso como fármacos.

Lentivirus es un género de virus lentos de la familia Retroviridae, caracterizado por un largo período de incubación. Los lentivirus pueden administrar una cantidad significativa de información genética en el ADN de la célula hospedadora y tienen la capacidad única entre los retrovirus de ser capaces de replicarse en las células que no se dividen, por lo que son uno de los procedimientos más eficaces de un vector de administración de genes. El VIH, VIS y VIF son ejemplos de lentivirus.

Según la OMS, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es una de las crisis de salud más graves que enfrenta el mundo en la actualidad. El SIDA ha matado a más de 25 millones de personas desde 1981. En los países más gravemente afectados, la esperanza de vida promedio ahora está disminuyendo a 49 años, 13 años menos que en ausencia de SIDA. Según ONUSIDA, un número estimado de 39,5 millones de personas vivían con el virus del VIH en 2006 y 4,3 millones estaban infectadas en 2006. En muchas regiones, las nuevas infecciones se concentran fuertemente en las generaciones más jóvenes (15-24 años de edad). El acceso al tratamiento y la atención ha aumentado considerablemente en los últimos años. La determinación de las tendencias en tiempo real a la incidencia del VIH y, en particular, el impacto de los programas de prevención idealmente requiere largos estudios de un gran número de personas. Dadas las dificultades prácticas para llevar a cabo dichos estudios, se ha puesto el foco en las mujeres jóvenes y sus bebés. Los niños que viven con el VIH generalmente adquieren la infección a través de una transmisión materno infantil (TMI), que ocurre durante el embarazo, el parto o durante la lactancia. Se requieren esfuerzos renovados con urgencia para aumentar el acceso a programas integrales e integrados para prevenir la infección por VIH en bebés y niños pequeños, lo que indicará una ruta hacia generaciones libres de VIH.

Hay dos tipos conocidos de VIH; VIH-1 y VIH-2 que infectan a los seres humanos. Pertenecen a un grupo de retrovirus llamados Lentivirus y se ha encontrado un virus similar al VIH en monos africanos. Los retrovirus transfieren sus genes de una célula productora a una célula diana como un transcrito de ARN genómico, que se transcribe de manera inversa después de la infección y se integra en el genoma de ADN de la célula diana.

La primera persona con una infección por VIH documentada murió en 1959. A principios de la década de 1980, los médicos en los EE.UU. se dieron cuenta de que cada vez más pacientes sufrían infecciones anormales y mostraban signos de insuficiencia inmunitaria. El síndrome se denominó Síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y poco después se descubrió que el VIH era el agente causante de la destrucción observada del sistema inmunitario. Inicialmente, a los pacientes se les ofreció un tratamiento basado únicamente en el alivio del dolor y casi todos murieron inevitablemente. A mediados de la década de 1990 hubo dos avances importantes en el tratamiento. En primer lugar, se descubrió un nuevo grupo de agentes antirretrovíricos y, en segundo lugar, fue posible medir la cantidad de virus del VIH en la sangre. Estos dos avances permitieron tratar a los pacientes con una combinación de diferentes agentes y los médicos pudieron verificar si el tratamiento realmente funcionaba. El resultado fue que el sistema inmunitario de los pacientes infectados gradualmente se normalizó y los pacientes vivieron más tiempo. Hoy en día, las personas infectadas en los países occidentales tienen el mismo nivel de calidad de vida que las personas no infectadas y pueden tener hijos, aunque las consecuencias económicas y psicológicas de tener el VIH son enormes. La situación es, sin embargo, aún más grave en los países en desarrollo, en los que viven más del 95 % de las personas infectadas con el VIH/SIDA. En todo el mundo, más de 25 millones de personas han muerto de SIDA en los últimos 25 años.

Aproximadamente el 95 % de las personas que se infectan hoy en día viven en los países en desarrollo, en los que los fármacos antivíricos caros no están disponibles. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de una vacuna eficaz, la única solución eficaz para la pandemia no controlada del VIH. Durante los últimos años, la investigación ha aportado nuevos conocimientos sobre la biología fundamental del virus del VIH que está dando lugar a nuevos fármacos antivíricos y estrategias para el diseño de vacunas. A pesar de estos avances sustanciales, todavía no existe una vacuna eficaz. Solo las cepas del VIH atenuadas (es decir, vivas pero debilitadas) han sido capaces de proporcionar inmunidad en los estudios de primates a pesar de que nunca alcanzarán un perfil de seguridad requerido adecuado para la vacunación masiva.

El proceso de replicación para el VIH-1 tiene una tasa de error de aproximadamente uno por cada 10.000 pares de bases. Dado que el genoma vírico completo está por debajo de los 10.000 pares de bases, se estima que, en promedio, se introduce un error en el genoma del VIH-1 en cada ciclo de replicación vírica.

Esta alta tasa de mutación contribuye a una amplia variabilidad de los virus dentro de cualquier persona y a una variabilidad aún más amplia entre las poblaciones.

Esta variabilidad ha dado como resultado que se describan tres variantes del VIH-1, y la subespecie del virus llamada "clados". Las distinciones se basan en la estructura de las proteínas de envoltura, que son especialmente variables. La variante M (para mayor) es, con mucho, la más prevalente en todo el mundo. Dentro de la variante M están los clados A, B, C, D, E, F, G, H, I, J y K, con los clados A a E que representan la gran mayoría de las infecciones a nivel mundial. Los clados A, C y D son dominantes en África, mientras que el clado B es el más frecuente en Europa, América del Norte y del Sur y el sudeste asiático. Los clados E y C son dominantes en Asia. Estos clados difieren hasta en un 35 %. Otra variante es el clado O, que se observa en aislamientos del VIH-1 en Camerún. La mayor variación en la estructura se observa en las proteínas de envoltura gp120 y gp41. Hay dos resultados importantes de la muy alta tasa de mutación del VIH-1 que tienen profundas consecuencias para la epidemia. En primer lugar, la alta tasa de mutación es uno de los mecanismos que permiten que el virus escape del control de las terapias farmacológicas. Estos nuevos virus representan cepas resistentes. La alta tasa de mutación también permite que el virus escape del sistema inmunitario del paciente mediante la alteración de las estructuras que son reconocidas por los componentes inmunitarios. Una consecuencia adicional de esta amplia variabilidad es que el virus también puede escapar del control de las vacunas y, por lo tanto, hace que sea difícil encontrar vacunas basadas en proteínas de envoltura que sean eficaces.

Además, el virus produce proteínas que tienen propiedades inmunosupresoras, lo que permite escapar del reconocimiento del sistema inmunitario del paciente. Por lo tanto, las células que expresan tales proteínas se vuelven "invisibles" para el sistema inmunitario.

En consecuencia, para una vacuna, existe una necesidad de proporcionar proteínas como antígenos que hayan perdido, o sustancialmente perdido, sus funciones inmunosupresoras, para generar una respuesta eficaz. Esto permitirá que las personas una vez infectadas por el virus permitan que el sistema inmunitario destruya las células infectadas y prevenga/cure la infección.

La técnica anterior ya ha tenido la intención de proporcionar dichas proteínas.

Por ejemplo, la solicitud internacional WO 2005/095.442(Inventores: Renard, Mangeney & Heidmann) desvelan mutaciones en los dominios inmunosupresores de retrovirus endógenos (ERV, de sus siglas en inglés) u oncorretrovirus, tales como las proteínas ENV HTLV o FeLV. El presente documento demuestra que las mutaciones en una posición específica eliminan las propiedades inmunosupresoras de las proteínas ENV de ERV u oncorretrovirus. Sin embargo, la solicitud internacional WO 2005/095.442 nunca menciona o sugiere que las mutaciones hechas en el dominio inmunosupresor de las proteínas ENV de ERV u oncorretrovirus puedan ser transponibles a proteínas ENV lentivíricas.

La solicitud internacional WO 2010/022.740 desvela una secuencia consenso extremadamente amplia de una región de la proteína ENV del VIH, que se describe a continuación:

X(1-22)-C(23)-X(24-28)-C(29)-(X30-50)

en la que los restos de aminoácidos de la secuencia consenso se seleccionan de los grupos de restos que consisten en:

X(45): D, E N, S, T, K, G L, A, Q, H, I, Y, B, R, V, P, M, F, W, Z, y C; y

X(46): E, D, Q Y, K, N T S, A, W H M, R, G, L,V , Z, F, B, y P; y

X(47): I, D, E, M, G, T, Q, S, W L, N, Y, K, V R F, A, P, y H, y

X(48): W, I, T, N, D, E, L, G, S, Y, R, V, K, H, A, Q, M, y F; y

X((49): D, N, E, G, W, Q, K, H, L, B, S, I, Y, T, A, R, M, Z, y V; y

X(50): N, D, T, K, S, H, L, G, E, W, I, Q, M, R, B, Y, P, y A;

Esta secuencia consenso contiene 50 aminoácidos, en los cuales los aminoácidos específicos en las posiciones 10, 19, 24, 34 y 40 se definen como que afectan las propiedades inmunogénicas de un polipéptido de envoltura del VIH-1, y las 45 posiciones restantes se definen aleatoriamente, incluyendo los aminoácidos más comunes de las proteínas ENV del VIH de tipo silvestre.

De hecho, la enseñanza del documento WO 2010/022.740 es una transposición de retrovirus endógenos (ERV) u oncorretrovirus a lentivirus según las enseñanzas del documento WO 2005/095.442 (Inventores: Renard, Mangeney y Heidmann), pero dicha transposición es inapropiada en el caso de lentivirus, como lo muestra el inventor de la presente invención. En términos breves, el Dr. Heidmann es un inventor en el documento WO 2005/095.442 y en la presente invención. De hecho, los efectos de las mutaciones descritas en el documento WO 2005/095.442 también fueron probados en lentivirus por el inventor de la presente invención, pero no se observó ningún efecto cuando las mutaciones identificadas en retrovirus endógenos u oncorretrovirus se transpusieron en proteína ENV de lentivirus.

Además, dado que cualquier aminoácido se puede asignar a las posiciones 10, 19, 24, 34 o 40 en la secuencia consenso, el documento WO 2010/022.740 enseña que dichas mutaciones pueden ser eficaces usando cualquier resto de aminoácido. Esta enseñanza está en contradicción con la presente invención, ya que muestra que las propiedades inmunosupresoras de la proteína ENV del VIH-1 solo se ven afectadas por mutaciones específicas que se definen no solo por su posición, sino también por la naturaleza de los restos de aminoácidos sustituidos.

Además, el documento WO 2010/022.740 desvela resultados experimentales para solo una mutación específica dentro del dominio inmunosupresor de la proteína ENV del VIH, tal como se define por la secuencia consenso de 50 aminoácidos. La mutación, una sustitución por R, como la única ejemplificada en la solicitud internacional WO 2010/022.740, ocurre en el aminoácido en la posición 19, que nuevamente es equivalente a la posición desvelada en la solicitud internacional WO 2005/095.442 si uno simplemente alinea las secuencias ENV (véase la Figura 3 en el documentos WO 2010/022.740, que es una

23, págs. 11709-11719) (Cabe destacar que no solo la posición del aminoácido, sino también la naturaleza de la sustitución (por arginina) es similar a la descrita en el documento WO 2005/095.442).

Más específicamente, cuando se alinean las secuencias ENV respectivamente de un retrovirus endógeno u oncorretrovirus y un lentivirus, de acuerdo con la Figura 3 de Benit y col.:

Retrovirus endógeno u oncorretrovirus:

parece que la posición 19 en lentivirus corresponde a la posición en WO 2005/095.442 en la que una sustitución específica en arginina, E ^ R para retrovirus endógeno u oncorretrovirus, da como resultado la pérdida de actividad inmunosupresora.

La solicitud internacional WO 2010/022.740 desvela que dicha proteína ENV del VIH mutada inhibe la proliferación de PBMC ex vivo, pero dicho resultado ex vivo no tiene valor predictivo in vivo.

Sin embargo, el documento WO 2010/022.740 nunca desvela o sugiere que los mutantes son eficaces in vivo, es decir, que el sistema inmunitario detecta mutantes que expresan células.

Además, como se desvela más adelante, dichas mutaciones no son eficaces in vivo. De hecho, los resultados desvelados a continuación en la sección de ejemplos relativos a la presente invención demuestran que dicha sustitución G19R no inhibe in vivo las propiedades inmunosupresoras de la proteína ENV.

Como consecuencia, el documento WO 2010/022.740 plantea el mismo problema técnico que la presente invención, pero no ofrece una solución técnica adecuada. Esta técnica anterior revela las dificultades para superar la identificación de las mutaciones eficaces que afectan las propiedades inmunosupresoras de las proteínas ENV lentivíricas.

Por lo tanto, permanece la provisión de proteínas ENV lentivíricas no inmunosupresoras eficaces in vivo.

Un objetivo de la invención es proporcionar nuevas proteínas ENV mutadas desprovistas de propiedades inmunosupresoras.

Otro objetivo de la invención es proporcionar una nueva composición farmacéutica eficaz para tratar una infección lentivírica.

Otro objetivo de la invención es proporcionar una vacuna eficaz.

La descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende como sustancia activa:

a) una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, resultando dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de la subunidad transmembrana (TM) de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre, teniendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada al menos un 70 % de identidad, preferentemente al menos un 80 % de identidad, a una secuencia elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 420 y SEQ ID NO: 421,

comprendiendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416), en la que,

X representa cualquier aminoácido, y

X^aes A, F, G, L, R o está eliminado, y X^bes C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o

X^aes C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y X^bes A, F, G, R o está eliminado, o X^aes A, F, G, L, R o está eliminado, y X^bes A, F, G, R o está eliminado,

o

b) al menos un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora,

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

comprendiendo dicho fragmento un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido, y

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable,

pudiendo evaluarse dicha ausencia sustancial de actividad inmunosupresora de la proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada mencionada anteriormente o del fragmento definido anteriormente por el hecho de que en un ensayo in vivo, que implica el rechazo de células tumorales injertadas,

dichas células tumorales se transducen para expresar dicha proteína ENV mutada o dicho fragmento ("células tumorales ENV mutadas"),

o dichas células tumorales se transducen para expresar dicha proteína ENV de tipo silvestre o un fragmento de la misma ("células tumorales ENV de tipo silvestre"),

o dichas células tumorales no se transducen ("células tumorales normales"),

siguiendo la relación:

índice de inmunosupresión de dicha proteína ENV mutada o de dicho fragmento (i^{env mutada})/índice de inmunosupresión de la proteína ENV de tipo silvestre (i^{env de tipo silvestre}) es inferior a 0,5, siendo i^{env mutada}definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV mutadas - área máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las células tumorales normales), y

siendo i^{env de tipo silvestre}definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV de tipo silvestre -área máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las células tumorales normales).

La invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende como sustancia activa:

a) una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, resultando dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de la subunidad transmembrana (TM) de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre, teniendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada al menos un 90 % de identidad con una secuencia elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 420 y SEQ ID NO: 421, comprendiendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos: A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q) (SEQ ID NO: 416), en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

X^aes A, F, G, L, R y X^bes C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o

X^aes C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y X ^bes A, F, G, R

o

X^aes A, F, G, L, R y X^bes A, F, G, R reteniendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada la estructura antigénica de la proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre

o

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido,

y

X^aes A, F, G, L, R y X^bes C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o

X^aes C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y X ^bes A, F, G, R o

X^aes A, F, G, L, R y X^bes A, F, G, R reteniendo dicho fragmento la estructura antigénica de la proteína ENV lentivírica humana o simia mutada aislada de longitud completa de la que procede

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable,

o dichas células tumorales no se transducen ("células tumorales normales"),

siguiendo la relación:

índice de inmunosupresión de dicha proteína ENV mutada o de dicho fragmento (i^{env mutada})/índice de inmunosupresión de la proteína ENV de tipo silvestre (i^{env de tipo silvestre}) es inferior a 0,5,

siendo i^{env mutada}definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV mutadas - área máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las células tumorales normales), y siendo i^{env de tipo silvestre}definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV de tipo silvestre -área máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las células tumorales normales).

La presente solicitud se basa en la observación inesperada realizada por los inventores de que algunos aminoácidos específicos del dominio inmunosupresor de una proteína ENV lentivírica pueden mutar, confiriéndole a dicha proteína ENV lentivírica esencialmente sin propiedades inmunosupresoras, o sin propiedades inmunosupresoras, mientras que retiene su antigenicidad, la estructura tridimensional del dominio inmunosupresor y su expresión en la membrana plasmática. Además, la proteína ENV lentivírica mutada de acuerdo con la invención no altera la infectividad de un virus que la expresa.

En la invención, las "proteínas ENV lentivíricas de simio o humanas mutadas" significa que las proteínas ENV proceden de la expresión de un gen env de un lentivirus de ser humano o de simio.

Los lentivirus de acuerdo con la invención abarcados por la invención son el VIH-1 y 2 y el virus de inmunodeficiencia de Simio (VIS).

Debido a la alta tasa de mutación de los virus VIH-1, VIH-2 y VIS, la "proteína ENV mutada", como se define en la invención, abarca dos significados.

De acuerdo con el primer significado, dicha "proteína ENV mutada" es el resultado no natural de la intervención de los seres humanos.

De acuerdo con el segundo significado, la proteína ENV mutada también abarca variantes de origen natural para las que hasta ahora las propiedades no inmunosupresoras permanecen desconocidas.

Este segundo significado tiene en cuenta la variabilidad natural de las variantes del VIH y VIS dentro de un mismo individuo infectado, en el que dicha "proteína ENV mutada" podría no ser inmunosupresora pero su propiedad es indetectable porque un paciente infectado por VIH siempre porta muchas variantes del VIH, la mayoría de los cuales son inmunosupresoras.

Las tres proteínas siguientes corresponden a secuencias de tipo silvestre de la proteína ENV del VIH-1, VIH-2 y VIS respectivamente. En la invención, se consideran secuencias de referencia de proteínas ENV de tipo silvestre.

(continuación)

La variante en la invención abarca las proteínas ENV de VIS, VIH-1 y VIH-2.

Las variantes de las proteínas ENV mutadas del VIH-1 de acuerdo con la invención tienen al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la proteína ENV del VIH-1, y comprenden las mutaciones como se describió anteriormente, y no albergan actividad inmunosupresora.

Las variantes de las proteínas ENV mutadas del VIH-2 de acuerdo con la invención tienen al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la proteína ENV del VIH-2, y comprenden las mutaciones como se describió anteriormente, y no albergan actividad inmunosupresora.

Las variantes de las proteínas ENV mutadas del VIS de acuerdo con la invención tienen al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la proteína ENV del VIS, y comprenden las mutaciones como se describió anteriormente, y no albergan actividad inmunosupresora.

Las tres proteínas siguientes (SEQ ID NO: 216, 420 y 421) corresponden a tres secuencias mutadas de la proteína ENV del VIH-1, VIH-2 y VIS respectivamente. En la invención, se consideran secuencias de referencia de las proteínas ENV mutadas.

Más específicamente, la SEQ ID NO: 216 corresponde a la SEQ ID NO: 417 en la que el resto de aminoácido Y en la posición 5 (X^a) de la secuencia A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q ha sido sustituido por R.

La SEQ ID NO: 420 corresponde a la SEQ ID NO: 418 en la que el resto de aminoácido Y en la posición 5 (X^a) de la secuencia A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q ha sido sustituido por R.

La SEQ ID NO: 421 corresponde a la SEQ ID NO: 419 en la que el resto de aminoácido Y en la posición 5 (X^a) de la secuencia A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q ha sido sustituido por R.

(continuación)

La invención también abarca las variantes de la "proteína ENV lentivírica de simio o humana mutada", que alberga las mutaciones mencionadas anteriormente y confiere una falta de propiedades inmunosupresoras a dicha variante. Las variantes de las proteínas ENV mutadas del VIH-1 de acuerdo con la invención tienen al menos un 90 % de identidad con la secuencia de referencia mutada de la proteína ENV del VIH-1 (SEQ ID NO: 216), y comprenden las mutaciones como se describió anteriormente, y no albergan actividad inmunosupresora.

Las variantes de las proteínas ENV mutadas del VIH-2 de acuerdo con la invención tienen al menos un 90 % de identidad con la secuencia de referencia mutada de la proteína ENV del VIH-2 (SEQ ID NO: 420), y comprenden las mutaciones como se describió anteriormente, y no albergan actividad inmunosupresora.

Las variantes de las proteínas ENV mutadas del VIS de acuerdo con la invención tienen al menos un 90 % de identidad con la secuencia de referencia mutada de la proteína ENV del VIS (SEQ ID NO: 421), y comprenden las mutaciones como se describió anteriormente, y no albergan actividad inmunosupresora.

El dominio inmunosupresor (ISU) del lentivirus de acuerdo con la invención se puede delimitar mediante la secuencia SEQ ID NO: 6, xGIVQQQxxLLxxxxxxQxxLxLxxWGxKxLQxRxxAfI/VlEfK/RIYLxDQxxLx (SEQ ID NO: 6) en la que x representa cualquier aminoácido.

La SEQ ID NO: 6 corresponde al dominio ISU no mutado.

En esta SEQ ID NO: 6, "x" (en minúsculas) debe considerarse independientemente de la "X" (en mayúsculas) utilizada ^{por primera vez en la SEQ ID NO: 416 de la presente invención. La SEQ ID NO:}6 ^{comprende la}sEq ^IDnO: ^1.Los dominios inmunosupresores más ventajosos de las proteínas ENV de tipo silvestre de acuerdo con la invención comprenden las siguientes secuencias:

la proteína ENV del VIH-1 comprende la secuencia de aminoácidos AVERYLKDQ (SEQ ID NO: 7),

^{la proteína ENV del VIH-2 comprende la secuencia de aminoácidos AIEKYLKDQ}(SeQ ^{ID NO:}8^{), y}la proteína ENV del VIS comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 u 8.

Cuando se aplican las mutaciones como se definió anteriormente, el dominio ISU pierde sus propiedades inmunosupresoras.

En dicha SEQ ID NO: 6, los aminoácidos subrayados son los aminoácidos esenciales.

En la invención, el dominio ISU, como se define en la SEQ ID NO: 6, es el dominio esencial mínimo de la proteína ENV de acuerdo con la invención que alberga una actividad inmunosupresora.

La localización de un dominio ISU se puede determinar en todas las proteínas ENV de virus como se describe en Benit y col. 2001, Journal of Virology, Vol. 75, N.° 23, págs.11709-11719. En un sentido amplio, el dominio ISU se define por su estructura y su localización, independientemente del hecho de que posea o no una actividad inmunosupresora. En la invención, el dominio ISU se refiere a un dominio específico en el que una mutación puede afectar la propiedad inmunosupresora de la proteína ENV.

La propiedad inmunosupresora de la proteína ENV se mide preferentemente usando procedimientos in vivo, que son representativos del entorno fisiológico.

Las propiedades inmunosupresoras de las proteínas ENV mutadas de acuerdo con la invención se miden de acuerdo con un procedimiento in vivo para analizar la actividad inmunosupresora de una proteína ENV desvelada previamente [Mangeney y Heidmann Proc Natl Acad Sci USA 1998;95: 14920-14925; Mangeney y col. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(51):20534-9].

Como prueba fisiológica, este procedimiento in vivo se realiza utilizando proteínas ENV, o fragmentos de las mismas, que no están asociadas a otro componente o proteínas transportadoras, tales como BSA.

En resumen, un ácido nucleico de tipo silvestre (proteína ENV lentivírica de tipo silvestre) o modificado que expresa la proteína a analizar (proteína ENV lentivírica mutada) se transfecta en líneas celulares tumorales tales como líneas celulares MCA 205 o C18.1 mediante procedimientos de transfección conocidos. Las células tumorales que expresan la proteína a analizar se inyectan luego, especialmente mediante inyección subcutánea (s.c.), a un hospedador, generalmente ratones. Después de dicha inyección, se determina el establecimiento del tumor o, por el contrario, su rechazo, y se mide el área del tumor. El establecimiento del tumor se determinó por palpación y el área del tumor (mm2) se determinó mediante la medición de los diámetros perpendiculares del tumor. El índice de inmunosupresión se define como i = (Senv-Sninguna)/Sninguna, en el que Senv es el área máxima alcanzada por un tumor que expresa una proteína de envoltura y Sninguna es el área máxima alcanzada por un tumor que no expresa la proteína ENV (control negativo).

De acuerdo con una realización de la invención, la relación definida anteriormente en relación con el índice de inmunosupresión puede ser inferior a 0,2 e incluso puede tener un valor negativo (véanse las Figuras 2 y 3).

El ensayo in vitro podría llevarse a cabo, utilizando altas dosis de péptidos sintéticos, pero son indirectos y menos convincentes, ya que la expresión "inmunosupresor" es relevante cuando se aplica a animales que poseen un sistema inmunitario completo y no a las líneas celulares.

Una dificultad adicional para la caracterización funcional de un dominio ISU se basa en el hecho de que el ISU transportado por las proteínas ENV retrovíricas es un dominio proteico altamente estructurado, con formación de trímero dentro de las proteínas ENV completas (Caffrey M., Biochimica et Biophysica Acta, 1536:116-122, 2001; Caffrey y col., The EMBO Journal, Vol. 17, N.° 16, págs.4572-4584, 1998). Dichas estructuras no se forman de manera natural con péptidos ISU de longitud limitada, y esta es probablemente la razón por la cual la mayoría de los estudios realizados con péptidos proporcionan resultados irrelevantes y/o dependen del acoplamiento específico de los péptidos a proteínas transportadoras (tales como BSA, por ejemplo, Denner y col., Current Science, AIDS 1994, 8:1063-1072).

Como se ha mencionado anteriormente, las proteínas ENV de acuerdo con la invención están mutadas. Esta mutación se hace in vitro. Por lo tanto, las proteínas ENV mutadas de acuerdo con la invención se aíslan y no corresponden a su equivalente de origen natural. Como se ha mencionado anteriormente, las proteínas ENV lentivíricas mutadas están sustancialmente desprovistas de propiedades inmunosupresoras. Esto significa que las proteínas ENV mutadas de acuerdo con la invención no tienen o tienen propiedades inmunosupresoras reducidas con respecto a la proteína ENV natural no mutada de un virus de la misma especie. Por ejemplo, una proteína ENV del VIH mutada de acuerdo con la invención tiene propiedades inmunosupresoras reducidas con respecto a la proteína ENV del VIH de tipo silvestre. En la invención, la expresión "sustancialmente desprovistos de propiedades inmunosupresoras" significa que las proteínas ENV mutadas de acuerdo con la invención tienen un índice de inmunosupresión inferior a aproximadamente 0,2 [Mangeney y Heidmann Proc Natl Acad Sci USA 1998;95: 14920-14925; Mangeney y col. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(51):20534-9].

En la invención, las estructuras responsables de la antigenicidad de la proteína ENV lentivírica mutada se conservan esencialmente. Como se pretende en el presente documento, la expresión "estructuras responsables de la antigenicidad" se refiere a estructuras de la proteína que pueden interactuar con componentes del sistema inmunitario tales como anticuerpos o receptores de membrana de células inmunitarias, en particular linfocitos T.

La(s) mutación(es) dentro del dominio inmunosupresor de las proteínas ENV lentivíricas es(son) suficientes para disminuir la actividad inmunosupresora de la proteína ENV lentivírica mutada con respecto al correspondiente ENV de tipo silvestre. Sin embargo, podría ser ventajoso que también se mute otro aminoácido porque asegura que la estructura de la proteína ENV mutada se conserve esencialmente con respecto a la proteína ENV de tipo silvestre correspondiente.

La proteína ENV lentivírica mutada ha retenido sustancialmente la estructura, especialmente la estructura antigénica, por ejemplo, determinantes inmunogénicos, de la proteína ENV lentivírica determinada original, es decir, la proteína ENV lentivírica no mutada de tipo silvestre.

Estas propiedades se pueden evaluar mediante la medición de las propiedades de fusión y/o infecciosas de dicha ENV lentivírica mutada con respecto a las mismas propiedades en la proteína ENV lentivírica no mutada de tipo silvestre (véase el ejemplo).

En términos generales, la proteína ENV mutada implicada en la presente invención tiene una longitud promedio de aproximadamente 700 a aproximadamente 950 aminoácidos.

La invención abarca fragmentos de la proteína ENV mutada como se definió anteriormente, siempre que dicho fragmento:

- comprenda al menos la secuencia SEQ ID NO: 2, como se ha definido anteriormente,

- comprenda al menos 40 aminoácidos, preferentemente comprenda al menos 50 aminoácidos,

- esté sustancialmente desprovisto de propiedades inmunosupresoras, como se ha definido anteriormente, - preferentemente, comprenda las partes extracelulares de la proteína ENV,

- conserve la estructura de la proteína ENV de la que procede,

- albergue los mismos epítopos que el fragmento correspondiente en la proteína ENV de tipo silvestre.

De acuerdo con una realización particular, el fragmento de la proteína ENV mutada de la invención puede comprender aproximadamente 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 o 700 aminoácidos. Estos valores se dan solo de manera ilustrativa, ya que el experto en la materia comprenderá que el fragmento puede comprender cualquier número de aminoácidos comprendidos entre 40 y 700.

Ventajosamente, los fragmentos, de acuerdo con la invención, son tales que, si bien conservan la estructura antigénica de la proteína ENV mutada de longitud completa y, por lo tanto, de la proteína ENV de tipo silvestre, han perdido regiones antigénicas principales que son responsables de la antigenicidad en otra región que no sea la región correspondiente al dominio inmunosupresor.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica en la que la sustancia activa es una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada de origen no natural aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, como se definió anteriormente, o fragmentos de la misma.

En una realización particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente que comprende como sustancia activa:

a) una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, resultando dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de la subunidad transmembrana (TM) de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre, comprendiendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido, y

X^aes A, F, G, L o R, y X^bes C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o X^aes C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y X^bes A, F, G o R, o X^aes A, F, G, L o R, y X ^bes A, F, G o R,

o

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido, y

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente que comprende como sustancia activa:

a) una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, resultando dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de la subunidad transmembrana (TM) de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre,

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

X^aes A, F, G, L o R, y X^bes L, I, V, M o P, o

X^aes Y, I, H, C o T, y X^bes A, F, G o R, o

X^aes A, F, G, L o R, y X^bes A, F, G o R,

o

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

X^aes A, F, G, L o R, y X^bes L, I, V, M o P, o

X^aes Y, I, H, C o T, y X^bes A, F, G o R, o

X^aes A, F, G, L o R, y X^bes A, F, G o R,

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con una realización particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente que comprende como sustancia activa:

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

X^aes A, G, o R, y X^bes C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o X^aes C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y X^bes F, G o R,

o

X^aes F o L, y X^bes F, G o R,

o

X^aes A, G o R, y X^bes A,

o

X^aes A, G, o R, y X^bes F, G o R,

o

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido, y

X^aes A, G, o R, y X^bes C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y,

o

X^aes C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y X ^bes F, G o R,

o

X^aes F o L, y X^bes F, G o R,

o

X^aes A, G o R, y X^bes A,

o

X^aes A, G, o R, y X^bes F, G, R,

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

X^aes A, G, o R, y X^bes L, I, V, M o P,

o

X^aes Y, I, H, C o T, y X^bes F, G o R,

o

X^aes F o L, y X^bes F, G o R,

o

X^aes A, G o R, y X^bes A,

o

X^aes A, G, o R, y X^bes F, G o R,

o

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

X^aes A, G, o R, y X^bes L, I, V, M o P,

o

X^aes Y, I, H, C o T, y X^bes F, G o R,

o

X^aes F o L, y X^bes F, G o R,

o

X^aes A, G o R, y X^bes A,

o

X^aes A, G, o R, y X^bes F, G o R,

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otra realización particular, la invención también se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente que comprende como sustancia activa:

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido,

y

X^aes A, G, o R, y X^bes C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y,

o

X^aes C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y X ^bes F, G o R,

o

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido,

y

X^aes A, G, o R, y X^bes C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y,

o

X^aes C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y X ^bes F, G o R,

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otra realización particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, que comprende como sustancia activa:

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido,

y

X^aes A, G, o R, y X^bes L, I, V, M o P,

o

X^aes Y, I, H, C o T, y X^bes F, G o R,

o

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-X^a-X^b-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido,

y

X^aes A, G, o R, y X^bes L, I, V, M o P,

o

X^aes Y, I, H, C o T, y X^bes F, G o R,

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otra realización particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente,

en la que

X^aes R, y X^bes C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o

X^aes C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y X ^bes R, o

X^aes R, y X^bes R.

De acuerdo con otra realización particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada o dicho fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos:

A-I-E-K-X^a-X^b-X-DQ (SEQ ID NO: 422),

A-I-E-R-X^a-X^b-X-DQ (SEQ ID NO: 423),

A-V-E-K-X^a-X^b-X-DQ (SEQ ID NO: 424),

A-V-E-R-X^a-X^b-X-DQ (SEQ ID NO: 425).

En una realización ventajosa, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que el dominio inmunosupresor resultante, contenido en la proteína lentivírica mutada, comprende la secuencia de aminoácidos de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 37.

En la invención, "SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 37" abarcan SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID

NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37.

La correspondencia es la siguiente:

En una realización ventajosa, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que el dominio inmunosupresor resultante, contenido en la proteína lentivírica mutada, comprende la secuencia de aminoácidos de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 66.

En la invención, "SEQ ID NO: 38 a SEQ ID NO: 66" abarcan SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ

ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48,

NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66.

La correspondencia es la siguiente:

En una realización ventajosa, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que el dominio inmunosupresor resultante, contenido en la proteína lentivírica mutada, comprende la secuencia de aminoácidos de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 67 a SEQ ID NO: 95.

En la invención, "SEQ ID NO: 67 a SEQ ID NO: 95" abarcan SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ

ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 95.

La correspondencia es la siguiente:

Como se ha mencionado anteriormente, las proteínas ENV anteriores que tienen su ISU que comprende la secuencia anterior están desprovistas de propiedades inmunosupresoras.

Por lo tanto, en otras palabras, cualquier proteína ENV de lentivirus humano o de simio que tenga en su ISU una secuencia de aminoácidos que comprenda las secuencias SEQ ID NO: 9 a 95, está desprovista de propiedades inmunosupresoras.

En otras palabras, una proteína ENV lentivírica de simio o humana que comprende, dentro de su dominio ISU, una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 9 a 95 está desprovista de propiedades inmunosupresoras.

En particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada o dicho fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada comprende una de las secuencias de aminoácidos:

SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 71,

SEQ ID NO: 9 a 12,

SEQ ID NO: 14 a 41,

SEQ ID NO: 43 a 70, y

SEQ ID NO: 72 a 95.

SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 71,

SEQ ID NO: 9, 11, 15 a 21, 23 a 29, 31 a 38, 40, 44 a 50, 52 a 58, 60 a 67, 69, 73 a 79, 81 a 87, 89 a 95.

En la invención, los fragmentos de las proteínas ENV mutadas de acuerdo con la invención comprenden o consisten en las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 67 a 211.

Estos fragmentos también están desprovistos de propiedades inmunosupresoras.

Sin embargo, estos fragmentos retienen la estructura y la antigenicidad del dominio inmunosupresor correspondiente que no está mutado, es decir, el dominio inmunosupresor de tipo silvestre.

En la invención, los fragmentos de las proteínas ENV mutadas de acuerdo con la invención comprenden o consisten en las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 96 a 211.

Las correspondencias son las siguientes

(continuación)

(continuación)

(continuación)

continuación

continuación

continuación

La composición farmacéutica de acuerdo con la divulgación puede comprender una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada o dicho fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que comprende una de las secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 96, 98, 100, 102 a 108, 110 a 116, 118 a 125, 127, 129, 131 a 137, 139 a 145, 147 a 154, 156, 158, 160 a 166, 168 a 174, 176 a 183, 185, 187, 189 a 195, 197 a 203, 205 a 211.

Ventajosamente, la invención se refiere a la composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicha proteína mutada consiste en una de las siguientes secuencias SEQ ID NO: 212 a 269

VIH-1 LAI

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

(continuación)

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

(continuación)

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

La divulgación también abarca las variantes de las secuencias anteriores, que albergan las mutaciones mencionadas anteriormente y que confieren a dicha variante una falta de propiedades inmunosupresoras.

En particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada consiste en una de las secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 212, 214, 216, 218 a 224, 226 a 232, 234 a 241,243, 245, 247 a 253, 255 a 261, 263 a 269.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicha proteína mutada comprende mutaciones adicionales ya sea cadena abajo del extremo C-terminal de la secuencia SEQ ID NO: 416 o cadena arriba del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 416. Estas mutaciones adicionales pueden ser ventajosas para mantener la estructura tridimensional del dominio inmunosupresor y de la proteína e Nv (véanse detalles sobre la expresión de la membrana de la proteína ENV [véase la Figura 4 y ejemplo] y sobre la infectividad [véase la Figura 5 y ejemplo]).

En una realización particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicha proteína mutada comprende una mutación adicional en uno de al menos los aminoácidos en las posiciones 29, 36 y 37 de la SEQ ID NO: 426: A[I/V]E[K/R]XaXbX1DQX2X3LX4X5WGC[A/S][F/G]X6X7CVX8TX9VPXcX1üZ1Z2Z3Z4Z5XdXe[S/T](SEQ ID NO: 426) en la que

Xa y Xb son como se han definido anteriormente,

Xi a Xio representan cualquier aminoácido,

Zi a Z5 no representan aminoácido o cualquier aminoácido, independientemente uno del otro de manera que o Xc es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, preferentemente A, D, o N,

o Xd es A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, W, preferentemente A, G, S o Y,

o Xe es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, Y, W, preferentemente A, D o N.

Esta secuencia contiene la siguiente secuencia de aminoácidos A[I/V]E[K/R]XaXbXiDQ (SEQ ID NO: 416) alargada en su extremo C-terminal en el que están presentes mutaciones adicionales.

Debe observarse que "Xi", en la secuencia mencionada anteriormente SEQ ID NO: 426, tiene el mismo significado que "X" en la SEQ ID NO: 4 i6.

En una realización ventajosa, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, comprendiendo dicha proteína mutada las secuencias de aminoácidos del grupo que consiste en SEQ ID NO: 27i a SEQ ID NO: 283.

SEQ ID NO: 27 i, contiene las mutaciones Y4iR, K72A:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG

KLICTTAVPWNASWSNASLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEK

NEQEL.

SEQ ID NO: 272, contiene las mutaciones Y4iR, K72G:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG

KLICTTAVPWNASWSNGSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEK

NEQEL.

SEQ ID NO: 273, contiene las mutaciones Y4iR, K72S:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG

KLICTTAVPWNASWSNSSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEK

NEQEL.

SEQ ID NO: 274, contiene las mutaciones Y4iR, W65D:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG

KLICTTAVPDNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEK

NEQEL.

SEQ ID NO: 275, contiene las mutaciones Y4iR, W65A:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG KLICTTAVPANASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEK NEQEL.

SEQ ID NO: 276, contiene las mutaciones Y41R, W65N:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG KLICTTAVPNNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEK NEQEL.

SEQ ID NO: 277, contiene las mutaciones Y41R, S73D:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG KLICTTAVPWNASWSNKDLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEK NEQEL.

SEQ ID NO: 278, contiene las mutaciones Y41R, S73A:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG KLICTTAVPWNASWSNKALEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEK NEQEL.

SEQ ID NO: 279, contiene las mutaciones Y41R, S73N:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG KLICTTAVPWNASWSNKNLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEK NEQEL.

SEQ ID NO: 280, contiene las mutaciones Y41R, K72Y:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG KLICTTAVPWNASWSNYSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEK NEQEL.

SEQ ID NO: 281, contiene las mutaciones R40A, Y41R, K72A:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVEARLKDQQLLGIWGCSG KLICTTAVPWNASWSNASLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEK NEQEL.

SEQ ID NO: 282, contiene las mutaciones Y41R, K72A, S73A:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG KLICTTAVPWNASWSNAALEOIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESONOOEK NEQEL.

SEQ ID NO: 283, contiene las mutaciones Y41R, W65A, K72A, S73A:

SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERRLKDQQLLGIWGCSG

KLICTTAVPANASWSNAALEOIWNNMTWMEWDREINNYTSL1HSLIEESONOOEK

NEQEL.

Las mutaciones en los péptidos mutados anteriores están indicadas por los restos de aminoácidos que están en negrita y subrayados.

También se desvela una composición farmacéutica como se definió anteriormente, que comprende una mutación adicional de uno de al menos los aminoácidos X11, X12, X13 y X14 en la siguiente secuencia (que contiene la secuencia SEQ ID NO: 416 definida anteriormente):

X11X12 X13X 14I LA[I/V]E[K/R]XaXbX1DQ (SEQ ID NO: 428),

en la que

X I representa cualquier aminoácido,

Xa y Xb son como se han definido anteriormente,

X II es:

- eliminado,

- o A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y o W, en particular A, G o R,

y/o

X12 es:

- eliminado,

- o A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, Y o W, en particular A, G o R,

y/o

X13 es:

- eliminado,

- o C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y o W, en particular R o G,

y/o

X14 es:

- eliminado,

- o A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, Y o W, en particular A o G.

Esta secuencia contiene la siguiente secuencia de aminoácidos A[I/V]E[K/R]XaXbX1DQ (SEQ ID NO: 416) alargada en su extremo N-terminal en el que están presentes mutaciones adicionales.

Debe observarse que "X1" en la SEQ ID NO: 428 tiene exactamente el mismo significado que "X" en la SEQ ID NO: 416.

En otra realización ventajosa, la invención se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicha proteína lentivírica mutada, dicha variante o dicho fragmento albergan una estructura tridimensional similar a la estructura de la proteína ENV lentivírica no mutada natural, variante ENV lentivírica no mutada o fragmento ENV lentivírico no mutado de la misma.

La persona experta sabe cómo medir la antigenicidad, mediante la utilización de procedimientos estándar.

La divulgación también proporciona una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicha proteína lentivírica mutada, dicha variante o dicho fragmento se expresan en la membrana plasmática a un nivel sustancialmente idéntico a la expresión en la membrana plasmática de la proteína ENV lentivírica natural no mutada, variante ENV lentivírica no mutada o fragmento ENV lentivírico no mutado de la misma.

La expresión de la membrana de la proteína ENV lentivírica puede medirse mediante cualquier técnica que permita la determinación de una proteína de membrana plasmática. Por ejemplo, las células se pueden transfectar con un vector de expresión que permite la expresión de la proteína ENV lentivírica mutada de acuerdo con la divulgación. Luego, las células se incuban con un anticuerpo que reconoce específicamente la parte extracelular de dicha proteína ENV mutada lentivírica. El complejo (anticuerpo/proteína ENV) es detectado por otro anticuerpo, y el complejo se puede cuantificar mediante citometría de flujo (véase, por ejemplo, la Figura 4 y ejemplo).

Si no se detecta ningún complejo, la proteína ENV mutada no se expresa en la membrana plasmática. Por el contrario, si la proteína se expresa, esto significa que la proteína ENV mutada se expresa en la membrana plasmática.

También se desvela una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicha proteína ENV lentivírica mutada es tal que un lentivirus, o un seudotipo, que expresa dicha proteína ENV lentivírica mutada, en lugar de la proteína ENV no mutada, tiene un título vírico similar al título vírico de dicho lentivirus, o seudotipo, que expresa la proteína lentivírica no mutada.

El título vírico se mide de acuerdo con un protocolo de uso común y como se describe en el ejemplo (véase la Figura 5).

Una composición farmacéutica como se definió anteriormente puede comprender una proteína ENV lentivírica mutada que es una proteína lentivírica del VIH-1 que consiste en las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 284 a SEQ ID NO: 292.

continuación

continuación

(continuación)

continuación

También, las siguientes proteínas son ventajosas en la invención

(continuación)

Ventajosamente: las proteínas lentivíricas mutadas son

1- SEQ ID NO: 284 a 294; estas proteínas ENV mutadas sustancialmente no tienen propiedades inmunosupresoras ventajosamente,

2- SEQ ID NO: 284 a SEQ ID NO: 292; estas proteínas ENV mutadas no tienen substancialmente propiedades inmunosupresoras y se expresan altamente en la membrana plasmática, más ventajosamente,

3- SEQ ID NO: 284 a SEQ ID NO: 291; estas proteínas ENV mutadas que sustancialmente no tienen propiedades inmunosupresoras, se expresan altamente en la membrana plasmática y confieren a un virus que les expresa un título vírico medio o alto,

en particular

4- Y41F (SEQ ID NO: 291), Y41L (SEQ ID NO: 289), Y41A (SEQ ID NO: 290); estas proteínas ENV mutadas que sustancialmente no tienen propiedades inmunosupresoras, se expresan altamente en la membrana plasmática y confieren a un virus que les expresa un título vírico alto.

Como se mencionó anteriormente, "conferir a un virus que les expresa un título vírico medio o alto" significa que, cuando la secuencia de la proteína ENV de tipo silvestre se sustituye por la secuencia de la ENV mutada en el retrovirus lentivírico o seudotipo, el virus expresa así una proteína ENV lentivírica mutada, junto con otras proteínas víricas de tipo silvestre (GAG, PRO, POL), confiriendo dicha proteína ENV mutada al virus la capacidad de ingresar en su célula diana:

- a un nivel comparable o superior a la capacidad de la virus de tipo silvestre, es decir, alta capacidad

- o en un nivel inferior en comparación con la capacidad del virus de tipo silvestre, es decir, capacidad media o baja.

La capacidad de entrar en la célula diana se puede medir por la carga vírica. La carga vírica es una medida de la cantidad de células diana que pueden infectarse por una cantidad dada (1 ml) de virus (véase la Figura 5 y ejemplo).

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ENV lentivírica mutada, o una variante de dicha proteína, o fragmentos de la misma, como se ha definido anteriormente, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El ácido nucleico puede estar comprendido en un vector, comprendiendo dicho vector medios que permiten la expresión de dicha proteína ENV lentivírica mutada, o una variante de dicha proteína, o fragmentos de la misma.

Si el ácido nucleico está comprendido en un vector, dicho ácido nucleico puede colocarse bajo el control de secuencias que permiten la expresión de dicha proteína ENV lentivírica mutada, o una variante de dicha proteína, o fragmentos de la misma.

Una composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, en particular como una vacuna, comprende una molécula de ADN que codifica dicha proteína ENV lentivírica mutada, o una variante de dicha proteína, o fragmentos de la misma.

Las vacunas de ADN que expresan proteínas ENV se pueden producir como se describe en Bellier y col., (DNA vaccines expressing retrovirus-like particles are efficient immunogens to induce neutralizing antibodies, Vaccine, 27(42):5772-80, 2009).

En una composición farmacéutica como se definió anteriormente, dicho vector puede elegirse entre un vector de expresión eucariota o procariota, en particular un vector eucariota que es un vector vírico, en particular un vector de viruela, tal como una viruela aviar, una viruela de canario o un vector MVA (virus vaccinia Ankara modificado), un vector adenovírico, un vector lentivírico, un vector de sarampión, un virus Sendai o un vector CMV (citomegalovirus).

Una composición farmacéutica como se definió anteriormente, puede comprender además al menos una molécula de nucleótidos que codifica una proteína GAG y/o PRO y/o POL y/o una proteína NEF mutada sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras, de un lentivirus, preferentemente un lentivirus del mismo origen que la proteína ENV lentivírica mutada.

La ventajosa proteína Nef mutada contiene una sustitución en la posición 93, como se describe en la solicitud internacional WO 2006/018289 (Inventores: Renard M., Mangeney M. y Heidmann T.) y una deleción del extremo N de la proteína implicada en su miristoilación.

La expresión de GAG producirá partículas similares a virus (VLP, de sus siglas en inglés) que son particularmente ventajosas para una vacuna, en particular si la proteína ENV está asociada con la VLP (Guerbois y col., Virology, 388:191-203, 2009).

En una composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, puede estar contenida en el mismo vector que el que también contiene dicha al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína GAG y/o una proteína PRO y/o una proteína POL y/o una proteína NEF mutada, en la que dicha proteína n Ef mutada está sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras.

En una composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, puede estar contenida en el mismo vector que el que también contiene todas las dichas al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína GAG y/o una proteína PRO y/o una proteína POL y/o una proteína NEF mutada, en la que dicha proteína NEF mutada está sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras.

Una composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, puede tener una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, que está contenida en un vector que es diferente de al menos un vector que contiene dicha al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína GAG y/o una proteína PRO y/o una proteína POL y/o una proteína NEF mutada, en la que dicha proteína NEF mutada está sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras.

En la composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína GAG, dicha moléculas de ácido nucleico que codifica una proteína PRO, dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína POL y dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína NEF mutada sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras, pueden estar contenidas en vectores que son diferentes entre sí.

Una composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, puede comprender al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína GAG y/o una proteína NEF mutada, en la que dicha proteína NEF mutada está sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras, de un lentivirus humano o de simio, siendo preferentemente dicho lentivirus del mismo origen que la proteína ENV lentivírica mutada.

En una composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, puede estar contenida en el mismo vector que el que también contiene dicha al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína GAG y/o una proteína NEF mutada, en la que dicha proteína NEF mutada está sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras.

En una composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, puede estar contenida en el mismo vector que el que también contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína GAG y una proteína NEF mutada, en la que dicha proteína NEF mutada está sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras.

En una composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, puede estar contenida en el mismo vector que el que también contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína GAG y una proteína NEF mutada, en la que dicha proteína NEF mutada está sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras,

siendo preferentemente dicho vector un vector de sarampión (Guerbois y col., Virology, 388:191-203, 2009) o un vector de viruela de canario (Poulet y col., Veterinary Record, 153(5):141-145, 2003; Vaccari y col., Expert Review of Vaccines, Vol. 9, N.° 9, páginas 997-1005, 2010).

En una composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, puede estar contenida en un vector que es diferente del al menos un vector que contiene dicha al menos una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína GAG y/o una proteína NEF mutada, en la que dicha proteína NEF mutada está sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras.

En una composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína GAG y dicha molécula de ácido nucleico que codifica una proteína NEF mutada sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras, pueden estar contenidas en vectores que son diferentes entre sí.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica de acuerdo con la definición anterior, para su uso como vacuna, para el tratamiento o la prevención de infección lentivírica, en particular infección por VIH-1, infección por VIH-2 e infección por VIS.

Como se mencionó anteriormente, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención abarca una vacuna, que comprende como sustancia activa, una proteína como se definió anteriormente, o un ácido nucleico como se definió anteriormente, o un vector como se definió anteriormente, o una combinación de los mismos.

La composición farmacéutica puede abarcar una vacuna, que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína GAG como se definió anteriormente, un ácido nucleico que codifica una proteína ENV mutada como se definió anteriormente y un ácido nucleico que codifica una proteína NEF mutada como se definió anteriormente.

La composición farmacéutica que abarca una vacuna como se definió anteriormente, puede comprender un ácido nucleico que codifica una proteína GAG como se definió anteriormente, un ácido nucleico que codifica una proteína ENV mutada como se definió anteriormente y un ácido nucleico que codifica una proteína NEF mutada como se definió anteriormente, que están contenidos en un mismo vector, siendo preferentemente dicho vector un vector de viruela de canario o un vector de sarampión, más preferentemente un vector de sarampión.

La composición farmacéutica que abarca una vacuna, puede comprender una proteína GAG como se definió anteriormente, una proteína ENV mutada como se definió anteriormente y una proteína NEF mutada como se definió anteriormente.

La composición farmacéutica que abarca una vacuna, puede comprender una proteína GAG como se definió anteriormente, una proteína ENV mutada como se definió anteriormente y una proteína NEF mutada como se definió anteriormente que están asociadas a al menos un adyuvante.

Una lista completa de adyuvantes que se pueden usar en las vacunas contra el VIH se indica en FRANKLIN PIERCE LAW CENTER EDUCATIONAL REPORT: PATENT LANDSCAPE OF ADJUVANT FOR HIV VACCINES. Esta lista incluye:

- Compuestos a base de aluminio tales como fosfato de aluminio e hidróxido de aluminio.

- Adyuvantes inmunoestimuladores como CpG, MPL y QS21 o MF59, que es una emulsión de aceite de escualeno en agua.

- también se puede utilizar el adyuvante incompleto de Freund (FIA, de sus siglas en inglés) o el adyuvante completo de Freund (FCA, de sus siglas en inglés).

- Fosfato de calcio en particular ortofosfatos, metafosfatos o pirofosfatos y ocasionalmente iones de hidrógeno o hidróxido.

- dipéptido de Muramil (N-acetil muramil-L-alanina-D-isoglutamina, MDP) y sus análogos sintéticos tales como tripéptido de muramil fosfatidiletanolamina MTPPTdEtn),

- Trehalosa-6,6'-dimicolato,

- Saponinas (glucósidos triterpenoides) como QS-21

- Estearil tirosina (sal de hidrocloruro de octadecil éster de tirosina). Los adyuvantes inmunoestimuladores pueden incluir las siguientes clases de compuestos:

- Polisacáridos como:

◦ Quitosano:

◦ Inulina:

◦ Beta - Glucanos

◦ Lipopolisacáridos o endotoxina

◦ MGN-3 Actinidia erianta (AEPS):

◦ Eldexómero:

◦ CpG ODN

- Liposomas como

◦ Vesículas de liposomas de deshidratación-rehidratación (DRV, de sus siglas en inglés)

◦ Linfocito T citotóxico (CTL, de sus siglas en inglés)

◦ CAF01

◦ Liposomas que contienen lípido A (LA)

- Péptidos centrales de lípidos y polisina (LCP, de sus siglas en inglés)

- Citocinas como GM-CSF, IL-2, IL-12 o IL-15

- Lípido A y monofosforil lípido A (MPL)

- Lipopéptidos, que son moléculas que consisten en lípidos conectados a un péptido. Proceden de la lipoproteína de la pared celular bacteriana.

- Adyuvantes inmunoestimuladores exógenos que son compuestos o proteínas que no se encuentran en el cuerpo humano como:

◦ Proteosomas, en particular, péptidos antigénicos múltiples (MAP, de sus siglas en inglés) o toxinas exógenas

De forma adecuada, la cantidad total de proteína ENV lentivírica mutada en una dosis única de la composición inmunogénica es de 10 |jg y/o la cantidad total de polipéptido no fusionado en una dosis única de la composición inmunogénica es de 20 jg . En una realización, la cantidad total de todos los antígenos en una dosis única de la composición inmunogénica es 0,5-50 jg , 2-40 jg , 5-30 jg , 10 j-20 jg o alrededor de 30 jg , alrededor de 20 jg o alrededor de 10 jg.

La cantidad de proteína ENV lentivírica mutada en una dosis de la composición inmunogénica se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunitaria sin efectos secundarios adversos significativos en los receptores normales. Dicha cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se emplee y el régimen de dosificación o vacunación que se seleccione. Se puede determinar una cantidad óptima para una composición inmunogénica particular mediante estudios estándar que implican la observación de respuestas inmunitarias relevantes en sujetos.

La administración de la composición farmacéutica puede tomar la forma de una o de más de una dosis individual, por ejemplo, como dosis repetidas de la misma composición que contiene el polipéptido, o en un régimen de vacunación heterólogo de "cebado-refuerzo", que incluye proteínas y vectores. En una realización, la composición inmunogénica de la invención se administra inicialmente a un sujeto como dos o tres dosis, en las que las dosis se separan por un período de dos semanas a tres meses, preferentemente un mes.

De forma conveniente, la composición se administra a un sujeto (por ejemplo, como refuerzo) cada 6-24, o 9-18 meses, por ejemplo, anualmente. Por ejemplo, la composición se administra a un sujeto (por ejemplo, como refuerzo) a intervalos de seis meses o 1 año. Adecuadamente a este respecto, las administraciones posteriores de la composición al sujeto refuerzan la respuesta inmunitaria de las administraciones anteriores de la composición al mismo sujeto. En una realización, la composición inmunogénica de la invención se usa como parte de un régimen de cebado-refuerzo para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades o infecciones por cepas del VIH-1 de uno o más clados diferentes del uno o más clados del VIH-1 en la composición inmunogénica. De forma conveniente, la composición es la dosis de cebado. Como alternativa, la composición es la dosis de refuerzo.

De forma adecuada, se administran dos o más dosis de cebado y/o de refuerzo. Un régimen de cebado-refuerzo heterólogo utiliza la administración de diferentes formas de composición inmunogénica o vacuna en el cebado y el refuerzo, cada una de las cuales puede incluir dos o más administraciones. La composición de cebado y la composición de refuerzo tendrán al menos un antígeno en común, aunque no es necesariamente una forma idéntica del antígeno, puede ser una forma diferente del mismo antígeno.

Las inmunizaciones de cebado-refuerzo de acuerdo con la invención pueden ser regímenes homólogos de cebadorefuerzo o regímenes heterólogos de cebado-refuerzo. Los regímenes homólogos de cebado-refuerzo utilizan la misma composición para cebado y refuerzo, por ejemplo, la composición inmunogénica de la invención. Los regímenes heterólogos de cebado-refuerzo se pueden realizar con una combinación de formulaciones basadas en ADN y proteínas. Dicha estrategia se considera eficaz para inducir respuestas inmunitarias amplias. Las vacunas proteicas adyuvantes inducen principalmente respuestas inmunitarias de linfocitos T CD4+ y anticuerpos, mientras que la administración de ADN como un plásmido o un vector recombinante induce fuertes respuestas de linfocitos T CD8+. Por lo tanto, la combinación de la vacunación con proteínas y ADN puede proporcionar una amplia variedad de respuestas inmunitarias. Esto es particularmente relevante en el contexto del VIH, ya que se cree que los anticuerpos neutralizantes, los linfocitos T CD4+ y los linfocitos T CD8+ son importantes para la defensa inmunitaria contra el VIH-1.

La divulgación también se refiere a una composición farmacéutica de acuerdo con la definición anterior, para su uso para el tratamiento de una infección lentivírica.

La divulgación también proporciona un procedimiento para tratar pacientes afectados por patologías relacionadas con una infección lentivírica, que comprende la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición farmacéutica como se definió anteriormente. La divulgación también se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra un lentivirus que ha infectado a un individuo, comprendiendo dicho procedimiento la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición farmacéutica como se definió anteriormente.

Una composición farmacéutica como se definió anteriormente, puede comprender un agente antivírico.

La composición de acuerdo con la divulgación también se puede usar en combinación con las composiciones antivíricas enumeradas en la Tabla 1 a continuación:

Tabla 1: Nombres comerciales de los diferentes antivíricos utilizados para el tratamiento del VIH, así como su especificidad de acción.

La composición farmacéutica como se definió anteriormente, puede ser de uso simultáneo, separado o secuencial.

Se puede usar una composición farmacéutica como se definió anteriormente para estimular una respuesta inmunitaria en un organismo hospedador.

La divulgación se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente para su uso para inducir una respuesta inmunitaria específica contra la proteína ENV del VIH.

La divulgación se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente para su uso para la

prevención o el tratamiento de la infección por VIH, o patologías relacionadas con el SIDA.

La divulgación se refiere a una composición farmacéutica como se definió anteriormente, como una vacuna, para su

uso para inducir una respuesta inmunitaria específica contra la proteína ENV del VIH.

uso para la prevención o el tratamiento de la infección por VIH, o patologías relacionadas con el SIDA.

En otro aspecto, la invención también se refiere a un procedimiento para obtener la sustancia activa de una

composición farmacéutica, como se ha definido anteriormente, que consiste en modificar la propiedad

inmunosupresora de:

una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre,

o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre, comprendiendo dicho

fragmento al menos 40 aminoácidos,

presentando dicha proteína ENV o fragmento de la misma una subunidad transmembrana (TM) que comprende

un dominio inmunosupresor (ISU) que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-X'a-X'b-X-D-Q (SEQ ID NO: 427),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

X'a es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y

X'b es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y,

comprendiendo dicho procedimiento una etapa de introducción de al menos una mutación de X'a y/o X'b, para

obtener:

una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad

inmunosupresora, teniendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada al menos un 90% de identidad, a una secuencia elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO:

O: 420 y SEQ ID NO: 421,

o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene

sustancialmente actividad inmunosupresora, comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

comprendiendo dicha proteína ENV mutada y fragmento de la misma un dominio inmunosupresor (ISU) mutado

que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, F, G, L, R y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o Xa es C, D, E, H,

I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es A, F, G, R o Xa es A, F, G, L, R y Xb es A, F, G, R

pudiendo evaluarse dicha ausencia sustancial de actividad inmunosupresora de la proteína ENV lentivírica

humana o de simio mutada mencionada anteriormente o del fragmento definido anteriormente por el hecho de

que en un ensayo in vivo, que implica el rechazo de células tumorales injertadas,

dichas células tumorales se transducen para expresar dicha proteína ENV mutada o dicho fragmento ("células

tumorales ENV mutadas),

o dichas células tumorales se transducen para expresar dicha proteína ENV de tipo silvestre o un fragmento

de la misma ("células tumorales ENV de tipo silvestre),

o dichas células tumorales no se transducen ( tumorales normales), siguiendo la relación:

índice de inmunosupresión de dicha proteína ENV mutada o de dicho fragmento (ienv mutada)/índice de

inmunosupresión de la proteína ENV de tipo silvestre (ienv de tipo silvestre) es inferior a 0,5,

siendo ienv mutada definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV mutadas - área

máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las células tumorales

normales), y

siendo ienv de tipo silvestre definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV de tipo

silvestre - área máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las

células tumorales normales).

La invención también se refiere a un procedimiento para obtener la sustancia activa de una composición farmacéutica,

de acuerdo con el procedimiento definido anteriormente, que consiste en modificar la propiedad inmunosupresora de:

una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre,

fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-Y-L-X-D-Q (SEQ ID NO: 1),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

comprendiendo dicho procedimiento una etapa de introducción de al menos una mutación de Y en la posición 5 y/o L en la posición 6, para obtener:

una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos, comprendiendo dicha proteína ENV mutada y fragmento de la misma un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, F, G, L, R y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es A, F, G, R o Xa es A, F, G, L, R y Xb es A, F, G, R.

La invención también se refiere a un procedimiento como se definió anteriormente para obtener la sustancia activa de una composición farmacéutica,

en la que dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos, comprendiendo dicha proteína ENV mutada y fragmento de la misma un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, F, G, L o R, y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o

Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es A, F, G o R, o

Xa es A, F, G, L o R, y Xb es A, F, G o R.

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, F, G, L o R, y Xb es L, I, V, M o P, o

Xa es Y, I, H, C o T, y Xb es A, F, G o R, o

Xa es A, F, G, L o R, y Xb es A, F, G o R.

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, G, o R, y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o

Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es F, G o

R, o Xa es F o L, y Xb es F, G o R, o Xa es A, G o R, y Xb es A.

en la que dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos, comprendiendo dicha proteína ENV mutada y fragmento de la misma un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la

siguiente secuencia amino:

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, G, o R, y Xb es L, I, V, M o P, o

Xa es Y, I, H, C o T, y Xb es F, G o R, o

Xa es F o L, y Xb es F, G o R, o

Xa es A, G o R, y Xb es A, o

Xa es A, G, o R, y Xb es F, G o R.

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, G, o R, y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o

Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es F, G o R.

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, G, o R, y Xb es L, I, V, M o P, o

Xa es Y, I, H, C o T, y Xb es F, G o R.

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es R, y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o

Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es R, o

Xa es R, y Xb es R.

en la que dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos, comprendiendo dicha proteína ENV mutada y fragmento de la misma una mutación en al menos uno de los aminoácidos en las posiciones, 29, 36 y 37 de la SEQ ID NO: 426:

A[I/V]E[K/R]XaXbX1DQX2X3LX4X5WGC[A/S][F/G]X6X7CVX8TXgVPXcX1üZ1 Z2Z3Z4Z5 XdXe[S/T] (SEQ ID NO: 426) en la que Xa y Xb son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, X1 a X10 representan cualquier aminoácido, Zi a Z5 no representan aminoácido o cualquier aminoácido, independientemente uno del otro de manera

que

K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, o está eliminado, preferentemente A, D, o L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y, W, o está eliminado, preferentemente A, G,

K, L, M, N, P, Q, R, T, V, Y, W, o está eliminado, preferentemente A, D o

Los siguientes ejemplos de composiciones farmacéuticas también son parte de la divulgación.

Una composición farmacéutica que comprende como sustancia activa:

a) una ENV lentivírica humana o de simio mutada de origen no natural aislada que no tiene sustancialmente

actividad inmunosupresora, resultando dicha ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de la

subunidad transmembrana (TM) de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre,

comprendiendo la subunidad transmembrana un dominio inmunodepresor (ISU) que comprende la siguiente

secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]- Y-L-X-D-Q (SEQ ID NO: 1),

abarcando dicha secuencia

AIEKYLXDQ (SEQ ID NO: 2), AIERYLXDQ (SEQ ID NO: 3), AVEKYLXDQ (SEQ ID NO: 4) y AVERYLXDQ (SEQ

ID NO: 5), en la que X representa cualquier aminoácido natural,

en la que los aminoácidos en las posiciones elegidas entre

- la posición 4 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 5 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 6 de la SEQ ID NO: 1,

- las posiciones 4 y 5 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 4 y 6 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 5 y 6 de la SEQ ID NO: 1, y

- la posición 4, 5 y 6 de la SEQ ID NO: 1,

son :

- eliminados,

- o sustituidos por otro aminoácido tal que

◦ cuando el dominio inmunosupresor comprende la SEQ ID NO: 2 o 4

■ el resto de aminoácido en la posición 4 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, L, M,

N, P, Q, R, S, T, V, W o Y, y/o

■ el resto de aminoácido en la posición 5 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, I, L, M, N,

P, Q, R, S, T, V o W, y/o

■ el resto de aminoácido en la posición 6 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, K, M,

N, P, Q, R, S, T, V, W o Y,

◦ cuando el dominio inmunosupresor comprende la SEQ ID NO: 3 o 5,

■ el resto de aminoácido en la posición 4 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, K, L,

M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y/o

P, Q, R, S, T, V o W, y/o

N, P, Q, R, S, T, V, W o Y,

o

b) un fragmento de dicha ENV lentivírica humana o de simio mutada, comprendiendo dicho fragmento al menos el

dominio inmunosupresor (ISU) de dicha ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre que comprende la

siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]- Y-L-X-D-Q (SEQ ID NO: 1),

en la que los aminoácidos en las posiciones elegidas entre

- la posición 4 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 5 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 6 de la SEQ ID NO: 1,

- las posiciones 4 y 5 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 4 y 6 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 5 y 6 de la SEQ ID NO: 1, y

- la posición 4, 5 y 6 de la SEQ ID NO: 1,

son:

- eliminados,

- o sustituidos por otro aminoácido tal que

◦ cuando el dominio inmunosupresor comprende la SEQ ID NO: 2 o 4

■ el resto de aminoácido en la posición 4 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y, y/o

■ el resto de aminoácido en la posición 5 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, I, L, M, N, P, Q, R, S,T, V o W, y/o

■ el resto de aminoácido en la posición 6 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y,

◦ cuando el dominio inmunosupresor comprende la SEQ ID NO: 3 o 5,

■ el resto de aminoácido en la posición 4 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y/o

teniendo dicho fragmento propiedades sustancialmente no inmunodepresoras,

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que los aminoácidos en las posiciones del grupo que consiste en

- la posición 4 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 5 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 6 de la SEQ ID NO: 1,

- las posiciones 4 y 5 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 4 y 6 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 5 y 6 de la SEQ ID NO: 1, y

- la posición 4, 5 y 6 de la SEQ ID NO: 1,

- son sustituidos por otro aminoácido tal que

◦ cuando el dominio inmunosupresor comprende la SEQ ID NO: 2 o 4

■ el resto de aminoácido en la posición 5 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, y/o

◦ cuando el dominio inmunosupresor comprende la SEQ ID NO: 3 o 5,

■ el resto de aminoácido en la posición 4 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y/o

■ el resto de aminoácido en la posición 6 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W o Y.

La proteína lentivírica mutada comprendida en la composición definida anteriormente, puede comprender la secuencia de aminoácidos de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 407 a SEQ ID NO: 414.

La correspondencia es la siguiente:

Estas proteínas han mutado en la posición 4 de la SEQ ID NO: 1, mediante sustitución, y el aminoácido en la posición 5 ha sido sustituido por A.

Una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que los aminoácidos en las posiciones del grupo que consiste en

- la posición 5 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 6 de la SEQ ID NO: 1, y

- la posición 5 y 6 de la SEQ ID NO: 1,

- son sustituidos por otro aminoácido tal que

■ el resto de aminoácido en la posición 5 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W y/o

Una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicho dominio inmunosupresor (ISU) comprende la secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 4 o 5.

Una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicho dominio inmunosupresor (ISU) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, y en la que

■ el resto de aminoácido en la posición 5 de la SEQ ID NO: 5 está sustituido por A, F, G, L o R, o

■ el resto de aminoácido en la posición 6 de la SEQ ID NO: 5 está sustituido por A, F, G o R, o

■ los restos de aminoácido en la posición 5 y 6 de la SEQ ID NO: 5 están sustituidos por A, F, G, o R.

Este es el caso cuando dicha proteína ENVes la proteína ENVdel virus VIH 1.

Una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicho dominio inmunosupresor (ISU) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, y en la que

■ el resto de aminoácido en la posición 5 de la SEQ ID NO: 2 está sustituido por A, F, G, L o R, o

■ el resto de aminoácido en la posición 6 de la SEQ ID NO: 2 está sustituido por A, F, G o R, o

■ los restos de aminoácido en la posición 5 y 6 de la SEQ ID NO: 2 están sustituidos por A, F, G, o R.

Una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicho dominio inmunosupresor (ISU) comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y en la que

■ el resto de aminoácido en la posición 5 de la SEQ ID NO: 3 está sustituido por A, F, G, L o R, o

■ el resto de aminoácido en la posición 6 de la SEQ ID NO: 3 está sustituido por A, F, G o R, o

■ los restos de aminoácido en la posición 5 y 6 de la SEQ ID NO: 3 están sustituidos por A, F, G, o R.

Una composición farmacéutica como se definió anteriormente, en la que dicha proteína mutada comprende además la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre SEQ ID NO: 270,

X 1D Q XX 3LX4X 5WGCW SU F IG X X 7CVX8TX9VPWX10Z 1Z2Z3Z4Z5W/SH E/D/N/AU S/ T] (SEQ ID NO: 270)

en la que X 1-X 10 representa cualquier aminoácido,

en la que Z 1 a Z5 no representa ningún aminoácido o ningún aminoácido natural, independientemente unos de los otros,

comprendiendo además dicha proteína lentivírica mutada una mutación en uno de al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 23, 30 y 31 de la SEQ ID NO: 270

siendo dicha mutación:

- o una eliminación,

- o una sustitución tal que

◦ el aminoácido en la posición 25 de la SEQ ID NO: 270 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y,

◦ el aminoácido en la posición 32 de la SEQ ID NO: 270 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, T, V, Y, W,

◦ el aminoácido en la posición 33 de la SEQ ID NO: 270 está sustituido por C, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, Y, W.

Una composición farmacéutica que comprende como sustancia activa:

una ENVlentivírica humana o de simio mutada de origen no natural aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, resultando dicha ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre, comprendiendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre la siguiente secuencia de aminoácidos:

A[I/V]E[K/R]YLXiDQX2X3LX4X5WGC[A/S][F/G]X6X7CVX8TX9VPWXioZ iZ2Z3Z4Z5[N/S][E/D/N/A][S/T] (SEQ ID NO: 415),

en la que X 1-X 10 representa cualquier aminoácido,

en la que los aminoácidos en las posiciones elegidas entre

- la posición 4 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 5 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 6 de la SEQ ID NO: 1,

- las posiciones 4 y 5 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 4 y 6 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 5 y 6 de la SEQ ID NO: 1, y

- la posición 4, 5 y 6 de la SEQ ID NO: 1,

son:

- eliminados,

- o sustituidos por otro aminoácido tal que

■ el resto de aminoácido en la posición 4 de la SEQ ID NO: 1 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y/o

y además en la que

al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 29,36 y 37 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 415 están mutados, por

- o una eliminación,

- o una sustitución tal que

◦ el aminoácido en la posición 29 de la SEQ ID NO: 415 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y,

◦ el aminoácido en la posición 36 de la SEQ ID NO: 415 está sustituido por A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, T, V, Y, W,

◦ el aminoácido en la posición 37 de la SEQ ID NO: 415 está sustituido por C, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, Y, W.

Una composición farmacéutica como se definió anteriormente, que comprende además una mutación en la posición X 4X1DQX2X3LX4X5WGC[A/S][F/G]XoX7CVX8TX9VPWX1oZ1Z2Z3Z4Z5[N/S][E/D/N/A][S/T (SEQ ID NO: 270) en la que X 1-X3 y X5-X 10 representan cualquier aminoácido,

Z 1 a Z ⁵ no representan aminoácido o cualquier aminoácido, independientemente unos de los otros

siendo dicha mutación:

- o una eliminación,

- o una sustitución por f\, C, D, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, Y o W.

Una composición farmacéutica que comprende como sustancia activa:

una ENV lentivírica humana o de simio mutada de origen no natural aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, resultando dicha ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre, comprendiendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre la siguiente secuencia de aminoácidos: A[IIV]E[KIR]YLX1DQX2X3LX4X5WGC[AIS][FIG]XoX7CVX8TX9VPWX1oZ1Z2Z3Z4Z5[NIS][EIDINIA][SIT (SEQ ID NO: 415),

en la que X 1-X 10 representa cualquier aminoácido,

en la que Z 1 a Z ⁵ no representa ningún aminoácido o ningún aminoácido natural, independientemente unos de los otros,

en la que los aminoácidos en las posiciones elegidas entre

- la posición 4 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 5 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 6 de la SEQ ID NO: 1,

- las posiciones 4 y 5 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 4 y 6 de la SEQ ID NO: 1,

- la posición 5 y 6 de la SEQ ID NO: 1, y

- la posición 4, 5 y 6 de la SEQ ID NO: 1,

son:

- eliminados,

- o sustituidos por otro aminoácido tal que

y posiblemente, además en la que

al menos uno de los aminoácidos en las posiciones 29, 36 y 37 de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 415 están mutados, por

- o una eliminación,

- o una sustitución tal que

◦ el aminoácido en la posición 37 de la SEQ ID NO: 415 está sustituido por C, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, Y, W,

y/o posiblemente en la que además el aminoácido en la posición X ⁴ se elimina o sustituye por A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, Y o W, preferentemente por R o H.

LEYENDA DE LAS FIGURAS

Figura 1:

Secuencias de aminoácidos de los delectores de ectodominio del VIH, con la longitud indicada, y de ectodominios mutantes únicos (la sustitución está subrayada).

Figura 2:

Delineación funcional del dominio inmunosupresor de la envoltura del VIH. La actividad inmunosupresora de ectodominios de envoltura del VIH de 115aa de longitud y truncados (véase estructuras a la izquierda) se probó usando el ensayo de rechazo tumoral MCA205 in vivo. Los índices de inmunosupresión se dan como histogramas a la derecha (valores medios /- DE).

Figura 3:

Identificación funcional del aminoácido en el ectodominio de la envoltura del VIH directamente implicado en la actividad inmunosupresora, y búsqueda de sustituciones de aminoácidos que inhiban esta actividad. La actividad inmunosupresora se probó in vivo como en la Figura 2.

Figura 4:

Perfil de expresión de la envoltura de VIH mutados usando vectores que expresan VIHenv de longitud completa y un anticuerpo monoclonal (FACS) anti-SU VIHenv (110H). Los datos se expresan como porcentajes del control VIHenv TS.

Figura 5:

Infectividad de las partículas víricas seudotipadas con VIHenv que muestran la funcionalidad de las envolturas del VIH de TS de longitud completa y específicamente mutadas. Los resultados se expresan como títulos víricos (número de células diana infectadas/ml de sobrenadante de virus).

Figura 6:

Identificación funcional del aminoácido en el ectodominio de la envoltura del VIS directamente implicado en la actividad inmunosupresora, y búsqueda de sustituciones de aminoácidos que inhiban esta actividad. La actividad inmunosupresora se probó usando el ensayo de rechazo tumoral MCA205 in vivo. Los índices de inmunosupresión se representan como histogramas (valores medios /- DE).

Ejemplo

Se han identificado dominios inmunosupresores en las proteínas de envoltura de los oncorretrovirus, ya sean del tipo gamma-(MLV murino) o delta (por ejemplo, HTLV humano), así como de algunos retrovirus endógenos (por ejemplo, HERV-FRD). Estos dominios tienen una estructura cristalográfica altamente conservada, aunque sus secuencias primarias son bastante diversas, y se ha demostrado previamente que un aminoácido (Q, E o K) en una posición definida es esencial para la actividad inmunosupresora de la proteína de envoltura correspondiente. Se demostró además que la mutación de este aminoácido a una Arginina (R) da como resultado la inhibición de la actividad inmunosupresora de la proteína de envoltura mutada, con, en algunos casos, la conservación completa de las otras propiedades funcionales de la proteína de envoltura, incluida su capacidad para ser normalmente expresada en la membrana celular, para ser capturada por una partícula retro vírica naciente, y finalmente para conferir infectividad del virus mutante in vitro. Dichas mutantes permitieron una demostración inequívoca del papel esencial de la actividad inmunosupresora para la vire mía in vivo, con el virus IS mutante incapaz de escapar del sistema inmunitario del hospedador y de propagarse en un animal inmunocompetente [Schlecht-Louf y col., Proc Natl Acad Sci USA.

2010;107(8):3782-7].

Sobre la base de la identificación de un dominio IS y de la capacidad de la función IS de inhibirse por mutaciones específicas dentro del dominio IS que no interrumpen la estructura antigénica de la proteína vírica correspondiente, se están desarrollando enfoques vacunales con vacunas que contienen antígenos víricos "optimizados" IS-negativos mutados, que demuestran una mayor inmunogenicidad en comparación con los que usan los antígenos víricos nativos. La búsqueda de dominios IS similares y mutaciones apropiadas en el caso de retrovirus no oncogénicos pero aún patógenos como el VIH es, por lo tanto, de interés para desarrollar vacunas tentativas mejoradas.

En realidad, en el caso de la otra clase principal de retrovirus, a saber, los lentivirus (entre los que se encuentran el VIH1 y el VIH2 humanos, y los homólogos de simios VIS), la estructura cristalográfica de la proteína de envoltura desvela algunas similitudes pero también diferencias muy importantes, especialmente en el dominio correspondiente al dominio IS de oncorretrovirus, con evidencia en VIH y VIS de un dominio hélice-bucle-hélice severamente extendido, y sin evidencia de similitudes de secuencia con el dominio IS de oncorretrovirus. Además, se identificó un dominio IS con fuertes similitudes de aminoácidos con el dominio IS de los oncorretrovirus dentro de una proteína accesoria del VIH y VIS, es decir, dentro de la proteína Nef. Esta proteína es producida específicamente por estos retrovirus complejos y no está codificada por los oncorretrovirus. La proteína Nef es esencial para la viremia in vivo, y posee varios dominios responsables del escape inmunitario, entre los cuales el dominio IS identificado, lo que sugiere fuertemente que los lentivirus habían transferido la actividad inmunosupresora encontrada en los oncorretrovirus dentro de su proteína de envoltura, a la proteína Nef accesoria. De acuerdo con esta hipótesis, los retrovirus con o sin mutación de Nef tienen una patogenicidad severamente atenuada en modelos animales macacos in vivo. En este caso, los inventores informan sobre la identificación de una actividad IS llevada por las proteínas de envoltura del VIH y VIS, y sobre mutaciones específicas que inhiben esta actividad sin una interrupción importante de la estructura general de las proteínas de envoltura correspondientes.

Resultados

Delineación del dom inio inmunosupresor de la envoltura del VIH

La delineación del dominio inmunosupresor de la envoltura del VIH se logró utilizando un ensayo de rechazo tumoral in vivo, que los inventores habían utilizado previamente para demostrar la actividad inmunosupresora de la proteína Env de los oncorretrovirus (MoMLV murino y MPMV de simio). El fundamento del ensayo se puede resumir de la siguiente manera: mientras la inyección de células tumorales MCA205 (H-2b) en ratones Balb/c alogénicos (H-2d) conduce a la formación de ningún tumor o tumores transitorios que se rechazan rápidamente, la inyección de las mismas células, pero que expresan de manera estable una proteína Env retro vírica inmunosupresora, conduce al crecimiento de tumores más grandes que persisten durante más tiempo, a pesar de la expresión del nuevo antígeno exógeno. Esta diferencia no está asociada con una diferencia en la tasa de crecimiento celular intrínseco ya que no se observa en ratones singénicos C57BL/6 y depende del sistema inmunitario. El grado de "inmunosupresión" puede cuantificarse mediante un índice basado en el tamaño del tumor: (Aenv-Aninguna)/Aninguna, en el que Aenv y Aninguna son las áreas medias en el máximo de crecimiento de tumores de ratones Balb/c inyectados con células que expresan env o de control, respectivamente. Un índice positivo indica que la expresión de env facilita el crecimiento tumoral, como consecuencia de su actividad inmunosupresora; un índice nulo o negativo apunta a ningún efecto o incluso un efecto inhibidor, respectivamente. Esto último puede explicarse mediante una estimulación de la respuesta inmunitaria del hospedador contra el nuevo antígeno extraño, representado por una proteína Env no inmunosupresora, expresada en la superficie de las células tumorales.

Para delinear primero un dominio inmunosupresor (ISD) mínimo activo in vivo, los inventores analizaron el efecto de una serie de truncamientos/deleciones dentro del gen env del VIH. El ensayo de la serie de truncamientos en el extremo C en las Figuras 1 y 2 identificó un dominio de 49 restos de largo con actividad IS, con el fragmento 6 aa más corto de VIH43 y los fragmentos truncados posteriores de VIH37 y VIH30 del extremo C siendo IS negativos. VIH49 está incluido en el llamado ectodominio, que corresponde a una parte soluble del dominio extracelular de la subunidad TM, y consiste en el dominio a-helicoidal implicado en la trimerización TM del VIH, y la parte N terminal del bucle que contiene los 2 restos de cisteína bien conservados, 6 aa distantes, encontrados en la mayoría de las envolturas retrovíricas. La delineación refinada de los aminoácidos responsables de la actividad IS se realizó luego mediante el escaneo de argininas entre los aa 36 y 51, es decir, en el dominio asociado con la transición de los subdominios de Env positivos a negativos de IS. Como se ilustra en la Figura 3, todas las sustituciones de X a Arg no produjeron cambios significativos en la actividad IS del VIH115, con una excepción para Y41 y L42, lo que dio como resultado la pérdida de actividad IS del péptido mutante.

Mutaciones en la posición 41

Luego, los inventores verificaron que la sustitución Y41R no alteraba la capacidad general de la envoltura del VIH para ser expresada por una célula eucariota y para exportarse a la membrana celular, mediante la introducción de la sustitución Y41R en un vector de expresión para la envoltura del VIH. Un análisis FACS de células transfectadas tanto con el mutante de tipo silvestre como con el mutante Y41R usando un anticuerpo monoclonal específico anti-SU realmente demostró la expresión cuantitativa de la envoltura mutante en la superficie celular, lo que indica que la mutación Y41R no altera significativamente la estructura Env del VIH ni la interacción SU-TM (Figura 4).

Finalmente se realizó una serie de sustituciones distintas en la posición Y41 para identificar tentativamente si otros aminoácidos pudieran ser sustituidos para generar variantes IS-negativas: el aminoácido analizado incluía K y H cargados positivamente (además de R), el pequeño A y G, y los restos hidrófobos L y F. Una vez más, se verificó que estas sustituciones no alteraban la estructura general de Env del VIH con las mutaciones correspondientes.

Entre ellas, la sustitución de Y41 por A, G, L y F dio como resultado la pérdida de IS (Figura 3), y no alteró la estructura general de Env del VIH con las mutaciones correspondientes (Figura 4 y 5).

Mutación adicional fuera del dominio ISU

También se probaron los efectos de un conjunto de segundas mutaciones en posiciones estructuralmente cercanas a la posición Y41 dentro de la estructura tridimensional del ectodominio ENV. Dos de ellas (Y41R-K72A e Y41R-K78G) mantienen una expresión de alto nivel en la membrana celular y confieren infectividad (Figura 5).

Mutaciones en la posición 42

De forma interesante, la posición adyacente a la posición Y41, la posición L42, también dio como resultado la pérdida de la actividad IS del péptido mutante cuando se introdujo la mutación L42R. Esta mutación mantiene una expresión de alto nivel en la membrana celular de la proteína ENV del VIH mutada (Figura 4).

Mutaciones dentro de la proteína ENV del VIS

De forma interesante, la mutación en la posición homóloga en ENV del VIS (L42) de la posición L42 en el ectodominio ENV del VIH-1 también dio como resultado la pérdida específica de las actividades IS (Figura 6).

En consecuencia, la presente investigación ha identificado claramente una ubicación definida y una(s) sustitución(es) definida(s) dentro del entorno del VIH, lo que da como resultado la pérdida de su actividad IS. Al ser compatibles con la conservación de la estructura general de las proteínas Env lentivíricas humanas y de simio, estas sustituciones deben introducirse en todas las preparaciones farmacéuticas que incluyen la proteína Env como antígeno de vacuna.

Materiales y procedimientos

Ratones y líneas celulares: Los ratones C57B1/6 y Balb/c, de 6-10 semanas de edad, se obtuvieron de CER Janvier (Laval, Francia). Los ratones se mantuvieron en las instalaciones para animales del Instituto Gustave Roussy de acuerdo con las regulaciones institucionales. Se cultivaron células 293T (ATCC CRL11268) y MCA205 en d Me M complementado con suero de ternera fetal al 10 % (Invitrogen), estreptomicina (100 pg/ml) y penicilina (100 unidades/ml).

Construcción de plásmidos: El PCEL/E160 que codifica la proteína de envoltura del aislado BRU/LAI VIH-1 es un regalo del Dr. Marc Sitbon. Para generar los plásmidos pDFG que codifican los diversos fragmentos del ectodominio de envoltura del VIH-1, los fragmentos de PCR generados usando PCEL/E160 como plantilla y los pares de cebadores 1-2 (pDFG-VIH115), 1-3 (pDFG-VIH81), 1-4 (pDFG-VIH67), 1-5 (pDFG-VIH55), 1-6 (pDFG-VIH49), 1-7 (pDFG-VIH43), 1-8 (pDFG-VIH37), 1-9 (pDFG-VIH30) se digirieron con SfiI y MluI y se insertaron en pDFG-ectoSincitina-1 (Mangeney y col., 2007) abierto con las mismas enzimas.

Se obtuvieron pDFG-VIH115 mutados mediante PCR sucesiva usando cebadores apropiados. Se realizó una primera serie de PCR con pDFG VIH115 como plantilla utilizando los cebadores 1-11 y 10-2, 1-13 y 12-2, 1-15 y 14-2 o 1-17 y 16-2 para introducir las mutaciones E39R, Y41R, K43R o D44R respectivamente, y cebadores 1-18 y 19-2, 1-20 y 21 2, 1-22 y 23-2, 1-24 y 25-2, 1-26 y 27-2, 1-28 y 29-2, 1-30 y 31-2, 1-32 y 33-2, 1-34 y 35-2, o 1-36 y 37-2 para introducir las mutaciones L36R, A37R, V38r , L42R, q 45R, Q46R, L47R, L48R, G49R, o 150r respectivamente. Los productos de PCR se usaron luego como plantillas en la PCR posterior usando los cebadores 1-2. Estos fragmentos de PCR se digirieron con SfiI y MluI y se insertaron en pDFG-ectoSincitina-1 (Mangeney y col., 2007) abiertos con las mismas enzimas.

Todas las construcciones fueron secuenciadas antes de su uso.

Tabla 1. Lista de cebadores

N.° Nombre Secuencia del cebador (5'-3') SEQ ID

1 TM VIH Sfi-Sens ACATggcccagccggccTCTGGTATAGTGCAGCAGC SEQ ID NO: 295

2 TM VIH115 Mlu-AS G T AT a cg cg tTT AT AATT CTTG TT C ATT CTTTTC SEQ ID NO: 296

3 TM VIH81 Mlu AS GTATacgcgtTTACATGTTATTCCAAATCTGTTCC SEQ ID NO: 297

4 TM VIH67 Mlu AS G T AT a cg cg tTTAAG C ATT C C AAG G C AC AG C SEQ ID NO: 298

5 TM VIH55 Mlu AS G T AT a cg cg tTT AT C C AG AG C AAC C C C AAAT C C SEQ ID NO: 299

6 TMVIH49 Mlu AS GTATacgcgtTTACCCCAGGAGCTGTTGATCC SEQ ID NO: 300

7 TMVIH43 Mlu AS GTATacgcgtTTACTTTAGGTATCTTTCCACAGC SEQ ID NO: 301

8 TMVIH37 Mlu AS GTATacgcgtTTAAGCCAGGATTCTTGCCTGGAG SEQ ID NO: 302

9 TMVIH30 Mlu AS GTATacgcgtTTACTGCTTGATGCCCCAGAC SEQ ID NO: 303

18 TMVIH115 L36R as CTTTCCACAGCCcGGATTCTTGCCTG SEQ ID NO: 304

19 TMVIH115 L36R s C AG G C AAG AATCCg G G CTG TG GAAAG SEQ ID NO: 305

20 TMVIH115 A37R as GTATCTTTCCACAcgCAGGATTCTTGCC SEQ ID NO: 306

21 TMVIH115 A37R s GGCAAGAATCCTGcgTGTGGAAAGATAC SEQ ID NO: 307

22 TMVIH115 V38R as CTTTAG GTATCTTTCC ctAG CC AG GATTCTTGCC SEQ ID NO: 308

23 TMVIH115 V38R s GGCAAGAATCCTGGCTagGGAAAGATACCTAAAG SEQ ID NO: 309

11 TMVIH115 E39R AS CCTTT AGGTAT CTT ctCACAGCCAGG ATT C SEQ ID NO: 310

10 TMVIH115 E39R S GAATCCTGGCTGTGagAAGATACCTAAAGG SEQ ID NO: 311

13 TMVIH115 Y41R AS GTT G ATCCTTT AGGcgT CTTTCCACAGCCAG SEQ ID NO: 312

12 TMVIH115 Y41R S CTGGCTGTGGAAAGAcgCCTAAAGGATCAAC SEQ ID NO: 313

24 TMVIH115 L42R as GG AG CT GTT G ATCCTTT cGGTAT CTTTCCACAG CC SEQ ID NO: 314

25 TMVIH115 L42R s GGCTGTGGAAAGATACCgAAAGGATCAACAGCTCC SEQ ID NO: 315

15 TMVIH115 K43R AS GAGCTGTTGATCCcTTAGGTATCTTTCCAC SEQ ID NO: 316

14 TMVIH115 K43R S GTG G AAAG AT ACCT AAg G G AT C AAC AG CTC SEQ ID NO: 317

17 TMVIH115 D44R AS AGGAGCTGTTGAcgCTTTAGGTATCTTT SEQ ID NO: 318

16 TMVIH115 D44R S AAAGATACCTAAAGcgTCAACAGCTCCT SEQ ID NO: 319

26 TMVIH115 Q45R as CCCAGGAGCTGTcGATCCTTTAGGTATC SEQ ID NO: 320

27 TMVIH115 Q45R s GATACCTAAAGGATCgACAGCTCCTGGG SEQ ID NO: 321

28 TMVIH115 Q46R as CAAATCCCCAGGAGCcGTTGATCCTTTAG SEQ ID NO: 322

29 TMVIH115 Q46R s CTAAAG GATCAACg GCTCCTGGG G ATTTG SEQ ID NO: 323

30 TMVIH115 L47R as CAAATCCCCAGGcGCT GTT GATCCTTT AG SEQ ID NO: 324

31 TMVIH115 L47R s CTAAAG G AT C AAC AG Cg CCTG G G G ATTT G SEQ ID NO: 325

32 TMVIH115 L48R as CCCAAATCCCCcGGAGCTGTTG SEQ ID NO: 326

33 TMVIH115 L48R s CAACAGCTCCgGGGGATTTGGG SEQ ID NO: 327

34 TMVIH115 G49R as CCCCAAATCCgCAGGAGCTGTTG SEQ ID NO: 328

35 TMVIH115 G49R s C AAC AG CTCCTGcG G ATTT G G G G SEQ ID NO: 329

36 TMVIH115 I50R as GCAACCCCAtcTCCCCAGGAGCTG SEQ ID NO: 330

37 TMVIH115 I50R s CAGCTCCTGGGGAgaTGGGGTTGC SEQ ID NO: 331

38 TMVIH115 W51R as GCAACCCCAtcTCCCCAGGAGCTG SEQ ID NO: 332

39 TMVIH115 W51R s CAGCTCCTGGGGAgaTGGGGTTGC SEQ ID NO: 333

Construcción mutante VIH115 Y41: Para explorar la secuencia de aminoácidos necesaria para la pérdida de la inmunosupresión, se produjeron mutantes VIH115 Y41 mediante PCR usando el plásmido pDFG VIH115 WT como plantilla y los pares de cebadores 1-42 y 43-2, 1-44 y 45-2, 1-46 y 47-2, 1-48 y 49-2, 1-50 y 51-2, o 1-52 y 53-2, para introducir las mutaciones Y41K, Y41H, Y41A, Y41G, Y41F, o Y41L respectivamente. Los productos de PCR se usaron luego como plantillas en la PCR posterior usando los cebadores 1-2. Estos fragmentos de PCR se digirieron con SfiI y MluI y se insertaron en pDFG-ectoSincitina-1 (Mangeney y col., 2007) abiertos con las mismas enzimas. Todas las construcciones se secuenciaron antes de su uso.

N.° Nombre Secuencia del cebador (5'-3') SEQ ID NO 42 TMVIH115 Y41K as GTT G ATCCTTT AGtTtT CTTTCCACAGCCAG SEQ ID NO: 334

43 TMVIH115 Y41K s CTGGCTGTG G AAAG Aa AaCT AAAG G AT C AAC SEQ ID NO: 335

44 TMVIH115 Y41H as GTT G ATCCTTT AGG TgTCTTT CCACAGCCAG SEQ ID NO: 336

45 TMVIH115 Y41H s CTGGCTGTG G AAAG AcAC CT AAAG G AT C AAC SEQ ID NO: 337

46 TMVIH115 Y41A as GTT G ATCCTTT AGG gcT CTTTCCACAGCCAG SEQ ID NO: 338

47 TMVIH115 Y41A s CTGGCTGTGGAAAGAgcCCTAAAGGATCAAC SEQ ID NO: 339

48 TMVIH 115 Y41G as GTTG ATCCTTT AGGccTCTTTCCACAGCCAG SEQ ID NO: 340

49 TMVIH115 Y41G s CTGGCTGTGGAAAGAggCCTAAAGGATCAAC SEQ ID NO: 341

50 TMVIH115 Y41F as GTT G ATCCTTT AGG aAT CTTTCCACAGCCAG SEQ ID NO: 342

51 TMVIH115 Y41F s CTGGCTGTGGAAAGATtCCTAAAGGATCAAC SEQ ID NO: 343

52 TMVIH115 Y41L as GTTGATCCTTTAGGagTCTTTCCACAGCCAG SEQ ID NO: 344

53 TMVIH115 Y41L s CTGGCTGTG G AAAG ActCCT AAAG G AT C AAC SEQ ID NO: 345

Construcción de dobles mutantes VIH115 Y41: Se produjeron mutantes dobles VIH115 Y41R K72A, G o S mediante PCR usando el plásmido pDFG VIH115 Y41R como plantilla y los pares de cebadores 1-94 y 93-2, 1-96 y 95-2, o 1 98 y 97-2. Los productos de PCR se usaron luego como plantillas en la PCR posterior usando los cebadores 1-2. Estos fragmentos de PCR se digirieron con SfiI y MluI y se insertaron en pDFG-ectoSincitina-1 (Mangeney y col., 2007) abiertos con las mismas enzimas. Los dobles mutantes VIH115 R40X Y41R se produjeron mediante PCR usando el pDFG VIH115 Y41R como plantilla y los pares de cebadores 1-54 y 55-2, 1-56 y 57-2 para introducir las mutaciones R40A y R40E respectivamente. Se produjeron dobles mutantes VIH115 R40X Y41A mediante PCR usando el pDFG VIH115 Y41A como plantilla y los pares de cebadores 1-58 y 59-2, 1-60 y 61-2, 1-62 y 63-2, 1-64 y 65-2 para introducir las mutaciones R40A, R40E, R40S, R40T respectivamente. También se generaron mutantes simples VIH115 R40X usando pDFG VIH115 WT como plantilla y los pares de cebadores 1-66 y 67-2, 1-68 y 69-2, 1-70 y 71-2, 1-72 y 73-2. Los productos de PCR se usaron luego como plantillas en la PCR posterior usando los cebadores 1-2. Estos fragmentos de PCR se digirieron con SfiI y MluI y se insertaron en pDFG-ectoSincitina-1 (Mangeney y col., 2007) abiertos con la misma enzima.

(continuación)

Introducción de mutaciones VIH115 en un vector de expresión de Env del VIH: Para introducir estas mutaciones de la envoltura del VIH en el vector de expresión pTr712 de VIHenv (Schnierle y col., PNAS 1997), primero se generó una mutación silenciosa para crear un sitio de inserción de SfiI. Se generaron fragmentos de PCR usando pTr712 como plantilla y los pares de cebadores 38-39 y 40-41. Los productos de PCR se usaron luego como plantillas en la PCR posterior usando los cebadores 38-41.

El fragmento de PCR resultante se digirió luego con BsaBI y HindIII y se insertó en el plásmido pTr712 abierto con las mismas enzimas que dieron como resultado el plásmido pTr712-Sfi. Luego se generaron fragmentos de PCR de cada mutación VIH115 usando cebadores 40-41 y los plásmidos mutantes pDFG VIH115 como plantillas, digestión con SfiI y HindIII y luego inserción en el plásmido pTr712-Sfi abierto con las mismas enzimas.

Todas las construcciones fueron secuenciadas antes de su uso.

Establecimiento de células tumorales que expresan env y ensayo de rechazo tumoral MCA205: Se cotransfectaron 7,5 x 105 células 293T con el vector retrovírico pDFG que expresa env para ser analizado (1,75 |jg) y vectores de expresión para las proteínas MLV (0,55 jg para el vector env MLV anfotrópico y 1,75 jg para el vector gag y pol MLV). 36 horas después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes para la infección de células tumorales MCA205 (2,5 ml de sobrenadante por 5 x 105 células con 8 jg/m l de polibreno). Las células se mantuvieron en medio selectivo (400 unidades/ml de higromicina) durante 3 semanas, y luego se lavaron con PBS, se tripsinizaron y se inocularon por vía subcutánea en el área afeitada de cada flanco derecho del ratón como en Mangeney y col., (1998, 2007). El crecimiento del tumor se controló mediante palpación dos o tres veces por semana y se determinó el área del tumor (mm2) mediante la medición de los diámetros perpendiculares del tumor. El grado de "inmunosupresión" se cuantificó mediante un índice basado en el tamaño del tumor: (Aenv-Aninguna)/Aninguna, en el que Aenv y Aninguna son las áreas medias en el máximo de crecimiento de tumores de ratones Balb/c inyectados con células que expresan env o de control, respectivamente.

Análisis de la expresión del VIHenv: Se transfectaron células 293T con 4 mg del vector de expresión para la envoltura del VIH-1 (pTr712) de tipo silvestre o mutado en las posiciones indicadas, mediante precipitación con fosfato de calcio. Las células se lavan 16 h más tarde y luego se cosechan 2 días después de la transfección usando PBS-EDTA 5 mM. Se usó el anticuerpo monoclonal 110-H (bucle anti-V3, obsequio de Hybridolab, Instituto Pasteur) (dilución 1/200) para teñir la envoltura del VIH. Como anticuerpo secundario, los inventores usaron el anticuerpo de cabra anti IgG de ratón Alexa 488 (1/400) (Invitrogen). Para la tinción intracelular de VIHenv, las células 293T se fijaron con un tampón de formaldehído y luego se permeabilizaron (BD cytofix/cytoperm, BD Biosciences). Se usó el isotipo de ratón anti IgGlKappa (BD Biosciences) para controlar la tinción no específica. La fluorescencia se adquirió mediante citometría de flujo utilizando un FACS Calibur (BD Biosciences), y los datos se analizaron mediante el programa informático CellQuest (BD Biosciences).

Seudotipado de Env mutada y medida del títu lo vírico: Las células 293T se transfectan triplemente con 3 mg de un vector MLV informador que lleva GFP (CNCG), 1,75 mg de vector gag-pol Mo-MLV y 0,55 mg de vector phCMV que codifica la envoltura del VIH-1 ts o mutado en las posiciones indicadas. La infectividad de los viriones Mo-MLV seudotipados con Env VIH-1, cosechada 48 horas después de la transfección, se mide utilizando células U87 (CD4+, CXCR4+) como células diana. La infectividad de las envolturas se analiza después de 72 h de exposición del sobrenadante diluido filtrado de 0,45 mm en presencia de 4 mg/ml de polibreno. La fluorescencia (GFP) se adquiere mediante citometría de flujo utilizando un FACS Calibur (BD Biosciences). Los resultados se analizan mediante el programa informático CellQuest (BD Biosciences). Los títulos resultantes (número de células infectadas/ml) se calculan como sigue: (% de células GFP+ (infectadas) x número de células en placa)/volumen de sobrenadante x 1000.

Construcción de mutantes Env VIS: Se generaron fragmentos de PCR usando p239 SPE3' (el plásmido que codifica el medio virus VIS que contiene la proteína de envoltura) como una plantilla y los pares de cebadores 77-79 y 78-80, 77-81 y 78-82, 77-83 y 78-84, 77-85 y 78-86, 77-87 y 78-88, 77-89 y 78-90 para introducir las mutaciones E39R, K40R, Y41R, L42R, K43R, D44R respectivamente. Los productos de PCR se usaron luego como plantillas en la PCR posterior usando los cebadores 77-78. El fragmento de PCR resultante se digirió luego con BmgBI y NheI y se insertó en el plásmido p239 SPE3 'abierto con las mismas enzimas.

Todas las construcciones fueron secuenciadas antes de su uso.

Introducción de ectodom inio mutantes del VIS en pDFG: Para generar los plásmidos pDFG que codifican el fragmento de ectodominio 55 de envoltura del VIS, se generaron fragmentos de PCR usando p239 SPE3' TS y mutantes como una plantilla y los pares de cebadores 91-92, se digirieron con SfiI y MluI y se insertaron en pDFG abierto con las mismas enzimas.

Ejemplo comparativo: prueba del efecto in vivo de la mutación G49R, que corresponde a la mutación "G19R" en la solicitud internacional WO 2010/022.740.

El documento WO 2010/022.740 desvela una secuencia consenso de 50 aminoácidos de la proteína ENV del VIH. En esta secuencia, se sugiere que la sustitución de aminoácidos en las posiciones 10, 19, 24, 34 y 40 afecta a las propiedades inmunosupresoras de la proteína ENV del VIH.

Estas mutaciones son una transposición en lentivirus de la enseñanza del documento WO 2005/095.442 limitada a retrovirus endógenos u oncorretrovirus. Los autores del documento WO 2005/095.442 también son los autores de la presente solicitud y pronto observaron que dicha transposición no es eficaz.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición farmacéutica que comprende como sustancia activa:

a) una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora,

resultando dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de la subunidad transmembrana (TM) de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre, teniendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada al menos un 90 % de identidad con una secuencia elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 420 y SEQ ID NO: 421,

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, F, G, L o R, y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es A, F, G o R, o Xa es A, F, G, L o R, y Xb es A, F, G o R,

dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada retiene la estructura antigénica de la proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre

o

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que,

X representa cualquier aminoácido,

y

dicho fragmento retiene la estructura antigénica de la proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada de longitud completa de la que procede

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable,

dichas células tumorales se transducen para expresar dicha proteína ENV mutada o dicho fragmento (células tumorales ENV mutadas),

o dichas células tumorales se transducen para expresar dicha proteína ENV de tipo silvestre o un fragmento de la misma (células tumorales ENV de tipo silvestre),

o dichas células tumorales no se transducen (células tumorales normales),

siguiendo la relación:

índice de inmunosupresión de dicha proteína ENV mutada o de dicho fragmento (ienv mutada)/índice de inmunosupresión de la proteína ENV de tipo silvestre (ienv de tipo silvestre) inferior a 0,5,

siendo ienv mutada definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV mutadas - área máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las células tumorales normales), y siendo ienv de tipo silvestre definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV de tipo silvestre -área máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las células tumorales normales).

2. Composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende como sustancia activa:

resultando dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de la subunidad transmembrana (TM) de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre, comprendiendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos: A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, F, G, L o R, y Xb es L, I, V, M o P, o

Xa es Y, I, H, C o T, y Xb es A, F, G o R, o

Xa es A, F, G, L o R, y Xb es A, F, G o R,

o

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, F, G, L o R, y Xb es L, I, V, M o P, o

Xa es Y, I, H, C o T, y Xb es A, F, G o R, o

Xa es A, F, G, L o R, y Xb es A, F, G o R,

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. Composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende como sustancia activa:

resultando dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de la subunidad transmembrana (TM) de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre,

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, G, o R, y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y,

o

Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es F, G o R,

o

Xa es F o L, y Xb es F, G o R,

o

Xa es A, G o R, y Xb es A,

o

Xa es A, G, o R, y Xb es F, G o R,

o

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, G, o R, y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y,

o

Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es F, G o R,

o

Xa es F o L, y Xb es F, G o R,

o

Xa es A, G o R, y Xb es A,

o

Xa es A, G, o R, y Xb es F, G, R,

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 1 a 3, que comprende como sustancia activa

resultando dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada de la mutación de la subunidad transmembrana (TM) de una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre, comprendiendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, G, o R, y Xb es L, I, V, M o P,

o

Xa es Y, I, H, C o T, y Xb es F, G o R,

o

comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, G, o R, y Xb es L, I, V, M o P,

o

Xa es Y, I, H, C o T, y Xb es F, G o R,

en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, en la que

Xa es R, y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o

Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es R, o

Xa es R, y Xb es R, en particular en la que dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada o dicho fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos

A-I-E-K-Xa-Xb-X-DQ (SEQ ID NO: 422),

A-I-E-R-Xa-Xb-X-DQ (SEQ ID NO: 423),

A-V-E-K-Xa-Xb-X-DQ (SEQ ID NO: 424),

A-V-E-R-Xa-Xb-X-DQ (SEQ ID NO: 425).

6. Composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada o dicho fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada comprende una de las secuencias de aminoácidos:

SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 71,

SEQ ID NO: 9 a 12,

SEQ ID NO: 14 a 41,

SEQ ID NO: 43 a 70, y

SEQ ID NO: 72 a 95,

en particular, en la que dicho fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada comprende una de las secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 96 a 211, más particularmente, en la que dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada consiste en una de las secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 212 a 269.

7. Composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha proteína mutada comprende una mutación adicional en uno de al menos los aminoácidos en las posiciones 29, 36 y 37 de la SEQ ID NO: 426:

A[I/V]E[K/R]XaXbX1DQX2X3LX4X5WGC[A/S][F/G]X6X7CVX8TXgVPXcX1üZ1Z2Z3Z4Z5XdXe[S/T] (SEQ ID NO: 426) en la que

Xa y Xb son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

X1 a X10 representan cualquier aminoácido,

Z1 a Z5 no representan aminoácido o cualquier aminoácido, independientemente uno del otro de manera que

◦ Xc es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, preferentemente A, D, o N,

◦ Xd es A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, Y o W, preferentemente A, G, S o Y,

◦ Xe es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, Y o W, preferentemente A, D o N,

en particular, en la que dicha proteína mutada consiste en una de las secuencias de aminoácidos del grupo que consiste en SEQ ID No : 271 a 283.

8. Composición farmacéutica que comprende como sustancia activa una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,

en la que dicha molécula de ácido nucleico está contenida en un vector, comprendiendo dicho vector medios que permiten la expresión de la proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 8, eligiéndose dicho vector entre un vector de sarampión, un vector de viruela del canario, un vector de viruela, una viruela aviar, un vector adenovírico, un vector lentivírico, un virus Sendai, un vector de citomegalovirus o un vector de Vaccinia Ankara modificado.

10. Composición farmacéutica, de acuerdo con las reivindicaciones 8 o 9, que comprende al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína GAG y/o una proteína PRO y/o una proteína POL y/o una proteína NEF mutada, en la que

dicha proteína NEF mutada está sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras,

de un lentivirus humano o de simio, siendo preferentemente dicho lentivirus del mismo origen que la proteína ENV lentivírica mutada.

11. Composición farmacéutica, de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicha molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, está contenida en el mismo vector que el que también contiene dicha al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína GAG y/o una proteína PRO y/o una proteína POL y/o una proteína NEF mutada, en la que dicha proteína NEF mutada está sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras,

o en la que dicha molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada, está contenida en el mismo vector que el que también contiene todas las dichas al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína GAG y/o una proteína PRO y/o una proteína POL y/o una proteína NEF mutada, en la que dicha proteína NEF mutada está sustancialmente desprovista de propiedades inmunosupresoras,

siendo dicho vector un vector de sarampión o un vector de viruela del canario.

12. Composición farmacéutica, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso para la prevención o el tratamiento de una infección lentivírica, preferentemente infección por VIH-1, infección por VIH-2 o infección por VIS,

en particular, para su uso como vacuna, en particular, contra infección por VIH-1, infección por VIH-2 o infección por VIS.

13. Un procedimiento para obtener la sustancia activa de una composición farmacéutica, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que consiste en modificar la propiedad inmunosupresora de:

una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre,

o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre, comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

presentando dicha proteína ENV o fragmento de la misma una subunidad transmembrana (TM) que comprende un dominio inmunosupresor (ISU) que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-X'a-X'b-X-D-Q (SEQ ID NO: 427),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

X'a es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y

X'b es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y,

comprendiendo dicho procedimiento una etapa de introducción de al menos una mutación de X'a y/o X'b, para obtener:

una proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora,

teniendo dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada al menos un 90% de identidad, con una secuencia elegida del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 420 y SEQ ID NO: 421, o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos, comprendiendo dicha proteína ENV mutada y fragmento de la misma un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

dichas células tumorales se transducen para expresar dicha proteína e Nv mutada o dicho fragmento (células tumorales ENV mutadas),

o dichas células tumorales no se transducen (células tumorales normales),

siguiendo la relación:

siendo ienv mutada definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV mutadas - área máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las células tumorales normales), y

siendo ienv de tipo silvestre definido por: (área máxima alcanzada por las células tumorales ENV de tipo silvestre - área máxima alcanzada por las células tumorales normales)/(área máxima alcanzada por las células tumorales normales).

14. Un procedimiento para obtener la sustancia activa de una composición farmacéutica, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, de acuerdo con la reivindicación 13, que consiste en modificar la propiedad inmunosupresora de:

una proteína ENV lentivírica humana o de simio de tipo silvestre,

A-[I/V]-E-[K/R]-Y-L-X-D-Q (SEQ ID NO: 1),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos, comprendiendo dicha proteína ENV mutada y fragmento de la misma un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, F, G, L o R, y Xb es C, D, E, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, o Xa es C, D, E, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, V, W o Y, y Xb es A, F, G o R, o Xa es A, F, G, L o R, y Xb es A, F, G o R.

15. Un procedimiento para obtener la sustancia activa de una composición farmacéutica, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, de acuerdo con la reivindicación 13 o 14,

en el que dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora,

o un fragmento de dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora, comprendiendo dicho fragmento al menos 40 aminoácidos,

comprendiendo dicha proteína ENV mutada y fragmento de la misma un dominio inmunosupresor (ISU) mutado que contiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

A-[I/V]-E-[K/R]-Xa-Xb-X-D-Q (SEQ ID NO: 416),

en la que

X representa cualquier aminoácido,

y

Xa es A, G, o R, y Xb es L, I, V, M o P, o

Xa es Y, I, H, C o T, y Xb es F, G o R, o

Xa es F o L, y Xb es F, G o R, o

Xa es A, G o R, y Xb es A, o

Xa es A, G, o R, y Xb es F, G o R.

16. Un procedimiento para obtener la sustancia activa de una composición farmacéutica, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicha proteína ENV lentivírica humana o de simio mutada aislada que no tiene sustancialmente actividad inmunosupresora,

comprendiendo dicha proteína ENV mutada y fragmento de la misma una mutación adicional en al menos uno de los aminoácidos en las posiciones, 29, 36 y 37 de la SEQ ID NO: 426:

A[I/V]E[K/R]XaXbX1DQX2X3LX4X5WGC[A/S][F/G]X6X7CVX8TXgVPXcX10Z1Z2 ZaZ4Z5XdXe[S/T] (SEQ ID NO: 426) en la que

Xa y Xb son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14,

X1 a X10 representan cualquier aminoácido,

Z1 a Z5 no representan aminoácido o cualquier aminoácido, independientemente unos de los otros

tal que

en particular, en el que dicho fragmento de dicha proteína mutada consiste en una de las secuencias de aminoácidos del grupo que consiste en SEQ ID NO: 271 a 283.