DE69629460T2

DE69629460T2 - Biologisches verfahren zur herstellung von verbindungen auf der basis der dipeptiden

Info

Publication number: DE69629460T2
Application number: DE69629460T
Authority: DE
Inventors: Scott W. Borneman; Anil Goyal; J. Michael CONDER; A. Victor VINCI
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1995-04-11
Filing date: 1996-04-08
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2016-04-09
Also published as: WO1996032468A2; CZ321497A3; EP0820465B1; AU5445596A; EA000736B1; AR001594A1; EA199700310A1; WO1996032468A3; US6204008B1; CN1193998A; DE69629460D1; ATE247129T1; SK138197A3; EP0820465A2; BR9608278A; ES2203690T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die großmaßstäbliche Produktion von Verbindungen, welche mindestens teilweise auf einem Dipeptid-Zwischenprodukt basieren, erfordert die unschwere Verfügbarkeit großer Mengen des Dipeptid-Zwischenprodukts zu niedrigen Kosten. Dipeptide von praktisch allen Aminosäuren können für diesen Zweck synthetisch hergestellt werden, jedoch kann die Synthese des Dipeptids zeitraubend und kostenaufwendig sein, was die Effizienz der Produktherstellung verringert und die Produktionskosten erhöht. Diese Nachteile sind insbesondere von Bedeutung für die Produktion der auf dem Dipeptid-Zwischenprodukt basierenden Verbindungen in sehr großem Maßstab.
GB-A-2068971 (G. D. Searle & Co.) offenbart die Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren zur Herstellung eines Asp-Phe-Repeat-Polypeptids (Asp-Phe)n.
EP-A-0036258 (Cetus Corporation) offenbart die Expression, in einer rekombinanten Wirtszelle, einer rekombinanten DNA, die für mehrere Repeats von Asp-Phe kodiert, die Fragmentation des Polypeptids in das Dipeptid-Zwischenprodukt Benzyl-Asp-Phe und Modifizierung des Dipeptid-Zwischenprodukts zur Herstellung von Aspartam-Dipeptid.
EP-A-0591524 (M & D Research Co., Ltd.) lehrt ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen eines gewinnbaren Proteins, welches ein Fusionsprotein, umfassend ein Trägerprotein, eine Dipeptid-Spaltstelle und den offenen Leserahmen des gewinnbaren Proteins von Interesse, beinhaltet. So wird ein Fusionsprotein offenbart, das eine Trägerproteinsequenz, auf jeder Seite von mehreren Repeats der Dipeptid-Spaltstelle und dem gewinnbaren Protein von Interesse flankiert, aufweist. Das Protein von Interesse wird durch enzymatische Hydrolyse an irgendeiner der Dipeptid-Bindungen freigesetzt.
Zusammenfassung der Offenbarung
Es wird ein Verfahren zur Herstellung von Dipeptid-Zwischenproduktverbindungen offenbart. Diese Dipeptid-Zwischenproduktverbindungen werden durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt und von einer synthetischen DNA-Sequenz oder von einer natürlich vorkommenden DNA-Sequenz hergestellt, welche beide für ein Protein oder Peptid mit einer spezifischen, sich wiederholenden Dipeptid-Sequenz kodieren. Die Dipeptid-Zwischenprodukte werden enzymatisch von dem größeren Protein oder Peptid freigesetzt und weiter prozessiert, um die Endverbindung zu ergeben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dipeptid-Zwischenproduktverbindungen. Diese Zwischenproduktverbindungen können weiter prozessiert werden, um die Endverbindung zu ergeben. Die Dipeptid-Zwischenprodukte werden in rekombinanten Wirtszellen durch die Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches für mindestens ein Dipeptid-Zwischenprodukt kodiert, hergestellt. Das rekombinante DNA-Molekül kann entweder ein synthetisches DNA-Molekül oder eine natürlich vorkommende DNA-Sequenz sein. Die für das Dipeptid kodierende DNA wird in einen Expressionsvektor zur Expression in einer rekombinanten Wirtszelle kloniert. Nach der Expression in dem rekombinanten Wirt wird das Dipeptid für die weitere Prozessierung gereinigt. Es kann erforderlich sein, das Dipeptid von einem größeren Polypeptid abzutrennen, bevor es gereinigt werden kann. Ein größeres Polypeptid, enthaltend das Dipeptid-Zwischenprodukt, kann mehrere Repeats der Dipeptid-Sequenz umfassen oder das Dipeptid kann in einer oder mehreren Kopie(n) als Teil eines größeren Proteins vorliegen, das Aminosäuresequenzen erhält, welche nicht die Dipeptid-Sequenz sind. Die Repeats der Dipeptid-Sequenz können durch enzymatische oder chemische Spaltung in individuelle Dipeptide aufgetrennt werden. Die individuellen Dipeptide können dann für die weitere Prozessierung gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines Dipeptids, das aus Ala-Pro und Lys-Pro ausgewählt ist, bereit, welches umfaßt:

(a) Transfektion eines DNA-Expressionsvektors in geeignete Wirtszellen, wobei der DNA-Expressionsvektor ein DNA-Molekül umfaßt, das für ein Oligopeptid oder Polypeptid kodiert, welches mehrere direkte Repeats des Dipeptids enthält,
(b) Kultivierung der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen zur Expression des Oligopeptids oder Polypeptids von dem DNA-Expressionsvektor,
(c) Spaltung des exprimierten Oligopeptids oder Polypeptids mit einem Enzym, um so das Dipeptid freizusetzen, und
(d) Isolierung und Reinigung des Dipeptids.

Die rekombinanten Wirtszellen, welche zur Herstellung des Dipeptids eingesetzt werden, können jede Wirtszelle sein, die zur Expression von rekombinanten DNA-Molekülen in der Lage ist. Für Fachleute auf dem Gebiet ist unschwer ersichtlich, daß praktisch jeder rekombinante Wirt zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Die bevorzugten Wirtszellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Bakterien und Pilzzellen, einschließlich Hefe. Bakterien- und Pilz-Wirtszellen, welche zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind und im Handel erhältlich sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Escherichia coli, Aspergillus niger, Streptomyces lividans und Bacillus subtilis.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist auch unschwer ersichtlich, daß der Expressionsvektor zur Expression der für das Dipeptid kodierenden DNA praktisch jeder Expressionsvektor sein kann, der sich für den Einsatz in der gewählten Wirtszelle eignet. Die bevorzugten Vektoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die sich für die Verwendung in Bakterien und Pilzzellen, einschließlich Hefe, eignen. Bakterien- und Pilz-Expressionsvektoren, welche sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen und im Handel erhältlich sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, die hier aufgelisteten.
Die Abtrennung des Dipeptids von den verbleibenden Nicht-Dipeptid-Sequenzen oder die Abtrennung individueller Dipeptide von Dipeptid-Repeats erfolgt enzymatisch unter Verwendung eines Enzyms, welches das Polypeptid in der geeigneten Position spaltet ohne das Dipeptid-Zwischenprodukt zu zerstören. Enzyme, die für die Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können diejenigen sein, welche im Handel erhältlich sind, oder diejenigen, welche von einem Organismus produziert werden, der die geeignete enyzmatische Aktivität besitzt. Die Auswahl eines geeigneten Enzyms wird von der speziellen exprimierten Dipeptid-Sequenz abhängen.
Das Dipeptid kann entweder vor oder nach der Abtrennung von dem Rest des Polypeptids oder von Repeats des Dipeptids gereinigt werden. Standard-Chromatographietechniken sind geeignet zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, um die individuellen Dipeptide oder das dipeptid-enthaltende Polypeptid zu reinigen. Solche Standard-Chromatographietechniken schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlußchromatographie, Hydroxylapatit-Adsorptionschromatographie und hydrophobe Wechselwirkungschromatographie.
Die klonierte DNA, welche mit dem hier beschriebenen Verfahren erhalten wurde, kann durch molekulare Klonierung in einen Expressionsvektor, der einen geeigneten Promotor und andere geeignete regulatorische Transkriptionselemente enthält, rekombinant exprimiert und in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen zur Produktion des rekombinanten Peptids überführt werden. Techniken für solche Manipulationen sind im Stand der Technik wohlbekannt.
Expressionsvektoren sind hier definiert als DNA-Sequenzen, welche für die Transkription klonierter Kopien von Genen und die Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können zur Expression eukaryotischer Gene in einer Vielfalt von Wirten, wie z. B. Bakterien, blaugrünen Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen und tierischen Zellen, eingesetzt werden.
Speziell konstruierte Vektoren erlauben das Shuttling von DNA zwischen Wirten wie Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen oder Bakterien-Pilzzellen oder Bakterien-Invertebratenzellen. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte einen Replikationsursprung für autonome Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine begrenzte Anzahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl und aktive Promotoren enthalten. Ein Promotor ist definiert als eine DNA-Sequenz, welche RNA-Polymerase zur Bindung an DNA und zur Initiierung von RNA-Synthese veranlaßt. Ein starker Promotor ist einer, welcher die Initiierung von mRNAs mit hoher Frequenz veranlaßt. Expressionsvektoren können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, speziell konstruierte Plasmide oder Viren.
Eine Vielfalt von Säuger-Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem Peptid in Säugerzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Säuger-Expressionsvektoren, welche für die Expression von rekombinantem Peptid geeignet sein mögen, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, pcDNA3 (Invitrogen), pMCIneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), und λZD35 (ATCC 37565).
Eine Vielfalt von bakteriellen Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem Peptid in Bakterienzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche bakterielle Expressionsvektoren, welche für die Expression von rekombinantem Peptid geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pET11 a (Novagen), Lambda gt11 (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).
Eine Vielfalt von Pilzzell-Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem Peptid in Pilzzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Pilzzell-Expressionsvektoren, welche für die Expression von rekombinantem Peptid geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pYES2 (Invitrogen), Pichia-Expressionsvektor (Invitrogen).
Eine Vielzahl von Insektenzell-Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem Peptid in Insektenzellen eingesetzt werden. Im Handel erhältliche Insektenzell-Expressionsvektoren, welche für die Expression von rekombinantem Peptid geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pBlue Bac III (Invitrogen).
Ein Expressionsvektor, enthaltend DNA, die für das Dipeptid-Zwischenprodukt kodiert, kann zur Expression von Peptid in einer rekombinanten Wirtszelle eingesetzt werden. Rekombinante Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterien wie E. coli, Pilzzellen wie Hefe, Säugerzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Zellinien, die von Menschen, Rindern, Schweinen, Affen und Nagern stammen, und Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Zellinien, die von Drosophila und der Seidenraupe stammen. Zellinien, die von Säuger-Spezies stammen, welche geeignet sein mögen und im Handel erhältlich sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, L-M(TK-)-L-Zellen, (ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-KI (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171).
Der Expressionsvektor kann mittels irgendeiner aus einer Reihe von Techniken, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Transformation, Transfektion, Lipofektion, Protoplastenfusion und Elektroporation, in Wirtszellen eingeführt werden. Die Zellen, welche Expressionsvektor enthalten, werden klonal vermehrt und individuell analysiert, um festzustellen, ob sie Protein produzieren. Die Identifizierung von Peptid-exprimierenden Wirtszellklonen kann auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, immunologische(n) Reaktivität mit Anti-Peptid-Antikörpern und Anwesenheit von wirtszellassoziierter B₁-Aktivität, wie z. B. peptidspezifische Ligandenbindung oder Signal-Trans duktion, definiert als eine Reaktion, welche durch die Wechselwirkung von B₁-spezifischen Liganden an dem Rezeptor vermittelt wird.
Die Expression von DNA kann auch unter Verwendung in vitro hergestellter synthetischer mRNA oder nativer mRNA durchgeführt werden. Synthetische mRNA oder aus peptidproduzierenden Zellen isolierte mRNA kann effizient in verschiedenen zellfreien Systemen translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Weizenkeimextrakte und Retikulozytenextrakte, sowie effizient in Systemen auf Zellbasis translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Mikroinjektion in Frosch-Oozyten, wobei die Mikroinjektion in Frosch-Oozyten bevorzugt ist.
Zur Feststellung der DNA-Sequenz(en), welche optimale Proteinniveaus ergibt/ergeben, können DNA-Moleküle konstruiert werden, welche das folgende einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind: den vollständigen offenen Leserahmen der DNA und mehrere Konstrukte, die Teile der für das Protein kodierenden DNA enthalten.
Die Niveaus der Proteinexpression kann nach der Einführung dieser Konstrukte, sowohl einzeln als auch in Kombination, in geeignete Wirtszellen festgestellt werden. Nach der Bestimmung der DNA-Kassette, welche eine optimale Expression ergibt, beispielsweise in transienten Assays, wird dieses DNA-Konstrukt in eine Vielfalt von Expressionsvektoren zur Expression in Wirtszellen, die Säugerzellen, Insektenzellen, E. coli und Hefezellen, wie z. B. S. cerevisiae, einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, überführt.
Wirtszell-Transfektanten und Oozyten, die eine Mikroinjektion erhalten haben, können hinsichtlich des Proteinniveaus nach dem folgenden Verfahren einem Assay unterworfen werden. Nach einer geeigneten Zeitspanne, um die Expression zu erlauben, wird das Peptidniveau gemessen. Ein Verfahren zum Nachweis des Peptids beinhaltet die direkte Messung des Peptidniveaus in ganzen Zellen oder zellulären Lysaten, die aus Wirtszellen, die mit DNA transfiziert wurden, hergestellt wurden.
Das Dipeptid Alanyl-Prolin, Ala-Pro, ist ein Ausgangsmaterial für die Synthese des ACE-Inhibitors Enalapril. Das Dipeptid Lys-Pro ist ein Ausgangsmaterial für die Synthese des ACE-Inhibitors Lysinopril. Das im Handel erhältliche Dipeptid wird gegenwärtig chemisch synthetisiert. Ein neues biologisches Verfahren wurde entwickelt, welches erfolgreich der Notwendigkeit für chemische Schritte zur Herstellung von Ala-Pro oder Lys-Pro enthebt.
Das Verfahren verwendet einen rekombinanten Wirt zur Überexpression eines Peptids, das Repeats des Dipeptids Ala-Pro- oder Lys-Pro enthält, welches dann mit Hilfe bakterieller Prolylpeptidasen in seine Bestandteile von Ala-Pro- oder Lys-Pro-Einheiten hydrolysiert wird. Escherichia coli wurde aufgrund der Verfügbarkeit von Expressionsvektoren als Wirt gewählt. Ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid, welches für Repeats von Ala-Pro und geeignete Stellen für die Ligierung kodiert, wurde in den im Handel erhältlichen Expressionsvektor pMAL kloniert. Eine Fermentation der rekombinanten E. coli, enthaltend das Konstrukt, ergab das gewünschte Fusionsprodukt, wie durch Proteingele bestimmt. Es wurde dann eine enzymatische Prozessierung eingesetzt, um Ala-Pro-Einheiten freizusetzen. Im Handel erhältlicher Faktor X wurde eingesetzt, um das (Ala-Pro)_n_₂₀-Peptid freizusetzen, obwohl die Prolylpeptidasen ebenso eingesetzt werden könnten. Ein vorheriges Screening hinsichtlich Prolylpeptidasen führte zur Identifizierung von Lactobacillus helveticus- und Xanthomonas maltophilia-Stämmen mit Aktivität gegenüber Ala-Pro-pNA und synthetischen (Ala-Pro)_n-Substraten. Rohextrakte einer jeder Kultur wurden befunden, erfolgreich (Ala-Pro)_n–20 zu Ala-Pro zu prozessieren, wie durch HPLC-Analyse festgestellt. Ein synergistischer Effekt wurde beobachtet, wenn Extrakte aus beiden Kulturen kombiniert wurden. Es wurde angenommen, daß die L. helveticus-Prolylpeptidase-Aktivität im Gegensatz zu der von X. maltophilia gezeigten Endopeptidase-Aktivität auf eine Exopeptidase-Aktivität zurückzuführen ist. Das beschriebene biologische Verfahren hat den Vorteil, toxische Materialien zu vermeiden, die bei der chemischen Synthese eingesetzt werden, und ist für andere Peptide adaptierbar.
Nach der Expression des Dipeptid-Zwischenprodukts in einer rekombinanten Wirtszelle kann rekombinantes Protein gewonnen werden, um das Dipeptid-Zwischenprodukt in gereinigter Form bereitzustellen. Mehrere Reinigungsverfahren stehen zur Verfügung und sind für den Einsatz geeignet. Wie hier beschrieben, können rekombinante Dipeptid-Zwischenprodukte aus Zellysaten und -extrakten gereinigt werden durch unterschiedliche Kombinationen oder individuelle Anwendung von Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlußchromatographie, Hydroxylapatit-Adsorptionschromatographie und hydrophobe Wechselwirkungschromatographie.
Nach der Reinigung des Dipeptid-Zwischenprodukts durch eine oder mehrere der hier beschriebenen Techniken und diejenigen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Peptidreinigung bekannt sind, werden die Dipeptid-Zwischenprodukte weiter zu dem Endprodukt prozessiert. Im Falle des Dipeptid-Zwischenprodukts Ala-Pro wird eine weitere Prozes sierung zu dem Endprodukt, welches als Enalapril bekannt ist, und verwandten Verbindungen wie in US-Patent Nr. 4,374,829 und US-Patent Nr. 4,555,502 beschrieben durchgeführt. Im Falle des Dipeptid-Zwischenprodukts Lys-Pro wird die weitere Prozessierung zu dem Endprodukt, das als Lisinopril bekannt ist, und verwandten Verbindungen wie in US-Patent Nr. 4,374,829 und US-Patent Nr. 4,555,502 beschrieben durchgeführt.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, ohne dieselbe jedoch darauf zu beschränken.
BEISPIEL 1
Konstruktion eines Vektors für die Dipeptid-Expression
Zur Konstruktion eines Vektors, der eine DNA-Sequenz von Dipeptid-Repeats exprimiert, kann ein Plasmid gewählt werden. Der Vektor der Wahl wird einen Replikationsursprung für den fraglichen Wirt aufweisen; alternativ kann der Vektor Ursprünge für die Expression in mehr als einer Gattung enthalten, um ihm die Wirkung als Shuttle-Vektor zu ermöglichen. Antibiotikaresistenzgene und/oder auxotrophe Marken sind auf dem Plasmid erforderlich, um zu verifizieren, daß die Transformation oder der Eintritt des Vektors in die Zelle erfolgt ist, und um die Vektorstabilität durch Selektionsdruck aufrechtzuerhalten. Ein starker Promotor, wie z. B. der tac-Promoter, der induzierbar ist, wird eine maximale Expression des/der stromabwärts gelegenen Gens/e erlauben. Eine Konsensus-Ribosomen-Bindungsstelle wird eingeschlossen sein und wird spezifisch von dem bevorzugten Wirt erkannt. Stromabwärts gelegene Transkriptionsterminationssequenzen und Stopcodons können eingeschlossen sein, um die richtige Länge des rekombinanten Peptids sicherzustellen.
Alternativ kann ein Fusionsprotein in dem Expressionsvektor kodiert werden. Der Vektor von Interesse wird für ein verkürztes Peptid kodieren, welches im allgemeinen in dem bevorzugten Wirt von seinem nativen Promotor oder in einem anderen starken Promotor stark exprimiert wird. Klonierungsstellen für das Gen oder Oligonukleotid, kodierend für ein Dipeptid-Zwischenprodukt, wie z. B. ein Ala-Pro- oder Lys-Pro-Repeat, können durch Synthesetechniken konstruiert werden oder auf Grundlage der 5'- oder 3'-DNA-Sequenzen der Repeats vorhanden sein. Das resultierende DNA-Konstrukt ergibt bei Expression ein Protein, welches das verkürzte Enzym oder Bindungsprotein, wie z. B. das Maltosebindungsprotein aus E. coli, fusioniert mit der Dipeptid-Zwischenprodukt-Sequenz enthält. Die Trennung kann unschwer mit Hilfe des Fusionspartners erreicht werden und eine anschließende Prozessierung wird das 5'-Peptid entfernen. Bei einigen Wirten können Signal- oder Leader-Peptide zur Ermöglichung des richtigen extrazellulären Transports eingesetzt werden, um das gewünschte Produkt zu sekretieren.
Die Codonbevorzugungen im Wirtsorganismus können manipuliert werden, um die Expression zu erhöhen. Die Codonverwendung wird im allgemeinen in der Wirtszelle eine solche Bevorzugung aufweisen, daß ein oder mehrere Codons) überwiegend bei der Expression spezifischer Gene verwendet werden. Stark exprimierte Gene, die höhere Niveaus an Proteinen oder Peptiden ergeben, werden typischerweise von Codons kodiert, welche bevorzugt sind oder häufiger als andere verwendet werden. In E. coli sind zwei Codons für Lysin verfügbar, AAA und AAG; vier Codons sind für Prolin möglich, CCA, CCC,. CCG und CCU. Die Codon-Sequenz CCG ist ein häufiger verwendetes Codon und somit würden Pro-Reste in dem synthetischen Lys-Pro-Oligonukleotid als CCG konstruiert werden. Lys wird von nur zwei Codons ohne klare Präferenz kodiert und somit würden bei der Konstruktion des Oligonukleotids, welches das Lys-Pro-Repeat wird, das als ein Lys-Pro-Polypeptid exprimiert wird, AAA und AAG beide gewählt werden. Für ein Ala-Pro-Oligonukleotid sind GCT und GCA bevorzugte Codon-Sequenzen für Ala-Reste und würden somit für eine maximale Expression in E. coli gewählt werden.
BEISPIEL 2
Klonierung der DNA in E. coli-Expressionsvektoren
Rekombinantes Peptid wird in E. coli nach der Überführung der Peptid-Expressionskassette in E. coli-Expressionsvektoren, welche die pET-Reihe (Novagen) einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, produziert. Die pET-Vektoren stellen die Peptidexpression unter die Kontrolle des streng regulierten Bakteriophagen T7-Promoters. Nach dem Transfer dieses Konstrukts in einen E. coli-Wirt, welcher eine chromosomale Kopie des T7 RNA-Polymerase-Gens, gesteuert von dem induzierbaren lac-Promotor, enthält, wird die Expression des Peptids induziert, wenn ein geeignetes lac-Substrat (IPTG) der Kultur zugegeben wird. Die Niveaus an exprimiertem Peptid werden mit den hier beschriebenen Assays bestimmt.
Die cDNA, welche für den vollständigen offenen Leserahmen für das Peptid kodiert, wird in die NdeI-Stelle von pET 11a inseriert. Konstrukte in der positiven Orientierung werden durch Sequenzanalyse identifiziert und zur Transformation des Expressionswirtsstammes BL21 verwendet. Transformanten werden dann zur Animpfung von Kulturen für die Proteinpro duktion eingesetzt. Die Kulturen können in M9- oder ZB-Medien gezüchtet werden, deren Formulierung Fachleuten bekannt ist. Nach Wachstum auf eine OD₆₀₀ = 1,5 wird die Expression des Peptids mit 1 mM IPTG für 3 Stunden bei 37°C induziert.
BEISPIEL 3
Klonierung von DNA in Vektoren zur Expression in Insektenzellen
Baculovirus-Vektoren, welche sich von dem Genom des AcNPV-Virus ableiten, sind ausgelegt, um ein hohes Expressionsniveau von cDNA in der Sf9-Linie von Insektenzellen (ATCC CRL# 1711) zu ergeben. Rekombinante Baculoviren, die für Dipeptid-Zwischenprodukt kodierende DNA exprimieren, werden nach den folgenden Standardverfahren hergestellt (InVitrogen Maxbac Manual): die DNA-Konstrukte werden in einer Vielfalt von Baculovirus-Transfervektoren, einschließlich des pAC360- und des BlueBac-Vektors (InVitrogen), in das Polyhedringen ligiert. Rekombinante Baculoviren werden erzeugt durch homologe Rekombination nach Co-Transfektion des Baculovirus-Transfervektors und von linearisierter genomischer AcNPV-DNA [Kitts, P. A., Nuc. Acid. Res. 18, 5667 (1990)] in Sf9-Zellen. Rekombinante pAC360-Viren werden durch das Fehlen von Einschlußkörpern in infizierten Zellen identifiziert und rekombinante pBlueBac-Viren werden auf Basis der β-Galactosidase-Expression identifiziert (Summers, M. D., und Smith, G. E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin No. 1555). Nach einer Plaque-Reinigung wird die Peptidexpression mit den hier beschriebenen Assays gemessen.
Die cDNA, welche für den vollständigen offenen Leserahmen für das Peptid kodiert, wird in die BamHI-Stelle des pBlueBacll inseriert. Konstrukte in der positiven Orientierung werden durch Sequenzanalyse identifiziert und zur Transfektion von Sf9-Zellen in Anwesenheit von linearer AcNPV-Wildtyp-DNA eingesetzt.
Authentisches Peptid wird in Verbindung mit den infizierten Zellen gefunden. Peptid wird aus infizierten Zellen durch hypotonische oder Detergens-Lyse extrahiert.
Alternativ wird das Peptid in der Schneider 2-Drosophila-Zellinie exprimiert durch Co-Transfektion der Schneider 2-Zellen mit einem Vektor, welcher die Peptid-DNA stromabwärts und unter der Kontrolle eines induzierbaren Metallothionin-Promotors enthält, und einem Vektor, der für das G418-Resistenz-Neomycingen kodiert. Nach Wachstum in Gegenwart von G418 werden resistente Zellen erhalten und zur Expression des Peptids durch die Zugabe von CuSO₄ induziert.
BEISPIEL 4
Klonierung von DNA in einen Hefe-Expressionsvektor
Rekombinantes Peptid wird in der Hefe S. cerevisiae nach der Insertion des optimalen DNA-Cistrons in Expressionsvektoren, welche für die Steuerung der intrazellulären oder extrazellulären Expression heterologer Proteine ausgelegt sind, produziert. Im Falle von intrazellulärer Expression werden Vektoren wie EmBLyex4 oder dgl. mit dem Cistron ligiert [Rings, U., et al., Biotechnology 8, 543–545 (1900); Horowitz, B., et al., Biol. Chem. 265, 4189–4192 (1989)]. Für die extrazelluläre Expression wird das Cistron in Hefe-Expressionsvektoren ligiert, welche ein Sekretionssignal fusionieren. Die Niveaus an exprimiertem Peptid werden mit den hier beschriebenen Assays bestimmt.
BEISPIEL 5
Reinigung von rekombinantem Peptid
Rekombinant produziertes Peptid kann durch Antikörper-Affinitätschromatographie gereinigt werden.
Peptid-Antikörper-Affinitätssäulen werden hergestellt durch Zugabe der Anti-Peptid-Antikörper zu Affigel-10 (Biorad), einem Gelträger, welcher mit N-Hydroxysuccinimidestern voraktiviert ist, so daß die Antikörper kovalente Verknüpfungen mit dem Agarosegelperlenträger bilden. Die Antikörper werden dann an das Gel über Amidbindungen mit dem Spacerarm gekoppelt. Die verbleibenden aktivierten Ester werden dann mit 1 M Ethanolamin-HCl (pH 8) gequencht. Die Säule wird mit Wasser, gefolgt von 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6), gewaschen, um jeglichen nicht-konjugierten Antikörper oder Fremdprotein zu entfernen. Die Säule wird dann in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,3) zusammen mit geeigneten membran-solubilisierenden Mitteln wie Detergentien äquilibriert und die Zellkulturüberstände oder Zellextrakte, die solubilisiertes Peptid enthalten, werden langsam durch die Säule geleitet. Die Säule wird dann mit phosphatgepufferter Salzlösung mit Detergentien gewaschen, bis die optische Dichte (A₂₈₀) auf den Hintergrund abfällt, dann wird das Protein mit 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6) mit Detergentien eluiert. Das gereinigte Protein wird dann gegen phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert.
BEISPIEL 6
Rekombinante Herstellungen von Ala-Pro-Dipeptid
Ala-Pro-Expression. Die Strategie zur Herstellung eines Ala-Pro-Polypeptids in E. coli beinhaltete die Klonierung einer Sequenz, die für Repeats von Ala-Pro kodiert. Eine Reihe kommerziell erhältlicher Systeme steht zur Verfügung. Zur Minimierung der Entwicklungszeit wurde ein im Handel erhältliches Expressionssystem, p-MAL, von New England Biolabs bezogen. Das System macht Gebrauch von einem Vektor, der ein Gen für das Maltose-Bindungsprotein neben einer Polylinkerstelle enthält, in die eine DNA-Sequenz von Interesse, wie z. B. ein Ala-Pro-Repeat-Codon, kloniert werden kann. Nach der Induktion eines Klons, der den obigen Vektor enthält, würde ein Fusionsprotein Maltose-(Ala-Pro)_n exprimiert werden, die Maltosebindungsdomäne zur Bindung an eine Maltosesäule genutzt werden und die Maltosedomäne nach Isolierung durch Faktor X abgespalten werden.
Dazu wurden zwei komplementäre Oligonukleotide konstruiert (87-mer und 91-mer), um für 14 Ala-Pro-Einheiten und ein Stopcodon zu kodieren. Die Oligos wurden nach Standardverfahren synthetisiert. Die Oligos wurden durch SDS-PAGE gereinigt und aus dem Gel extrahiert. Eine direktionale Klonierungsstrategie unter Verwendung eines glatten Endes und eines kohäsiven Endes wurde eingesetzt, um die richtige Zuordnung und Ligierung des Ala-Pro-Gens in das Plasmid sicherzustellen. Die Klone wurden nach Transformation von E. coli selektioniert. Proteinanalyse und Induktionsexperimente mit einem Klon, AP/2, zeigten, daß nach der Induktion Fusionsproteine gebildet wurden. Eine Größenbestimmung der Banden auf SDS-PAGE-Gelen legte mehr als ein Fusionsprodukt nahe. Nichtsdestoweniger ist die Induktion und Produktion des Fusionsproteins eindeutig.
Bedenken hinsichtlich einer Umlagerung der klonierten Sequenz und richtigen Erkennung des Stopcodons, das in das Oligonukleotid konstruiert worden war, führten zur Sequenzierung der inserierten DNA. DNA aus dem Klon wurde mit Hilfe des M13-Universalprimers sequenziert. Interessanterweise kodiert die Sequenz des Inserts für 20 Ala-Pro-Repeats anstelle der 14 Ala-Pro-Repeats. Das Stopcodon TAG liegt am Ende der 20 Repeats vor. Die Anwesenheit von (Ala-Pro)₂₀ wird darauf zurückgeführt, daß die beiden Oligonukleotide in einem versetzten Muster miteinander verschmolzen sind und die resultierenden Lücken während der Rekombination durch die Polymerase aufgefüllt wurden. Die Verschmelzung ist infolge der hoch wiederholten Sequenz nicht ungewöhnlich. In diesem Fall kann sie vorteilhaft sein, da sie zu einem längeren Gen (und somit mehr Ala-Pro-Repeats) führte.
Hydrolyse von Ala-Pro-Substraten. Drei Bakterienkulturen, Lactobacillus helveticus, L. sp. und Xanthomonas maltophilia, von denen in der Literatur berichtet wurde, daß sie Prolyldipeptidase-Aktivität produzieren, wurden von der ATCC erhalten. Die Kulturen wurden in 250-ml-Kolben gezüchtet und hinsichtlich hydrolytischer Aktivität gegenüber einem im Handel erhältlichen kolorimetrischen Substrat, Ala-Pro-pNA (Ausgangsmaterial), überprüft. Alle drei Kulturen ergaben eine Aktivität, von denen der Großteil zellassoziiert war (Tabelle 1). Stammkulturen wurden anschließend auf Schrägkulturen und in eingefrorenen FVM hergestellt. Für das optimale Wachstum erforderten die Lactobacilli eine mikroaerophile Kammer für die Schrägkulturen und stationäre Flüssigkultur in Kolben.
Tabelle 1. Spezifische Aktivität von Prolyldipeptidasen gegenüber (Ala-Pro)₂
Es war wünschenswert, Substrate zu erhalten, welche das tatsächliche oligomere Ala-Pro-Substrat reflektieren könnten, das nach dem Wachstum eines rekombinanten E. coli zur Verfügung stünde. Diesbezüglich wurden Peptid-Oligomere zur Verwendung als Prolypeptidase-Substrate von Biosynthesis Inc. synthetisiert. Ein HPLC-Verfahren zur Abtrennung von Peptiden mit niedrigem Molekulargewicht und freien Aminosäuren wurde entwickelt, um die Enzymaktivität gegenüber authentischen Ala-Pro-Substraten zu beurteilen. Die Peptid-Polymerase von Biosynthesis wurde anschließend mit Hilfe des HPLC-Verfahrens gereinigt. Nach der Gewinnung von Fraktionen aus der HPLC standen Ala-Pro-Peptide von 2, 4 und 6 Repeats zur Verfügung. Die Temperatur- und pH-Optima für die Peptide wurden für jeden der Rohextrakte bestimmt (Tabelle 2). L. helveticus ergab den höchsten Enzymtiter und die höchsten spezifischen Aktivitäten. Empfohlene komplexe Medien aus der Literatur wurde für alle Untersuchungen eingesetzt, es erfolgte keine) Mediumoptimierung oder Screening. Auf Grundlage von Unterschieden im Auftreten hydrolytischer Produkte scheint es so, daß die Lactobacilli eine Endo-Prolyldipeptidase und die Xanthomonas eine Exopeptidase produ zieren. Ein Vorteil dieser Beobachtung wird gezeigt, indem Enzyme kombiniert werden, um einen synergistischen Effekt bei der Hydrolyse von (Ala-Pro)₆ zu erzielen.
Es wurde festgestellt, daß bei Zuführung eines Überschusses an Enzym (600fach konzentriert im Vergleich zu normalen Assay-Bedingungen) zu Ala-Pro das Ala-Pro-Substrat zu Alanin und Prolin hydrolysiert wurde. Metallo- und Cystein-Proteaseinhibitoren waren wirksam bei der Hemmung der Ala-Pro-Hydrolyse, während sie wenig Auswirkung auf die Hydrolyse von (Ala-Pro)₆ zu Ala-Pro hatten, was nahelegt, daß ein separates Enzym die Ala-Pro-Spaltung erleichtert. Eine partielle Reinigung sollte ebenfalls unerwünschte Aktivitäten aus diesen Rohextrakten entfernen.
Im Falle des Dipeptid-Zwischenprodukts Ala-Pro wird eine weitere Prozessierung zu dem Endprodukt, das als Enalapril bekannt ist, und verwandten Verbindungen wie in US-Patent Nr. 4,374,829 und US-Patent Nr. 4,555,502 beschrieben durchgeführt.
BEISPIEL 7
Rekombinante Herstellung von Lys-Pro-Digeptid aus einem rekombinanten Pflanzenprotein
Natürlich vorkommende Sequenzen, die reich an Lys-Pro-kodierenden Sequenzen sind, können in der Zellwandprotein-Genfamilie von Sojabohnen (Glycine max) gefunden werden [Aus: Hong et al., J. Biol. Chem., 1990]. Die drei prolinreichen Proteingene der Sojabohne sind SbPRP1, SbPRP2, und SbPRP3, welche eine Länge von 256, 230 bzw. 90 Aminosäuren aufweisen. Die Aminosäurezusammensetzungen für diese Proteine zeigen an, daß 34 bis 40% der Reste Prolin und 18 bis 25% Lysin sind. Von besonderem Interesse ist, daß SbPRP1 37 Lys-Pro-Aminosäurepaare in der Peptidsequenz enthält und somit eine ausgezeichnete Quelle von Lys-Pro-Dipeptid ist. SbPRP3 kodiert für 12 Lys-Pro-Dipeptid-Sequenzen, einschließlich zweier Lys-Pro-Lys-Pro-Repeat-Sequenzen, die bei 183 und 195 bp in dem Gen kodiert werden.
Die Klonierung des an Lys-Pro reichen SbPRP1-Gens wird erreicht durch Herstellung von PCR-Primern, die auf den berichteten DNA-Sequenzen basieren. DNA-Fragmente, enthaltend die Sequenzen von Interesse, werden unter Verwendung der Primer und einer Bank, welche die Sojabohnen-DNA enthält, erzeugt. Die resultierende DNA, die reich an Lys-Pro-Codons ist, wird mit geeigneten Restriktionsstellen in einem Expressionsvektor ligiert. Bei Verwendung eines E. coli-Wirts werden die Sojabohnen-Peptide exprimiert und aus den lysierten Zellen gewonnen. Bei Verwendung von Lactobacillus helveticus oder der aus diesem Stamm erhaltenen Prolylpeptidase wird das Protein in die Aminosäurebestandteile und kleine Peptide, einschließlich der Lys-Pro-Reste, hydrolysiert. Chromatographie oder Extraktion wird relativ reines Lys-Pro ergeben.
Ein alternatives Verfahren ist die Synthese von Oligonukleotiden, welche den Lys-Pro-Lys-Pro-Repeats in SbPRP3 entsprechen [oder Verwendung von zwei Sätzen Rücken-an-Rücken, jedoch nicht zusammenhängend, in der natürlichen Sequenz], konstruiert mit den geeigneten Restriktionsstellen für die Insertion in den Expressionsvektor von Interesse. Die Expression im richtigen Wirt ergibt signifikante Mengen an Lys-Pro als Oligopeptide. Bei Verwendung von Lactobacillus helveticus oder der von diesem Stamm erhaltenen Prolylpeptidase wird das an Lysin und Prolin reiche Peptid in Lys-Pro-Reste hydrolysiert. Alternativ wird eine prolin-spezifische Peptidase aus Flavobacterium menigosepticum [Yoshimoto, T., of al., Agric. Biol. Chem., 42: 2417, 1978] zur Hydrolyse des Peptids verwendet. Chromatographie oder Extraktion ergibt relativ reines Lys-Pro.
Im Falle des Dipeptid-Zwischenprodukts Lys-Pro wird eine weitere Prozessierung zu dem Endprodukt, das als Lysinopril bekannt ist, und verwandten Verbindungen wie in US-Patent Nr. 4,374,829 und US-Patent Nr. 4,555,502 beschrieben durchgeführt.
BEISPIEL 8
Rekombinante Herstellung von Ala-Pro-Dipeptid aus rekombinantem Amphibienprotein
Ein saures Polypeptid von etwa 75 kD, das in den Speichergranula in Hautdrüsen von Xenopus laevis gefunden wird, als das APEG-Protein bezeichnet, ist reich an Ala-Pro- Dipeptiden [Gmachl, M., et al., FEBS Letters, 260: 145–148]. Mindestens 80% der Masse ist Alanin, Prolin, Glutaminsäure und Glycin in einem Verhältnis von 2 : 2 : 1 : 1.
Eine cDNA-Expressionsbank in einem von Lambda abgeleiteten Vektor kann mit Oligonukleotid-Sonden von der veröffentlichten Sequenz gescreent werden, um das Fragment von Interesse zu isolieren. Alternativ können Antikörper gegen das APEG zum Screenen einer solchen cDNA-Expressionsbank eingesetzt werden. Das Fragment von Interesse kann aus dem Klon von Interesse isoliert und in einen Expressionsvektor inseriert werden. (Prozessierung des resultierenden Peptids wie in Beispiel 6 – Hydrolyse von Ala-Pro-Substraten).
Ein bevorzugtes Verfahren ist die Synthese eines Oligonukleotids, das den natürlichen APEG-DNA-Sequenzen für Ala-Pro-Ala-Pro-Ala-Pro entspricht (CACCAGCTCCAGCACCAG). Mit den geeigneten Restriktionsstellen in dem Oligonukleotid wird die DNA in einen Expressionsvektor zur Expression in einer rekombinanten Wirtszelle wie oben angegeben kloniert. Das Polypeptid, welches die Dipeptid-Zwischenprodukt-Repeats enthält, wird enzymatisch wie oben beschrieben hydrolysiert und das Dipeptid-Zwischenprodukt Ala-Pro wird für die weitere Prozessierung zu dem Produkt isoliert.
Im Falle des Dipeptid-Zwischenprodukts Ala-Pro wird die weitere Prozessierung zu dem Endprodukt, das als Enalapril bekannt ist, und verwandten Verbindungen wie in US-Patent Nr. 4,374,829 und US-Patent Nr. 4,555,502 beschrieben durchgeführt.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Dipeptids, das aus Ala-Pro und Lys-Pro ausgewählt ist, welches umfaßt: (a) Transfektion eines DNA-Expressionsvektors in geeignete Wirtszellen, wobei der DNA-Expressionsvektor ein DNA-Molekül umfaßt, das für ein Oligopeptid oder Polypeptid kodiert, welches mehrere direkte Repeats des Dipeptids enthält, (b) Kultivierung der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen zur Expression des Oligopeptids oder Polypeptids von dem DNA-Expressionsvektor, (c) Spaltung des exprimierten Oligopeptids oder Polypeptids mit einem Enzym, um so das Dipeptid freizusetzen, und (d) Isolierung und Reinigung des Dipeptids.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der DNA-Expressionsvektor für ein Fusionsprotein kodiert, das ein spaltbares Fragment in Verknüpfung mit dem Oligopeptid oder Polypeptid, welches mehrere direkte Repeats des Dipeptids enthält, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das spaltbare Fragment das Maltose-Bindungsprotein von E. coli ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Dipeptid Ala-Pro ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lactobacillus helveticus-Prolylpeptidase, Xanthomonas maltophilia-Prolylpeptidase und Mischungen davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei der DNA-Expressionsvektor das Oligopeptid Ala-Pro-Ala-Pro-Ala-Pro exprimiert.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Dipeptid Lys-Pro ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lactobacillus helveticus-Prolylpeptidase, Flavobacterium meningosepticum-Prolylpeptidase und Mischungen davon besteht.
Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei der DNA-Expressionsvektor das Oligopeptid Lys-Pro-Lys-Pro exprimiert.