JP4312615B2 - D−酵素組成物およびそれらの使用方法 - Google Patents
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Description
Fersht“Enzylne Stracture and Mechanism,酵素構造および機構”W.H.Freemanand Company,ダブリュ.エッチ.フリーマン社サンフランシスコ市,1977年,75−81頁を参照。この特異性は、フォールドされた(折りたたまれた)タンパク質分子中、ポリペブチド骨格(バックボーン)の3次元的フオールディング(折りたたみ)およびアミノ酸側鎖の配向を含む酵素分子のキラール構造に関連づけることができる。Fersht上記参照。今日まで、L−酵素のみが自然界で知られている。フォールド構造、酵素活性およびキラール特異性を含むD−酵素とそれらの性質を知ることは、未開発の問題として残されている。
,Paven等(米国特許4,257,976),Halmos(米国特許4,151,198)そしてKameswaren(米国特許4,454,344)を参照。
Stauffer(米国特許3,963,573)およびBauer(米国特許4,262,092)を参照。
a)水性混合物中、第1の立体異性体基質と、該第1立体異性体基質を特異的にキラールな反応生成物に変換するD−酵素を反応させ、該反応は反応生成物を生成するのに充分な時間および反応条件で起こり、そしてb)前記混合物からキラールな反応生成物を単離し、それによってキラル純粋な化学物質を生成する。代替的な実施態様で、前記水性混合物は、少なくとも第1および第2の立体異性体を有する基質のラセミ混合物または部分的ラセミ混合物からなっていてもよいし、またその基質の第1立体異性体だけからなっていてもよい。
アミノ酸残基: ポリペプチドのペプチド結合での化学消化(加水分解)によって形成されるアミノ酸を指す。本明細中に記載されるアミノ酸残基は「L」または「D」立体異性体形のいずれかである。「NH2」は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を指す。「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基を指す。標準的ポリペプチド命名法(J.Biol.Chem,243巻,3552−59頁,1969年に記載され、そして37C.F.R.米国特許法施行規則1、822(b)(2)条に採用された)に従って、アミノ酸残基の省略記号は下記の対応表に示される。
B.D−酵素組成物
本発明は、酵素反応の触媒作用ができるポリペプチトを定義するアミノ酸残基配列を有する分子を含んで成る(から成る)D−酵素に関する。D−酵素は、実質的にD−アミノ酸から成るアミノ酸残基配列を有する。
好適なエステラーゼは、高い立体選択性および広い基質範囲のため、キモトリプシン(E.C.3.4.21.1)を含む。他のエステラーゼは、限定されないが、カルボキシルエスラーゼ(E.C.3.1.1.1)、カルボキシペプチダーゼA(E.C.3.4.17.1),アセチルコリンエステラーゼ(E.C.3.1.1.7)、ペプシン(E.C.3.4.23.1),トリプシン(E.C.3.4.21.4)そしてパパイン(E.C.3.4.22.2)を含む。
(1hvp):hiv−1プロテアーゼ基質銘体;
(2hvp):hiv−1プロテアーゼ:(3hvp):(aba==67,95==)−hiv−1プロテアーゼ,sf2単離体;(4hvp):hiv−1プロテアーゼ阻害剤錯体,n−acetyl−*thr−*ile−*nle−psi(ch2−nh)−*nle−*gln−*argamide(mvt−101)(SEQIDNO,1);(2cyp);シトクロムCペルオキシダーゼ(e.c.1.11.1.5);(igpl):グルタチオンペルオキジダーゼ(e.c.1.11.1.9);
(4cat):カタラーゼ(e.c.1.11.1.6);
(7cat):カタラーゼ(e.c.1.11.1.6);(8cat):カタラーゼ(e.c.1.11.1.6);そして
(2sod):銅、亜鉛スーパーオキジド ジスムターゼ(e.c.1.15.1.1)。
C.D−酵素の合成
本発明のD−酵素は、ポリペプチドの分野の当業者が利用できるいかなる手段によっても合成できる。ポリペプチドを合成するのに用いる正確な方法は、本発明のD−酵素の基本構造に重要とは考えられない。そして、そのため、特に技術が進歩し、ポリペプチドを合成し、そして組立てる新しい手法が出てくるので、該方法は限定的であるとは考えられない。
・ たとえば、段階的合成のような通常の化学合成そして
・ ポリペプチド組立てブロックの化学連結による組立てを含む。
他方、それより数倍大きいポリペプチドを組立てるのに化学連結が用いられている。したがって、100アミノ酸残基以上のD−酵素のために、化学的または酵素的連結がこのような生成物を作る現在ある唯一つの実用的な手段である。本明細書中、記載するのは、10−100mgの量のD−およびL−HIV−1プロテアーゼ酵素を合成する連結戦略(ligation strategy)である。
通常の段階的合成
たとえば、固相Merrifield−型合成において、アミノ酸の段階的付加のような合成化学的手法が純度、抗原特異性、望ましくない副成物を伴わないこと、製造の容易さ等の理由から好適である。L−タンバク質および酵素を合成するのに利用できる多くの手法について優れた総説が、次の文献に見いだされる。Steward等“Solid PhasePeptide Synthesis固相ぺプチド合成”,W.H.Freeman Co.,ダブリュ・エッチ フリーマン社,サンフランシスコ市,1969年,Bodanszky等“Peptide Synthesisペプチド合成”,JohnWiley & Sons,Second Edition,ジョン ウイリー アンドサンズ社第2版1976年,Meienhofer“Hormonal Proteins and Peptidesホルモン性タンパク質およびペプチド”,第2巻46頁,Acadenic Press(New York)、アカデミックプレス社(ニューヨーク市)1983年,.Kent Ann Rew Biochem,57巻,957頁,1988年固相ペブチド合成のために,そしてSchroder等“The Peptidesペプチド”1巻,Academic Press(New York)1965年,ペブチドアカデミックプレス社(ニューヨーク市)古典的な溶液合成にために”。これら文献の各々は、参考文献として本明細書中に組入れられる。このような合成で用いることのできる適当な保護基は、上記の文献、そしてMcOmie“Protectice Groupsin Organic Chemistry 有機化学における保護基,”Plenum Press,New York,プレナム出版,ニューヨーク市,1973年に記載されている。後者の文献も参考文献として、本明細書中に組入れられる。
Bachem California(Torrance,CA)バーケムカリフォルニア(トーランス市,カリフォルニア州)から商業的に入手できる。
連結方法
ポリペプチドの化学連結法は、最近Kentによる米国特許出願Ser.No.07/865,368,1992年4月8日出願に記載されている。その開示は、参考文献として本明細書中に組入れられる。100アミノ酸残基またはそれ以上の鎖長を有するD−酵素について、この手法は好適である。この方法で、2つのポリペプチドが先ず合成され、そして化学連結に適合する末端を含む。段階的化学合成、そして夫々固相樹脂から開裂した後、2つのポリペプチドは混合され、適合する末端を接合するべく反応させられ、そして2つのポリペプチドから成るより大きな直線状ポリペプチドが生成する。
D.スクリーン化学ライブラリの方法
薬学的に有用な化合物を同定する最も普通の方法は、化学ライブラリをスクリーニングすることである。このようなスクリーニングの徹底性は、L−酵素およびD−酵素の両方を利用ずることにより一段と増す。
E.キラール純粋な化合物を製造する方法
別の実施態様において、本発明のD−酵素をキラール純粋な化学物質の製造に用いる方法を本発明は意図する。本明細書中、用いられるキラール純粋な化合物とは、実質的にその立体異性体を含まない分子を指す。
(a)水性混合物中で、第1立体異性体をキラールな反応性生物に特異的に変換するD−酵素と、第1立体異性体を反応させ、そして
(b)前記混合物からキラール反応生成物を単離し、それによってキラール純粋な化学物質を生成させる。この実施態様の別の形では、前記水性混合物は少なくとも第1および第2の立体異性体を有するラセミ混合物から成る。
(a)水性混合物中、少なくとも第1および第2の立体異性体を有するラセミ混合物と、第1の立体異性体を反応生成物に特異的に変換するD−酵素とを反応させ、そして
(b)前記混合物から第2の立体異性体を単離し、それによってキラール純粋な化学物質を生成する。この反応は、実質的に全ての第1の立体異性体をキラール反応生成物に変換するのに充分な時間および反応条件の下で実施される。
F.ラセミ混合物の共結晶化の方法
1つの実施態様において、本発明はタンパク質の三次元構造を決定するための結晶のX線回折パターンを形成するために、D−酵素を使用することを意図する。結晶化したタンパク質を製造し、そしてX線結晶学的な技術によって結晶構造を分析する方法は、周知である。たとえば、Stout等“X-Ray Structure Determination:A PracticalGuide,X線構造決定,実用的ガイド”,Macomillan,New York,マクミラン社ニユーヨーク市,1968年そして、Miller J.Mol.Biol,204巻,211−212頁,1988年等の教示を参照のこと。これらの文献は、本明細書中、参考文献として組込まれる。
G.治療方法
本発明は、投与されるべき治療組成物中、L−酵素が通常活性成分である所の治療方法において、治療的に有効量のD−酵素を哺乳類またはヒトに投与することを含む治療方法を意図する。対応するL−酵素をD−酵素によって置換することにより、治療的酵素は本明細書中、記載したD−酵素の恩典を獲得する。これらは、プロテアーゼに対する耐性による有効的な半減期の増加および減少した免疫認識を含む。
これらの酵素は、虚血後負傷の防止および炎症疾患の制御に関与する。Wilsman等、“Superoxide and Superoxide Dismutase inChemistry,Biology and Medicineスーパオキシドおよびスーパオキシドジスムターゼ化学、生物学および薬品”Rotilio,Ed,ElsevierScience,Amsterdam Publishers1986年、ロティリオ編エルセビィアサイエンス、アムステルダム出版。SODの場合に例証されるように、これらの酵素は増加した循環半減期から思典を受けるだろう。
SOD酵素の不均化(dismutation )反応は、遊離ラジカルによる組織損傷を防止するのに重要である。実際、変形性関節症を含む炎症疾患を軽減するのにヒト細胞内SOD(HSOD)が有効であることはヒトでの臨床試験によって立証された。Wilsman、“Superoxide and SuperoxideDismutase in Chemistry,Biology and Medicineスーパオキシドおよびスーパオキシドジスムターゼ、化学、生物学および薬品、エルセビィア社”,Elsevier,500−5頁,1986年を参照。加えて、SOD酵素はウィルス感染に治療的可能性を有することを動物実験が示唆している。Oda等、Science,244巻,974−6頁,1989年を参照。SOD酵素は、アロキサン糖尿病(Grankvist等 Nature,294巻,158頁,1981年)を予防しそしてある種の癌の転移(ヨーロッパ特許出願0332464)を防止するのに関係があるとされてきた。
H.治療組成物
本明細書中に記載される化合物および基(たとえばD−アミノ酸残基)多くはお互いに平衡状態にあるいくつかの形態、特にかわり得るようにプロトン化された形態を有する。当業者が理解するように、本明細書中、化合物または基の1つの形態を表記することはお互いに平衡状態にあるそれらのすべての形態を包含することを意図する。本明細書中、「μM」はマイクロモル、「μl」はマイクロリットル、そして「μg」はマイクログラムを意昧する。
実施例
下記の実施例は本発明の範囲を限定することなく例示することを意図する。
1.LおよびD−[Aba 67 , 95 , 167 , 195 ]HIV−1プロテアーゼ(HIV−1 PR)の通常型段階的合成
タンバク質の全化学的合成の進歩によって、均質な結晶形L−[Aba67,95,167,195]HIV−1ブロテアーゼ(HIV−1 PR)の反復可能な製造が可能となった。たとえば、Kent,Annu.Rev.Biochem.57巻,957頁,1988年,Wlodawer等,SCience.,245巻,616頁,1989年,およびMiller等Science.,246巻,1149頁,1989年を参照。
2.上記L−およびD−[Aba 67 , 95 , 167 , 195 ]HIV−1プロテアーゼ(HIV−1 PR)の構造分析
D−酵素99−aaモノマ、D−[Aba67,95]HIV−1プロテアーゼは、種々の構造特性について分析され、そしてL−異性体の構造特性と比較された。たとえば分析用の逆相HPLCは、2つのポリペプチド鎖について同一の時間を与えた。
CDスペクトルはエナンシオメリックなタンパク質分子で予期するように、等しくそして反対符号の旋光を呈した。
3.L−およびD−[Aba 67 , 95 , 167 , 195 ]HIV−1プロテアーゼHIV−1 PR酵素特性
D−アミノ酸からなるエナンシオメリックなタンパク質の酵素特性は、Toths等Int.J.Peptide Protein Res.36巻,544頁,1990年に記載されているように、天然のGAG開裂部位を持つヘキサペプチド類似体を基質として用いる蛍光アッセイを用いて、評価しそしてL−酵素と比較した。
L−MVT101 D−MVT101 エバンスブルーb
L−HIV PR + − +
D−HIV PR − + +
a.D−およびL−酵素は5×IC50濃度の阻害剤存在下、対応するキラール基質を用いる上述の蛍光アッセイ法によって別々にアッセイを行った。
b.阻害剤エバンスブルー(Evans Blue)は、ノンペプチド、アキラールなHIV−PRの競合−非競合混合阻害剤である。
4.実施例1−3の検討
本発明において、酵素HIV−1プロテアーゼのD−およびL−形が全化学合成によって製造された。2つのタンバク質は同一の共有構造を有する。しかしながら、フォールドされたタンパク質/酵素エナンシオマはタンパク質基質に対して補完的なキラール特異性を示す。すなわち、各々の酵素エナンシオマは対応する基質エナンシオマのみを切断する。本発明で合成されたHIV−1プロテアーゼ酵素のエナンシオメリック阻害剤への影響でも、補完的キラール特異性が明白であった。これらのデータは、化学的に合成されたD−およびL−酵素分子が3次元構造のすべての要素で互いの鏡像体であることを示す。エナンシオメリックタンバク質はそれらの生化学的相互作用のすべての面で補完的キラールな特異性を示し、酵素活性を保持し、そして本発明書中に記載する広範囲の有用な組成物を提供する。
5.D−およびL−[Aba 67 , 75 (CO−S) 51 , 52 ] 2 HIV−1プロテアーゼ類似体の合成および連結
図4は、D−およびL−[Aba67,95(CO−S)51,52]2HIV−1プロテアーゼ類似体の全合成に用いられる計画を模式的に示すものである。保護されたD−およびL−アミノ酸はthe Peptide Institute(Osaka, Japan)タンパク研究所、大阪 日本、Peptide International(Louisville,KY):ペプチドインターナショナル(ルイスビル市 ケンタッキー州)、Bachem Bio Science(Philadelphia,PA);バーケムバイオサイエンス(フィラデルフィア市 ペンジルベニア州)そしてBachem Caifornia(Torrance,CA);バーケムカリフォルニア(トーレンス,カリフォルニア州)から入手でき、そして0.03%以下の反対のエナンシオマーを有する。HPLCで精製され、機能化され、段階的な固相合成で組立てられ、保護されていないペブチドセグメントが6MGuHClの存在下反応され、連結された99−残基D−およびL−[(NHCH2COSCH2CO)51-52]HIV−1 PR生成物を生じる。schnolzer等Science,256巻,221−225頁,1992年参照。図4の箱で囲んだ部分は、連結が起こった部位でのペブチド結合Gly51−Gly52のチオエステル類似体の構造を表す。チオエステルは2つのD−ペプチド間の結合、すなわち連結の部位として働く。セレノールエステル結合もまた2つのD−ペプチドを連結するのに用いることができる。
6.連結生成物、D−およびL−[Aba 67 , 95 (CO−S) 51-52 ] 2 HIV−1ブロテアーゼ類似体の物理的特性
HPLCで精製された連結生成物のイオンスブレイ質量スペクトロメトリは図8に示される。イオンスブレイ質量スペクトロメトリは各々の場合、実測された分子量10768.9±1.4ダルトン(D−エナンシオマー)および10769.4±0.9ダルトン(L−エナンシオマー)[計算値10763.9ダルトン(モノアイソトピック)および10770.8ダルトン(平均)]を有する単一の分子種を明らかにする。少量の脱水副生成物もまた検出された。モノマーの配列もまた1段階レーザー脱着質量読出し.を利用する新しいタンパク質ラダー(ladder)配列手法で検査された。図8(AおよびC)は過剰のプロトンによって異なる単一分子種を表すラベルされたピークを示す。
連結生成物の実測された分子量は、10768.9±1.4ダルトン(D−エナンシオマー)そして10769.4±0.9ダルトン(L,−エナンシオマー)[計算値:10763.9ダルトン(モノアイソトピック)そして10770.8ダルトン(平均)]である。図8(BおよびD)はAおよびCに示されたデータが単一の電荷状態に減られた再構成された質量ベクトルを示す。AおよびCにおけるすべてのデータ点が計算に含まれ、そして数学的なフィルターリングは実施されない。10−11KDの質量領域は明瞭に示されている。
7.連結生成物、D−およびL−[Aba 67 , 95 (CO−S) 51-52 ] 2 HIV−1プロテアーゼ類似体の酵素活性の特性
D−およびL−[Aba67,95(CO−S)51-52]2HIV−1PR エナンシオマーの酵素活性がヘキサペブチド基質 Ac−Thr−Ile−NIe−Nle−Gln−Arg.アミド(p24/p15 GAGウイルスブロセジング部位の類似体)のD−およびL−異性体に対するそれらの作用によって決定されるうることを図11は示す。D−酵素はD−基質のみを開裂し、そしてL−基質に対して不活性で、そしてL−酵素はL−基質に対して完全な活性を示すが、D−基質に対して不活性である。この補完的なキラール特異性は、キラール阻害剤の効果でもまた明らかである。下表に示すように、D−およびL−[MVT−101]はキラール蛍光性(fluorogenic)基質のD−およびL−HIV−1PR類似体による開裂を夫々阻害する。しかし逆のエナンシオマーの作用については影響がない。興昧深いことに、アキラールな阻害剤であるエバンスブルー(Evance Blue)は、混成の阻害動力学を示すが、酵素の両方のエナンシオマーを阻害する。
表
8.実施例4−7の検討
HIV−1プロテアーゼ酵素は、ホモジメリックとして存在する。
それは、高度に特異的な酵素であり、そしてこの特異性および触媒活性は、フォールドされた二量体および基質分子の6つの残基の間で形成される正確な3−D(三次元)構造に依存する。したがって観察された補完的な特異性は、D−およびL−酵素分子のフォールドされた形が、それらの酵素活性の原因となる3−D構造のすべての要素においてお互いに鏡像であることを示す。この結果は、観察されたCDスペクトルと一致する。
配列リスティング
・ 一般情報
(i)出願人 (A)ザスクリップス リサーチ インスティチュート(B)番地ニノース トーリ パインズロード 10666 (C)都市:ラホヤ (D)州:カリフォルニア (E)国名:アメリカ合衆国(F)郵便番号:92037 (G)電話:619−554−2937 (H)ファックス:619−554−6312
(i)発明の名称:D−酵素組成物およびそれらを使用する方法
(iii)配列の数:3
(iv)コンビュータ読込みフォーム (A)媒体型:フロッピーディスク (B)コンピュータ:IBC PC コンパチブル (C)オペレーティング システム:PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア:PatentIn Release (パテントイン,リリース)#1.0 バージョン#1.25
(v)出願データ (A)出願番号: (B)出願日:1993年6月7日
(vi)先出願データ (A)出願番号:US 07/894,817 (B)出願日:1992年6月8日
・ SEQ ID NO.1に関する情報
(i)配列特性 (A)鎖長:6アミノ酸 (B)タイプ:アミノ酸 (C)トポロジー:直線状
(ii)分子タイプ:ペプチド
(v)フラグメントタイプ:内部
(ix)特徴: (A)名前/キー:修飾部位 (B)位置:1 (D)他の情報:/ラベル=N−アセチル/ 「N−アセチル基はペプチドの アミノ末端に位置する」ことに注意。
(ix)特徴: (A)名前/キー:修飾部位 (B)位置:3 (D)他の情報:/ラベル=Nle/ 「修飾されたアミノ酸、Nleはこの位置に ある」ことに注意。
(ix)特徴: (A)名前/キー:修飾部位 (B)位置:4 (D)他の情報:/ラベル=Nle/ 「修飾されたアミノ酸、Nleはこの位置に ある」ことに注意。
(ix)特徴: (A)名前/キー:修飾部位 (B)位置:(3〜4)
(D)他の情報:/ラベル=psiCH2NH/ 「これらのアミノ酸の間の開裂ペプチド結合は、 還元された類似体psiCH2NHによって 置換された」ことに注意。
(ix)特徴 (A)名前/キー:修飾位置 (B)位置:6 (C)他の情報:/ラベル=アミド/ 「アミドはペプチドのカルボキシ末端に 位置する」ことに注意。
(xi)配列記載:SEQ ID NO.1
Thr lle Xaa Xaa Gln Arg
1 5
(2)SEQ ID NO.2に関する情報
(i)配列特性 (A)鎖長:6アミノ酸(B)タイプ:アミノ酸 (D)トポロジー:直線状
(ii)分子タイプ:ペプチド
(V)フラグメントタイプ:内部
(ix)特徴: (A)名前/キー:修飾部位 (B)位置:1 (D)他の情報:「2−アミノベンゾイル基はペプチドの アミノ末端に位置する」ことに注意。
(ix)特徴: (A)名前/キー:修飾部位 (B)位置:3 (C)他の情報:/ラベル=Nle/ 「修飾されたアミノ酸、Nleはこの位置に ある」ことに注意。
(ix)特徴: (A)名前/キー:修飾部位 (B):4 (C)他の情報:/ラベル=Phe−pNO2/ 「修飾されたアミノ酸、Phe−pNO2は この位置にある」ことに注意。
(ix)特徴 (A)名前/キー:修飾部位 (B)位置:6 (C)他の情報:/ラベル=アミド/ 「アミドはペプチドのカルボキシ末端に 位置する」ことに注意。
(xi)配列記載:SEQ ID NO.2
Thr lle Xaa Xaa Gln Arg
1 5
(2)SEQ ID NO.3に関する情報
(i)配列情報 (A)鎖長:6アミノ酸(B)タイプ:アミノ酸 (C)トポロジー:直線状
(ii)分子タイプ:ペプチド
(V)フラグメントタイプ:内部
(ix)特徴: (A)名前/キー:修飾部位 (B)位置:1 (D)他の情報:/ラベル=AC/ 「アセチル、AC基はぺプチドのアミノ末端に 位置する」ことに注意。
(ix)特徴: (A)名前/キー:修飾部位 (B)位置:3 (D)他の情報:/ラベル=Nle/ 「修飾されたアミノ酸、Nleはこの位置に ある」ことに注意。
(ix)特徴: (A)名前/キー:修飾部位 (B)位置:4 (D)他の情報:/ラベル=Nle/ 「修飾されたアミノ酸、Nleは この位置にある」ことに注意。
(ix)特徴: (A)名前/キー:修飾部位 (B)位置:6 (D)他の情報:/ラベル=アミド/ 「アミドはペプチドのカルボキシ末端に 位置する」ことに注意。
(ix)配列記載:SEQ ID NO.3
Thr lle Xaa Xaa Gln Arg
1 5
Claims (15)
- 合成L−酵素に対応するアミノ酸残基配列を含んでなる合成D−酵素であって、該D−酵素は酵素反応の触媒作用ができ、該アミノ酸残基配列は、アキラール酸残基のほかは、D−アミノ酸からなることを特徴とする前記合成D−酵素。
- 前記酵素がアキラール基質特異性を有する請求項1記載の合成D−酵素。
- 前記酵素がキラール基質特異性を有し、合成D−酵素のキラール基質特異性は合成L−酵素のキラール特異性の反対である請求項1記載の合成D−酵素。
- 前記酵素がHIV−1プロテアーゼ、D−[Aba67,95,167,195]HIV−1プロテアーゼ(HIV−1PR)、そしてD−[Aba67,95(CO−S)51-52]2HIV−1プロテアーゼ類似体からなる群より選ばれる請求項3記載の合成D−酵素。
- (a)水性混合物中、第1の立体異性体と該第1立体異性体を特異的にキラール反応生成物に変換する請求項3記載の合成D−酵素とを反応させ、該反応は該反応生成物を生成するのに充分な時間および反応条件で起こり、該D−酵素は該反応の触媒作用ができる酵素を定義するアミノ酸残基配列を含んでなり、そして該アミノ酸配列は、アキラールアミノ酸残基のほかは、D−アミノ酸からなる工程、そして(b)前記混合物から前記キラール反応生成物を単離し、それによってキラール純粋な化学物質を生成する工程、以上の工程からなることを特徴とするキラール純粋な化学物質を製造する方法。
- 前記水性混合物が少なくとも第1および第2の立体異性体を有するラセミ混合物からなる請求項5記載の方法。
- (a)水性混合物中、少なくとも第1および第2の立体異性体を有するラセミ混合物と該第1の立体異性体を特異的に反応生成物に変換する請求項3記載の合成D−酵素とを反応させ、該反応は第1立体異性体の実質的にすべてを該反応生成物に変換するのに充分な時間および反応条件で起こり、該D−酵素は該反応の触媒作用ができる酵素を定義するアミノ酸残基配列を含んでなり、そして該アミノ酸残基配列は、アキラールアミノ酸残基のほかは、D−アミノ酸からなる工程、そして(b)前記混合物から前記第2の立体異性体を単離し、それによってキラール純粋な化学物質を生成する工程、以上の工程からなることを特徴とするキラール純粋な化学物質を製造する方法。
- 次の工程からなることを特徴とするアキラール基質が関与する反応を触媒作用する方法:
工程A:前記アキラール基質に対する特異性を有する請求項2記載の合成D−酵素を提供する、それから工程B:アキラール基質が関与する反応を触媒作用するために該アキラール基質と工程Aの合成D−酵素を接触する。 - 合成L−酵素に関する活性を有する薬品候補を求めてライブラリーをスクリーニングする方法において、次の工程からなることを特徴とする前記方法:工程A:前記合成L−酵素のエナンシオマーである合成D−酵素を提供する;該D−酵素は、アキラールアミノ酸残基のほかは、D−アミノ酸からなる;それから工程B:合成D−酵素に関する活性を有するライブラリーの1つまたはそれ以上の構成要素を同定するためにライブラリーをスクリーニングする;そしてそれから工程C:工程Bで同定されたライブラリーの1つまたはそれ以上の構成要素を用い、合成L−酵素に関する薬品候補を同定する。
- 試料がある化合物を含むかどうかを決定する方法において、(a)前記試料と、アキラールアミノ酸配列のほかはD−アミノ酸からなるアミノ酸残基配列を含んでなり酵素反応の触媒作用ができるD−酵素を接触する工程、そして(b)前記試料の存在下で前記D−酵素の活性を決定する工程からなり、前記D−酵素の活性は前記化合物の存在と関係することを特徴とする前記方法。
- 前記化合物が前記D−酵素の基質である請求項10記載の方法。
- 前記D−酵素が80〜500アミノ酸である請求項11記載の方法。
- 治療用の請求項1〜4いずれか一項記載のD−酵素。
- 対応するL−酵素によって処置できる疾患および状態を処置するための薬品の製造を目的とする請求項2記載のD−酵素の使用方法。
- 治療量の請求項2記載のD−酵素と生理学的に耐え得る担体とを含んでなる治療組成物。
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