DE69334152T2

DE69334152T2 - Verknüpftes D-Protein und Verfahren zur Identifizierung von Rezeptor Aktivität modulierenden Verbindungen

Info

Publication number: DE69334152T2
Application number: DE69334152T
Authority: DE
Inventors: Stephen Brian Henry La Jolla Kent; Raymond Cecil deLisle La Jolla Milton; Saskia Charlotte Florence La Jolla Milton
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1992-06-05
Filing date: 1993-06-07
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2013-06-08
Also published as: EP0647266A1; EP0882737A1; AU3756497A; DE69324362D1; US6548279B1; US20030113881A1; WO1993025667A1; AU678768B2; JPH08501207A; EP0647266B1; AU721228B2; DE69324362T2; US20040086988A1; US7118856B2; AU4599693A; ES2290976T3; US7135279B2; US5910437A; ATE366744T1; JP4312615B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, welche D-Aminosäurereste enthalten. Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Kandidatenverbindungen aus einer chemischen Bibliothek unter Verwendung von einem D-Protein, welches im Wesentlichen aus D-Aminosäuren besteht, und Verfahren zur Verwendung derartiger Proteine.
Allgemeiner Stand der Technik
Die Biosphäre ist schon von sich aus chiral; jede Klasse von biologischen Makromolekülen ist aufgebaut aus Monomermolekülen von einheitlicher Chiralität (Mason, Chirality 3: 223, 1991) und die biochemischen Wechselwirkungen von biologischen Makromolekülen sind schon aus sich heraus chiral.
Die Enzyme, zum Beispiel, reagieren ausnahmslos nur mit einem Enantiomer von einem chiralen Substrat, oder erzeugen nur ein Diastereomer aus einem prochiralen Substrat. Fersht, in "Enzyme structure and Mechanism", W. H. Freeman and Company, San Francisco, 1977, pp. 75-81. Diese Spezifität kann die chirale Struktur von dem Enzymmolekül betreffen, einschließlich der dreidimensionalen Faltung von dem Polypeptid-Rückgrat und der Orientierung der Aminosäure-Seitenketten in dem gefalteten Proteinmolekül. Fersht, supra. Bis heute sind einzig L-Enzyme in der Natur beschrieben worden; dies lässt die Beschreibung von D-Enzymen und ihrer Eigenschaften, welche die gefaltete Struktur, die enzymatische Aktivität und ihre chirale Spezifität einschließen, als unerforschte Fragestellungen zurück.
Kürzlich beschrieben Zawadzke et al., J. Am. Chem, Soc., 114: 4002-4003, 1992, die Herstellung von einem kleinen Polypeptid mit 45 Aminosäureresten (D-Rubredoxin) unter Verwendung von D-Aminosäuren. L-Rubredoxin wird in Clostridien gefunden und ist das einfachste Eisen-Schwefel-Protein. Es wird angenommen, dass es eine Funktion im Elektronentransport besitzt. Es fehlt jedoch eine nachgewiesene enzymatische Aktivität.
Vor der vorliegenden Erfindung war das größte L-Protein, von dem bekannt war, dass es chemisch auf eine konventionelle schrittweise Art synthetisiert worden ist, das Preprogonadotropin-Freisetzungs-Hormon (PreproGnRH). PreproGnRH weist 93 Aminosäurereste auf. (Milton et al., Biochemistry, (1992) 31: 8800.) PreproGnRH inhibiert die Prolactin-Freisetzung.
Viele organische Verbindungen existieren in optisch aktiven Formen, d. h. sie weisen die Fähigkeit auf, die Ebene von eben-polarisiertem Licht zu drehen. In der Beschreibung von einer optisch aktiven Verbindung werden die Vorzeichen D und L oder R und S verwendet, um die absolute Konfiguration von dem Molekül um sein(e) chirale(s) Zentrum/Zentren herum zu kennzeichnen. Die Vorzeichen (+) und (–) oder d und 1 werden eingesetzt, um die Rotationsrichtung von dem eben polarisierten Licht durch die Verbindung zu bezeichnen, wobei (–) oder L bedeuten, dass die Verbindung linksdrehend ist. Eine Verbindung, welche mit den Vorzeichen (+) oder d bezeichnet ist, ist rechtsdrehend. Für eine vorgegebene chemische Struktur sind diese Verbindungen, genannt Stereoisomere, identisch, außer dass sie Spiegelbilder voneinander darstellen. Ein spezifisches Stereoisomer kann ebenfalls als ein Enantiomer bezeichnet werden und eine Mischung derartiger Isomere wird oft als enantiomerische oder racemische Mischung bezeichnet.
Die Eigenschaft der optischen Aktivität ist auf die moleku lare Asymmetrie rund um die Kohlenstoffatome zurückzuführen, welche mit vier unterschiedlichen Atomen oder Molekülen verbunden sind. Wo nur ein asymmetrisches Kohlenstoffatom, oder chirales Zentrum, wie es bisweilen genannt wird, vorhanden ist, existieren zwei mögliche Stereoisomere. Wo n asymmetrische Kohlenstoffe oder chirale Zentren vorhanden sind erhöht sich die Anzahl von den potentiellen Stereoisomeren auf 2ⁿ. Dementsprechend würde ein Molekül mit drei chiralen Zentren acht mögliche Stereoisomere aufweisen.
Während die strukturellen Unterschiede zwischen den Stereoisomeren fast unmerklich und von geringer Konsequenz in gebräuchlichen chemischen Reaktionen sind, können sie schwerwiegend sein, wo biologische Systeme betroffen sind, d. h. falls die Verbindungen in Enzym-katalysierten Reaktionen verwendet werden. Daher werden die L-Aminosäuren in Menschen leicht metabolisiert, aber nicht die korrespondierenden D-Analoge, und nur D-Glucose kann phosphoryliert und zu Glykogen umgewandelt werden oder durch die glykolytischen und oxidativen Signalwege des Intermediär-Metabolismus abgebaut werden. Ähnlich weisen Beta-Blocker, Pheromone, Prostaglandine, Steroide, Aroma- und Duftstoffe, Pharmazeutika, Pestizide, Herbizide und viele andere Verbindungen eine kritische Stereospezifität auf. Auf dem Gebiet der Pestizide ist von Tessier [Chemistry and Industry, Mar. 19, 1984, p. 199] gezeigt worden, dass nur zwei von acht Stereoisomeren von Deltamethrin, einem Pyrethroid-Insektizid, irgendeine biologische Aktivität aufweisen. Dieselbe Feststellung bezüglich der Konzentration der Bioaktivität in einem einzelnen Isomer kann bei vielen anderen Pestiziden getroffen werden, einschließlich der Phenoxypropionate und der Halogenpropionat-Derivate, wobei jedes ein chirales Zentrum enthält und in der Form von zwei optischen Isomeren vorkommt.
Die stereochemische Reinheit ist von der gleichen Bedeutung auf dem Gebiet der Pharmazeutika, wo 12 von den 20 am meisten verschriebenen Arzneimitteln Chiralität aufweisen. Ein typisches Beispiel wird durch Naproxen, oder (+)-S-2-(6-Methoxy-2-Naphthyl)-Propionsäure, bereitgestellt, welches eines von den zwei wichtigsten Mitgliedern von einer Klasse von 2-Aryl-Propionsäuren mit nicht-steroidaler entzündungshemmender Aktivität ist, das, zum Beispiel, in der Behandlung von Arthritis verwendet wird. In diesem Fall ist bekannt, dass das S-(+)-Enantiomer von dem Arzneimittel therapeutisch 28-fach potenter ist als sein R-(–) Gegenstück. Noch ein weiteres Beispiel von chiralen Pharmazeutika wird durch die Familie der Beta-Blocker bereitgestellt, wobei für die L-Form von Propranolol bekannt ist, dass sie 100-fach wirksamer ist als das D-Enantiomer.
Die Synthese von organischen Verbindungen durch organischsynthetische Standardtechniken führt im Allgemeinen zu einem racemischen Gemisch, welches, in der Gesamtsumme, eine relativ niedrige spezifische biologische Aktivität aufweisen kann, da bestimmte von den Stereoisomeren in dem Gemisch wahrscheinlich biologisch oder funktionell inaktiv sind. Als Folge daraus müssen größere Mengen von der Substanz verwendet werden, um eine wirksame Dosis zu erhalten und die Herstellungskosten sind aufgrund der Gemeinschaftsproduktion von stereochemisch „fehlerhaften" und somit inaktiven Inhaltsstoffen gesteigert.
In einigen Fällen können bestimmte Isomere tatsächlich schädlich, anstatt nur einfach inaktiv sein. Zum Beispiel war das D-Enantiomer von Thalidomid ein sicheres und wirksames Beruhigungsmittel, wenn es für die Verhinderung der morgendlichen Übelkeit während der Schwangerschaft verschrieben wurde. Für sein Gegenstück L-Thalidomid wurde jedoch entdeckt, dass es ein wirksames Mutagen ist.
Es stehen für die stereoselektive Synthese Verfahren zur Verfügung, die im Allgemeinen chemische Synthese- und Isolierungsschritte beinhalten, die übermäßig lang, kompli ziert und kostenintensiv sind. Darüber hinaus kann ein synthetisches Schema, das in der Lage ist, ein spezifisches Enantiomer herzustellen, nicht in einer allgemeinen Art und Weise angewendet werden, um andere optisch aktive Verbindungen zu erhalten. Was benötigt wird, ist ein verallgemeinerter Ansatz für die Auftrennung von racemischen Gemischen, die durch gebräuchliche chemische Reaktionen hergestellt werden und eine Anzahl von Vorgehensweisen ist dafür verwendet worden.
Ein weit verbreiteter Ansatz ist die selektive Fällung von den erwünschten Verbindungen aus den racemischen Gemischen gewesen. Siehe zum Beispiel Yoshioka et al. [ US-Patentschrift Nr. 3,879,451 ], Paven et al. [ US-Patentschrift Nr. 4,257,976 ], Halmos [ US-Patentschrift Nr. 4,151,198 ) und Kameswaran [ US-Patentschrift Nr. 4,454,344 ].
Die oben angeführten Verfahren trennten racemische Gemische erfolgreich auf, weil die Behandlung von den Gemischen mit optisch reinen Reagenzien Diastereomere erzeugte, welche, im Gegensatz zu den anfänglichen racemischen Verbindungen, unterschiedliche physikalische Eigenschaften aufweisen. Folglich können die fraktionelle Kristallisation oder andere physikalische Mittel eingesetzt werden, um diastereomere Verbindungen zu trennen.
Die Trennung von Diastereomeren kann ebenfalls mittels Chromatographie durchgeführt werden. Zum Beispiel haben Pollock et al. [J. Gas Chromatogr. 3: 174 (1965)] diastereomere Aminosäuren durch Gaschromatographie aufgetrennt. Mikes et al. [J. Chromatogr. 112: 205 (1976)] haben die Flüssigchromatographie verwendet, um diastereomere Dipeptide aufzutrennen. In den meisten Fällen sind die optisch reinen Reagenzien während der chromatographischen Trennung in der stationären Phase gewesen, aber sie können ebenfalls in Elutionsmitteln verwendet werden. Hare et al. [ US-Patentschrift Nr. 4,290,893 ] haben die Flüssigchromatographie verwendet, um racemische Gemische aufzutrennen, die mit wässrigen Elutionsmitteln behandelt wurden, welche optisch reine Reagenzien und Metallkationen enthielten; die Auftrennung erfolgte, weil die sich ergebenden diastereomeren Komplexe in dem chromatographischen System unterschiedliche Verteilungskoeffizienten aufwiesen.
Alle von den bis zu diesem Punkt beschriebenen Verfahren waren auf die Verfügbarkeit von geeigneten optisch reinen Reagenzien angewiesen, aber derartige Reagenzien sind oft nicht verfügbar oder anderenfalls ist ihre Verwendung unerschwinglich teuer. In einer alternativen Vorgehensweise sind enzymatische Auftrennungstechniken entwickelt worden. Viele unterschiedliche Klassen von Enzymen sind für die Auftrennung von Stereoisomeren im präparativen Maßstab verwendet worden, einschließlich Hydrolasen (insbesondere die Lipasen und Esterasen wie Chymotrypsin); Lyasen und Oxidoreduktasen (z. B. Aminosäureoxidasen und Alkohol-Reduktasen). Allgemein gesprochen sollten Enzyme, die für Auftrennungen verwendet werden, eine breite Substratspezifität aufweisen, sodass sie in der Lage sein werden, Reaktionen mit einer Vielzahl von „unnatürlichen" Substraten zu katalysieren und einen hohen Grad an Stereoselektivität zum Katalysieren der Reaktion mit einem Isomer bis zu dem Ausschluss von anderen Isomeren.
Die Hydrolasen (z. B. Lipasen und Esterasen) gehören zu den eher attraktiven Enzymen für die Verwendung in Auftrennungen, da sie keine teueren Cofaktoren benötigen und einige von ihnen eine angemessene Toleranz gegenüber organischen Lösemitteln aufweisen. Des Weiteren bezieht die chirale Chemie oft Alkohole, Carbonsäuren, Ester, Amide und Amine mit chiralen Kohlenstoffen ein und Carboxyl-Hydrolasen sind die bevorzugte Wahl als stereoselektive Katalysatoren für Reaktionen derartiger Spezies. Zum Beispiel ist die enzymatische Behandlung zur Auftrennung racemischer Gemische von Aminosäure-Estern angewendet worden. Stauffer [ US-Patentschrift Nr. 3,963,573 ] und Bauer [ US-Patentschrift Nr. 4,262,092 ].
Die Trennung der Reaktionsprodukte von Enzymen ist erleichtert worden durch das Verknüpfen von dem Enzym mit einem festen Trägermaterial, welches durch Zentrifugation entfernt werden oder in eine Säule gepackt werden könnte, durch welche die racemischen Gemische hindurchgeleitet werden.
Enzyme sind ebenfalls erforscht worden für die Auftrennung von anderen Verbindungsklassen als die zuvor diskutierten Aminosäuren. Immobilisierte Lipase trennt im Prinzip Gemische durch enzymatische Hydrolyse oder durch Umesterung auf. In dem Falle von einer biphasischen Hydrolysereaktion erforderten die unterschiedlichen Löslichkeitseigenschaften von den beteiligten Säuren und Estern die Dispersion und das Rühren von den Mischungen, welche das immobilisierte Festphasen-Enzym enthielten, einen wässrigen Puffer und die nicht mit Wasser mischbare organische Phase, welche das Lösemittel und den Recktanten enthält – ein relativ unwirtschaftlicher Prozess.
Enzyme sind für die Auftrennung der optischen Isomere von Insektiziden angewendet worden. Zum Beispiel brachten Mitsuda et al. [ Eur. Patentanmeldung Publ. Nr. 0 080 827 A2 ] einen racemischen Essigsäureester mit stereoselektiven Esterasen mikrobiellen und tierischen Ursprungs in biphasischen Systemen (d. h. wässrig/organische Dispersion) in Kontakt. In einer dazu in Beziehung stehenden Arbeit an optisch gereinigten Pyrethroiden setzten Mitsuda et al. [ US-Patentschrift Nr. 4,607,013 ] mikrobielle Esterasen ein. Klibanov et al. [ US-Patentschrift Nr. 4,601,987 ] trennten racemische 2-Halogenpropionsäuren mittels Lipase-katalysierten Veresterungsreaktionen auf, die in organischen Medien durchgeführt wurden.
Zusätzliche Beispiele können ebenfalls von der auf dem neuesten Stand der Technik beruhenden enzym-vermittelten Auftrennung, wie sie für die Herstellung von optisch gereinigten Pharmazeutika angewendet wurden, bereitgestellt werden. Sih [ US-Patentschrift Nr. 4,584,270 ] hat enzymatische Mittel für die Herstellung von optisch reiner (R)-4-Amino-3-hydroxybuttersäure, einem Schlüsselintermediat in der Herstellung von L-Carnitin, offengelegt.
Bis heute konnten einzig natürlich vorkommende L-Enzyme beschrieben werden und dies ließ die mutmaßlichen Eigenschaften von D-Enzymen, einschließlich ihrer gefalteten Strukturen, ihrer enzymatischen Aktivität und ihrer chiralen Spezifität als unerforschte Fragestellungen zurück. Was benötigt wurde, war ein ausreichender Fortschritt in der chemischen Synthese von Proteinen, um die Gesamtsynthese von dem D-Enantiomer von vollständigen Enzymen in ausreichenden Mengen möglich zu machen, um Kristalle zu bilden und andere Funktionen auszuführen.
Ein Beitrag in Science 1992, Band 256, Nr. 5054, Seite 221- 225 offenbart die Ligation von HIV-Protease, um ein aktives Analog zu bilden.
Ein Beitrag in Science 1992, Band 256, Nr. 5062, Seite 1445- 1448 (veröffentlicht 5. Juni 1992) offenbart die chemische Synthese von einem D-Enzym, D-HIV-Protease.
Ein Beitrag in Science 1992, Band 256, Nr. 5062, Seite 1403- 1404 (veröffentlicht 5. Juni 1992) ist eine Diskussion von den Ergebnissen des Artikels, welcher in dem vorhergehenden Absatz dargelegt wurde.
Verfahren zum Screenen der chemischen Bibliotheken für pharmazeutisch verwendbare Verbindungen unter Benutzung von L-Rezeptoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren von Kandidatenverbindungen aus einer Kandidatenbibliothek, wobei der Kandidat ein chiraler Agonist oder ein chiraler Antagonist von einem L-Proteinrezeptor ist und wobei das Verfahren umfasst:

a) Screenen der chemischen Bibliothek durch Inkontaktbringen der chemischen Bibliothek mit einem D-Proteinrezeptor, welcher die D-Version von dem L-Proteinrezeptor ist, oder mit einem D-Protein, welches eine Rezeptorbindungsstelle aufweist, welches die D-Version der Bindungsstelle von dem L-Proteinrezeptor ist und
b) Ermitteln von einer oder mehreren Verbindungen aus der chemischen Bibliothek, welche Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität in Bezug auf den D-Proteinrezeptor oder das D-Protein, das eine Rezeptorbindungsstelle besitzt, aufweisen, wobei der Begriff „D-Protein" ein Protein bedeutet, in welchem alle chiralen Aminosäurereste eine D-Chiralität aufweisen und der Begriff „L-Protein" ein Protein bedeutet, in welchem alle chiralen Aminosäurereste eine L-Chiralität aufweisen und wobei der chirale Kandidatenagonist oder -Antagonist von dem L-Proteinrezeptor das Enantiomer von der Verbindung ist, die in Schritt b) erhalten wurde.

Andere Merkmale von dem Verfahren sind in den beiliegenden Ansprüchen dargelegt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den Zeichnungen, die einen Teilbereich von dieser Offen barung bilden, veranschaulicht:
1 die Molekulargewichtscharakterisierung von den D- und L-Enzym-Enantiomeren von der HIV-1-Protease, wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung der rekonstruierten Innenspray-Massenspektrometrie. Das Molekulargewicht ist in Dalton ausgedrückt und als Peak des Prozentsatzes (%) der relativen Intensität von den gemessenen Spektren dargestellt. 1A veranschaulicht die Molekulargewichtsdaten, die von dem L-Enzyme erhalten wurden und 1B veranschaulicht die Daten, die mit dem D-Enzym erhalten wurden.
2 veranschaulicht die Vergleichs-Enzymaktivität von den D- und L-Enantiomeren von dem HIV-PR-Enzym mit den D- und L-Enantiomeren von einem chiralen fluorogenen Substrat, wie in Beispiel 3 beschrieben. 2A stellt das L-Enzym mit dem L-Substrat dar; 2B stellt das L-Enzym mit dem D-Substrat dar; 2C stellt das D-Enzym mit dem L-Substrat dar und 2D stellt das D-Enzym mit dem D-Substrat dar. Die Daten sind als Aktivität dargestellt, gemessen in willkürlichen Einheiten der Fluoreszenzintensität über einen Reaktionszeitverlauf in Minuten.
Die 3A und 3B veranschaulichen die Bandmodell-Darstellungen von dem Polypeptid-Rückgrat des homodimeren HIV-1-Protease Moleküls sowohl in der L- als auch in der D-Konformation, gezeigt in 3B, beziehungsweise in 3A. Die Pfeile zeigen die Ausrichtung von dem Polypeptid in der Richtung von dem Amino- zu dem Carboxy-Terminus an.
4 veranschaulicht eine schematische Darstellung der chemischen Segmentligations-Strategie, welche für die Gesamtsynthese von den D- und L-[Aba^67,95(CO-S)^51-52] ₂HIV-1-Protease Analoga angewendet wurde.
5 veranschaulicht eine schematische Darstellung der optimierten Festphasen-Ketten-Assemblierungstaktiken, welche in der Synthese von den funktionalisierten Peptidsegmenten eingesetzt wurden. Die Entschützungs- und Kopplungs-Reaktionen sind durch einen einzelnen Waschschritt mittels Durchfluss voneinander getrennt.
6 veranschaulicht ein zusammengesetztes Chromatogramm, welches zwei gereinigte, funktionalisierte, ungeschützte D-[αCOSH]HIV-1 PR (1-51) und D-[N^α-BrCH₂CO]HIV-1(53-99)-Segmente darstellt und das endgültige (48 Stunden) D-[Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1 PR Ligationsprodukt (fett gedruckt), das auf einer Vydac 218TP5415-Säule laufen lassen wurde, eluiert durch einen Gradienten (40-55 % B), bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 Milliliter pro Minute.
7 veranschaulicht die Ausbeuten der Reaktionsschritte für die Synthese von den D- und L-[Aba^67,95 (CO-S)^51-52]₂HIV-1 Protease-Analoga.
Die 8A, 8B, 8C und 8D veranschaulichen die Innenspray-Massenspektren von den HPLC-gereinigten [(NHCH₂OSCH₂CO)^51-52HIV-1 PR Monomeren.
Die 9A, 9B, 9C und 9D veranschaulichen die Messungen der Umkehrphasen-HPLC von den D- und L-[Aba^67,95, (CO-S)^51-52]HIV-1 PR Ligationsprodukten.
10A und 10B veranschaulichen die Circulardichroismus-Spektren im fernen Ultraviolett von den D- und L-[Aba^67,95(CO-S)⁵¹ ^-52 ^] ₂HIV-1 Protease-Analoga.
11 veranschaulicht die enzymatische Aktivität von den [Aba^67,95, (CO-S)^51-52]₂HIV-1-PR Enantiomeren mit den D- und L-Isomeren von dem Substrat Ac-Thr-Ile-Nle-Nle-Gln-Arg·Amid.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
A. Definitionen

Aminosäurerest: Eine Aminosäure, die nach dem chemischen Verdau (Hydrolyse) von einem Polypeptid an seinen Peptidbindungen gebildet wird. Die Aminosäurereste, die hierin beschrieben werden, sind entweder in der stereoisomeren „L-" oder in der "D-" Form. NH₂ bezieht sich auf die freie Aminogruppe, welche an dem Amino-Terminus von einem Polypeptid vorhanden ist. COOH bezieht sich auf die freie Carboxy-Gruppe, welche an dem Carboxy-Terminus von einem Polypeptid vorhanden ist. In Übereinstimmung mit der Standard-Polypeptidnomenklatur (beschrieben in J. Biol. Chem. 243: 3552-59 (1969) und angenommen in Titel 37, Code of Federal Regulations (C.F.R.) § 1.822(b) (2)) werden die Abkürzungen für die Aminosäurereste in der nachfolgenden Übereinstimmungs-Tabelle dargestellt: ÜBEREINSTIMMUNGS-TABELLE

SYMBOL		AMINOSÄURE
1-Buchstaben	3-Buchstaben
Y	Tyr	Tyrosin
G	Gly	Glycin
F	Phe	Phenylalanin
M	Met	Methionin
A	Ala	Alanin
S	Ser	Serin
I	Ile	Isoleucin
L	Leu	Leucin
T	Thr	Threonin
v	Val	Valin
P	Pro	Prolin
K	Lys	Lysin
H	His	Histidin
Q	Gin	Glutamin
E	Glu	Glutamicsäure
Z	Glx	Glu und/oder Gin
W	Trp	Tryptophan
R	Arg	Arginin
D	Asp	Asparaginsäure
N	Asn	Asparagin
B	Asx	Asn und/oder Asp
C	Cys	Cystein
J	Xaa	Unbekannt oder andere

Die oben angeführten Symbole werden sowohl für L- als auch für D-Aminosäurereste verwendet. Das Symbol Xaa wird für jeden unbekannten oder anderen Aminosäurerest eingesetzt. Das Symbol Xaa wird jedoch häufig hierin angewendet, um L- oder D-a-Amino-n-buttersäure (aba) zu kennzeichnen, das einen isosterischen Ersatz für Cystein-Reste darstellt.
Es sollte beachtet werden, dass alle hierin durch Formeln dargestellte Sequenzen der Aminosäurereste eine Orientierung von links nach rechts in der konventionellen Richtung von Amino-Terminus zu Carboxy-Terminus aufweisen. Darüber hinaus ist die Formulierung „Aminosäurerest" allgemein definiert, um die Aminosäuren in der Übereinstimmungs-Tabelle und modifizierte und ungewöhnliche Aminosäuren einzubeziehen, wie solche, die in Titel 37, Code of Federal Regulations (C.F.R.) § 1.822(b) (4) aufgelistet sind, und hierin durch Verweis eingebunden. Darüber hinaus sollte beachtet werden, dass der Strich am Anfang oder am Ende von einer Aminosäurerest-Sequenz eine Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz aus einem oder mehreren Aminosäurenresten oder eine kovalente Bindung zu einer aminoterminalen Gruppe wie NH₂ oder Acetyl oder zu einer carboxyterminalen Gruppe wie beispielsweise COOH kenntlich macht.
Racemisches Gemisch: Ein racemisches Gemisch wird hierin verwendet, um sich auf ein Gemisch von mindestens einem ersten und zweiten Stereoisomer in irgendwelchen Anteilen zu beziehen. In diesem Zusammenhang bezieht sich die Bezeichnung „Auftrennung", wie hierin verwendet, auf die Trennung von einem ersten racemischen Gemisch in zweite und dritte Gemische, wobei die Anteile von den beiden Stereoisomeren in den zweiten und dritten Gemischen unterschiedlich sind zu denen in dem ersten racemischen Gemisch, wobei der Anteil in einem größer und notwendigerweise in dem anderen kleiner ist.
B. D-Protein Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung zieht ein D-Protein in Betracht, welches ein Molekül umfasst, das eine Sequenz aus Aminosäureresten aufweist, die ein Polypeptid definieren. Ein D-Protein weist eine Sequenz von Aminosäureresten auf, die im Wesentlichen aus D-Aminosäuren besteht.
Die Bezeichnung „D-Aminosäure" kennzeichnet nicht die Richtung der spezifischen Rotation von dem Molekül, da es gut bekannt ist, dass einige Aminosäuren rechtsdrehend sind, während hingegen andere linksdrehend sind. Vielmehr bezeichnet der Begriff per Vereinbarung eine absolute Konfiguration, welche relativ zu den zwei möglichen Stereoisomeren von Glycerinaldehyd, D-Glycerinaldehyd und L-Glycerinaldehyd, ist. Siehe zum Beispiel Lehninger, in "Biochemistry", Worth Publishers, Inc., New York, 1970, pp. 76-78. Demzufolge werden alle Stereoisomere, die stereochemisch in Beziehung zu L-Glycerinaldehyd stehen; mit L-bezeichnet und solche, die ähnlich zu D-Glycerinaldehyd sind; mit D- bezeichnet, unabhängig von der Richtung der Drehung der Ebene von dem polarisierten Licht, welche durch das Isomer vorgegeben wird.
In dem Fall von Threonin und Isoleucin existieren zwei stereochemische Zentren, d. h. die Cα-Atome und die Cβ-Atome. Die hierin angewendeten D-Threonin und D-Isoleucin weisen Stereochemien an den beiden Cα-Atomen der Aminosäuren auf, die entgegengesetzt sind zu der Stereochemie von L-Threonin und L-Isoleucin, d. h. D-Threonin und D-Isoleucin sind vollständige Spiegelbilder von L-Threonin, beziehungsweise L-Isoleucin.
Glycin ist die einzige, gewöhnlich achiral vorkommende Aminosäure. Dementsprechend ist gemeint, dass, wenn ein Protein oder Enzym hierin als ein D- oder L-Protein oder -Enzym bezeichnet wird, im Wesentlichen alle chiralen Aminosäurereste, welche derartige Proteine oder Enzyme umfassen, die angegebene Chiralität aufweisen. Das Vorhandensein von achiralen Aminosäureresten wie beispielsweise Glycin innerhalb von einem Protein oder Enzym beeinflusst nicht die Bezeichnung von seiner Chiralität wie sie hierin angewendet wird.
Alle chiralen Aminosäuren in Proteinen, die in der Natur beschrieben werden, sind L-Aminosäuren. Demzufolge sind Proteine, die nur chirale Aminosäuren mit einer D-Konfiguration in ihrer Sequenz der Aminosäurereste aufweisen (bezeichnet als D-Proteine), in der Natur unbekannt.
D-Proteine, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können eine Sequenz der Aminosäurereste aufweisen, die übereinstimmt mit, und vorzugsweise identisch ist zu, der Sequenz der Aminosäurereste von einem bekannten oder „natürlichen" Protein. Mit „natürlich" ist eine Sequenz gemeint, die in einem Protein vorhanden ist, das aus der Natur ohne Labor-vermitteltes Eingreifen, welches auf die Veränderung der Sequenz des Proteins gerichtet ist, isoliert wurde. Mit „bekannt" ist entweder ein natürliches Protein gemeint oder ein Protein, welches das Produkt von einem die Sequenz verändernden Prozess ist, der die Aminosäuresequenz verändert, um ein Protein mit bekannten Eigenschaften herzustellen.
Viele Proteine, die in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben werden, zu zahlreich, um sie hier aufzuzählen, sind der Gegenstand der Mutation von ihrer natürlichen Sequenz der Aminosäurereste derart geworden, dass sie nicht mehr länger in der Sequenz ihrer Aminosäurereste mit der Sequenz von dem natürlich isolierten Produkt übereinstimmen, und dennoch nach wie vor die ursprüngliche Aktivität aufrechterhalten. Dementsprechend zieht in einer weiteren Ausführungsform die vorliegende Erfindung die Verwendung von D-Proteinen in Betracht, welche Sequenzen von Aminosäureresten aufweisen, die mit bekannten Proteinen übereinstimmen.
Für die Zwecke dieser Erfindung ist es nützlich, die Spezifitäten der Proteinsubstratbindung, die chiral und achiral sind, zu unterscheiden.
Die chirale Spezifität bezieht sich auf die Selektivität von einem Protein nur an eines von zwei Stereoisomeren zu binden. Die achirale Spezifität bezieht sich auf die Fähigkeit von dem Protein, ein Substrat zu binden, das dem Protein nicht eine erkennungsabhängige asymmetrische Struktur präsentiert, d. h. die Protein-Substrat-Erkennung und die Bindung sind nicht abhängig von dem Vorhandensein von einer asymmetrischen Struktur in der Substratbindungsregion von dem Protein. Anders ausgeführt und in dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung, der sich auf die enantiomere Selektivität von einem D-Protein bezieht, ein achirales Substrat kann entweder an ein D- oder L-Protein binden, weil keine asymmetrischen Strukturen in dem achiralen Substrat vorhanden sind, von denen die Bindung abhängt. Im Gegensatz dazu kann ein chirales Substrat nur an das eine oder das andere von dem D- und L-Protein-Paar binden, weil die strukturelle Asymmetrie von dem Substrat in die Bindung eingebunden ist.
Viele Proteine und Enzyme weisen eine chirale Spezifität aus, einschließlich dem Enzym HIV-1-Protease, das später diskutiert wird. In ähnlicher Weise existieren viele Prote ine und Enzyme, die eine achirale Spezifität aufweisen, einschließlich Superoxid-Dismutase und Carboanhydrase.
Ein D-Protein, das in dieser Erfindung verwendet wird, kann von beliebiger Größe (Länge der Aminosäuren) sein und kann aus mehreren Untereinheiten zusammengesetzt sein. Ein D-Protein mit mehreren Untereinheiten ist vollständig aus D-Proteinuntereinheiten zusammengesetzt.
C. Synthese von D-Proteinen
Ein D-Protein, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann durch jegliche Mittel hergestellt werden, die für den Fachmann auf dem Polypeptidgebiet zur Verfügung stehen. Das präzise Verfahren, welches für das Synthetisieren des Polypeptids eingesetzt wird, wird nicht als unbedingt notwendig für die Grundstruktur von einem D-Protein, das in dieser Erfindung verwendet wird, erachtet und ist deswegen nicht als einschränkend zu betrachten, insbesondere da die Technologie neue Wege entwickelt, um Polypeptide zu synthetisieren und zusammenzusetzen.
Bevorzugte Routen der Polypeptid-Synthese beinhalten:

1. Konventionelle chemische Synthese, z. B. schrittweise Synthese, und
2. Zusammenfügen von Polypeptid-Bausteinen mittels chemischer Ligation.

Es wird gegenwärtig als unpraktisch betrachtet, die konventionellen chemischen (schrittweisen), synthetischen Verfahren einzusetzen, um Polypeptide herzustellen, welche mehr als 100 Aminosäurereste besitzen. Auf der anderen Seite können chemische Ligations-Verfahren eingesetzt werden, um Polypeptid-Proteine zusammenzusetzen, die um ein Mehrfaches größer sind. Demzufolge sind für D-Proteine, welche größer sind als 100 Aminosäurereste, chemische oder enzymatische Ligations-Techniken gegenwärtig die einzigen praktischen Mittel für die Herstellung derartiger Produkte. Hier ist eine Ligationsstrategie für die Herstellung von Mengen von 10-100 Milligramm der D- und L-HIV-1 Protease-Enzyme beschrieben.
Obwohl gegenwärtig nicht erhältlich, können fabrikmäßig hergestellte Proteinsynthese-Apparate, die D-Proteine verwenden, das Problem des Einbaus von D-Aminosäuren in dem Protein-Translationsmechanismus lösen, wodurch es möglich gemacht wird, D-Proteine unter Verwendung der rekombinanten DNA-Expression von Boten-RNA und D-Aminosäuren zu synthetisieren.
Konventionelle schrittweise Synthesen:
Chemische Synthesetechniken, wie beispielsweise die schrittweise Addition von Aminosäuren in einer Festphasen-Synthese vom Merrifield-Typ, werden bevorzugt aus Gründen der Reinheit, der antigenen Spezifität, des Freiseins von unerwünschten Nebenprodukten, der Einfachheit der Herstellung und dergleichen. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung von den zahlreichen Techniken, die für das Synthetisieren von L-Proteinen und -Enzymen zur Verfügung stehen, kann gefunden werden in Steward et al., in "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky et al., in "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, Second Edition, 1976 und Meienhofer, in "Hormonal Proteins and Peptides", Vol. 2, p. 46, Academic Press (New York), 1983; und in Kent, Ann. Rev. Biochem., 57: 957, 1988 für die Festphasen-Peptidsynthese und in Schroder et al., in "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 für die klassische Lösungssynthese, wobei jede hierin durch Verweis eingebunden ist. Zweckdienliche schützende Gruppen, die in einer derartigen Synthese verwendbar sind, sind in den oben angeführten Texten und bei McOmie in "Protective Groups in Organic chemistry", Plenum Press, New York, 1973 beschrieben, was durch Verweis hierin eingebunden ist.
Im Allgemeinen umfassen die Festphasen-Syntheseverfahren, die in Betracht gezogen wurden, die sequentielle Addition von einem oder mehreren Aminosäureresten oder passend geschützten Aminosäureresten an eine wachsende Peptidkette. Normalerweise ist entweder die Amino- oder die Carboxy-Gruppe von dem ersten Aminosäurerest durch eine passende, selektiv entfernbare Schutzgruppe geschützt. Eine unterschiedliche, selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für die Aminosäuren verwendet, die eine reaktive Seitengruppe enthalten, wie beispielsweise Lysin.
Für die Synthese von einem D-Protein werden D-Aminosäuren oder geschützte D-Aminosäuren anstelle der konventionellen L-Aminosäuren verwendet. D-Aminosäuren, die für die Polypeptidsynthese geeignet sind, sind handelsüblich erhältlich von dem Peptide Institute (Osaka, Japan); Peptides International (Louisville, KY); Bachem Bioscience (Philadelphia, PA) und Bachem California, (Torrance, CA).
Unter Verwendung einer Festphasensynthese als beispielhafte Synthese wird die geschützte oder derivatisierte D-Aminosäure an ein festes Trägermaterial durch ihre ungeschützte Carboxyl- oder Aminogruppe angeheftet. Die Schutzgruppe von der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann selektiv entfernt und die nächste D-Aminosäure in der Sequenz, wobei deren komplementäre (Amino- oder Carboxyl-) Gruppe geeignet geschützt ist, wird beigemischt und unter Bedingungen umgesetzt, die geeignet sind, die Amidbindung mit dem bereits an dem festen Trägermaterial befestigten Aminosäurerest zu bilden. Die Schutzgruppe von der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann von diesem neu hinzugefügten D-Aminosäurerest entfernt und die nächste D-Aminosäure (geeignet geschützt) wird dann hinzugefügt und so weiter. Nachdem alle erwünschten D-Aminosäuren in der korrekten Sequenz verbunden worden sind, werden jegliche Schutzgruppen der terminalen und der Seitengruppen (und von dem festen Trägermaterial) aufeinanderfolgend oder gleichzeitig entfernt, um das endgültige Polypeptid zu liefern.
Ligations-Techniken:
Die chemische Ligation von Polypeptiden ist vor kurzem durch Kent in der US-Patentanmeldung Seriennummer 07/865,368 , eingereicht am 8. April 1992, beschrieben worden. Diese Technik wird für D-Proteine, welche eine Länge von 100 Aminosäuren oder größer aufweisen, bevorzugt. In diesem Verfahren werden zuerst zwei Polypeptide synthetisiert, die Enden enthalten, welche für die chemische Ligation angepasst sind. Nach der schrittweisen chemischen Synthese und der Abspaltung von ihren entsprechenden Festphase-Harzen, werden die zwei Polypeptide gemischt und miteinander umgesetzt, um die angepassten Enden zusammenzufügen und ein größeres, lineares Polypeptid zu bilden, das aus den zwei Polypeptiden besteht.
Eine beispielhafte schrittweise Synthese von einem D-Enzym ist in allen Einzelheiten in Beispiel 1 angeführt, wobei die Synthese von einer Sonderform der D-HIV-1 Protease beschrieben ist. Beispiel 5 offenbart eine beispielhafte ligationsartige Synthese von D- und L-[Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1 Protease-Analoga. Das D-[Aba^67,9S(CO-S)^5I-52]₂HIV-1 Protease-Analog von Beispiel 5 ist funktionell äquivalent zu der D-HIV-1 Protease aus Beispiel 1.
Eine ähnliche Synthese kann für die Herstellung von D-Superoxid-Dismutase, -Carboanhydrase oder irgendeinem von den anderen D-Enzymen angewendet werden, die hierin beschrieben sind.
D. Verfahren zum Screenen chemischer Bibliotheken
Das am meisten gebräuchliche Mittel zur Identifizierung von pharmazeutisch nutzbaren Verbindungen beinhaltet das Screenen von chemischen Bibliotheken. Die Gründlichkeit von einem derartigen Screenen kann merklich erhöht werden durch das Einsetzen von sowohl L-Proteinen als auch D-Proteinen.
Naturprodukt-Bibliotheken, die aus der Natur isoliert wurden, können aus mehreren hunderttausend Verbindungen bestehen. Die chemischen Bibliotheken können ebenfalls durch chirale Synthese von bestimmten Enantiomeren oder durch nicht-chirale Synthese von Racematen hergestellt werden. Auf der Suche nach neuartigen Arzneimittelkandidaten können solche Bibliotheken gescreent werden, um Verbindungen zu identifizieren, welche in einem bestimmten Test aktiv sind. In vielen Fällen ist das Zielmolekül ein Agonist oder ein Antagonist von einem Proteinrezeptor oder von einem Protein, welches eine Rezeptorbindungsstelle aufweist und wobei die Suche ausgerichtet ist auf die Identifizierung von Arzneimittelkandidaten, welche als ein derartiger Agonist oder Antagonist dienen können. Sobald eine Kandidatenverbindung als ein Agonist oder ein Antagonist identifiziert ist, können Analoga von einer derartigen Kandidatenverbindung entworfen und synthetisiert werden, um so ihre Aktivität und andere wünschenswerte Eigenschaften zu verbessern.
In vielen Fällen ist die chirale Spezifität ein notwendiges Attribut von aktiven Agonisten oder von Antagonisten. Es ist jedoch hierin offenbart, dass die chirale Spezifität von den Agonisten und den Antagonisten von der Chiralität des Proteinrezeptors oder der Rezeptorbindungsstelle abhängt. Demzufolge kann der Rezeptor oder die Rezeptorbindungsstelle oft zwischen aktiven und inaktiven Enantiomeren von einem vorgegebenen Agonisten oder Antagonisten unterscheiden. Die Komponentenelemente von einer natürlichen Produktbibliothek weisen oft eine zufällige Chiralität auf und bringen keine innewohnende Beziehung zu dem Rezeptor oder der Rezeptorbindungsstelle hervor. Demzufolge ist, falls nur ein einzelnes Enantiomer innerhalb einer Bibliothek vorhanden ist, für die Chiralität von einem derartigen Enantiomer es genau so wahrscheinlich, unter Bezug zu einem beliebigen Zielenzym, dass es das falsche (inaktive) als auch das richtige (aktive) Enantiomer ist. Falls die Bibliothek nur gegen die native (L-) Konfiguration von einem Zielrezeptor oder einer Rezeptorbindungsstelle gescreent wird, und falls die Elemente von der Bibliothek Nicht-Racemate sind, d. h. falls sie chiral sind, existiert eine signifikante Chance (50/50), dass die Bibliothek nur das inaktive Enantiomer beinhaltet.
Die vorliegende Erfindung lehrt, dass das Screenen einer Naturprodukt-Bibliothek sowohl gegen einen L-Rezeptor oder ein L-Protein, welches eine Rezeptorbindungsstelle aufweist, als auch gegen seine dementsprechende D-Version, die Anzahl der Kandidatenverbindungen, die aus einer solchen Bibliothek identifiziert werden, ungefähr verdoppeln kann.
Irgendeine beliebige Kandidatenverbindung, die als aktiv gegen einen D-Rezeptor oder eine -Rezeptorbindungsstelle identifiziert worden ist, kann hinsichtlich der übereinstimmenden L-Version inaktiv sein. Die strukturelle Analyse von einer Kandidatenverbindung, welche im Hinblick auf eine D-Version aktiv ist, hat eine Vorhersagekraft von der Struktur einer Kandidatenverbindung, die mit Hinblick auf die korrespondierende L-Version aktiv ist, d. h. für die Enantiomere von Verbindungen, die im Hinblick auf eine D-Version aktiv sind, ist es wahrscheinlich, dass sie eine entsprechende Aktivität im Hinblick auf die korrespondierende L-Version aufweisen.
Demzufolge kann die Anzahl der Kandidatenverbindungen, welche positiv aus einer chemischen oder Naturprodukt-Bibliothek identifiziert wurden, signifikant erhöht werden, wenn die Bibliothek sowohl gegen die L- als auch die D-Version von dem Proteinrezeptor oder dem Protein, das eine Rezeptorbindungsstelle aufweist, gescreent werden.
Eingeschlossen in den Proteinrezeptoren, gegen welche die Naturprodukt- und/oder die chemischen Bibliotheken nutzvoll gescrennt werden können, sind die Folgenden: GPIIb-IIIa und LFA-1, Ruoslahti et al., Science, 238: 491-497 (1987); CSAT, Horwitz et al., J. Cell Biol„ 101: 2134 (1985); VLA-2, Nieuwenhuis et al. Nature, 318: 470 (1985); CR3 Complement Rezeptor, Wright et al., PNAS, 84: 1965 (1987); CR2 Complement-Rezeptor, Nemerow et al., J. Virol., 55: 3476 (1985); CD4 T-Zellrezeptor, Guyader et al., Nature, 320: 662 (1987); FRP-Rezeptor, Yu et al., Nature, 330: 765 (1987); Apolipoprotein-Rezeptor, Yamada et al., J. Clin. Invest., 80: 507 (1987); Interleukin-Rezeptor, Dower et al., Immunology Today, 8: 46 (1987); Fc-Rezeptor, Anderson et al., J. Immunol., 138: 2254 (1987); Somatostatin-Rezeptor, Kim et al., J. Biol. Chem., 262: 470 (1987); PDGF-Rezeptor, Keating et al., J. Biol. Chem., 252: 7932 (1987); und Transferrin-Rezeptor, Kohgo et al., Blood, 70:1955 (1987).
Andere Proteine, welche Bindungsstellen aufweisen, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gescreent werden können, beinhalten die Insulinrezeptor-Bindungsstelle an Insulin, die Reovirus-Rezeptor-Bindungsstelle an dem endgültigen Hämagglutininprotein, die Fibrinogen-Rezeptor-Bindungsstelle an Fibrinogen A-alpha, die Schilddrüsenhormonrezeptor-Bindungsstellen α und β, die LDL-Rezeptor-Bindungsstelle an ApoE, die Lipid-A Bindungsstelle, die Lecithin-Cholesterol Acyltransferase-(LCAT-) Bindungsstelle an ApoA1 und die Mac-1 Integrinrezeptor-Bindungsstelle an Fibrinogen D-30.
Beispiele
Die folgenden Beispiele sind vorgesehen, die Synthese und die Verwendung von D-Proteinen in der Form von D-Enzymen zu veranschaulichen.
1. Konventionelle schrittweise Synthese von L- und D-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 Protease (HIV-1 PR)
Fortschritte in der chemischen Totalsynthese von Proteinen machten die reproduzierbare Herstellung von homogener, kristalliner L-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 Protease (HIV-1 PR) möglich. Siehe zum Beispiel Kent, Annu. Rev. Biochem. 57: 957, (1988); Wlodawer et al., Science, 245: 616 (1989) und Miller et al., Science, 246: 1149 (1989).
Die HIV-1 Protease (HIV-1 PR) ist ein Virus-kodiertes Enzyme, welches Polypeptidketten mit hoher Spezifität schneidet und welches für die Replikation von aktiven Virionen unentbehrlich ist. Kohl et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.. 85: 4686, 1988. Das 21.500 Dalton große HIV-PR Molekül besteht aus zwei identischen, 99 Aminosäuren langen Polypeptidketten.
Die chemische Totalsynthese von wurde wie nachfolgend beschrieben durchgeführt und die Eigenschaften (kovalente Struktur, physikalische Eigenschaften, Circulardichroismus, enzymatische Aktivität) von den enantiomeren D- und L-Formen von diesem HIV-1 Proteaseenzym wurden miteinander verglichen.
Zu diesem Zweck wurden in getrennten chemischen Synthesen die geschützten Polypeptidketten, die mit den L- und D-Sequenzen von dem 99 Aminosäure langen [Aba^67, ⁹⁵] HIV-1 Protease-Monomer übereinstimmen, durch chemische Totalsynthese hergestellt. Aba entspricht L- oder D-a-Amino-n-buttersäure und wird als ein isosterischer Ersatz für Cys-Reste an den Positionen 67 und 95 in der Polypeptidkette des HIV-PR Monomers verwendet. Derselbe isosterische Ersatz wurde in den Arbeiten von Wlodawer et al., supra, und Miller et al., supra, verwendet, was zu den ursprünglichen ordnungsgemäßen Strukturen von HIV-PR führt.
Die chemische Synthese wurde in der konventionellen schrittweisen Art ausgeführt. Die 99 Aminosäuren langen Polypeptidketten wurden aus geschützten L-Aminosäuren, beziehungsweise geschützten D-Aminosäuren zusammengesetzt. Die t-Boc-D- und L-Aminosäure-Derivate wurden von dem Peptide Institute (Osaka, Japan) und Peptides International (Louisville, KY) erhalten, außer: Boc-L-Aba, Boc-L-Asn(Xan), Boc-D-Ile und Boc-D-His(Bom) wurden erhalten von Bachem Bioscience (Philadelphia,PA); Boc-D-Asn(Xan), Boc-D-Asp(OcHex) und Boc-D-Glu(OcHex) wurden erhalten von Bachem California, (Torrance, CA); Boc-D-Lys(ClZ), kristallisiert aus dem TBA-Salz wurde von dem Peptide Institute erhalten und D-Aba (Sigma, St. Louis, MO), was zu t-Boc-D-Aba umgewandelt und als das DCHA-Salz isoliert wurde. Andere Seitenketten-Schutzgruppen, die verwendet wurden, waren: Arg (Tos), Tyr (BrZ), L-His (Tos), D-His (Bom) und Thr (BzL). Der Gehalt der L-Enantiomere von den Präparationen der Boc-D-Aminosäuren lag zwischen 0,01 und 0,08 % (Spezifikationen des Herstellers). Der schrittweise Kettenaufbau wurde in einer maschinen-unterstützten Art und Weise an einem Applied Biosystems 430A Syntheseapparat (0,2 mmol Skala mit D- oder L-Boc-Phe-OCH₂-Pam Harz) durchgeführt. Jeder Zyklus der Aminosäure-Addition beinhaltete: unverdünnte (100 %) TFA [2 × 30 Sek. fließendes Waschen, plus 1 Minute chargenweise Behandlung]; fließendes Waschen mit DMF [1 × 22 Sek., 1 × 38 Sek.]; Kopplung [1 × 10 Minuten] mit gleichzeitiger in situ Neutralisation [Boc-Aminosäure (2,25 mmol) voraktiviert durch Reaktion mit HBTU (2,22 mmol) und DIEA (6,4 mmol) in DMF für 2 Minuten]. Für die in situ Neutralisationsmethode ist gezeigt worden, dass sie in vernachlässigbaren Konzentrationswerten der Racemisierung resultiert. Henklein et al., in "Innovation & Perspectives in Solid Phase synthesis", R. Epton Ed., SPPC Ltd., Birmingham, U.K., 1992. Die zusammengesetzten Peptide wurden entschützt und von dem Harz in 9:1 HF/p-Cresol (Resorcinol und Thiocresol waren gegenwärtig, wenn His(Bom) in der Sequenz eingebaut war) nach der Entfernung von der Boc-Gruppe und der Formyl-Gruppe von Trp (mit Ethanolamin) abgespalten.
Nach der Entschützung wurden die D- und L-Produkte individuell aufgearbeitet und die synthetischen Enzyme wurden anschließend durch Falten der Polypeptidpolymere aus der denaturierenden Substanz wie bei Wlodawer et al., supra, und Miller et al., supra, beschrieben, hergestellt. Zu diesem Zweck wurden, nach der Entschützung und der Abspaltung, die rohen Peptidprodukte mit Ether ausgefällt und vor der semi-präparativen Anreicherung über C18-RP-HPLC und der Faltung durch Dialyse in 10 % Glycerol, 25 mM NaH₂PO₄-Puffer, pH 7,0, mit 6 M Guanidin-Hydrochlorid in einem NaHCO₃-Puffer, pH 8,0, aufgelöst. Nach der Konzentrierung unter Hochvakuum zu einer Lösung in Glycerol wurden die Enzyme durch Aminosäure-Analyse quantifiziert und bei 4 °C gelagert.
Die Gesamtausbeute für die Synthese von L-[Aba^{67,95,167,195}] HIV-1 Protease (HIV-1 PR) betrug näherungsweise 2 Milligramm oder 0,09 %.
Die Gesamtausbeute für die Synthese von D-[Aba^{67,95,167,195}] HIV-1 Protease (HIV-1 PR) war unbestimmbar, da sie weniger als 2 Milligramm betrug.
2. Strukturanalyse von der obigen L- und D-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 Protease (HIV-1 PR)
Das 99 Aminosäuren lange D-Enzym-Monomer, D-[Aba⁶⁷ ^, ⁹⁵]HIV-1 Protease, wurde auf verschiedene strukturelle Eigenschaften hin untersucht und mit den strukturellen Eigenschaften von dem L-Isomer verglichen. Zum Beispiel ergab die analytische Umkehrphasen-HPLC identische Retentionszeiten für die zwei synthetischen Polypeptidketten.
Die Proben der gereinigten, gefalteten, chemisch syntheti sierten [Aba^67, ⁹⁵]HIV-1 Protease-Monomere, die in Beispiel 1 in MES-Puffer, pH 6,5, 10 % Glycerol hergestellt wurden, wurden einer Entsalzung mittels Umkehrphasen-HPLC unterworfen. Die gesammelten Proteinspitzen wurden jeweils getrennt durch Ionenspray-Massenspektrometrie analysiert, wie bei Bruins et al., Anal. Chem., 59: 2642 (1987) beschrieben. Unter den verwendeten Bedingungen (50 % Acetonitril, 50 % Wasser, 0,1 % TFA) ist das Enzym denaturiert. In den dargestellten rekonstruierten Massenspektren, sind die rohen m/z-Daten einem digitalen Hochpassfilter unterworfen und danach sortiert worden, um alle molekularen Ausgangsspezies zwischen 10 kDa und 110 kDa zu ergeben. Dieses Rekonstruktionsverfahren vermindert mathematisch die multiplen Ladungszustände, welche für eine vorgegebene Molekülspezies beobachtet werden, auf eine einzelne Molekülmasse.
Mittels rekonstruierter Ionenspray-Massenspektrometrie betrug die beobachtete Molekülmasse von dem L-Enzym 10.748 ± 4 Dalton (Da) und die Masse von dem D-Enzym betrug 10.752 ± 3 Da. Berechnete Masse: (monoisotopisch) 10.748,0 Da; (Durchschnittswert) 10.754,7 Da.
Dementsprechend wiesen die zwei Produkte (D- und L-Enzym-Monomere), innerhalb der experimentellen Unsicherheit, dasselbe Molekulargewicht auf, wenn sie mittels Ionenspray-Massenspektrometrie gemessen wurden. Die Daten der Ionenspray-Massenspektrometrie sind in den 1A und 1B dargestellt.
Die vollständige Aminosäuresequenz von dem 99 Aminosäure langen D-Enzym-Monomer wurde durch Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie-Auslesung (MALDI-TOF; Modell API-III Massenspektrometer, P.E. SCIEX Inc. Thornhill, Toronto, Kanada) bestimmt und es konnte gezeigt werden, dass sie identisch zu der von dem L-Enzym war. Demzufolge wiesen die zwei synthetischen Enzymmoleküle eine identische kovalente Struktur auf.
Auf der anderen Seite wurden die Unterschiede zwischen den zwei Molekülen durch verschiedene chirale Interaktionen deutlich gemacht. Die Circulardichroismus-(CD-)Spektren von den individuellen D- und L-HIV-1 Protease-Enantiomeren wurden über einen Bereich von 260-195 nm bei pH 5,5 in einer wässrigen Lösung, die 5 Glycerol enthielt, bei 25 °C unter Verwendung von einer Quarz-Küvette mit 1 mm Weglänge in einem Aviv CD-Spektrometer aufgenommen. Die CD-Spektren ließen gleiche und gegensätzliche optische Drehungen erkennen, wie es für enantiomere Proteinmoleküle erwartet wird.
3. Enzymatische Eigenschaften von der obigen L- und D-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 Protease (HIV-1 PR)
Die enzymatischen Eigenschaften von dem enantiomeren Protein, welches D-Aminosäuren enthält, wurden untersucht und verglichen mit dem L-Isomer unter Verwendung von einem fluorogenen Test, welcher ein Hexapeptid-Analog von einer natürlichen GAG-Spaltungsstelle als Substrat einsetzt, wie bei Toth et al., Int. J. Peptide Protein Res., 36: 544 (1990), beschrieben.
Die fluorogenen Tests wurden mit 15-μl Aliquots (entsprechend zu 1,75 μg Protein (± 10 %)) von jedem Enzym-Enantiomer in 10 Glycerol, 100 mM MES-Puffer, pH 6,5, die zu einer Lösung von 50 mM D- oder L-fluorogenem Substrat in MES-Puffer hinzugefügt wurden, durchgeführt. Das Substrat für das Enzym wies die Sequenz 2-Aminobenzoyl-Thr-Ile-Nle-Phe(p-NO2)-Gln-Arg·Amid (SEQ-ID Nr. 2) auf. Das Substrat wurde entweder mit den D- oder L-Aminosäure-Derivaten synthetisiert, um die entsprechenden enantiomeren Formen bereitzustellen.
Die Ergebnisse von dem fluorogenen Test sind in den 2A, 2B, 2C und 2D dargestellt. Aliquots, die gleiche Mengen (wie durch die Aminosäure-Analyse bestimmt) von den gereinigten, gefalteten Enzympräparationen enthielten, wurden in dem fluorogenen Test verwendet. Die Zunahme in der Fluoreszenz wurde auf einem Kurvenregistriergerät fortlaufend aufgezeichnet. Die Daten veranschaulichen, dass die zwei synthetischen Enzymmoleküle gleich aktiv sind, aber sie offenbarten eine umgekehrte chirale Spezifität, da das L-Enzym nur die L-Substrate spaltete, während das D-Enzym nur die entsprechenden D-Substrate spaltete.
In einer ähnlichen Studie wurden die D- und die L-Enantiomere von dem Pseudopeptid-Inhibitor, MVT101 (Ac-Thr-Ile-Nle-psi[CH₂NH]-Nle-Gln-Arg·Amid), (SEQ-ID Nr. 1), hergestellt wie durch Miller et al., Science, 246: 1149 (1989) beschrieben, auf ihre Wirkung auf die D- und L-HIV Protease untersucht. Die Ergebnisse von den Untersuchungen sind in Tabelle 1 dargestellt.
TABELLE 1
Chirale Inhibitoren weisen eine reziproke chirale Spezifität gegenüber D- und L-HIV PR^a auf.

L-MVT101 D-MVT101 Evans Blue^b

L-HIV PR + – +

D-HIV PR – + +

^a Die D- und L-Enzyme wurden durch das fluorogene Testverfahren, welches zuvor beschrieben wurde, unter Verwendung des korrespondierenden chiralen Substrates in der Gegenwart der 5 X IC₅₀-Konzentration von dem Inhibitor getrennt untersucht.
^b Der Inhibitor Evans Blue ist ein nichtpeptiderger, achiral gemischt kompetitv-unkompetitiver Inhibitor von dem HIV-1 PR.

Die chiralen Inhibitoren waren nur gegen das entsprechende Enantiomer von dem Enzym wirksam, d. h. L-MVT101 inhibierte L-HIV PR, aber nicht die durch D-HIV PR-katalysierte Reaktion, und D-MVT101 inhibierte D-HIV PR, aber es hatte keine Wirkung auf die L-Enzym-katalysierte Reaktion. Interessanterweise war der achirale Inhibitor Evans Blue, welcher gemischte Inhibierungskinetiken zeigte, ein potenter Inhibitor von beiden Enantiomeren des Enzyms (Tabelle 1).
Die HIV-1 Protease liegt als ein Homodimer vor; das heißt, ein einzelnes Enzymmolekül ist aus zwei identischen, aus 99 Resten bestehenden, gefalteten Polypeptidketten aufgebaut. Wlodaver et al., Science, 245: 616 (1989); und Miller et al., Science, 246: 1149 (1989). HIV PR ist höchst aktiv, wobei sie eine Geschwindigkeitserhöhung von etwa 1010-fach über die unkatalysierte Hydrolyse der Peptidbindung zeigt. Kent et al., in "Viral Proteinases as Therapeutic Targets", Winner et al., Eds., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, pp. 223-230; und Richards et al., FEBS Lett., 247: 113 (1989). Es ist ein höchst spezifisches Enzym, welches sowohl Peptide als auch Proteine spaltet (Kent et al., supra; und Kröusslich, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 807, 1989) und seine Spezifität wird bestimmt durch die Interaktionen von dem dreidimensional gefalteten Enzymmolekül, welches einen Komplex mit sechs aufeinanderfolgenden Aminosäureresten in der Substrat-Polypeptidkette bildet. Miller et al., Science, 246: 1149 (1989); und Kent et al., supra.
Wie bei allen Enzymen verdankt HIV PR seine Spezifität und katalytische Aktivität der präzisen dreidimensionalen Struktur, welche durch die spezifische Faltung von der Polypeptidkette gebildet wird, und den präzisen geometrischen Wechselwirkungen in den spezifischen Komplexen, welche mit den Substraten gebildet werden. Fersht, in "Enzyme Structure and Mechanism", W. H. Freeman and Company, San Francisco, 1977, pp. 75-81. Die beobachteten reziproken chiralen Spezifitäten zeigen deswegen, dass die gefalteten Formen von den D- und L-Enzymmolekülen Spiegel bilder voneinander in allen Elementen von der dreidimensionalen Struktur sind, welche für die enzymatische Aktivität verantwortlich ist. Die weitreichende Art von dieser Art der Wechselwirkungen setzt voraus, dass die zwei Enzymmoleküle Spiegelbilder in jeder Beziehung sind (21), was mit den beobachteten gleichen und entgegengesetzten CD-Spektren übereinstimmt. Vor allem ist die gefaltete Form von dem Polypeptid-Rückgrat (d. h. unter nicht Beachtung der Seitenketten) selbst eine chirale Einheit, welche in der Spiegelbildform in den zwei Protein-Enantiomeren existieren muss, wie in den 3A und 3B dargestellt.
Die Bandmodell-Darstellung von den L- und D-[Aba^{67,95,167,195}]HIV-1 Proteasen, die in 3 dargestellt ist, basiert auf den röntgenkristallografischen Koordinaten von dem chemisch synthetisierten Enzym, wenn es mit einem von einem Substrat abgeleiteten Peptidinhibitor komplexiert ist (Inhibitor ist nicht dargestellt), wie durch Miller et al., Science, 246: 1149 (1989) beschrieben. Dieses Modell wurde mittels der Durchführung von einer Spiegelbildtransformation der Daten des L-Enzyms erzeugt.
Die gefalteten dreidimensionalen Band-„Rückgrat"-Strukturen stellen nicht deckungsgleich übereinanderlegbare Spiegelbilder dar und enthalten zahlreiche chirale Elemente. Diese werden in sekundären und supersekundären Strukturen, in der Tertiärstruktur und in der Quaternärstruktur, wie in den 3A und 3B veranschaulicht, gefunden. Es ist zum Beispiel zur Kenntnis zu nehmen, die Beziehung von den Wulstbändern zueinander, die Beziehung von den Helixsegmenten zu den benachbarten β-Strängen; die charakteristische Windung (rechtshändig, in der L-Protease) von den antiparallelen β-Strängen in jedem Wulstband, beschrieben durch Richardson et al., in "Protein Folding", Gierasch et al., Eds., American Association of the Advancement of Science, Washington, D.C., 1990, pp. 5-17; und die Händigkeit von den helikalen Segmenten. Da das einzige chirale Element, welches in die chemisch synthetisierten Polypeptidketten eingeführt wurde, die Stereochemie an den Ca-Atomen der Aminosäuren (und den Cβ-Atomen von Thr und Ile) ist, verlangen die hierin präsentierten Daten, dass alle stereochemischen Aspekte von dem gefalteten Enzymmolekül, von der sekundären bis zur quartären Struktur, einfach durch die Stereochemie von dem Polypeptid-Rückgrat bestimmt werden. Demzufolge sind die vorliegenden reziproken chiralen Eigenschaften von den chemisch synthetisierten Enzym-Enantiomeren eine grundsätzliche Demonstration, dass die endgültig gefaltete/dreidimensionale Struktur und die daraus resultierenden biologischen Aktivitäten von diesem 21.500 Dalton homodimeren Enzymmolekül vollständig durch die Aminosäuresequenz bestimmt sind.
Die L- und D-Enzyme in dieser Untersuchung haben niemals biosynthetische Bedingungen gesehen und sind somit niemals mit biochemischen Faktoren von irgendeiner Gattung in Kontakt gekommen. Interessanterweise wird das einfache homodimere Enzymmolekül, welches hier untersucht wird, schnell und akkurat gebildet (sowohl Faltung und Zusammenbau), sogar bei den relativ niedrigen Konzentrationen, die in den Testbedingungen verwendet wurden, sowie unter den Faltungsbedingungen der Dialyse von der denaturierenden Substanz. Die hierin beschriebenen Ergebnisse stellen einen überzeugenden Beweis dar, dass, was auch immer ihre vorgeschlagene Rolle sein mag, biosynthetische Faktoren nicht für die Bildung von der ordnungsgemäßen, funktional gefalteten und zusammengesetzten Form von dem Protein benötigt werden.
Die beobachteten reziproken chiralen Eigenschaften von den Spiegelbild-Enzymmolekülen, welche hierin beschrieben werden, untermauert und verallgemeinert die chirale Natur von den biochemischen Wechselwirkungen der Proteine. Den chiralen Eigenschaften von den Proteinmolekülen selbst, welche den Anlass geben zu diesem Verhalten, wird nur eine oberflächliche Aufmerksamkeit in biochemischen Texten gewidmet. Wir können jetzt feststellen, basierend auf experimentellen Beweisen, dass Protein-Enantiomere eine reziproke chirale Spezifität in ihren biochemischen Wechselwirkungen, einschließlich der Katalyse, zeigen werden.
Die Beobachtung, dass beide Enantiomere von HIV PR gleichartig durch den achiralen Inhibitor Evans Blue beeinträchtigt wurden, stellt eine Anzahl von signifikanten Schlussfolgerungen bereit. Erstens, das unnatürliche Enantiomer von einem Enzym, das an einem achiralen Substrat wirkt und ein achirales Produkt ergibt, wird in vivo vollständig funktionsfähig sein. Dieser Aspekt stellt bedeutende potentielle therapeutische Anwendungen bereit. Beispiele sind Carboanhydrase und Superoxid-Dismutase. Von den D-Enzymen wird angenommen, dass sie in vivo langlebig sind (in einer L-Protein Biosphäre), weil sie resistent sein werden gegenüber den natürlich auftretenden Proteasen, welche im Allgemeinen nur Proteine angreifen werden, die aus L-Aminosäuren aufgebaut sind. Die D-Proteine sind vergleichsweise weniger immunogen als L-Proteine, da lange Polypeptide, welche vollständig aus D-Aminosäuren aufgebaut sind nicht prozessiert werden und nicht so wirksam durch das Immunsystem präsentiert werden wie Polypeptide, welche aus L-Aminosäuren aufgebaut sind.
Die D-Proteinmoleküle weisen weitere potentielle praktische Anwendungen auf. Zum Beispiel besitzen Enzym-Enantiomere eine Verwendbarkeit als chirale Katalysatoren in der selektiven Herstellung von einem reinen Enantiomer von einer Feinchemikalie. Eine enantiomerisch reine Chemikaliensynthese weist Anwendungen in der Produktion von menschlichen Pharmazeutika auf. Darüber hinaus können Protein-Enantiomere zu der Erfassung von Phasendaten in der Röntgen-Kristallographie beitragen, wie durch Mackay, Nature, 342: 133 (1989) beschrieben. Zentrum-symmetrische Kristalle, welche durch die Co-Kristallisation von einem D-, L-Proteinpaar gebildet wurden, würden außerordentlich vereinheitlichte Phasen aufweisen und noch verlässlichere Röntgenstruktur-Daten bereitstellen. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind D-Enzyme, und D-Proteine im Allgemeinen, nur durch chemische Totalsynthese zugänglich. Während der ribosomalen Synthese von Polypeptidketten, sogar in in vitro Translationssystemen, werden D-Aminosäuren nicht in die wachsenden Polypeptide eingebaut werden. Ellman et al., Science, 255: 197 (1992).
4. Diskussion der Beispiele 1-3
Die D- und die L-Formen von dem Enzym HIV-1 Protease werden hierin durch chemische Totalsynthese hergestellt. Die zwei Proteine weisen identische kovalente Strukturen auf. Die gefalteten Protein-/Enzym-Enantiomere weisen jedoch eine reziproke chirale Spezifität an den Peptidsubstraten auf. Das bedeutet, dass jedes Enzym-Enantiomer nur die entsprechenden Substrat-Enantiomere schneidet. Die reziproke chirale Spezifität war ebenfalls in der Wirkung von den enantiomeren Inhibitoren von den HIV-1 Proteaseenzymen, die hierin hergestellt wurden, offensichtlich. Diese Daten zeigen, dass die gefalteten Formen von den chemisch synthetisierten D- und L-Enzymmolekülen Spiegelbilder voneinander in allen Elementen von der dreidimensionalen Struktur sind. Die enantiomeren Proteine offenbaren eine reziproke chirale Spezifität in allen Aspekten von ihren biochemischen Wechselwirkungen, behalten ihre enzymatische Aktivität bei und stellen eine große Auswahl von brauchbaren Zusammensetzungen bereit, wie hierin beschrieben.
5. Synthese und Ligation von D- und L-[Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1 Protease-Analoga.
4 veranschaulicht eine schematische Darstellung von der Strategie, welche für die Totalsynthese von den D- und L-[Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1-Protease Analoga angewendet wurde. Geschützte D- und L-Aminosäuren können von dem Peptide Institute (Osaka, Japan); Peptides International (Louisville, KY); Bachem Bioscience (Philadelphia, PA) und Bachem California, (Torrance, CA) erhalten werden und besaßen < 0,03 % von dem entgegengesetzten Enantiomer. Die HPLC-gereinigten, funktionalisierten, ungeschützten Peptidsegmente, welche durch die schrittweise Festphasensynthese zusammengebaut wurden, werden in der Gegenwart von 6M Guanidin-Hydrochlorid (GuHCl) umgesetzt, um die ligierten, 99 Reste langen D- und L-[(NHCH₂COSCH₂ CO)^51-52]HIV-1 PR-Produkte zu bilden. (Schnölzer et al., (1992), Science 256, 221-225.) Der eingerahmte Bereich von 4 repräsentiert die Struktur von dem Thioester-Analog von der Peptidbindung Gly⁵¹-Gly⁵² an der Stelle, wo die Ligation stattfand. Der Thioester dient als eine Verbindung zwischen den zwei D-Peptiden, d. h. der Stelle von der Ligation. Eine Selenolester-Verbindung kann ebenfalls für die Ligation von zwei D-Peptiden eingesetzt werden.
Zwei große Peptidsegmente, d. h. [αCOSH]HIV-1 PR(1-51) und [N^α-BrCH₂CO]HIV-1 PR (53-99) werden, wie in 5 veranschaulicht, in getrennten Synthesen durch ein äußerst optimiertes, maschinen-unterstütztes SPPS-Protokoll, das an einer modifizierten ABI 430A Syntheseapparatur durchgeführt wird, unter Verwendung der Boc-Chemie zusammengesetzt. (Kent et al., "Innovation & Perspectives in Solid-Phase Synthesis", (1992) Ed. Epton, R. SPPC Ltd. Birmingham, U.K.). Das Protokoll umfasste das Entfernen von der Na-Boc-Gruppe mit unverdünnter TFA (2 Minuten insgesamt), gefolgt durch ein fließendes Waschen mit DMF, um das TFA-Peptid-Harz-Salz zu ergeben, und einem einzigen, 10 Minuten dauernden Kopplungsschritt unter Verwendung von HBTU-aktivierten Boc-Aminosäuren und der in situ Neutralisation mit DIEA in DMF. Die Entschützungs- und Kopplungs-Reaktionen sind durch einen Waschschritt mittels Durchfluss voneinander getrennt. Nach der Reinigung werden die Monomere getrennt durch Dialyse in der Gegenwart von D-, beziehungsweise L- MVT101-Inhibitor gefaltet, um die homodimeren Enzyme zu erhalten. Die Milligramm-Ausbeuten von jedem Produkt sind in 4 bereitgestellt.
Das [αCOSH]HIV-1 PR(1-51)-Peptid kann an einem 4-[a(Boc-Gly-S)benzylI]phenoxyacetamidomethyl-Harz zusammengesetzt werden. Das [Nα-BrCH₂CO)HIV-1 PR[53-99]-Peptid kann durch Bromacetylierung von [Aba^67,95]HIV-1 PR(53-99)-OCH₂-Pam-Peptidharz hergestellt werden. (Yamashiro et al., (1988) Int. J. Peptide Protein Res. 31, 322-334). Alle Peptide werden durch Behandlung mit hohem HF gespalten und entschützt.
Nach der Reinigung mittels der präparativen Umkehrphasen-HPLC (Vydac 218TP101550 – 5 × 25cm, 0,1 % TFA/CH₃CN & 30-50 ml/Min.) werden die funktionalisierten Peptidsegmente in der Gegenwart von 6 M GuHCl (in 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 5,3) für 48 Stunden umgesetzt, um die ligierten D- und L-[(NHCH₂COSCH₂CO)_51-52] HIV-1 PR-Monomere zu bilden. 6 veranschaulicht ein zusammengesetztes Chromatogramm, das die zwei gereinigten, funktionalisierten, ungeschützten Segmente darstellt und das endgültige (48 Stunden) Ligationsprodukt der Reaktion (fett gedruckt), das auf einer Vydac 218TP5415-Säule laufen lassen wurde, eluiert durch 0,1 % TFA (Puffer A) und 0,9 % TFA/CH₃CN, 1:9 (Puffer B), bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/Min.
Nach der Reinigung durch Umkehrphasen-HPLC können die Produkte getrennt mittels Dialyse in 25 Millimolar Phosphatpuffer, pH 5,5, in der Gegenwart von einem 10-fachen Überschuss von entweder dem D- oder dem L-[MVT101]-Inhibitor (Ac-Thr-Ile-Nle-ψ-[CH₂NH]-Nle-Gln-Arg·NH₂) (SEQ-ID Nr. 1) gefaltet werden, um die homodimeren Enzyme zu erhalten. (Miller et al., (1989) Science 246, 1149.) Die Ausbeuten der Reaktionsschritte für die Synthese von den D- und L-[Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1 Protease-Analoga sind in 7 bereitgestellt.
Die Gesamtausbeute im Hinblick auf die Synthese von dem D-[Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1 Protease-Analog betrug 48 Milligramm oder 3 %.
Die Gesamtausbeute im Hinblick auf die Synthese von dem L-[Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1 Protease-Analog betrug 47 Milligramm oder 2,5 %.
6. Physikalische Charakterisierung von den Ligationsprodukten, den D- und L-[Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1 Protease-Analoga.
Die Ionenspray-Massenspektrometrie von den HPLC-gereinigten ligierten Produkten ist in den 8A, 8B, 8C und 8D veranschaulicht. Die Ionenspray-Massenspektrometrie offenbart in jedem Fall einzelne Molekülspezies mit beobachteten Molekularmassen von 10.768,9 ± 1,4 Dalton (D-Enantiomer) und 10.769,4 ± 0,9 Dalton (L-Enantiomer) [Berechnet: 10763,9 Dalton(monoisotopisch) und 10770,8 Dalton (Mittelwert)]. Geringe Mengen an Dehydratations-Nebenprodukten wurden ebenfalls nachgewiesen. Die Sequenzen von den Monomeren wurden ebenfalls durch eine neue Proteinleiter-Sequenzierungstechnik unter Verwendung einer Einschritt-Laserdesorptions-Massenspektrometer-Auslesung untersucht. Die 8A und 8C veranschaulichen die markierten Spitzen, die eine einzelne Molekülspezies repräsentieren, welche sich in der Anzahl der überschüssigen Protonen unterscheidet. Die beobachteten Molekülmassen von den ligierten Produkten betragen 10.768,9 ± 1,4 Dalton (D-Enantiomer) und 10.769,4 ± 0,9 Dalton (L-Enantiomer) [Berechnet: 10.763,9 Dalton (monoisotopisch) und 10.770,8 Dalton (Mittelwert)]. Die 8B und 8D veranschaulichen die rekonstruierten Massenspektren, in welchen die Rohdaten, die in den 8A und 8C dargestellt sind, auf einen einzelnen Ladungszustand reduziert wurden. Alle Datenpunkte in den 8A und 8C sind in den Berechnun gen enthalten und es ist keine mathematische Filterung durchgeführt worden. Die Massenbereiche von 10 bis 11 kDa sind der Übersichtlichkeit halber dargestellt worden.
Die 9A bis 9D veranschaulichen die Messungen der Umkehrphasen-HPLC von den D- und L-[Aba^67,95, (CO-S)^51-42]HIV-1 PR Ligationsprodukten. Die ligierten Produkte von dem 6 M GuHCl-Schritt weisen in jedem Fall eine einzelne Spitze auf. Die 9A und 9C veranschaulichen die gereinigten, ligierten Monomere in 6 M GuHCl. Die 9B und 9D veranschaulichen die homodimeren Enzyme, welche in der Gegenwart von dem D- oder beziehungsweise dem L-[MVT101]-Inhibitor in 25 Millimolar Natriumphosphat-Puffer, pH 5,5, gefaltet wurden. Es ist zur Kenntnis zu nehmen, dass, nach der Faltung, eine Anzahl von unbedeutenden Autolyse-Produkten sowohl in den D- als auch in den L-[Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1-Protease-Präparationen zu sehen sind. Nach ungefähr 27 Minuten werden geringfügige proteolytische Produkte von dem MVT-101-Inhibitorpeptid ebenfalls gesehen. Es scheint, als ob sogar in der Gegenwart von einem großen Überschuss an Inhibitor das Enzym immer noch einem geringfügigen Grad der Autolyse unterworfen ist. Die Proben wurden auf einer Vydac 218TP5415-Säule laufen lassen, eluiert durch 0,1 % TFA (Puffer A) und 0,9 % TFA/CH₃CN, 1:9 (Puffer B), bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/Min.
Die 10A und 10B veranschaulichen die Fern-Ultraviolett Circulardichroismus-Spektren von den gefalteten D- und L-Protease Präparationen. Die Spektren wurden in 25 Millimolar Natriumphosphat-Puffer, pH 5,5 (0,4 mg/ml Protease in der Gegenwart von dem Inhibitor) bei 25 °C in einer Quarz-Küvette mit einer Weglänge von 1 Millimeter aufgenommen. Jede Präparation ist von gleichem Ausmaß, aber entgegengesetzten Vorzeichen, wie es für Spiegelbild-Proteine erwartet wird. (Corigliano-Murphy et al., (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 225; und Zawadzke et al., (1992) J. Am. Chem. Soc. 114, 4002).
7. Charakterisierung von der enzymatischen Aktivität der Ligationsprodukte, den D- und L-[Aba^67,95(CO-S)⁵¹⁵²]₂HIV-1 Protease-Analoga.
11 veranschaulicht die enzymatische Aktivität von den D- und L-[Aba^67,95, (CO-S)^51-52]₂HIV-1-PR Enantiomeren, welche durch ihre Einwirkung auf die D- und L-Isomere von dem Hexapeptid-Substrat Ac-Th-Ile-Nle-Nle-Gln-Arg·Amid (einem Analog von der p24/p15-GAG viralen Prozessierungsstelle) bestimmt werden kann. Das D-Enzym spaltet nur das D-Substrat und ist inaktiv an dem L-Substrat, während hingegen das L-Enzym eine vollständige Aktivität gegenüber dem L-Substrat zeigt, aber inaktiv gegenüber dem D-Substrat ist.
Diese reziproke chirale Spezifität ist ebenfalls augenscheinlich in der Wirkung von chiralen Inhibitoren. Wie in der Tabelle gezeigt, inhibieren D- und L-[MVT101] die Spaltung von chiralen fluorogenen Substraten durch die D-, beziehungsweise die L-HIV-1 PR-Analoga, aber haben ebenfalls keinen Einfluss auf die Wirkung an dem entgegengesetzten Enantiomer. Interessanterweise inhibierte der achirale Inhibitor Evans Blue, welcher gemischte Inhibierungskinetiken zeigte, die beiden Enantiomere des Enzyms.
Tabelle
Chirale Inhibitoren weisen eine reziproke chirale Spezifität gegenüber D- und L-[Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1 PR auf.

L-MVT101 D-MVT101 Evans Blue

D-[Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1 PR + – +

L- [Aba^67,95(CO-S)^51-52]₂HIV-1 PR – + +
Die D- und L-Enzyme wurden getrennt durch das fluorogene Testverfahren unter Verwendung des korrespondierenden chiralen Substrates in der Gegenwart der 5-fachen IC₅₀-Konzentration von dem Inhibitor untersucht. Die fluorogenen Tests wurden durchgeführt mit 15-μl Aliquots (entsprechend zu 1,75 mg Protein (± 10 %)) von jedem Enzym-Enantiomer in 100 Millimolar MES-Puffer, pH 6,5, die zu einer Lösung von 50 mM D- oder L-fluorogenem Substrat in MES-Puffer hinzugefügt wurden. Das Substrat wies die Sequenz 2-Aminobenzoyl-Thr-Ile-Nle-Phe(p-NO2)-Gln-Arg·Amid (SEQ-ID Nr. 2) auf: sie wurde entweder mit den D- oder den L-Aminosäure-Derivaten synthetisiert, um die entsprechenden enantiomeren Formen bereitzustellen. Der Inhibitor Evans Blue ist ein nichtpeptiderger, achiral gemischt kompetitv-unkompetitiver Inhibitor von dem HIV-1 PR Enzym.
Die enzymatische Aktivität von den [Aba^67-95, (CO-S)^51-52]₂HIV-1-PR Enantiomeren unter Bezug auf die D- und L-Isomere von dem Substrat Ac-Thr-Ile-Nle-Nle-Gln-Arg·Amid (SE-ID Nr. 3) kann gemessen werden wie folgt: Das Substrat (1 mg/ml) wird mit dem Enzym (0,1 mg/ml) bei pH 6,5 (MES-Puffer, 100 mM) für 30 Minuten bei 37 °C behandelt. Ein Aliquot der Reaktionsmischung wird anschließend mit einem linearen Gradienten 0-40 % Puffer B (0,09 % TFA/CH₃CN, 1:9) in Puffer A (0,1 % TFA) über 20 Minuten (Flussgeschwindigkeit 1 ml/Min, A^214nm) chromatographiert (Vydac 218TP5415 RP HPLC-Säule). Die Peptidprodukte werden mittels Ionenspray-MS als (H)-Nle-Gln-Arg·Amid (m/z: 415,0 – früh eluierend) und Ac-Thr-Ile-Nle-(OH) (m/z: 388,0 – spät eluierend) identifiziert. Die geringfügigen Verunreinigungen, welche in den Substrat-Präparationen aufgrund der ungereinigten Peptide vorhanden sind, werden nicht gespalten. Feld A veranschaulicht nur das D-Substrat; Feld B veranschaulicht nur das L-Substrat; Feld C veranschaulicht das D-Substrat plus das D-Enzym; Feld D veranschaulicht das D-Substrat plus das L-Enzym; Feld E veranschaulicht das L-Substrat plus das L-Enzym und Feld F veranschaulicht das L-Substrat plus das D-Enzym.
B. Diskussion der Beispiele 4-7
Das HIV-1 Proteaseenzym kommt mit einer homodimeren Struktur vor. Es ist ein äußerst spezifisches Enzym und diese Spezifität und seine katalytische Aktivität hängen von einer präzisen 3D-Struktur ab, die zwischen dem gefalteten Dimer und sechs Resten von dem Substratmolekül gebildet werden. Die beobachteten reziproken chiralen Spezifitäten zeigen deswegen, dass die gefalteten Formen von den D- und L-Enzymmolekülen Spiegelbilder voneinander in allen Elementen von der 3D-Struktur sind, welche für die enzymatische Aktivität verantwortlich ist. Dies stimmt mit ihren beobachteten CD-Spektren überein.
Die 3D-Struktur von einem gefalteten Enzymmolekül enthält zahlreiche chirale Elemente in der Sekundär- oder Supersekundär-Struktur, in der tertiären Struktur und in der quartären Struktur, wie in 3 bildlich dargestellt. Da der einzige Unterschied zwischen den synthetischen D- und L-Polypeptidketten die Stereochemie an den Cα-Atomen der Aminosäuren (und den Cβ-Atomen von Thr und Ile) ist, wird daraus geschlossen, dass die Stereochemie von dem Rückgrat alle Aspekte der höheren Struktur in diesem Protein bestimmt.
Die Beobachtungen der reziproken chiralen Spezifität in der enzymatischen Aktivität von den D- und L-HIV-1 Proteasen, welche hierin offengelegt sind, dienen zur Verallgemeinerung und stellen die chirale Natur von den biochemischen Wechselwirkungen von Proteinen heraus. Die großen Mengen der hochreinen enantiomorphen D- und L-Enzyme, die unter Verwendung des chemischen Ligationsverfahrens hergestellt wurden, werden eine gründliche experimentelle Untersuchung von der Verwendung der D-, L-Proteine in der Röntgen-Kristallographie gestatten. SEQUENZ-AUFLISTUNG

Claims

Verfahren zum Ermitteln von Kandidatenverbindungen aus einer chemischen Bibliothek, wobei der Kandidat ein chiraler Agonist oder ein chiraler Antagonist eines L-Proteinrezeptors ist, wobei das Verfahren aufweist: a) Screenen der chemischen Bibliothek durch in Kontakt bringen der chemischen Bibliothek mit einem D-Proteinrezeptor, welcher die D-Version des L- Proteinrezeptors oder ein D-Protein mit einer Rezeptorbindungsstelle ist, welche die D-Version der Bindungsstelle des L-Proteinrezeptors ist und b) Ermitteln von einer oder mehreren Verbindungen aus der chemischen Bibliothek, die Agonist- oder Antagonist-Aktivität in Bezug auf den D-Proteinrezeptor oder das D-Protein mit einer Rezeptor-Bindungsstelle aufweisen, wobei der Begriff „D-Protein" ein Protein bedeutet, in welchem alle chiralen Aminosäure-Reste eine D-Chiralität aufweisen und der Begriff „L-Protein" ein Protein bedeutet, in welchem alle chrialen Aminosäure-Reste eine L-Chiralität aufweisen, wobei der Kandidatenchirale Agonist oder Antagonist des L-Proteinrezeptors das Enantiomer der Verbindung ist, 1 die im Schritt b) erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der D-Proteinrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GPIIb-IIIa, LFA-1, CSAT, VLA-2, CR3 Komplementrezeptor, CR2 Komplementrezeptor, CD4 T-Zellrezeptor, FRP-Rezeptor, Apolipoprotein-Rezeptor, Interleukin-Rezeptor, Fc-Rezeptor, Somatostatin-Rezeptor, PDGF Rezeptor, und Transferrin-Rezeptor.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das D-Protein mit einer Rezeptor-Bindungsstelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Insulin mit einer Insulinrezeptor-Bindungsstelle, viralem Hämaglutinin-Protein mit einer Reovirusrezeptor-Bindungsstelle, Fibrinogen A Alpha mit einer Fibrinogenrezeptor-Bindungsstelle, Fibrinogen D-30 mit einer Mac-1 Integrinrezeptor-Bindungsstelle, Thyroid-Hormonrezeptor mit Bindungsstellen α und β, Apo E mit einer LDL Rezeptor-Bindungsstelle, Lipid A, und Apo AI mit einer Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase-Bindungsstelle.
Verfahren nach Anspruch 1, welches das Isolieren einer chemischen Bibliothek aufweist und wobei die chemische Bibliothek natürliche Verbindungen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, welches das Herstellen einer chemischen Bibliothek aufweist, und wobei die chemische Bibliothek synthetisierte Verbindungen enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, welches weiters aufweist: das in Kontakt bringen der Enantiomere mit einem L-Proteinrezeptor oder einem L-Protein mit einer Rezeptor-Bindungsstelle, die dem D-Proteinrezeptor bzw. dem D-Protein mit einer Rezeptor-Bindungsstelle entspricht; und Ermitteln von einem oder mehreren Enantiomeren, die eine Agonist oder Antagonist-Aktivität in Bezug auf den L-Proteinrezeptor oder das L-Protein mit einer Rezeptor-Bindungstelle aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren im Schritt a) das in Kontakt bringen der chemischen Bibliothek mit dem D-Proteinrezeptor und dem entsprechenden L-Proteinrezeptor oder mit dem D-Protein mit einer Rezeptor-Bindungsstelle und dem entsprechenden L-Protein mit einer Rezeptor-Bindungsstelle aufweist und im Schritt b) weist das Verfahren das Ermitteln von einer oder mehreren Verbindungen aus der chemischen Bibliothek auf, die eine Agonist- oder Antagonist-Aktivität in Bezug auf den D-Proteinrezeptor oder den entsprechenden L-Proteinrezeptor oder in Bezug auf das D-Protein mit einer Rezeptor-Bindungsstelle oder das entsprechende L-Protein mit einer Rezeptor-Bindungsstelle aufweisen.