DE69324362T2

DE69324362T2 - D-enzymzusammensetzungen und verfahren zu deren verwendung

Info

Publication number: DE69324362T2
Application number: DE69324362T
Authority: DE
Inventors: Stephen Kent; Raymond Milton; Saskia Milton
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1992-06-05
Filing date: 1993-06-07
Publication date: 1999-08-26
Anticipated expiration: 2013-06-08
Also published as: DE69324362D1; EP0882737B1; WO1993025667A1; DE69334152D1; US6548279B1; ATE178650T1; DE69334152T2; EP0882737A1; EP0647266B1; US20030113881A1; JP4312615B2; US5910437A; AU678768B2; CA2137378A1; AU3756497A; US7118856B2; ATE366744T1; ES2290976T3; CA2137378C; EP0647266A1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, in denen D-Aminosäure-Reste eingebracht sind. Inbesondere betrifft die vorliegende Erfindung enzymatisch aktive Proteine, die im wesentlichen aus D-Aminosäuren bestehen, und Verfahren zur Verwendung solcher Proteine.

Hintergrund

Die Biosphäre ist inhärent chiral; jede Masse von biologischen Makromolekülen ist aus Monomermolekülen einheitlicher Chiralität aufgebaut (Mason, Chirality 3 : 223, 1991), und die biochemischen Wechselwirkungen von biologischen Makromolekülen sind inhärent chiral.
Zum Beispiel wirken Enzyme ausnahmslos nur bei einem Enantiomer einer chiralen Substanz oder erzeugen nur ein Diastereomer aus einem prochiralen Substrat; Fersht, in "Enzyme Structure and Mechanism", W. H. Freeman and Company, San Franzisko, 1977, S. 75-81. Diese Spezifität kann zu der chiralen Struktur des Enzymmoleküls in Zusammenhang gestellt werden, einschließlich der dreidimensionalen Faltung des Polypeptid-Grundgerüstes und der Orientierung der Aminosäure-Seitenketten in dem gefalteten Proteinmolekül; Fersht. s. o. Bis jetzt wurden nur L-Enzyme in der Natur beschrieben. Dies läßt die Beschreibung von D-Enzymen und ihren Eigenschaften, welche die gefaltete Struktur, die enzymatische Aktivität und die chirale Spezifität einschließt, als ungeklärte Fragen zurück.
Kürzlich haben Zawadzke et al.. J. Am. Chem. Soc., 114 : 4002-4003, 1992, die Herstellung eines kleinen Polypeptids mit 45 Aminosäure-Resten (D-Rubrodoxin) unter Verwendung von D-Aminosäuren beschrieben. L-Rubrodoxin wird in Clostridia gefunden und ist das einfachste Eisen- Schwefel-Protein. Man nimmt an, daß es im Elektronentransport fungiert. Allerdings fehlt es an nachgewiesener Enzymaktivität.
Vor der vorliegenden Erfindung war das größte L-Protein, von dem bekannt war, daß es chemisch in einer herkömmlichen stufenartigen Weise synthetisiert wurde, Preprogonadotropin- Release-Hormon (PreproGnRH). PreproGnRH hat 93 Aminosäure-Reste (Milton et al., Biochemistry (1992), 31 : 8800). PreproGnRH inhibiert die Prolactin-Freisetzung. Ein Artikel in Science (Band 256, 5. Juni 1992, 1445) beschreibt D- und L-Formen von HIV-1- Proteaseenzym.
Ein Artikel in Science (Band 256, 10. April 1992, 221) beschreibt ein Verfahren der End-an- End-Ligation von zwei Oligopeptiden mit einer Zusammensetzung aus Aminosäuren zum Erhalt eines synthetischen L-Enzyms. Der Artikel schließt ebenfalls die Vermutung ein, D-Aminosäure- Reste einzubringen, um stereochemisch das Enzym zu gestalten.
Viele organische Verbindungen existieren in optisch aktiven Formen, d. h., sie besitzen die Fähigkeit, die Ebene von planar polarisiertem Licht zu drehen. Bei der Beschreibung einer optisch aktiven Verbindung werden die Prefixe D und L oder R und S verwendet, um die absolute Konfiguration des Moleküls um sein(e) chirale(s) Zentrum/Zentren zu bezeichnen. Die Prefixe (+) und (-) oder d und l werden angewandt, um die Richtung der Rotation von planar polarisiertem Licht durch die Verbindung zu bezeichnen, wobei (-) oder l bedeutet, daß die Verbindung linksdrehend ist. Eine Verbindung, bei der (+) oder d vorausgestellt ist, ist rechtsdrehend. Für eine gegebene chemische Struktur sind diese Verbindungen, genannt Stereoisomere, identisch, außer daß sie Spiegelbilder voneinander darstellen. Ein spezifisches Stereoisomer kann ebenfalls als ein Enantiomer bezeichnet werden, und eine Mischung von solchen Isomeren wird häufig eine enantiomere oder racemische Mischung genannt.
Das Vermögen der optischen Aktivität ist auf die molekulare Asymmetrie um Kohlenstoffatome zurückzuführen, welche an vier unterschiedliche Atome oder Moleküle gebunden sind. Wo es nur ein asymmetrisches Kohlenstoffatom gibt, oder ein chirales Zentrum, wie es manchmal genannt wird, gibt es zwei mögliche Stereoisomere. Wenn es n-asymmetrische Kohlenstoffe oder chirale Zentren gibt, steigt die Anzahl an potentiellen Stereoisomeren auf 2n. Somit würde ein Molekül mit drei chiralen Zentren acht mögliche Stereoisomere aufweisen.
Während die strukturellen Unterschiede zwischen Stereoisomeren subtil sind und nur geringe Konsequenzen bei normalen chemischen Reaktionen haben, können sie tiefgründig sein, wenn biologische Systeme betroffen sind, d. h., wenn die Verbindungen in Enzym-katalysierten Reaktionen verwendet werden. So werden die L-Aminosäuren leicht im Menschen metabolisiert, jedoch nicht die entsprechenden D-Analoga, und nur D-Glucose kann phosphoryliert und zu Glykogen prozessiert werden oder durch die glykolytischen und oxidativen Wege des intermediären Metabolismus abgebaut werden. In entsprechender Weise zeigen Betablocker, Pheromone, Prostaglandine, Steroide, Geschmacks- und Duftstoffe, Pharmazeutika, Pestizide, Herbizide und viele andere Verbindungen kritische Stereospezifität. Im Bereich der Pestizide hat Tessier [Chemistry and Industry, 19. März 1984, S. 199] gezeigt, daß nur zwei der acht Stereoisomeren von δ-Methrin, einem Pyrethroid-Insektizid, biologische Aktivität besitzt. Die gleiche Aussage betreffend der Konzentration der Bioaktivität in einem einzelnen Isomer kann über viele andere Pestizide gemacht werden, einschließlich der Phenoxypropionate und Halogenpropionat- Derivate, wobei jedes ein chirales Zentrum enthält und in Form von zwei optischen Isomeren vorliegt.
Die stereochemische Reinheit ist von derselben Bedeutung im Bereich von Pharmazeutika, wo 12 der 20 am meisten verschriebenen Arzneimittel Chiralität zeigen. Ein betreffender Fall wird durch Naproxen oder (+)-S-2-(6-Methoxy-2-naphthyl)propionsäure dargestellt, welche eine der zwei wichtigsten Vertreter einer Klasse von 2-Arylpropionsäuren mit nicht-steroidaler entzündungshemmender Aktivität ist, welcher z. B. bei der Bewältigung von Arthritis verwendet wird. In diesem Fall ist bekannt, daß das S(+)-Enantiomer des Arzneistoffes 28 Mal stärker therapeutisch wirksam ist als sein R(-)-Gegenstück. Ein weiteres Beispiel von chiralen Pharmazeutika wird durch die Familie von Betablockern bereitgestellt, wobei für die L-Form des Propanolols bekannt ist, daß es 100-fach wirksamer ist als das D-Enantiomer ist.
Die Synthese von chiralen Verbindungen durch organische Standard-Synthesetechniken führen im allgemeinen zu einer racemischen Mischung, welche im Aggregat eine relativ niedrige spezifische Bioaktivität aufweisen kann, da bestimmte der Stereoisomeren in der Mischung wahrscheinlich biologisch oder funktionell inaktiv sind. Als ein Ergebnis müssen größere Mengen des Materials verwendet werden, um eine wirksame Dosis zu erhalten, und die Herstellungskosten erhöhen sich aufgrund der gleichzeitigen Herstellung von stereochemisch "inkorrekten Stoffen" und somit unwirksamen Bestandteilen.
In einigen Fällen können bestimmte Isomere tatsächlich eher schädlich sein, als einfach inert. Zum Beispiel war das D-Enantiomer von Thalidomid ein unschädliches und wirksames Beruhigungsmittel, wenn es zur Regulierung des morgendlichen Unwohlseins während der Schwangerschaft verschrieben wurde. Gleichwohl entdeckte man, daß das L-Thalidomid-Gegenstück ein potentes Mutagen war.
Es sind Verfahren zur stereoselektiven Synthese verfügbar, welche im allgemeinen die chemische Synthese und Isolierungsschritte involvieren, welche langwierig, komplex und kostspielig sind. Außerdem kann kein synthetisches Schema, welches zur Herstellung eines spezifischen Enantiomeren in der Lage ist, auf einem allgemeinen Weg angewandt werden, um andere optisch aktive Verbindungen zu erhalten. Was gebraucht wird, ist ein generalisierter Ansatz für die Auftrennung von racemischen Mischungen, welche durch normale chemische Reaktionen erzeugt werden, und es wurde eine Vielzahl von Ansätzen eingesetzt.
Ein weithin verwendeter Ansatz war die selektive Präzipitation von gewünschten Verbindungen aus racemischen Mischungen; siehe Yoshioka et al. [US-Patent Nr. 3 879 451], Paven et al. [US- Patent Nr. 4 257 976], Halmos [US-Patent Nr. 4 151 198] und Kameswaran [US-Patent Nr. 4 454 344].
Die oben erwähnten Vorgehensweisen trennten erfolgreich racemische Mischungen auf, da die Behandlung der Mischungen mit optisch reinen Reagenzien Diastereomere erzeugten, welche, im Gegensatz zu den anfänglichen racemischen Verbindungen, unterschiedliche physikalische Eigenschaften aufweisen. Somit können die fraktionelle Kristallisation oder andere physikalische Methoden angewandt werden, um diastereomere Verbindungen zu trennen.
Die Trennung von Diastereomeren kann ebenfalls mittels Chromatographie durchgeführt werden. Zum Beispiel lösten Pollock et al. [J. Gas Chromatogr. 3 : 174 (1965)] diastereomere Aminosäuren mittels Gaschromatographie auf. Mikes et al. [J. Chromatogr. 112 : 205 (1976)] haben die Flüssigchromatographie eingesetzt, um diastereomere Dipeptide aufzulösen. In den meisten Fällen waren die optisch reinen Reagenzien in der stationären Phase während der chromatographischen Abtrennung, jedoch können sie auch in Elutionsmitteln eingesetzt werden. Hare et al. [US- Patent Nr. 4 290 893] haben die Flüssigchromatographie eingesetzt, um racemische Mischungen aufzulösen, welche mit wäßrigen Elutionsmitteln behandelt wurden, die optisch reine Reagenzien und Metallkationen enthielten; die Auftrennung trat auf, da die resultierenden diastereomeren Komplexe unterschiedliche Verteilungskoeffizienten in dem Chromatographiesystem besaßen.
Alle der zu diesem Punkt beschriebenen Verfahren beruhten auf der Verfügbarkeit von geeigneten optisch reinen Reagenzien, jedoch sind solche Reagenzien häufig nicht verfügbar oder ist ansonsten ihre Verwendung in nicht annehmbarer Weise kostspielig. Bei einem alternativen Ansatz wurden enzymatische Auftrennungstechniken entwickelt. Viele unterschiedliche Klassen von Enzymen sind für die Auftrennung von Stereoisomeren auf einem präparativen Niveau verwendet worden, einschließlich Hydrolasen (insbesondere die Lipasen und Esterasen, wie Chymotrypsin), Lyasen und Oxidoreduktasen (z. B. Aminosäureoxidasen und Alkoholreduktasen). Allgemein gesprochen, sollen Enzyme für die Verwendung bei Auftrennungen idealerweise eine breite Substratspezifität zeigen, so daß sie in der Lage sind, Reaktionen einer großen Vielzahl von "unnatürlichen" Substraten zu katalysieren, und daß sie ein hohes Ausmaß der Stereoselektivität zur Katalysierung der Reaktion eines Isomeren unter Ausschluß der anderen besitzen.
Die Hydrolasen (z. B. Lipasen und Esterasen) befinden sich unter den stärker attraktiven Enzymen zur Verwendung bei der Auftrennung, da sie keine teuren Co-Faktoren erfordern und einige von ihnen eine vernünftige Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln zeigen. Darüber hinaus involviert die chirale Chemie häufig Alkohole, Carbonsäuren, Ester, Amide und Amine mit chiralen Kohlenstoffen, und Carboxylhydrolasen stellen die bevorzugte Wahl als stereoselektive Katalysatoren für Reaktionen solcher Spezies dar. Zum Beispiel wurde die enzymatische Behandlung auf die Auftrennung von racemischen Mischungen von Aminosäureestern angewandt; Stauffer [US-Patent Nr. 3 963 573] und Bauer [US-Patent Nr. 4 262 092].
Die Trennung von Reaktionsprodukten von Enzymen wurde erleichtert, indem das Enzym an einen festen Träger gebunden wurde, welcher durch Zentrifugation entfernt werden konnte oder in einer Säule gepackt war, durch welche die racemischen Mischungen geführt wurden.
Enzyme sind ebenfalls für die Auftrennung von anderen Klassen an Verbindungen als den oben diskutierten Aminosäuren untersucht worden. Immobilisierte Lipase trennt im Prinzip Mischungen durch enzymatische Hydrolyse oder Umesterung auf. Im Fall einer biphasischen Hydrolysereaktion erfordern die unterschiedlichen Löslichkeitseigenschaften der involvierten Säuren und Estern die Dispergierung und Bewegung von Mischungen, welche das immobilisierte Festphasen-Enzym, einen wäßrigen Puffer und die mit Waschwasser unmischbare organische Phase, enthaltend das Lösungsmittel und den Reaktanten, enthalten - ein relativ ineffizientes Verfahren.
Enzyme sind bei der Auftrennung von optischen Isomeren von Insektiziden eingesetzt worden. Zum Beispiel kontaktierten Mitsuda et al. [europäische Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. 0 080 827 A2] einen racemischen Essigsäureester mit stereoselektiven Esterasen mikrobiellen und tierischen Ursprungs in biphasischen Systemen (d. h. wäßriger/organischer Dispersion). In einer verwandten Arbeit bezüglich optisch gereinigter Pyrethroiden wendete Mitsuda et al. [US- Patent Nr. 4 607 013] mikrobielle Esterasen an. Klibanov et al. [US-Patent Nr. 4 601 987] trennte racemische 2-Halogenpropionsäuren mit Hilfe von durch Lipase katalysierten Veresterungsreaktionen auf, die in organischen Medien durchgeführt wurden.
Zusätzliche Beispiele können ebenfalls durch die durch Enzym-vermittelte Auftrennung des Stands der Technik bereitgestellt werden, wie sie bei der Herstellung von optisch gereinigten Pharmazeutika angewendet werden. Sih [US-Patent Nr. 4 584 270] hat enzymatische Methoden zur Herstellung von optisch reiner (R)-4-Amino-3-hydroxybuttersäure, einem Schlüssel-Intermediat bei der Herstellung von L-Carnitin, beschrieben.
Bis vor kurzem konnten nur natürlich auftretende L-Enzyme beschrieben werden, und dies läßt die vermuteten Eigenschaften von D-Enzymen, einschließlich ihrer gefalteten Strukturen, Enzymaktivität und chiralen Spezifität als ungeklärte Fragen zurück. Was benötigt wurde, war ein ausreichender Fortschritt bezüglich der chemischen Synthese von Proteinen, um die Gesamt synthese des D-Enantiomeren von ganzen Enzymen in ausreichender Menge möglich zu machen, um Kristalle zu bilden und andere Funktionen durchzuführen.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Ein neuer Typ an Enzym, der als ein D-Enzym bezeichnet wird, wurde gefunden, der die Fähigkeit besitzt, die Reaktion eines chiralen Substrats zu katalysieren. Deshalb ist hierin ein synthetisches D-Enzym beschrieben, das eine Sequenz aus Aminosäure-Resten umfaßt, die einem synthetischen L-Enzym entspricht, das in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion zu katalysieren, wobei die Sequenz aus Aminosäure-Resten abgesehen von achiralen Aminosäure-Resten aus D- Aminosäure-Resten besteht.
Die enzymatische Reaktion kann eine achirale Substratspezifität oder eine chirale Substratspezifität aufweisen. Bevorzugte für achirales Substrat spezifische D-Enzyme sind Superoxiddismutase oder Carboanhydrase. Ein bevorzugtes für chirales Substrat spezifisches D-Enzym ist HIV-1-Protease.
Die Erfindung sieht ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer chiral reinen Chemikalie vor, umfassend:
a) Umsetzen in einer wäßrigen Mischung eines ersten Stereoisomer-Substrates mit einem synthetischen D-Enzym, welches spezifisch das erste Stereoisomer-Substrat in ein chirales Reaktionsprodukt umwandelt, wobei die Reaktion während eines Zeitraums und unter Reaktionsbedingungen abläuft, die ausreichen, um ein Reaktionsprodukt zu bilden; und
b) Isolieren des chiralen Reaktionsproduktes von der Mischung, wodurch die chiral reine Chemikalie gebildet wird. In alternativen Ausführungsformen kann die wäßrige Mischung eine racemische Mischung oder eine partielle racemische Mischung eines Substrates mit mindestens einem ersten und einem zweiten Stereoisomer umfassen, oder sie kann das erste Stereoisomer des Substrates allein umfassen.
Ein D-Enzym dieser Erfindung sieht eine große Vielzahl von Nutzungsmöglichkeiten und Vorteilen vor, welche dem Fachpersonal in der Praxis ersichtlich sind. Ein D-Enzym liefert eine Methode, um effizient chiral reine Chemikalien zur Verwendung als Industriechemikalien von Reagenzien-Güte herzustellen, und als pharmazeutisch reine Medikamente. Darüber hinaus kann ein D-Enzym in Kombination mit seinem L-Enzym-Gegenstück in Co-Kristallisationsvermischungen verwendet werden, um racemische Kristalle zur Bestimmung der kristallographischen Strukturen unter Verwendung von Röntgenbeugungsdaten zu bilden. Darüber hinaus können, aufgrund der inhärenten Resistenz eines D-Enzyms gegenüber einer Proteolyse durch natürliche L-Aminosäure-spezifische Proteasen, therapeutisch verabreichte D-Enzyme, welche eine achirale Substratspezifität aufweisen, anstelle des entsprechenden L-Enzyms eingesetzt werden und eine verlängerte Halbwertszeit in proteolytischen Umgebungen, wie dem Blut oder dem Verdauungstrakt, bieten, wodurch die Wirksamkeit des therapeutischen Enzyms gesteigert wird.
Ein D-Enzym der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls für das Screenen von Naturprodukt- Bibliotheken angewandt werden. Insbesondere kann ein D-Enzym angewandt werden, um chirale Inhibitoren innerhalb einer Naturprodukt-Bibliothek zu identifizieren. In einigen Fällen kann eine Naturprodukt-Bibliothek einen chiralen Inhibitor mit Aktivität bezüglich eines D-Enzyms einschließen, welcher jedoch keine Aktivität bezüglich des entsprechenden L-Enzyms aufweist. Die Synthese des Enantiomeren des identifizierten chiralen Inhibitors kann dann zur Bildung eines Inhibitors des entsprechenden L-Enzyms führen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Bezüglich der Zeichnungen, die einen Teil dieser Beschreibung bilden:
Fig. 1A und 1B veranschaulichen die Molekulargewicht-Charaktieriserung der D- und L-Enzym- Enantiomere der HIV-1-Protease, wie in Beispiel 2 unter Verwendung von rekonstruierter Ionensprüh-Massenspektroskopie beschrieben. Das Molekulargewicht wird in Dalton ausgedrückt und ist als ein Peak des Prozentwertes (%) der relativen Intensität der gemessenen Spektren gezeigt. Die Fig. 1A veranschaulicht die Molekulargewichtsdaten, welche mit dem L-Enzym erhalten wurden, und die Fig. 1B veranschaulicht Daten, die mit dem D-Enzym erhalten wurden.
Fig. 2A, 2B, 2C und 2D veranschaulichen die vergleichende Enzymaktivität der D- und L-Enantiomere vom HIV-PR-Enzym bei D- und L-Enantiomeren eines chiralen fluorogenen Substrats, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Fig. 2A zeigt L-Enzym mit L-Substrat; die Fig. 2B zeigt L- Enzym mit D-Substrat; die Fig. 2C zeigt D-Enzym mit L-Substrat; und die Fig. 2D zeigt D- Enzym mit D-Substrat. Die Daten sind als Aktivität ausgedrückt, gemessen in willkürlichen Einheiten der Fluoreszenzintensität im Reaktionszeitverlauf in Minuten.
Fig. 3A und 3B veranschaulichen Band-Repräsentationen des Polypeptid-Grundgerüstes des homodimeren HIV-1-Proteasemoleküls in sowohl L- als auch D-Konformation, gezeigt in der Fig. 3B bzw. Fig. 3A der Figur. Die Pfeile geben die Richtung des Polypeptids in der Richtung vom Aminoende zum Carboxyende an.
Fig. 4 veranschaulicht eine schematische Repräsentation der chemischen Segment-Ligationsstrategie, die für die Totalsynthese von D- und L-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;-HIV-1-Proteaseanaloga angewandt wurde.
Fig. 5 veranschaulicht eine schematische Repräsentation der optimierten Festphasen-Kettenanordnungstaktik, die bei der Synthese der funktionalisierten Peptidsegmente angewandt wurde. Die Entschützungs- und Kopplungsreaktionen sind durch einen Waschschritt mit einzelnem Strom getrennt.
Fig. 6 veranschaulicht ein Kompositchromatogramm, das zwei gereinigte funktionalisierte ungeschützte D-[αCOSH]HIV-1-PR(1-51)- und D-[Nα-BrCH&sub2;CO]HIV-1(53-99)-Segmente und das letztendliche (48 Stunden) D-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-PR-Ligationsprodukt (grobkörnig) (bold), laufengelassen auf einer Vydac 218TP5415-Säule, eluiert mittels eines Gradienten (40- 55% B) bei einer Flußrate von 1 ml/min. zeigt.
Fig. 7 veranschaulicht die Reaktionsausbeuten bei den Schritten für die Synthese der D- und L- [Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-Proteaseanaloga.
Fig. 8A, 8B, 8C und 8D veranschaulichen die Ionensprüh-Massenspektren der durch HPLC gereinigten [(NHCH&sub2;COSCH&sub2;CO)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]HIV-1-PR-Monomeren.
Fig. 9A, 9B, 9C und 9D veranschaulichen Umkehrphasen-HPLC-Messungen von D- und L- [Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]HIV-1-PR-Ligationprodukten.
Fig. 10A und 10B veranschaulichen Spektren des zirkulären Dichroismus im fernen Ultraviolett der D- und L-[Aba67,95(CO-S)51,52]&sub2;HIV-1-Proteaseanaloga.
Fig. 11 veranschaulicht die Enzymaktivität der [Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-PR-Enantiomeren bei D- und L-Isomeren des Substrats Ac-Thr-Ile-Nle-Nle-Gln-Arg-Amid.

Genaue Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Aminosäure-Rest: Eine Aminosäure, die durch chemischen Verdau (Hydrolyse) eines Polypeptids an seinen Peptid-Verknüpfungen gebildet wurde. Die hierin beschriebenen Aminosäure- Reste liegen entweder in der stereoisomeren "L"- oder in der "D"-Form vor. NH&sub2; bezieht sich auf die freie Aminogruppe, die an dem Aminoende eines Polypeptids vorliegt. COOH bezieht sich auf die freie Carboxygruppe, die an dem Carboxyende eines Polypeptids vorliegt. Unter Einhaltung der standardmäßigen Polypeptid-Nomenklatur (beschrieben in J. Biol. Chem., 243 : 3552-59 (1969) und angepaßt an 37 C. F. R. 1.822(b) (2)), sind Abkürzungen für Aminosäure-Reste in der folgenden Bezugstabelle gezeigt. BEZUGSTABELLE
Die obigen Symbole werden sowohl für L- als auch für D-Aminosäure-Reste angewandt. Das Symbol Xaa wird für einen unbekannten oder einen anderen Aminosäure-Rest angewandt. Gleichwohl wird das Symbol Xaa häufig hierin angewendet, um L- oder D-α-Amino-n-buttersäure (aba), ein isosterischer Ersatz für Cys-Reste, zu bezeichnen.
Es sollte angemerkt werden, daß alle hier durch Formeln angegebenen Sequenzen an Aminosäure-Resten eine Links-zu-Rechts-Orientierung in der herkömmlichen Richtung vom Aminoende zum Carboxyende aufweisen. Darüber hinaus wird der Ausdruck "Aminosäure-Rest" breit definiert, um die Aminosäuren, welche in der Bezugstabelle aufgelistet sind, und modifizierte und ungewöhnliche Aminosäuren, wie jene, welche in 37 C. F. R. 1.822(b)(4) aufgelistet sind und hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, einzuschließen. Ferner sollte zur Kenntnis genommen werden, daß ein Strich am Anfang oder am Ende einer Sequenz von Aminosäure- Resten eine Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz von einer oder mehreren Aminosäure- Resten oder eine kovalente Bindung zu einer Amino-terminierten Gruppe, wie NH&sub2; oder Acetyl, oder zu einer Carboxy-terminierten Gruppe, wie COOH, angibt.
Racemische Mischung: Eine racemische Mischung wird hierin verwendet, um eine Mischung von mindestens einem ersten und zweiten Stereoisomer in jedweden Verhältnissen anzugeben. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "Auftrennung", wie er hierin verwendet wird, auf die Trennung einer ersten racemischen Mischung zu einer zweiten und dritten Mischung, worin die Verhältnisse der zwei Stereoisomeren in der zweiten und dritten Mischung sich von der in der ersten racemischen Mischung unterscheiden, wobei der Anteil von einem größer ist und notwendigerweise der des anderen kleiner ist.

B. D-Enzym-Zusammensetzungen

Die vorliegende Erfindung zieht ein D-Enzym in Betracht, umfassend ein Molekül mit einer Sequenz an Aminosäure-Resten, die ein Polypeptid definiert, welches in der Lage ist, eine enzymatische Reaktion zu katalysieren. Ein D-Enzym weist eine Sequenz an Aminosäure-Resten auf, die im wesentlichen aus D-Aminosäuren besteht.
Der Ausdruck "D-Aminosäure" gibt nicht die Richtung einer spezifischen Drehung des Moleküls an, da es allgemein bekannt ist, daß einige Aminosäuren rechtsdrehend sind, wohingegen andere linksdrehend sind. Vielmehr gibt der Ausdruck eine absolute Konfiguration vermittels einer Übereinkunft an, und zwar bezogen zu den zwei möglichen Stereoisomeren von Glyceraldehyd, D-Glyceraldehyd und L-Glyceraldehyd; siehe z. B. Lehninger in "Biochemistry", Worth Publishers, Inc., New York, 1970, S. 76-78. Somit werden alle Stereoisomeren, welche stereochemisch mit L-Glyceraldehyd verwandt sind, als L bezeichnet, und jene, welche mit D-Glyceraldehyd verwandt sind, werden als D bezeichnet, unabhängig von der Richtung der Rotationsebene von polarisiertem Licht, die durch das Isomer erhalten wird.
Im Fall von Threonin und Isoleucin gibt es zwei stereochemische Zentren, d. h. die Cα-Atome und die Cβ-Atome der Aminosäure. Das hierin verwendete D-Threonin und D-Isoleucin besitzen Stereochemieen an beiden der Aminosäure-Cα-Atomen entgegenstehend der Stereochemie von L-Threonin und L-Isoleucin, d. h. das D-Threonin und D-Isoleucin vollständige Spiegelbilder von L-Threonin bzw. L-Isoleucin sind.
Glycin ist die einzige normal auftretende achirale Aminosäure. Wenn ein Protein oder Enzym hierin als D- oder L-Protein oder -Enzym bezeichnet wird, bedeutet dieses demzufolge, daß im wesentlichen alle der chiralen Aminosäure-Reste, die ein solches Protein oder Enzym ausmachen, die angegebene Chiralität besitzen. Die Anwesenheit von achiralen Aminosäure-Resten, wie Glycin, innerhalb eines Proteins oder Enzyms beeinflußt die Bezeichnung seiner Chiralität, wie sie hierin verwendet wird, nicht.
Alle chiralen Aminosäuren in in der Natur beschriebenen Proteine sind L-Aminosäuren. Somit sind Proteine, die nur chirale Aminosäuren der D-Konfiguration in ihrer Sequenz an Aminosäure-Resten aufweisen (als D-Proteine bezeichnet), in der Natur unbekannt.
In einer Ausführungsform ist es bevorzugt, daß ein D-Enzym eine Sequenz an Aminosäure- Resten besitzt, die der Sequenz an Aminosäure-Resten eines bekannten oder "natürlichen" Enzyms entspricht oder vorzugsweise dazu identisch ist. Mit "natürlich" ist eine Sequenz gemeint, die bei einem Enzym vorliegt, das von der Natur isoliert worden ist, ohne auf eine Abänderung der Enzymsequenz abzielenden labormäßigen Eingriffe. Mit "bekannt" ist entweder ein natürliches Enzym oder ein Enzym gemeint, daß das Produkt eines Sequenz-modifizierenden Prozesses ist, der die Aminosäuresequenz abändert, um ein Enzym mit bekannten enzymatischen Eigenschaften zu erzeugen.
Viele in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen Enzyme, die zu zahlreich sind, um hier angeführt zu werden, wurden einer Mutation ihrer natürlichen Sequenz an Aminosäure-Resten unterzogen, so daß sie nicht länger in ihrer Sequenz an Aminosäure-Resten der Sequenz eines natürlichen Isolats entsprechen und immer noch eine enzymatische Aktivität aufweisen. Somit sieht die Erfindung in einer anderen Ausführungsform D-Enzyme mit Sequenzen an Aminosäure-Resten vor, welche bekannten Enzymen entsprechen.
Ein D-Enzym kann eine Vielzahl von enzymatischen Aktivitäten aufweisen, so wie die Aktivität gemeinhin in der Biochemie verstanden wird, was grob die Fähigkeit bedeutet, die Aktivitätsenergie einer Reaktion zwischen einem oder mehreren Substraten zu verringern, um ein oder mehrere Reaktionsprodukte zu bilden. Zum Zwecke dieser Erfindung ist es brauchbar, Enzymsubstrat-Spezifitäten, welche chiral und achiral sind, zu unterscheiden.
Die chirale Spezifität bezieht sich auf die Selektivität eines Enzyms, die Reaktion nur eines von zwei Stereoisomeren zu katalysieren. Die achirale Spezifität bezieht sich auf das Vermögen des Enzyms, mit einem Substrat zu reagieren, welches dem Enzym keine erkennungsabhängige asymmetrische Struktur präsentiert, d. h. die Enzym-Substrat-Erkennung und Katalyse hängt nicht von der Anwesenheit einer asymmetrischen Struktur in der Substrat-Bindungsregion des Enzyms ab. Anders ausgedrückt und im Kontext der vorliegenden Erfindung, die sich auf die enantiomere Selektivität eines D-Enzyms bezieht, kann ein achirales Substrat durch entweder ein D- oder L-Enzym katalysiert werden, da keine asymmetrische Strukturen in dem achiralen Substrat vorliegen, von dem die Enzym-Bindung und -Katalyse abhängt. Dagegen kann ein chirales Substrat nur durch das eine oder andere eines D- und L-Enzympaares katalysiert werden, da eine strukturelle Asymmetrie bei der Bindung und Katalyse involviert ist.
Eine weitere Unterscheidung kann zwischen chiralen und achiralen Reaktionsprodukten vorgenommen werden. Zum Beispiel kann ein achirales Substrat zu einem chiralen oder achiralen Reaktionsprodukt umgewandelt werden. Wenn ein achirales Substrat zu einem chiralen Reaktionsprodukt umgewandelt wird, hängt die Chiralität des Reaktionsproduktes von der Chiralität des Enzyms ab, d. h. einem L- oder D-Enzym, ab. In gleicher Weise kann ein chirales Substrat zu einem chiralen oder einem achiralen Reaktionsprodukt umgewandelt werden.
Viele Enzyme zeigen chirale Spezifität einschließlich des bevorzugten und beispielhaften Enzyms HIV-I-Protease. In gleicher Weise gibt es viele Enzyme, welche achirale Spezifität zeigen, einschließlich Superoxiddismutase und Carboanhydrase.
Somit zieht die Erfindung in einer Ausführungsform ein D-Enzym mit chiraler Spezifität in Betracht, welches ein chirales Substrat zu einem Reaktionsprodukt umwandelt (die Reaktion davon katalysiert), jedoch nicht auch das Enantiomer (Stereoisomer) des chiralen Substrats umwandelt. Ein Beispiel ist die hierin beschriebene HIV-1-Protease, welche nur mit dem D-Substrat und nicht mit dem L-Substrat reagiert.
In einer weiteren Ausführungsform sieht die Erfindung ein D-Enzym mit achiraler Spezifität vor, wobei sowohl das D-Enzym als auch das entsprechende L-Enzym ein achirales Substrat zu einem Reaktionsprodukt umwandelt. Ein Beispiel ist die Reaktion, welche durch Superoxiddismutase bei Superoxid-Radikalen katalysiert wird. Ein weiteres Beispiel ist die Reaktion, welche durch Carboanhydrase katalysiert wird.
Ein D-Enzym dieser Erfindung kann jedwede Größe (Länge an Aminosäuren) aufweisen und kann aus mehreren Untereinheiten bestehen, wie es allgemein für viele charakterisierte Enzyme bekannt ist. Ein D-Enzym aus mehreren Untereinheiten besteht gänzlich aus D-Protein-Untereinheiten. Protein-Untereinheiten, welche ein Enzym aufbauen, oder ein Enzym aus einer einzelnen Protein-Untereinheit, können stark in der Größe variieren. Typische Enzym-Untereinheiten liegen zwischen 80 und 500 Aminosäure-Resten in der Länge, obgleich kürzere und längere Proteine bekannt sind, von etwa 50 Aminosäure-Resten zu Größen von über 4000 Aminosäure- Resten.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einer Ausführungsform allgemein die Verwendung von D- Enzymen in Verfahren zur stereoselektiven Synthese oder Auftrennung von racemischen Mischungen von chiralen organischen Säuren, Alkoholen, Aminen, Estern, Amiden, Nitrilen, Hydantoinen und anderen chiralen Verbindungen, in denen ein Enzym verwendet wird, welches in der Lage ist, stereoselektiv eine Reaktion zu katalysieren, um ein Isomer eines chiralen Vorläufers zu einer chemisch davon unterschiedenen optisch aktiven Verbindung umzuwandeln. Enzyme sind für die Rolle der stereoselektiven Katalyse gut geeignet, da sie asymmetrische, katalytisch wirksame Stellen enthalten, in denen das Molekül, welches synthetisiert wird oder eine Auftrennung erfährt, gebunden werden kann. Da diese aktiven Enzymstellen selbst asymmetrisch sind, ermöglichen sie es, daß zwei Enantiomere eines gegebenen racemischen Substrats unterschiedlich bearbeitet werden, und sie ermöglichen es, daß chirale Produkte aus achiralen Vorläufern gebildet werden.
Zum Beispiel liegen viele Enzyme vor, welche die Hydrolyse oder Kondensation von chemisch funktionellen Ester- und Amidgruppen katalysieren. Viele von diesen Enzymen, jedoch nicht alle von ihnen, gehören zu entweder einer von zwei Hauptklassen an Enzymen, die als Hydrolasen oder Lyasen bekannt sind, wie in den Empfehlungen der "Commission on Biochemical Nomenclature", Elsevier, Amsterdam, The Nomenclature and Classification of Enzyms (1972), S. 17- 22, definiert sind. Der Ausdruck E. C., dem eine Reihe von Zahlen folgt, wie hier verwendet, liefert die Identifizierung eines Enzyms, und zwar den Empfehlungen der Kommission folgend.
Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung brauchbare Enzym-Typen schließen Enzyme ein, welche die folgenden Kategorien von Reaktionen katalysieren, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die Hydrolyse von Estern zur Bildung von Säuren und Alkoholen;
die Bildung von Estern (d. h. Veresterungen) aus Säuren und Alkoholen;
die Umesterung, d. h. die Reaktion eines Esters mit einem Alkohol oder einer Säure zur Bildung eines anderen Esters und eines anderen Alkohols oder einer anderen Säure;
Transaminierungen (z. B. die Reaktion zwischen einer α-Ketosäure und einer Aminosäure);
die Hydrolyse von Amiden (einschließlich Peptid-Bindungen und N-Acylverbindungen) unter Bildung von Säuren und Aminen;
die Bildung von Amiden (einschließlich Peptiden) aus Säuren und Aminen (oder Aminosäuren); die Hydrolyse von Aminosäurehydantoinen, um Carbamoylaminosäuren und Aminosäuren zu erhalten; und
die Hydrolyse von Nitrilen, um die entsprechenden Amide und Carbonsäuren zu erhalten (und insbesondere die Hydrolyse von Aminonitrilen zu Aminoamiden und Aminosäuren).
Spezifische Beispiele von solchen Enzymen schließen Trypsin, Chymotrypsin, Thermolysin, Rennin, Pepsin, Papain, Carboxypeptidasen, Aminopeptidasen, Penicillin- und Cephalosporinacylase, Acetylcholinesterase, Cholesterinesterase und Säugerpankreaslipasen und -peptidasen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Bevorzugte Esterasen schließen Chymotrypsin (E. C. 3.4.21.1) ein, und zwar aufgrund ihrer hohen Stereoselektivität und breitem Substratbereich. Andere Esterasen schließen Carboxylesterase (E. C. 3.1.1.1), Carboxypeptidase A (E. C. 3.4.17.1), Acetylcholinesterase (E. C. 3.1.1.7), Pepsin (E. C. 3.4.23.1), Trypsin (E. C. 3.4.21.4) und Papain (E. C. 3.4.22.2) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. ·
Die Sequenzen aus Aminosäure-Resten für natürliche Enzyme und veröffentlichte modifizierte Enzyme, die für die vorliegende Erfindung brauchbar sind, sind allgemein in der veröffentlichten Literatur und auf Computer-Datenbanken verfügbar. Bevorzugt und weithin verwendete Datenbanken für Proteinsequenzen schließen GeneseqTM, GenBank®, EMBL, Swiss-Prot, PIR und GenPept ein, welche allesamt kommerziell von der Intelligenetics, Inc. (Mountain View, Kalifornien) verfügbar sind.
Die komplette dreidimensionale Struktur für viele Enzyme, welche zur Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind, ist von der Datenbank Brookhaven Protein Datenbank, Brookhaven National Laboratories, Upton, NY, verfügbar. Beispielhafte Proteine mit ihren jeweiligen Protein-Datenbanken-Codes (PDB-Nummern), welche in der Datenbank eingeschlossen sind, schließen folgende ein:
(1hvp): HIV-1-Protease-Komplex mit Substrat; (2hvp): HIV-1-Protease; (3hvp): (aba==67,95==)-HIV-1-Protease, sf2-Isolat; (4hvp): HIV-1-Protease Komplex mit dem Inhibitor n-Acetyl-*thr-*ile-*nle-psi(ch2-nh)-*nle-*gln-*arg-amid (mvt-101) (SEQ ID NR 1); 2(cyp): Cytochrom-C-peroxidase (e.c.1.11.1.5); (1gp1): Glutathionperoxidase (e.c.1.11.1.9); (4cat): Catalase (e.c.1.11.1.6); (7cat): Catalase (e.c.1.11.1.6); (8cat): Catalase (e.c.1.11.1.6); und (2sod): cu, zn-Superoxiddismutase (e.c.1.15.1.1).
Besonders bevorzugt sind die Antioxidanz-Enzyme der Superoxiddismutase(SOD)-Klasse. Aufgrund der breiten Verteilung von SOD-Enzymen in aeroben Organismen sind viele Isolate von SOD in vielen Spezies berichtet worden. Eine kürzliche Literatur-Recherche enthüllte Beschreibungen der Sequenz von 26 unterschiedlichen SOD-Enzymen in Säugern, Nicht-Säugern, Bakterien, Hefe und Pflanzen, einschließlich humane EC-SOD [Hjalmarsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 6340-6344 (1987)]; humane SOD [Sherman et al., Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 5465-5469] und Schneider et al., Cell, 54 : 363-368 (1988); Rinder-SOD [Steinmann et al., J. Biol. Chem., 249 : 7326-7338 (1974)]; Pferde-SOD [Lerch et al., J. Biol. Chem., 256 : 11545- 11551 (1981)]; Maus-SOD [Getzoff et al., Proteins: Struct. Fung. Genet., 5 : 322-336 (1989)]; Schweine-SOD [Schinina et al., FEBS Lett., 186 : 267-270 (1985)]; Kaninchen-SOD [Reinecke et al., Biol. Chem., 369 : 715-725 (1988)]; Schaf-SOD [Schinina et al., FEBS Lett., 207 : 7-10 (1986)]; Ratten-SOD [Steffens et al., Z. Physiol. Chem., 367 : 1017-1024 (1986)]; Drosophila- SOD [Nucleic Acids Res., 17 : 2133-2133 (1989)]; Xenopus-SOD [Eur. J. Biochem. 1989)]; Brucella-SOD [Beck et al., Biochemistry, 29 : 372-376 (1990)]; Caulobakter-SOD [Steinman et al., J. Bacteriol. (1988)]; Neurospora-SOD [Lerch, J. Biol. Chem., 260 : 9559-9566 (1985)]; Photobakterium-SOD [Steffens et al., Z. Physiol. Chem., 364 : 675-690 (1983)]; Schistosoma-SOD [Simorda et al., Exp. Parasitol., 67 : 73-84 (1988)]; Hefe-SOD [Steinman et al., J. Biol. Chem., 255 : 6758-6765 (1980)]; Blumenkohl-SOD [Steffens et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 367: 1007-1016 (1986)]; Kohl-SOD [Steffens et al., Physiol. Chem., 367 : 1007-1016 (1986)]; Mais- SOD (Cannon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 : 179-183 (1987)]; Erbsen-SOD [Scioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 7661-7665 (1988)]; Spinat-SOD [Kitagawa et al., J. Biochem., 99 : 1289-1298 (1986)]; und Tomaten-SOD [Plant Mol. Biol., 11 : 609-623 (1988)]. Jede dieser Varietäten von SOD sind zur Verwendung als ein D-Enzym der vorliegenden Erfindung geeignet.
Carboanhydrase C ist ein weiteres bevorzugtes Enzym, das zur Herstellung eines D-Enzyms geeignet ist. Carboanhydrase C katalysiert die Reaktion, welche Kohlendioxid und Wasser unter Bildung von Bicarbonat und Wasserstoffionen kombiniert. Die Sequenz von Carboanhydrase C wird von Henderson et al., Biochim. Biophys. Res. Comm., 52 : 1388 (1973); Lin et al., J. Biol. Chem., 249 : 2329 (1974) beschrieben.
Andere optisch spezifische Enzyme, welche mit einem chiralen Substrat reagieren und deshalb als ein D-Enzym dieser Erfindung brauchbar sind, sind ausführlich in dem US-Patent Nr. 5 077 217, 5 057 427, 4 800 162 und 4 795 704 beschrieben worden, welche hierin durch den Bezug darauf spezifisch einbezogen sind.

C. Synthese eines D-Enzyms

Ein D-Enzym der vorliegenden Erfindung kann mittels Methoden hergestellt werden, die den Fachleuten im Polypeptid-Bereich verfügbar sind. Das genaue Verfahren, welches für die Synthese des Polypeptids verwendet wird, wird nicht als wesentlich für die Grundstruktur eines D- Enzyms dieser Erfindung angesehen, und deshalb wird es nicht als beschränkend angesehen, insbesondere da die Technologie neue Wege entwickelt, um Polypeptide zu synthetisieren und anzuordnen bzw. zusammenzubauen.
Bevorzugte Wege der Polypeptidsynthese schließen ein:
1. Herkömmliche chemische Synthese, z. B. schrittweise Synthese, und
2. Zusammenbauen von Polypeptid-Baublöcken durch chemische Ligation.
Derzeit wird es als unpraktisch angesehen, herkömmliche chemische (schrittweise) Syntheseverfahren anzuwenden, um Polypeptide mit mehr als 100 Aminosäure-Resten herzustellen. Andererseits können die chemischen Ligationsverfahren angewendet werden, um Polypeptide zusammenzubauen, die um ein Vielfaches größer sind. Demzufolge sind für D-Enzyme mit mehr als 100 Aminosäure-Resten chemische oder enzymatische Ligationstechniken derzeit die einzige praktische Methode zur Herstellung solcher Produkte. Hierin ist eine Ligationsstrategie zur Herstellung von Mengen im Bereich von 10 bis 100 mg der D- und L-HIV-1-Protease-Enzyme beschrieben.
Obgleich sie derzeit noch nicht verfügbar sind, können hergestellte Protein-Synthesegerätschaften unter Verwendung von D-Proteinen das Problem der Einbringung von D-Aminosäuren in die Protein-Translationsmaschinerie lösen, wodurch es möglich wird, D-Enzyme unter Verwendung von rekombinanter DNA-Expression von Messenger-RNA und D-Aminosäuren herzustellen.

Herkömmliche stufenweise Synthesen:

Techniken der synthetischen Chemie, wie die stufenweise Zugabe von Aminosäuren bei einer Festphasen-Synthese vom Merrifield-Typ, sind aus Gründen der Reinheit, der antigenen Spezifität, der Freiheit von ungewünschten Nebenprodukten, der Leichtigkeit der Herstellung und dergleichen bevorzugt. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der vielen Techniken, die zur Syn these von L-Proteinen und -Enzymen verfügbar sind, kann gefunden werden in "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Franzisko, 1969; Bodanszky et al., in "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons, Zweite Ausgabe, 1976, und Meienhofer, in "Hormonal Proteins and Peptides", Band 2. S. 46, Academic Press (New York), 1983; und Kent, Ann. Rev. Biochem., 57: 957, 1988, für die Festphasen-Peptidsynthese, und Schroder et al., in "The Peptides", Band 1, Academic Press (New York), 1965, für Synthesen der klassischen Lösung, wobei jede davon hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Geeignete Schutzgruppen, die in jeder solcher Synthesen geeignet sind, sind in den obigen Texten und von McOmie in "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973, welche hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, einbezogen.
Im allgemeinen umfassen die in Betracht gezogenen Festphasen-Syntheseverfahren die sequentielle Zugabe eines oder mehrerer Aminosäure-Reste oder geeignet geschützter Aminosäure- Reste zu einer wachsenden Peptidkette. Normalerweise ist entweder die Amino- oder Carboxylgruppe des ersten Aminosäure-Restes durch eine geeignete, selektiv entfernbare Schutzgruppe geschützt. Eine andere, selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für Aminosäuren eingesetzt, die eine reaktive Seitengruppe enthält, wie Lysin.
Für die Synthese eines D-Enzyms werden eher D-Aminosäuren oder geschützte D-Aminosäuren eingesetzt als die herkömmlichen L-Aminosäuren. Für die Polypeptid-Synthese geeignete D- Aminosäuren sind von dem Peptide Institute (Osaka, Japan); Peptides International (Louisville, KY); Bachem Bioscience (Philadelphia, PA); und Bachem California (Torrance, CA) im Handel erhältlich.
Beispielsweise wird unter Anwendung einer Festphasen-Synthese die geschützte oder derivatisierte D-Aminosäure an einen inerten festen Träger durch ihre ungeschützte Carboxyl- oder Aminogruppe gebunden. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann selektiv entfernt, und die nächste D-Aminosäure in der Sequenz, bei der die komplementäre (Amino- oder Carboxyl-)Gruppe in geeigneter Weise geschützt ist, wird eingemischt und unter Bedingungen umgesetzt, die zur Bildung der Amid-Bindung mit dem Rest, der bereits an dem festen Träger gebunden ist, geeignet sind. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann von diesem neu hinzugesetzten D-Aminosäure-Rest entfernt, und dann wird die nächste D-Aminosäure (geeigneterweise geschützt) hinzugesetzt, usw. Schließlich wurden die gewünschten D- Aminosäuren in geeigneter Reihenfolge verbunden, wobei jedwede verbleibenden End- und Seitengruppen schützende Gruppen (und fester Träger) sequentiell oder gleichzeitig entfernt werden, um das endgültige Polypeptid zu erhalten.

Ligationstechniken:

Die chemische Ligation von Polypeptiden wurde kürzlich von Kent in der US-Anmeldung, Serien-Nr. 07/865 368, eingereicht am 8. April 1992, beschrieben. Diese Technik ist für D- Enzyme mit einer Länge von 100 Aminosäure-Resten oder mehr bevorzugt. Bei diesem Verfahren werden zuerst zwei Polypeptide synthetisiert, und sie enthalten Enden, die für eine chemische Ligation geeignet sind. Nach der stufenweisen chemischen Synthese und der Abspaltung von ihren jeweiligen Festphasen-Harzen, werden die zwei Polypeptide gemischt und umgesetzt, um die angepaßten Enden zu vereinigen und ein größeres, lineares Polypeptid zu bilden, welches die zwei Polypeptide beinhaltet.
Eine beispielhafte stufenweise Synthese eines D-Enzyms ist in Beispiel 1 genau aufgeführt, welches die Synthese einer Vielzahl von D-HIV-1-Proteasen beschreibt. Das Beispiel 5 beschreibt eine beispielhafte Synthese des Ligations-Typs von D- und L-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-Proteaseanaloga. Das D-[Aba67,95(CO-S)51,52]&sub2;HIV-1-Proteaseanalog von Beispiel 5 ist funktionell zu der D-HIV-1-Protease von Beispiel 1 äquivalent.
Eine ähnliche Synthese kann für die Herstellung von D-Superoxiddismutase, Carboanhydrase oder jedwedem anderen D-Enzym, welches hierin beschrieben ist, angewendet werden.

D. Verfahren zum Screenen von chemischen Bibliotheken

Die gängigste Methode zur Identifizierung von pharmazeutisch brauchbaren Verbindungen involviert das Screenen von chemischen Bibliotheken. Die Gründlichkeit eines solchen Screenens kann in starkem Maße durch die Anwendung sowohl von L-Enzymen als auch von D- Enzymen erhöht werden.
Aus der Natur isolierte Naturprodukt-Bibliotheken können aus mehreren hunderttausend Verbindungen bestehen. Chemische Bibliotheken können ebenfalls hergestellt werden durch die chirale Synthese von bestimmten Enantiomeren oder durch die nicht-chirale Synthese von Racematen. Bei der Suche nach neuen Arzneimittel-Kandidaten können solche Bibliotheken gescreent werden, um Verbindungen zu identifizieren, die in einem bestimmten Assay aktiv sind. In vielen Fällen ist das Zielmolekül ein Enzym oder ein Enzym-System, und die Suche zielt auf die Identifizierung von Arzneimittel-Kandidaten ab, welche als spezifische Inhibitoren oder Co-Faktoren eines solchen Enzyms oder eines solchen Enzym-Systems dienen können. Sobald eine Kandidatverbindung als ein Inhibitor eines spezifischen therapeutisch relevanten Enzyms identifiziert worden ist, können Analoga einer solchen Kandidatverbindung entworfen und synthetisiert werden, um ihre Aktivität oder andere wünschenswerte Eigenschaften zu verbessern.
In vielen Fällen ist die chirale Spezifität ein notwendiges Merkmal von aktiven Substraten, Co- Faktor und Inhibitoren. Gleichwohl ist hierin beschrieben, daß die chirale Spezifität von Substraten, Co-Faktoren und Inhibitoren von der Chiralität des Zielenzyms abhängt. Demzufolge kann das Zielenzym häufig zwischen aktiven und inaktiven Enantiomeren eines gegebenen Substrats, Co-Faktors und Inhibitors unterscheiden. Komponentenelemente einer Naturprodukt- Bibliothek zeigen häufig eine statistische Chiralität und besitzen eine inhärente Beziehung zu dem Zielenzym. Demzufolge, wenn nur ein einzelnes Enantiomer innerhalb der Bibliothek vorliegt, ist die Chiralität eines solchen Enantiomeren mit bezug auf ein bestimmtes Zielenzym genauso wahrscheinlich das falsche (inaktive) Enantiomer, wie es das richte (aktive) ist. Wenn die Bibliothek nur gegen die native (L)-Konfiguration eines Zielenzyms gescreent wird, und wenn die Elemente der Bibliothek nicht racemisch sind, d. h., wenn sie chiral sind, gibt es eine beträchtliche Chance (50/50), daß die Bibliothek nur das inaktive Enantiomer einschließt.
Die vorliegende Erfindung lehrt, daß das Screenen einer Naturprodukt-Bibliothek gegen sowohl ein L-Enzym als auch gegenüber seinem D-Enzym ungefähr die Anzahl von Kandidatverbindungen, die aus einer solchen Bibliothek identifiziert werden können, ungefähr verdoppelt werden kann.
Jedwede Kandidatverbindung, die als aktiv gegenüber ein D-Enzym identifiziert worden ist, kann bezüglich des entsprechenden L-Enzyms inaktiv sein. Gleichwohl ist die Strukturanalyse einer Kandidatverbindung, die mit bezug auf ein D-Enzym aktiv ist, voraussagend für die Struktur einer Kandidatverbindung, die bezüglich des korrespondierenden L-Enzyms aktiv ist, d. h. die Enantiomeren von Verbindungen, die sich als aktiv mit bezug auf ein D-Enzym herausgestellt haben, haben sehr wahrscheinlich eine entsprechende Aktivität mit bezug auf das entsprechende L-Enzym.
Demzufolge kann die Anzahl von Kandidatverbindungen, die als positiv aus einer chemischen oder natürlichen Produkt-Bibliothek identifiziert werden, beträchtlich erhöht werden, wenn die Bibliothek sowohl gegen die L- als auch gegen die D-Version des Enzyms gescreent wird. Zum Beispiel könnte das Screenen einer Naturprodukt-Bibliothek mit bezug auf die Inhibierung der Protease-Aktivität sowohl von L- als auch D-HIV-Protease signifikant die Anzahl von Kandidat- Arzneistoffen, die als aktive Inhibitoren identifiziert werden, erhöhen.
Die oben erwähnten Konzepte gelten in gleichem Maße für das Screenen von Naturprodukt- Bibliotheken mit bezug auf die Rezeptoraktivität, d. h. als Agonisten oder Antagonisten mit bezug auf Protein-Rezeptoren. Eingeschlossen unter Protein-Rezeptoren, gegen welche Naturprodukt- und/oder chemische Bibliotheken in geeigneter Weise gescreent werden können, sind folgende: GPIIb-IIIa und LFA-1, Rouslahti et al. Science, 238 : 491-497 (1987); CSAT, Horwitz et al. J. Cell Biol., 101 : 2134 (1985); VLA-2, Nieuwenhuis et al., Nature, 318 : 470 (1985); CR3- Komplement-Rezeptor, Wright et al., PNAS, 84 : 1965 (1987); CR2-Komplement-Rezeptor, Nemerow et al., J. Virol., 55 : 3476 (1985); CD4 T-Zell-Receptor, Guyader et al., Nature, 320 : 662 (1987); FRP-Rezeptor, Yu et al., Nature, 330 : 765 (1987); Apolipoprotein-Rezeptor, Yamada et al., J. Clin. Invest., 80 : 507 (1987); Interleukin-Rezeptor, Dower et al., Immunology Today, 8 : 46 (1987); Fc-Rezeptor, Anderson et al., J. Immunol., 138 : 2254 (1987); Somatostatin- Rezeptor, Kim et al., J. Biol. Chem., 262 : 470 (1987); PDGF-Rezeptor, Keating et al., J. Biol. Chem., 252 : 7932 (1987); und Transferrin-Rezeptor, Kohgo et al., Blood, 70 : 1955 (1987).
Andere Proteine mit Bindungsstellen, welche gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gescreent werden können, schließen folgende ein: Insulin-Rezeptor-Bindungsstelle auf Insulin, Reovirus-Rezeptor-Bindungsstelle auf dem viralen Hämaglutininprotein, Fibrinogen-Rezeptor- Bindungsstelle auf Fibrinogen A α, Thyroid-Hormon-Rezeptor-Bindungsstellen α und β, LDL- Rezeptor-Bindungsstelle auf Apo E, Lipid-A-Bindungsstelle, Lecithin-Cholesterol-Acyltransferase(LCAT)-Bindungsstelle auf Apo AI, und Mac-1-Integrin-Rezeptor-Bindungsstelle auf Fibrinogen-D-30.

E. Verfahren zur Herstellung von chiral reinen Verbindungen

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren unter Verwendung eines D-Enzyms dieser Erfindung zur Herstellung von chiral reinen chemischen Verbindungen in Betracht gezogen. Eine chiral reine Verbindung, wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das im wesentlichen frei von seinem Stereoisomer ist.
Die Verfahren können in einer Vielzahl von Wegen ausgeführt werden. Eine einzelne chiral reie Chemikalie kann hergestellt werden durch die Reaktion eines D-Enzyms bei einer racemischen Mischung von Substraten, wodurch in der racemischen Mischung eines der Substratisomere zurückbleibt, und Umwandeln des anderen Substratisomeren in ein Produkt. Bei diesem Verfahren kann die gewünschte chiral reine Verbindung ein Reaktionsprodukt sein, oder es kann das Substratisomer sein, was in der racemischen Mischung nicht umgesetzt zurückbleibt, befreit von dem verunreinigenden Isomer, durch die Wirkung des D-Enzyms.
Somit wird in dieser Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer chiral reinen Chemikalie in Betracht gezogen, umfassend:
a) die Umsetzung eines ersten Stereoisomeren mit einem D-Enzym, das spezifisch das erste Stereoisomer zu einem chiralen Reaktionsprodukt umwandelt, in einer wäßrigen Mischung; und
b) das Isolieren des chiralen Reaktionsprodukts aus der Mischung, wodurch der chiral reine chemische Stoff gebildet wird. In einer alternativen Version dieser Ausführungsform umfaßt die wäßrige Mischung eine racemische Mischung mit mindestens einem ersten und einem zweiten Stereoisomer.
Die Reaktion wird initiiert durch Vermischen vom D-Enzym mit Substrat und Unterziehen der Reaktionsmischung geeigneten Reaktionsbedingungen zum Betreiben der durch Enzym-kataly sierten Reaktion. Für ein D-Enzym hängen diese Bedingungen von der besonderen zu katalysierenden Reaktionschemie und von den Bedingungen ab, unter denen das Enzym aktiv ist. Die Reaktionsbedingungen für ein D-Enzym sind bevorzugterweise die gleichen, welche optimalerweise für die korrespondierende Reaktion des isomeren Substrats vermittels des korrespondierenden L-Enzyms verwendet werden. Bevorzugte Reaktionsbedingungen sind jene Temperatur- und wäßrige Pufferbedingungen, welche die maximale Enzymaktivität für die gewünschte Reaktion und minimale unerwünschte Nebenreaktionen begünstigen.
Der Isolationsschritt kann mittels jedweder chemischen Manipulation durchgeführt werden, welche zu der Auftrennung des chiral reinen chemischen Stoffes von der in Schritt (a) gebildeten Reaktionsproduktmischung führt. Beispielhafte Isolationsmanipulationen sind dem Chemiker allgemein bekannt und schließen Lösungsmittelextraktionen, Chromatographie, selektive Kristallisation, Destillation und dergleichen ein.
In einer verwandten Ausführungsform sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer chiral reinen Chemikalie vor, umfassend:
a) die Umsetzung einer racemischen Mischung, die mindestens ein erstes und ein zweites Stereoisomer aufweist, mit einem D-Enzym, welches das erste Stereoisomer zu einem Reaktionsprodukt umwandelt, in einer wäßrigen Mischung; und
b) das Isolieren des zweiten Stereoisomeren aus der Mischung, wodurch die chiral reine Chemikalie gebildet wird. Die Reaktion wird für eine Zeitdauer und unter Reaktionsbedingungen durchgeführt, die ausreicht, um im wesentlichen das gesamte des ersten Stereoisomeren zu dem chiralen Reaktionsprodukt umzuwandeln.
Bei dieser letzteren Ausführungsform führt die Entleerung der ursprünglich racemischen Mischung an unerwünschtem Stereoisomer zu der chiral reinen Chemikalie, und das verbleibende nicht umgesetzte Stereoisomer wird isoliert, um die chiral reine Chemikalie zu bilden.
Die chemische Synthese einer chiral reinen Chemikalie unter Verwendung eines D-Enzyms kann in einer homogenen oder heterogenen, wäßrigen Reaktionsumgebung durchgeführt werden, oder sie kann in Enzym-Reaktoren durchgeführt werden, wo das D-Enzym in der festen Phase vorliegt, oder in Membran-Reaktoren, wo ein Lösungsmittel oder D-Enzym entweder von den Reaktanten oder Produkten wegseggregiert wird. Solche Festphasen-Enzym-Reaktoren und Membran-Enzym-Reaktoren und ihre Verfahren zur Anwendung sind ausführlich in folgenden US-Patenten beschrieben worden: Nr. 5 077, 217, 5 057 427, 4 800 162 und 4 795 704.

F. Verfahren der Co-Kristallisation von racemischen Mischungen

Bei einer Ausführungsform faßt die Erfindung die Verwendung eines D-Enzyms in Betracht, um ein Röntgenbeugungsmuster eines Kristalls zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur eines Proteins zu erzeugen. Verfahren zur Herstellung von kristallisierten Proteinen und der Analyse der Kristallstruktur durch Röntgenstrahl-Kristallographie sind allgemein bekannt; siehe z. B. die Lehren von Stout et al., "X-Ray Structure Determination: A Practical Guide", Macmillan, New York, 1968; und Miller et al., J. Mol. Biol., 204 : 211-212, 1988.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform zieht die Erfindung die Co-Kristallisation von D- und L-HIV-1-Proteaseenzymen, die wie in Beispiel 1 hergestellt worden sind, in Betracht. Der resultierende Kristall, welcher durch die von Miller et al., supra, beschriebene Dampfdiffusions-Kristallwachstumsmethode gebildet wurde, wird verwendet, um die dreidimensionale Struktur von HIV-1-Protease unter Verwendung herkömmlicher Röntgenstrahlbeugungsmethoden aufzulösen, um einen racemischen Kristall zu erzeugen, bedingt durch die Gegenwart der enantiomeren Formen (D- und L-) von HIV-1-Protease in dem Kristall.
Eine solche Kristallstruktur ist weiterhin z. B. brauchbar, um Inhibitoren von HIV-1-Protease zu modellieren, die brauchbar sind zur therapeutischen Behandlung der HIV-1-Infektion durch Inhibierung der Protease.
Die Co-Kristallisation von D- und L-HIV-Protease-Präparationen kann zentrosymmetrische Kristalle für Röntgenstrahlbeugungsuntersuchungen hoher Genauigkeit erzeugen. Dieses sollte zu Daten führen, welche breite Anwendbarkeit bei Arzneimittel-Designstudien für AIDS-Therapeutika finden können. Zu diesem Zweck ist es notwendig, jedes Enantiomorph des Enzyms in Mengen von 100 mg ohne der Komplikation der Autolyse während der Extraktion, Reinigung und dem Falten der synthetischen Produkte herzustellen. Wir haben beschrieben, daß ein HIV-1- Protease-Analog, welches durch die gezielte chemische Ligation von ungeschützten Peptid-Segmenten hergestellt wurde und einen Thioester-Ersatz für die natürliche Peptid-Bindung zwischen Gly&sup5;¹-Gly&sup5;² enthält, volle Aktivität zeigt. Diese Segment-Kondensationsstrategie vermeidet ebenfalls in starkem Maße die Möglichkeit des Selbstverdaus durch die Enzyme während ihrer Herstellung.

G. Therapeutische Methoden

Die Erfindung zieht therapeutische Methoden in Betracht, die die Verabreichung von therapeutisch wirksamen Mengen eines D-Enzyms an Säuger oder Menschen involviert, wobei ein L- Enzym normalerweise der aktive Bestandteil in der zu verabreichenden therapeutischen Zusammensetzung wäre. Durch den Ersatz eines D-Enzyms für sein korrespondierendes L-Enzym erlangt das therapeutische Enzym die Vorteile eines D-Enzyms, wie hierin beschrieben, einschließlich der erhöhten wirksamen Halbwertszeit, bedingt durch die Beständigkeit gegenüber Proteasen und die verringerte Immun-Erkennung.
Enzyme zur Verwendung bei therapeutischen Behandlungsmethoden, wie ein D-Enzym dieser Erfindung, können von einer Vielzahl von Enzymen aus bekannten primären Aminosäure-Rest- Sequenzen abgeleitet werden, welche therapeutische Anwendungsmöglichkeiten bereitstellen und welche achirale Substrate besitzen. Insbesondere Antioxidanz-Enzyme besitzen therapeutische Anwendungsmöglichkeiten, welche davon Nutzen ziehen können, daß sie in Form eines D-Enzyms vorliegen, um die wirksame therapeutische Halbwertszeit zu erhöhen.
Antioxidanzien fungieren als entzündungshemmende Mittel. Die medizinisch wichtigen Antioxidanz-Enzyme bekannter Strukturen sind Superoxiddismutase, Katalase und Glutathionperoxidase. Diese Enzyme sind bei der Verhinderung von post-ischämischen Verletzungen und der Regulierung von Entzündungsstörungen involviert; Wilsman et al., Superoxide and Superoxide Dismutase in Chemistry, Biology and Medicine, Rotilio, Hg., Elsevier Science, Amsterdam Publishers (1986). Wie im Fall von SOD gezeigt, würden diese Enzyme Nutzen ziehen aus einer erhöhten zirkulatorischen Halbwertszeit.

1. Superoxiddismutase

Die SOD-Enzyme, welche die Umwandlung vom Superoxid-Radikal zu molekularem Sauerstoff und Wasserstoffperoxid katalysieren, sind ubiquitär in Organismen, welche Sauerstoff nutzen, vorhanden. ·
Die Dismutationsreaktion von SOD-Enzymen ist wichtig, um zu verhindern, daß Gewebe durch freie Radikale Schaden nimmt. Tatsächlich wurde die Wirksamkeit von humaner intrazellulärer SOD (HSOD) bei der Linderung von Entzündungsstörungen, einschließlich Osteoarthritis, durch klinische Studien beim Menschen gezeigt; Superoxide and Superoxide Dismutase in Chemistry, Biology and Medicine, Elsevier, 500-5 (1986). Darüber hinaus haben tierische Studien nahegelegt, daß SOD-Enzyme ein therapeutisches Potential für virale Infektionen besitzen; siehe Oda et al., Science, 244 : 974-6 (1989). SOD-Enzyme sind ebenfalls bei der Vorbeugung von Alloxan- Diabetes impliziert worden [Grankvist et al., Nature, 294 : 158 (1981)] und bei der Vermeidung von Metastasen von bestimmten Krebsformen (EPA-Anmeldung Nr. 0 332 464).
Mithin sind bei einer Ausführungsform Verfahren zur Verringerung von Gewebeschäden, die durch freie Sauerstoff-Radikale (Superoxid) in vivo oder in vitro verursacht werden, durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen, und zwar unter Verwendung eines D-Superoxiddismutase(D-SOD)-Enzyms dieser Erfindung.
Humane rekombinante SOD kann ischämisches Gewebe in experimentellen Modellen schützen, wenn es in den Kreislauf kurz vor der Reperfusion injiziert wird (Ambrosio et al., Circulations, 75 : 282, 1987). Die Verletzung des Endothels, einem mit Glykosaminoglycanen bedeckten Gewebe, ist eine Hauptfolge der Ischämie-Reperfusion-Verletzung. Dies verursacht Ödem-Bildung aufgrund des Verlustes der Barriere-Funktion und begünstigt die Plättchenanheftung am Endothel. Die Schutzwirkung von SOD ist aus sein Abfangen vom Superoxidanionen zurückzuführen. SOD kann ebenfalls das Endothel "in vivo" schützen, indem es die Bildung von Peroxynitrit verhindert, welches aufgrund seines Zerfalls unter Bildung von potenten, zytotoxischen Oxidanzien toxisch ist (Beckman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87 : 1620-1624, 1990). Ein post-ischämische Verletzung, die das Superoxidanion involviert, wurde im Herzen, im Darm, in der Leber, im Pankreas, in der Haut, im Skelettmuskel, in der Niere beobachtet und tritt leicht in anderen Organen auf (McCord Fed. Proc., 46 : 2402-2406, 1987). SOD, das chemisch an Albumin gebunden ist und damit konjugiert ist, zeigt eine erhöhte "in vivo"-Halbwertszeit, d. h. eine langsame Clearance. Eine solche konjugierte SOD hat sich als überlegen gegenüber nicht-konjugierter SOD hinsichtlich der Inhibierung von post-ischämischen Reperfusionsarrhythmia herausgestellt (Watanabe et al., Biochem. Pharmacol., 38 : 3477-3483, 1989). Die Herstellung von D-SOD mit einer größeren Halbwertszeit als der Halbwertszeit von L-SOD erleichtert die Verwendung von SOD zur Verhinderung oder Abminderung von post-ischämischer Schädigung.
SOD hat sich ebenfalls als wirksam bei mehreren Entzündungserkrankungen, wie Osteoarthritis und rheumatoide Arthritis, herausgestellt. Die lokale Infiltration von SOD bei extra-artikulären Entzündungsprozessen (z. B. Tendinitis, Tendovaginitis, Bursitis, Epicondylitis, Periarthritis) hat sich ebenfalls als wirksam herausgestellt. Eine Verbesserung nach SOD-Verabreichung wurde ebenfalls bei der Peyronie-Erkrankung und der Dupuytren-Kontraktur beobachtet (Wilsman, In Rotilio Hg., Superoxide and Superoxide Dismutase in Chemistry, Biology and Medicine, Elsevier, 1986). Für diese Entzündungsstörungen sowie für das Atemnot-Syndrom wird eine auf die Zelloberfläche abzielende SOD mit erhöhter Halbwertszeit ein brauchbares Arzneimittel sein. Der Organtransport und die Organtransplantation kann ebenfalls durch solch eine verbesserte SOD Nutzen ziehen. Darüber hinaus sollte auf Gewebe abzielende SOD dabei helfen, den toxischen sekundären Effekt der Anti-Krebs-Strahlen- und -Chemotherapie zu lindern. Durch Arzneimittel (antibiotisch oder gegen Krebs) induzierte Nephritis kann ebenfalls durch eine potentere SOD reduziert werden. D-SOD kann zum Vorteil für L-SOD bei den oben angeführten therapeutischen Anwendungen eingesetzt werden.
Somit zieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Abfangen von Superoxid-Radikalen in vivo in einem Säuger in Betracht, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer physiologisch tolerierbaren Zusammensetzung, die ein D-SOD-Enzym enthält, an einen Säuger in einer vorbestimmten Menge, die so berechnet ist, um den gewünschten Effekt zu erhalten, umfaßt.
Wenn z. B. das D-SOD-Enzym als ein Mittel zum Abfangen von Superoxid-Radikalen, wie in humanen Patienten, die die Symptome der durch Entzündung induzierten Gewebeschädigung zeigen, wie während einer Autoimmun-Erkrankung, Osteeroarthritis und dergleichen, oder während eines Reperfusionsvorganges, um Blut oder Plasma in ischämisches Gewebe wiedereinzuführen, wie während oder nach Operationseingriffen, Trauma, in Thrombi oder in transplantierten Organen, oder nach Episoden einer Infektion, die zu einem massiven Zell-Tod unter Freisetzung von Oxidanzien führt, verwendet wird, wird es in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um 1 bis 50 Milligramm (mg), vorzugsweise etwa 5 bis 20 mg, pro Erwachsenem, zuzuführen, wenn das D-SOD-Enzym eine spezifische Aktivität von etwa 3000 U pro mg besitzt. Eine bevorzugte Dosierung kann alternativ als eine Menge angegeben werden, die ausreicht, um eine Plasma-Konzentration von etwa 0,1 ug/ml bis etwa 100 ug/ml, vorzugsweise von etwa 1,0 ug/ml bis etwa 50 ug/ml, stärker bevorzugt von mindestens etwa 2 ug/ml und für gewöhnlich 5 bis 10 ug/ml, zu erreichen.
D-SOD-Enzyme mit Superoxiddismutase(SOD)-Aktivität zur Verwendung in einer therapeutischen Zusammensetzung weisen typischerweise etwa 200 bis 5000 Einheiten (U) an Enzym- Aktivität pro mg Protein auf. Enzym-Assays zur SOD-Aktivität sind allgemein bekannt, und ein bevorzugtes Assay, um die SOD-Aktivität in einem D-Enzym zu standardisieren, ist jenes, welches von McCord et al., J. Biol. Chem., 244 : 6049 (1969), beschrieben worden ist.
Zur Behandlung von arthritischen Zuständen, wie rheumatoide Arthritis, Tendinitis, Bursitis oder dergleichen, wird eine Dosismenge von etwa 1 bis 20 mg, vorzugsweise etwa 4 bis 8 mg, intraartikulär pro Woche bei menschlichem Erwachsenen verabreicht. In bestimmten Fällen können gar 20 mg pro Kilogramm (kg) Körpergewicht des Patienten verabreicht werden.
Zur Behandlung von Reperfusionen oder myokardialen Verletzungen ist eine Dosismenge von 5 mg pro kg Körpergewicht bevorzugt, intravenös zu verabreichen.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, welche ein D-SOD-Enzym enthalten, werden in herkömmlicher Weise intravenös, oder intraartikulär (ia) im Fall von Arthritis, verabreicht, und zwar z. B. durch Injizierung einer Einheitsdosis. Der Ausdruck "Einheitsdosis" bezieht sich, wenn er in bezug auf eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, auf physikalisch diskrete Einheiten, die als einmalige Dosismengen für das Subjekt geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an aktivem Material enthält, die so berechnet ist, daß der gewünschte therapeutische Effekt in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. Träger oder Vehikel, erzeugt wird.
Die Zusammensetzungen werden in einer Weise verabreicht, die mit der Dosisformulierung verträglich ist, und in einer therapeutisch wirksamen Menge. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt, der Kapazität des Immunsystems des Subjektes, das den Wirkbestandteil nutzen soll, und dem Grad des gewünschten therapeutischen Effektes ab. Genaue Mengen an Wirkbestandteil, die zur Verabreichung erforderlich ist, hängt von der Beurteilung der ausführenden Person ab und sind für jedes Individuum eigentümlich. Gleichwohl sind geeignete Dosisbereiche für die systemische Anwendung hierin beschrieben und hängen von dem Weg der Verabreichung ab. Geeignete Regime für die anfängliche Verabreichung und Booster-Injektionen sind ebenfalls variabel, liegen jedoch typischerweise bei einer anfänglichen Verabreichung, gefolgt von wiederholten Dosen in Intervallen von einer oder mehreren Stunden durch eine nachfolgende Injektion oder einer anderen Verabreichung. Alternativ wird eine kontinuierliche intravenöse Infusion in Betracht gezogen, die ausreicht, um Konzentrationen im Blut in den Bereichen, die für in vivo-Therapien angegeben sind, aufrechtzuerhalten.
Zusätzliche beispielhafte therapeutische Anwendungen von SOD, welche direkt bei den vorliegenden Methoden zur Verwendung von therapeutischer D-SOD anwendbar sind, und Zusammensetzungen, die dafür brauchbares SOD enthalten, sind in den US-Patenten Nr. 5 084 390, 5 006 333 und 4 656 034 beschrieben, wobei deren Beschreibungen spezifisch durch den Bezug darauf hier einbezogen sind.
In gleicher Weise zu den oben beschriebenen verbesserten therapeutischen Verfahren mit D-SOD wird erwartet, daß viele ansonsten befriedigende pharmazeutische Enzymmittel nur beschränkten therapeutischen Einsatz finden werden, und zwar aufgrund ihrer kurzen Lebenszeit in vivo. Somit ist ein bequemes Verfahren zur Ausdehnung der brauchbaren Lebenszeiten von vorgeschlagenen pharmazeutischen Mitteln erwünscht und wird durch die Herstellung eines D-Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehen. Die hierin beschriebenen Methoden ermöglichen die Herstellung der D-Enzym-Varianten der pharmazeutischen Enzymmittel, welche zumindest biologische Aktivitäten aufweisen, die mit denen für das nicht veränderte Mittel vergleichbar sind.

H. Therapeutische Zusammensetzungen

Viele der Verbindungen und Gruppen, die in der vorliegenden Beschreibung involviert sind (z. B. D-Aminosäure-Reste), weisen eine Vielzahl von Formen, insbesondere in unterschiedliche Weise protonierte Formen, im Gleichgewicht miteinander auf. Wie es für den mit fachlicher Kenntnis Ausführenden verständlich ist, soll die Repräsentation einer Form einer Verbindung oder Gruppe hierin, alle Formen davon einschließen, welche im Gleichgewicht miteinander sind.
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet "uM" mikromolar, "ul" bedeutet Mikroliter und "ug" bedeutet Mikrogramm.
Therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten einen physiologisch tolerierbaren Träger zusammen mit einem D-Enzym, wie hierin beschrieben, darin als ein Wirkbestandteil gelöst oder dispergiert.
Wie hierin verwendet, werden die Ausdrücke "pharmazeutisch annehmbar", "physiologisch tolerierbar" und grammatikalische Abänderungen davon, wenn sie Zusammensetzungen, Träger, Verdünnungsmittel und Reagenzien betreffen, austauschbar verwendet und bedeuten, daß die Materialien in der Lage sind, auf oder bei einem Säuger verabreicht zu werden, ohne die Hervorrufung von ungewünschten physiologischen Wirkungen, wie Übelkeit, Schwindelgefühl, gastritische Störungen und dergleichen.
Die Herstellung einer pharmakologischen Zusammensetzung, welche darin gelöste oder dispergierte Wirkbestandteile enthält, ist allgemeiner Kenntnisstand im Fachbereich. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als injizierbare Stoffe hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, gleichwohl können auch feste Formen, die für Lösungen oder Suspensionen in Flüssigkeit vor der Verwendung geeignet sind, ebenfalls hergestellt werden. Die Präparation kann ebenfalls emulgiert sein.
Der Wirkbestandteil kann mit Trägersubstanzen vermischt werden, welche pharmazeutisch annehmbar sind und mit dem Wirkbestandteil verträglich sind. Geeignete Trägersubstanzen sind z. B. Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Sofern erwünscht, kann zusätzlich die Zusammensetzung Nebenbestandteile an Hilfssubstanzen, wie Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-Puffermittel und dergleichen, enthalten, welche die Wirksamkeit des Wirkbestandteils erhöhen.
Die therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann pharmazeutisch annehmbare Salze der hierin beschriebenen Komponenten einschließen. Pharmazeutisch annehmbare Salze schließen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Polypeptids), die mit anorganischen Säuren, wie z. B. Chlorwasserstoff oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Essigsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen, gebildet werden, ein. Mit den freien Carboxylgruppen gebildete Salze können ebenfalls von anorganischen Basen, wie z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden, und solchen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Hisitidin, Procain und dergleichen, abgeleitet werden.
Physiologisch tolerierbare Träger sind im Fachbereich allgemein bekannt. Beispielhaft für flüssige Träger sind sterile wäßrige Lösungen, welche keine Materialien zusätzlich zu den Wirkbestandteilen und Wasser enthalten, oder einen Puffer enthalten, wie Natriumphosphat bei physiologischem pH-Wert, phyiologischer Kochsalzlösung oder beides, wie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung. Ferner können wäßrige Träger mehr als ein Puffersalz enthalten, sowie Salze, wie Natrium- und Kaliumchloride, Dextrose, Polyethylenglykol und andere Lösungsstoffe.
Flüssige Zusammensetzungen können ebenfalls flüssige Phasen zusätzlich zu und bis zum Ausschluß von Wasser enthalten. Beispielhaft von solchen zusätzlichen flüssigen Phasen sind Glycerin, Pflanzenöle wie Baumwollsamenöl und Wasser-Öl-Emulsionen.
Eine therapeutische Zusammensetzung enthält eine Menge eines D-Enzyms der vorliegenden Erfindung, die ausreicht, um eine katalytische Menge des Enzyms dem zu behandelnden Zielgewebe zuzuführen. Typischerweise ist dies eine Menge von mindestens 0,1 Gew.-% und stärker bevorzugt mindestens 1 Gew.-% D-Enzym pro Gewicht der therapeutischen Gesamtzusammensetzung. Ein Gewichtsprozent ist ein Gewichtsanteil Protein zur Gesamtzusammensetzung. So ist z. B. 0,1 Gew.-% 0,1 g D-Enzym pro 100 g Gesamtzusammensetzung.

Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen den Umfang der Erfindung veranschaulichen, jedoch nicht beschränken.

1. Herkömmliche schrittweise Synthese von L- und D-[Aba67,95,167,195]HIV-1-Protease (HIV-1 PR)

Fortschritte bei der chemischen Gesamtsynthese von Proteinen machen die reproduzierbare Herstellung von homogener kristalliner L-[Aba67,95,167,195]HIV-1-Protease (HIV-1 PR) möglich; siehe z. B. Kent, Annu. Rev. Biochem., 57 : 957 (1988); Wlodawer et al., Science, 245 : 616 (1989); und Miller et al., Science, 246 : 1149 (1989).
HIV-1-Protease (HIV-1 PR) ist ein viral kodiertes Enzym, welches Polypeptidketten mit hoher Spezifität schneidet und welches für die Replikation von aktiven Virionen wesentlich ist; Kohl et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85 : 4686, 1988. Das 21.500 Dalton große HIV-PR-Molekül ist aus zwei identischen 99 Aminosäure langen Polypeptidketten aufgebaut.
Die chemische Totalsynthese von D-[Aba67,95,167,195]HIV-1-Protease wurde wie unten beschrieben durchgeführt, und die Eigenschaften (kovalente Struktur, physikalische Eigenschaften, zirkularer Dichroismus, enzymatische Aktivität) der D- und L-enantiomeren Formen dieses HIV-1-Proteaseenzyms wurden verglichen.
Zu diesem Zweck wurden in gesonderten chemischen Synthesen die geschützten Polypeptidketten, die den L- und den D-Sequenzen des 99-aa-Monomers der [Aba67,95]HIV-1-Protease entspra chen, durch die chemische Totalsynthese hergestellt. Aba ist L- oder D-α-Amino-n-Buttersäure und wird als ein isosterischer Ersatz für Cys-Reste an den Positionen 67 und 95 in dem HIV-PR- Monomer der Polypeptidkette verwendet. Dieser gleiche isosterische Ersatz wurde bei der Arbeit von Wlodawer et al., supra, und Miller et al., supra, verwendet, was zu den ursprünglichen korrekten Strukturen von HIV-PR führte.
Die chemische Synthese wurde in herkömmlicher schrittweiser Art durchgeführt. Die 99-aa- Polypeptidketten wurden aus geschützten L-Aminosäuren bzw. geschützten D-Aminosäuren zusammengebaut. Die t-Boc-D- und -L-Aminosäure-Derivate wurden von dem Peptide Institute (Osaka, Japan) und Peptides International (Louisville, KY) erhalten, außer: Boc-L-Aba, Boc-L- Asn(Xan), Boc-D-Ile und Boc-D-His(Bom), erhalten von Bachem Bioscience (Philadelphia, PA); Boc-D-Asn(Xan), Boc-D-Asp(OcHex) und Boc-D-Glu(OcHex), erhalten von Bachem California, Torrance, CA); Boc-D-Lys(C1Z), kristallisiert aus dem TBA-Salz, erhalten von dem Peptide Institute; und D-Aba (Sigma, St. Louis, MO), welches zu Boc-D-Aba umgewandelt wurde und als DCHA-Salz isoliert wurde. Andere Seitenketten-Schutzgruppen, welche verwendet wurden, waren: Arg(Tos), Tyr(BrZ), L-His(Tos), D-His(Bom) und Thr(BzL). Der Gehalt an L- Enantiomer der Boc-D-Aminosäure-Präparationen lag zwischen 0,01 und 0,08% [Instruktionen des Herstellers]. Ein schrittweiser Kettenzusammenbau wurde in einer maschinenunterstützen Weise auf einem Synthesizer von Applied Biosystems, Modell 430A, durchgeführt (0,2-mMol- Maßstab mit D- oder L-Boc-Phe-OCH&sub2;-Pam-Harz). Jeder Zyklus der Aminosäurezugabe involvierte: Nα-Entschützung, pures (100%) TFA [2 · 30 s-Waschströme plus 1 Minute satzweiser Behandlung]; DMF-Waschströme [1 · 22 s, 1 · 38 s]; Kopplung [1 · 10 Minuten] mit gleichzeitiger in situ-Neutralisation [Boc-Aminosäure (2,25 mMol), voraktiviert durch die Reaktion mit HBTU (2,22 mMol) und DIEA (6,4 mMol) in DMF während 2 Minuten]. Es hat sich herausgestellt, daß das in situ-Neutralisationsverfahren zu einem vernachlässigbaren Ausmaß der Racemierung führt; Henklein et al., in "Innovation & Perspectives in Solid Phase Synthesis", R. Epton Hg., SPPC Ltd., Birmingham, GB, 1992. Die zusammengebauten Peptide wurden entschützt und von dem Harz in 9 : 1 HF/p-Cresol (Resorcinol und Thiocresol) lagen vor, wenn His(Bom) in die Sequenz eingeschlossen war nach der Entfernung von der Boc-Gruppe und der Formylgruppe vom Trp (mit Ethanolamin).
Die D- und L-Produkte wurden nach der Entschützung einzeln aufgearbeitet, und synthetische Enzyme wurden dann hergestellt durch Faltung der Polypeptidpolymere vom Denaturanz, wie von Wlodawer et al.. supra, und Miller et al., supra, beschrieben. Zu diesem Zweck wurde nach der Entschützung und Spaltung die rohen Peptidprodukte mit Ether präzipitiert und mit 6 M Guanidinhydrochlorid in einem NaHCO&sub3;-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 vor der halbpräparativen C18-RP-HPLC-Anreicherung unter Faltung durch Dialyse in 10% Glycerin, 25 mM NaH&sub2;PO&sub4;-Puffer, pH-Wert 7,0, gelöst. Nach der Konzentrierung unter Hochvakuum zu einer Lösung in Glycerin wurden die Enzyme durch Aminosäureanalyse quantifiziert und bei 4ºC gelagert.
Die Gesamtausbeute für die Synthese von L-[Aba67,95,167,195]HIV-1-Protease (HIV-1 PR) betrug etwa 2 mg oder 0,09%.
Die Gesamtausbeute für die Synthese an D-[Aba67,95,167,195]HIV-1-Protease (HIV-1 PR) war nicht zu bestimmen, da sie geringer als 2 mg war.

2. Strukturanalyse der oben erwähnten L- und D-[Aba67,95,167,195]HIV-1-Protease (HIV-1 PR)

Das D-Enzym-99-aa-monomer D-[Aba67,95]HIV-1-Protease wurde bezüglich verschiedener struktureller Charakteristika analysiert und mit den Strukturcharakteristika des L-Isomeren verglichen. Zum Beispiel ergab die analytische Umkehrphasen-HPLC identische Retentionszeiten für die zwei synthetischen Polypeptidketten.
Gereinigte, gefaltete, chemisch synthetisierte [Aba67,95]HIV-1-Proteasemonomer-Proben, welche in Beispiel 1 hergestellt worden waren, wurden in pH 6,5-MES-Puffer/10% Glycerin einer Entsalzung durch Umkehrphasen-HPLC unterzogen. Die gesammelten Protein-Peaks wurden jeweils gesondert durch Ionensprüh-Massenspektrometrie analysiert, wie von Bruins et al., Anal. Chem., 59 : 2642 (1987), beschrieben. Unter den verwendeten Bedingungen (50% Acetonitril, 50% Wasser, 0,1% TF A) war das Enzym denaturiert. In den gezeigten rekonstruierten Massenspektren wurden die rohen m/z-Daten einem Hochpaß-Digitalfilter unterzogen, dann aussortiert, wodurch alle molekularen Stammspezies zwischen 10 kDa und 11 kDa erhalten wurden. Dieses Rekonstruktionsverfahren verringert mathematisch die mehrfachen Ladungszustände, welche für eine bestimmte Molekularspezies beobachtet wurden, zu einer einzelnen molekularen Masse.
Durch die rekonstruierte Ionensprüh-Massenspektroskopie lag die beobachtete Monomermolekülmasse des L-Enzyms bei 10.748 ± 4 Dalton (Da), und die Masse des D-Enzyms lag bei 10.751 + 3 Da. Berechnete Masse: (monoisotopisch) 10.748,0 Da; (Durchschnitt) 10.754,7 Da.
Somit besaßen die zwei Produkte (D- und L-Enzymmonomere) das gleiche Molekulargewicht innerhalb der experimentellen Unsicherheit, wenn mittels Ionensprüh-Massenspektrometrie gemessen. Diese Ionensprüh-Massenspektrometrie-Daten sind in den Fig. 1A und 1B gezeigt.
Die vollständige Aminosäure-Sequenz des D-Enzym-99-aa-Monomeren wurden mittels Matrixunterstützter Laserdesorption-Massenspektrometrie unter Flugzeitablesung (Massenspektrometer Modell API-III, P. E. SCIEX Inc., Thornhill, Toronto, Kanada) bestimmt, und es wurde gezeigt, daß sie die gleiche war die des L-Enzyms. Somit besaßen die zwei synthetischen Enzymmoleküle die identische kovalente Struktur.
Andererseits wurden Unterschiede zwischen den zwei Molekülen in verschiedenen chiralen Wechselwirkungen enthüllt. Spektren des zirkulären Dichroismus (C) der einzelnen D- und L- HIV-1-Proteaseenantiomeren wurden über einen Bereich von 260 bis 195 nm in einer wäßrigen Lösung mit einem pH-Wert von 5,5, die 5% Glycerin enthielt, bei 25ºC unter Verwendung einer Quarzzelle mit einer Streckenlänge von 1 mm auf einem Aviv-CD-Spektrometer aufgenommen. Die CD-Spektren enthüllten gleiche und entgegengesetzte optische Rotationen, wie es für enantiomere Proteinmoleküle zu erwarten ist.

3. Enzymatische Eigenschaften der oben erwähnten L- und D-[Aba67,95,167,195]- HIV-1-Protease (HIV-1 PR)

Die enzymatischen Eigenschaften des aus D-Aminosäuren bestehenden enantiomeren Proteins wurden evaluiert und mit dem L-Isomer unter Verwendung eines fluorogenen Assays verglichen, bei welchem ein Hexapeptid-Analog einer natürlichen GAG-Spaltungsstelle als Substrat verwendet wurde, wie von Toth et al., Int. J. Peptide Protein Res., 36 : 544 (1990), beschrieben.
Die fluorogenen Assays wurden mit 15 ul großen Aliquots (entsprechend 1,75 (±10%) ug Protein) jedes Enzymenantiomeren in 10% Glycerin, 100 mM MES-Puffer, pH 6,5, die einer Lösung aus 50 mM D- oder L-fluorogenem Substrat in dem MES-Puffer hinzugesetzt wurden, durchgeführt. Das Substrat für das Enzym besaß die Sequenz 2-Aminobenzoyl-Thr-Ile-Nle-Phe(p- NO2)-Gln-Arg.-amid (SEQ ID-NR. 2). Das Substrat wurde entweder mit D- oder mit L-Aminosäure-Derivaten synthetisiert, um die geeigneten enantiomeren Formen bereitzustellen.
Die Ergebnisse des fluorogenen Assays sind in den Fig. 2A, 2B, 2C und 2D gezeigt. Aliquots, welche gleiche Mengen (wie durch Aminosäure-Analyse bestimmt) der gereinigten, gefalteten Enzympräparationen enthielten, wurden in dem fluorogenen Assay eingesetzt. Die Zunahme in der Fluoreszenz wurde auf einem kontinuierlichen laufenden Schreiber aufgezeichnet. Die Daten zeigen, daß die zwei synthetischen Enzymmoleküle gleich aktiv waren, enthüllten jedoch eine reziproke chirale Spezifität, und zwar insofern, als daß das L-Enzym nur das L-Substrat spaltete, während das D-Enzym nur das entsprechende D-Substrat spaltete.
In einer ähnlichen Studie wurden die D- und L-Enantiomere des Pseudopeptid-Inhibitors MVT101 (Ac-Thr-Ile-Nle-psi[CH&sub2;NH]-Nle-Gln-Arg.-amid) (SEQ ID-Nr. 1), hergestellt wie von Miller et al., Science, 246 : 1149 (1989), beschrieben, bezüglich ihrer Wirkung auf die D- und L- HIV-Protease beurteilt. Die Ergebnisse der Studien unter Verwendung vom Inhibitor sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Chirale Inhibitoren zeigen reziproke chirale Spezifität gegenüber D- und L-HIV PR a
a Die D- und L-Enzyme wurden getrennt durch das oben beschriebene fluorogene Assay-Verfahren unter Verwendung des entsprechenden chiralen Substrats in Gegenwart einer 5xIC50-Konzentration an Inhibitor untersucht.
b Der Inhibitor Evans-Blau ist ein Nicht-Peptid-achiraler, gemischt kompetitiv-unkompetitiver Inhibitor der HIV-1 PR.
Die chiralen Inhibitoren waren nur gegen das entsprechende Enantiomer des Enzyms wirksam, d. h. L-MVT101 inhibierte L-HIV PR, jedoch nicht die D-HIV-PR-katalysierte Reaktion, und D- MVT101 inhibierte D-HIV-PR, besaß jedoch keinen Effekt auf die L-Enzym-katalysierte Reaktion. Interessanterweise war der achirale Inhibitor Evans-Blau, welcher eine gemischte Inhibitionskinetik zeigte, ein potenter Inhibitor von beiden Enantiomeren des Enzyms (Tabelle 1). Die HIV-1-Protease besteht als ein Homodimer; d. h., ein einziges Enzymmolekül ist aus zwei identischen gefalteten Polypeptidketten mit 99 Resten aufgebaut; Wlodawer et al., Science, 245: 616 (1989); und Miller et al., Science, 246 : 1149 (1989). HIV PR ist hochaktiv, welche eine Geschwindigkeitssteigerung von etwa dem 10¹&sup0;-fachen über die unkatalyiserte Peptid-Bindungshydrolyse zeigt; Kent et al., in "Viral Proteinases as Therapeutic Targets", Wimmer et al., Hg., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989, S. 223-230; und Richards et al., FEBS Lett., 247 : 113 (1989). Es ist ein hochspezifisches Enzym, welches Peptide sowie Proteine spaltet (Kent et al., supra; und Kröusslich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 807, 1989), und seine Spezifität wird durch die Wechselwirkungen des dreidimensional gefalteten Enzymmoleküls, das ein Komplex mit sechs nachfolgenden Aminosäure-Resten in der Substrat-Polypeptidkette bildet, bestimmt; Miller et al., Science, 246 : 1149 (1989); und Kent et al., supra.
Wie bei allen Enzymen verdankt die HIV PR ihre Spezifität und katalytische Aktivität der genauen dreidimensionalen Struktur, die durch die spezifische Faltung der Polypeptidkette gebildet wird, und den genauen geometrischen Wechselwirkungen in den spezifischen mit Substraten gebildeten Komplexen; Fersht, in "Enzyme Structure and Mechanism", W. H. Freeman and Company, San Franzisko, 1977, S. 75-81. Die beobachteten reziproken chiralen Spezifitäten zeigen mithin, daß die gefalteten Formen von D- und L-Enzymmolekülen Spiegelbilder voneinander in allen Elementen der dreidimensionalen Struktur, die für die enzymatische Aktivität verantwortlich ist, darstellen. Die außerordentliche Natur dieser Wechselwirkungen impliziert, daß die zwei Enzymmoleküle Spiegelbilder in jeder Hinsicht (21) sind, konsistent mit den (betragsmäßig) gleichen und entgegengesetzten CD-Spektren. Am beachtenswertesten ist die gefaltete Form des Polypeptid-Grundgerüstes (d. h. unter Ignorierung der Seitenketten) selbst eine chirale Ganzheit, welche in Spiegelbildform in den zwei Proteinenantiomeren vorliegen muß, wie in den Fig. 3A und 3B gezeigt.
Die Bandrepräsentation von L- und D-[Aba67,95,167,195]HIV-1-Proteasen, die in Fig. 3 gezeigt ist, basiert auf den kristallographischen Röntgenstrahl-Koordinaten des chemisch synthetisierten Enzyms, wenn es mit einem vom Substrat abgeleiteten Peptid-Inhibitor (Inhibitor ist nicht gezeigt) komplexiert ist, wie von Miller et al., Science, 246 : 1149 (1989), beschrieben. Dieses Modell wurde durch Durchführung einer Spiegelbild-Transformation der L-Enzym-Daten erzeugt.
Die gefalteten, dreidimensionalen Band-"Gerüst"-Strukturen sind nicht übereinanderlegbare Spiegelbilder und enthalten zahlreiche chirale Elemente. Diese werden in der sekundären und supersekundären Struktur, in der Tertiärstruktur und in der quaternären Struktur gefunden, wie in den Fig. 3A und 3B veranschaulicht. Siehe z. B. die Verwandtheit der Randklappen (flaps) zueinander; die Verwandtheit der Helix-Segmente der benachbarten b-Stränge; die charakteristische Verdrillung (rechtsgängig in der L-Protease) der antiparallelen β-Stränge in jeder Randklappe, beschrieben von Richardson et al., in "Protein Folding", Gierasch et al., Hg., American Association of the Advancement of Science, Washington, D. C., 1990, S. S-17; und die Händigkeit der helikalen Segmente. Da das einzige chirale Element, das in die chemisch synthetisierten Polypeptidketten eingeführt ist, die Stereochemie der Aminosäure-C-α-Atome (und der C-β-Atome von Thr, Ile) ist, ist es erforderlich, daß alle hierin vorgelegten Daten das alle stereochemischen Aspekte des gefalteten Enzymmoleküls, von sekundärer bis hin zu quaternärer Struktur, einfach durch die Stereochemie des Polypeptid-Grundgerüstes bestimmt wird. Somit sind die vorliegenden reziproken chiralen Eigenschaften der chemisch synthetisierten Enzymenantiomere eine fundamentale Demonstration dafür, daß die letztendliche gefaltete/dreidimensionale Struktur und folglich die biologischen Aktivitäten dieses 21500 Dalten großen homodimeren Enzymmoleküls vollständig durch die Aminosäure-Sequenz bestimmt werden.
Die L- und D-Enzyme in dieser Untersuchung haben niemals biosynthetische Bedingungen gesehen und waren somit niemals im Kontakt mit biochemischen Faktoren irgendwelcher Art. Interessanterweise wird das hierin untersuchte einfache homodimere Enzymmolekül schnell (sowohl Faltung als auch Anordnung) und genau gebildet, selbst bei den relativ niedrigen bei den Assaybedingungen verwendeten Konzentrationen, sowie bei den gängigeren Dialyse-aus-Denaturant-Faltbedingungen. Die hierin beschriebenen Ergebnisse liefern den aussagekräftigen Beweis, daß, was auch immer die vermutete Rolle von biosynthetischen Faktoren ist, sie nicht für die Bildung der korrekten, funktionell gefalteten und angeordneten Form des Proteins erforderlich sind.
Die beobachteten reziproken chiralen Eigenschaften der hierin beschriebenen Spiegelbild- Enzymmoleküle verstärken und verallgemeinern die chirale Natur von biochemischen Wechselwirkungen von Proteinen. Die chiralen Eigenschaften der Proteinmoleküle selbst, welche zu diesem Verhalten führen, werden nur oberflächliche Beachtung in biochemischen Texten geschenkt. Wir können nun behaupten, und zwar basierend auf experimentellen Hinweisen, daß Proteinenantiomere reziproke chirale Spezifität bei ihren biochemischen Wechselwirkungen, einschließlich der Katalyse, zeigen werden.
Die Beobachtung, daß beide Enantiomere von HIV PR gleich wirksam bei dem achiralen Inhibitor Evans-Blau waren, liefert eine Vielzahl von signifikanten Implikationen. Als erstes wird das unnatürliche Enantiomer eines Enzyms, welches bei einem achiralen Substrat wirkt und ein achirales Produkt liefert, vollständig funktional in vivo sein. Dieser Aspekt liefert wichtige potentielle therapeutische Anwendungsmöglichkeiten. Beispiele sind Carboanhydrase und Superoxiddismutase. Von D-Enzymen wird erwartet, daß sie in vivo (in einer L-Protein-Biosphäre) lang leben, da sie gegenüber natürlich auftretenden Proteasen, welche im allgemeinen nur aus L-Aminosäuren aufgebaute Proteine angreifen, resistent sind. D-Proteine sind vergleichsweise weniger immunogen als L-Proteine, da lange Polypeptide, die gänzlich aus D-Aminosäuren aufgebaut sind, nicht in gleicher Weise effizient durch das Immunsystem prozessiert und präsentiert werden, wie aus L-Aminosäuren aufgebaute Polypeptide.
D-Proteinmoleküle besitzen andere potentielle praktische Anwendungsmöglichkeiten. Zum Beispiel besitzen Enzymenantiomere Nützlichkeit als chirale Katalysatoren bei der selektiven Herstellung eines puren Enantiomeren von einer Feinchemikalie. Die enantiomer reine chemische Synthese hat Anwendungsmöglichkeiten bei der Herstellung von menschlichen Pharmazeutika.
Darüber hinaus können Proteinenantiomere zu einer Erlangung von Phasendaten bei der Röntgenstrahl-Kristallographie beitragen, wie von Mackay, Nature, 342 : 133 (1989), beschrieben. Zentrosymmetrische Kristalle, die durch die Co-Kristallisation eines D-, L-Proteinpaares gebildet werden, würden zu stark vereinfachten Phasen führen und verläßlichere Röntgenstrahl-Strukturdaten liefern. Derzeit sind D-Enzyme und D-Proteine allgemein nur durch die chemische Totalsynthese zugänglich. Während der ribosomalen Synthese von Polypeptidketten werden D-Aminosäuren, selbst bei in vitro-Translationssystemen, nicht in wachsende Polypeptidketten eingebaut; Ellman et al., Science, 255 : 197 (1992).

4. Diskussion der Beispiele 1 bis 3

D- und L-Formen des Enzyms HIV-1-Protease werden hierin durch die chemische Totalsynthese hergestellt. Die zwei Proteine besitzen identische kovalente Strukturen. Gleichwohl zeigen die gefalteten Protein/Enzym-Enantiomere reziproke chirale Spezifität bei Peptidsubstraten. Das heißt, jedes Enzymenantiomer schneidet nur das korrespondierende Substratenantiomer. Die reziproke chirale Spezifität war ebenfalls bei dem Effekt der enantiomeren Inhibitoren der hierin hergestellten HIV-1-Proteasen sichtbar. Diese Daten zeigen, daß die gefalteten Formen der chemisch synthetisierten D- und L-Enzymmoleküle Spiegelbilder voneinander in allen Elementen der dreidimensionalen Struktur sind. Enantiomere Proteine zeigen reziproke chirale Spezifität in allen Aspekten ihrer biochemischen Wechselwirkungen, halten die enzymatische Aktivität bei und liefern einen großen Bereich von brauchbaren Zusammensetzungen, wie hierin beschrieben.

5. Synthese und Ligation von D- und L-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-Protease-Analoga

Die Fig. 4 veranschaulicht eine schematische Repräsentation der Strategie, die für die Totalsynthese der D- und L-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-Protease-Analoga angewandt wurde. Geschützte D- und L-Aminosäuren können aus dem Peptide Institute (Osaka, Japan), Peptides International (Louisville, KY), Bachem Bioscience (Philadelphia, PA) und Bachem California (Torrance, CA) erhalten werden und wies < 0,03% des entgegengesetzten Enantiomeren auf. HPLC-gereinigte, funktionalisierte, ungeschützte Peptid-Segmente, zusammengebaut durch schrittweise Festphasen-Synthese, wurden in Gegenwart von 6M GuHCl umgesetzt, um die ligierten D- und L- [(NHCH&sub2;COSC&sub2;HCO)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]HIV-1-PR-Produkte mit 99 Resten zu bilden (Schnölzer et al. (1992), Science, 256, 221-225). Die kastenförmige Fläche von Fig. 4 repräsentiert die Struktur des Thioester-Analogs der Peptid-Bindung Gly&sup5;¹-Gly&sup5;² an der Stelle, wo die Ligation auftrat. Der Thioester dient als Bindeglied zwischen den zwei D-Peptiden, d. h. der Stelle der Ligation. Eine Selenolester-Verknüpfung kann ebenfalls für die Ligation von zwei D-Peptiden angewendet werden.
Die zwei großen Peptid-Segmente, d. h. [αCOSH]HIV-1-PR(1-51) und [Nα-BrCH&sub2;CO]HIV-1- PR(53-99) werden so zusammengebaut, wie es in Fig. 5 gezeigt ist, und zwar in gesonderten Synthesen durch ein stark optimiertes, maschinenunterstütztes SPPS-Protokoll unter Verwendung der Boc-Chemie, die auf einem modifizierten ABI 430A-Synthesizer durchgeführt wurde (Kent et al., "Innovation & Perspectives in Solid-Phase Synthesis" (1992), Hg. Epton, R. SPPC Ltd., Birmingham, GB). Das Protokoll umfaßte die Entfernung der Na-Boc-Gruppe mit unverdünntem TFA (insgesamt 2 Minuten), gefolgt von einem DMF-Waschstrom, um das TFA-Peptid-Harzsalz zu erhalten, und einem einzigen 10-minütigen Kopplungsschritt unter Verwendung von HBTU-aktivierten Boc-Aminosäuren und in situ-Neutralisation mit DIEA in DMF. Die Entschützungs- und Kopplungsreaktionen sind durch einen Waschstromschritt getrennt. Nach der Reinigung werden die Monomeren gesondert durch Dialyse in Gegenwart von D- bzw. L-MVT- 101-Inhibitor gefaltet, um die homodimeren Enzyme zu erhalten. Die Ausbeuten in Milligramm jedes Produktes sind in Fig. 4 dargelegt.
Das [αCOSH]HIV-1-PR(1-51)-Peptid kann auf 4-[a(Boc-Gly-S)benzylI]phenoxyacetamidomethyl-Harz zusammengebaut werden. Das [Nα-BrCH&sub2;CO]HIV-1-PR[53-99]-Peptid kann durch Bromacetylierung von [Aba67,95]HIV-1-PR(53-99)-OCH&sub2;-Pam-Peptid-Harz hergestellt werden (Yamashiro et al. (1988), Int. J. Peptide Protein Res. 31, 322-334). Alle Peptide werden gespalten und entschützt, und zwar durch Hoch-HF-Behandlung.
Nach der präparativen Umkehrphasen-HPLC-Reinigung (Vydac 218TP101550 - 5 · 25 cm, 0,1% TFA/CH&sub3;CN & 30-50 ml/min) werden die funktionalisierten Peptid-Segmente in Gegenwart von 6M GuHCl (in 0,1 M Phosphatpuffer, pH-Wert 5,3) 48 Stunden lang umgesetzt, um die ligierten D- und L-[(NHCH²COSCH&sub2;CO)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]HIV-1-PR-Monomere zu bilden. Die Fig. 6 veranschaulicht ein Verbundchromatogramm, das die zwei gereinigten funktionalisierten ungeschützten Segmente und das letztendliche (48 Stunden) Ligationsreaktionsprodukt (rein) zeigt, laufengelassen auf einer Vydac 218TP5415-Säule, eluiert mit 0,1% TFA (Puffer A) und 0,9% TFA/CH&sub3;CN, 1 : 9 (Puffer B), mit einer Flußrate von 1 ml/min.
Nach der Reinigung durch Umkehrphasen-HPLC können die Produkte gesondert durch Dialyse in 25 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 5,5, in Gegenwart eines 10-fachen Überschusses, entweder an D- oder L-[MVT-101]-Inhibitor (Ac-Thr-Ile-Nle-ψ-[CH&sub2;NH]-Nle-Gln-Arg.NH&sub2;) (SEQ. ID- NR. 1) gefalten werden, um die homodimeren Enzyme zu erhalten (Miller et al. (1989), Science 246, 1149). Die Ausbeuten für die Reaktionsstufen für die Synthese der D- und L-[Aba67,95(CO- S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-Protease-Analoga werden in Fig. 7 gezeigt.
Die Gesamtausbeute im Hinblick auf die Synthese des D-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-Protease- Analogs lag bei 48 mg oder 3,0%.
Die Gesamtausbeute mit bezug auf die Synthese des L-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-Protease- Analogs lag bei 47 mg oder 2,5%.

6. Physikalische Charakterisierung der Ligationsprodukte D- und L-[Aba67,95- (CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-Protease-Analoga

Die Ionensprüh-Massenspektrometrie der HPLC-gereinigten, ligierten Produkte ist in den Fig. 8A, 8B, 8C und 8D gezeigt. Die Ionensprüh-Massenspektrometrie enthüllt einzelne molekulare Spezies in jedem Fall mit den beobachteten molekularen Massen von 10768,9 ± 1,4 Dalton (D- Enantiomer) und 10769,4 ± 0,9 Dalton (L-Enantiomer) [berechnet: 10763,9 Dalton (monoisotopisch) und 10770,8 Dalton (Durchschnitt)]. Geringe Mengen an Dehydrations-Nebenprodukten wurden ebenfalls nachgewiesen. Die Sequenzen der Monomere wurden ebenfalls mittels einer neuen Proteinleiter-Sequenztechnik untersucht, bei der eine Ein-Schritt-Laserdesorptions-Massenspektrometrie-Ablesung zur Anwendung kam. Die Fig. 8A und 8C veranschaulichen markierte Peaks, die eine einzelne molekulare Spezies darstellen, die sich in der Anzahl von überschüssigen Protonen unterscheiden. Die beobachteten molekularen Massen der ligierten Produkte belaufen sich auf 10768,9 ± 1,4 Dalton (D-Enantiomer) und 10769,4 ± 0,9 Dalton (L-Enantiomer) [berechnet: 10763,9 Dalton (monoisotopisch) und 10770,8 Dalton (Durchschnitt)]. Die Fig. 8B und 8D veranschaulichen rekonstruierte Massenspektren, in denen die Rohdaten, welche in den Fig. 8A und 8C gezeigt sind, zu einem einzelnen Ladungszustand reduziert wurden. Alle Datenpunkte in den Fig. 8A und 8C sind in den Berechnungen einschlossen, und keine mathematische Filterung wurde vorgenommen. Die Massenregionen von 10 bis 11 kD sind zur Klarheit gezeigt.
Die Fig. 9A, 9B, 9C und 9D veranschaulichen die Umkehrphasen-HPLC-Messungen von D- und L-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]HIV-1-PR-Ligationsprodukten. Die ligierten Produkte von 6M GuHCI enthüllen einen einzelnen Peak in jedem Fall. Die Fig. 9A und 9C veranschaulichen die gereinigten ligierten Monomeren in 6M GuHCl. Die Fig. 9B und 9D veranschaulichen die homodimeren Enzyme, welche in Gegenwart von D- bzw. L-[MVT-101]-Inhibitor in 25 mM Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 5,5, gefalten wurden. Man beachte, daß nach der Faltung eine Vielzahl von nebensächlichen Autolyse-Produkten sowohl bei der D- als auch L- D- und L-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin; &sup5;²]&sub2;HIV-1-Protease-Präparationen zu sehen waren. Nach etwa 27 Minuten sind nebensächliche proteolytische Produkte des MVT-101-Inhibitor-Peptids ebenfalls sichtbar. Es würde so scheinen, daß selbst in Gegenwart eines großen Überschusses an Inhibitor das Enzym immer noch ein kleineres Ausmaß der Autolyse erfährt. Die Proben wurden auf einer Vydac 218TP5415-Säule, eluiert mit 0,1% TFA (Puffer A) und 0,9% TFA/CH&sub3;CN, 1 : 9 (Puffer B), mit einer Flußrate von 1 ml/min. laufengelassen.
Die Fig. 10A und 10B veranschaulichen Spektren des zirkulären Dichroismus im fernen Ultraviolett der gefalteten D- und L-Protease-Präparationen. Die Spektren wurden in 25 mM Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 5,5 (0,4 mg/ml Protease in Gegenwart vom Inhibitor) bei 25ºC in einer Quarzzelle mit einer Weglänge von 1 mm aufgezeichnet. Jede Präparation zeigt die gleiche Größe, jedoch ein unterschiedliches Vorzeichen, wie es für Spiegelbild-Proteine zu erwarten ist (Corigliano-Murphy et al. (1985), Int. J. Peptide Protein Res., 25, 225; und Zawadzke et al. (1992), J. Am. Chem. Soc., 114, 4002).

7. Charakterisierung der enzymatischen Aktivität von Ligationsprodukten, D- und L-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-Protease-Analoga

Die Fig. 11 veranschaulicht die enzymatische Aktivität von D- und L-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV- 1-PR-Enantiomeren, die durch ihre Wirkung auf D- und L-Isomere des Hexapeptid-Substrats Ac- Thr-Ile-Nle-Nle-Gln-Arg.-amid (ein Analog der p24/p15-GAG-viralen Prozessierungsstelle) bestimmt werden. Das D-Enzym spaltet nur das D-Substrat und ist inaktiv bei dem L-Substrat, während das L-Enzym voller Aktivität in bezug auf das L-Substrat zeigt, jedoch gegenüber dem D-Substrat inaktiv ist. Diese reziproke chirale Spezifität ist ebenfalls bei der Wirkung von chiralen Inhibitoren ersichtlich. Wie in der Tabelle gezeigt, inhibiert D- und L-[MVT-101] die Spaltung der chiralen fluorogenen Substrate durch die D- bzw. L-HIV-1-PR-Analoga, hat jedoch keinen Effekt auf die Wirkung des entgegengesetzten Enantiomeren. Interessanterweise inhibiert der achirale Inhibitor Evans-Blau, welcher gemischte Inhibitionskinetiken zeigt, beide Enantiomere des Enzyms. Tabelle Chirale Inhibitoren zeigen reziproke chirale Spezifität gegen D- und L-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-PR
Die D- und L-Enzyme wurden getrennt durch das fluorogene Assay-Verfahren unter Verwendung des entsprechenden chiralen Substrats untersucht, und zwar in Gegenwart des Inhibitors in einer Konzentration von 5 · 1C&sub5;&sub0;. Die fluorogenen Assays wurden mit 15 ul großen Aliquots (entsprechend 1,75 (±10%) mg Protein) für jedes Enzym-Enantiomer in 100 mM MES-Puffer, pH-Wert 6,5, durchgeführt, hinzugesetzt zu einer Lösung von 50 mM D- oder L-fluorogenem Substrat in dem MES-Puffer. Die Substratsequenz war 2-Aminobenzoyl-Thr-Ile-Nle-Phe(p- NO&sub2;)-Gln-Arg-amid (SEQ. ID-NR. 2): Es wurde entweder mit D- oder L-Aminosäure-Derivaten synthetisiert, um die geeigneten enantiomeren Formen darzustellen. Der Inhibitor Evans-Blau ist ein nicht-Peptid-achiraler, gemischt kompetitiver-nicht kompetitiver Inhibitor des HIV-1-PR- Enzyms.
Die enzymatische Aktivität der [Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;HIV-1-PR-Enantiomeren mit bezug auf die D- und L-Isomere des Substrates Ac-Thr-Ile-Nle-Nle-Gln-Arg.-amid (SEQ. ID-NR. 3) kann wie folgt gemessen werden. Das Substrat (1 mg/ml) wird mit Enzym (0,1 mg/ml) bei einem pH-Wert von 6,5 (MES-Puffer, 100 mM) 30 Minuten lang bei 37ºC behandelt. Ein Aliquot der Reaktionsmischung wird dann chromatographiert (Vydac 218TP5415-RP-HPLC-Säule) mit einem linearen Gradienten, 0 bis 40% von Puffer B (0,09% TF A/CH&sub3;CN, 1 : 9) in Puffer A (0,1% TFA) während 20 Minuten (Flußrate: 1 ml/min, A214nm). Die Peptid-Produkte wurden durch Ionensprüh-MS als (H)-Nle-Gln-Arg.-amid (m/z: 415,0 - frühe Elution) und Ac-Thr-Ile-Nle-(OH) (m/z: 388,0 - späte Elution) identifiziert. Nebensächliche Verunreinigungen, die in den Substrat- Präparationen aufgrund von ungereinigten Peptiden vorliegen, werden nicht gespalten. Tafel A veranschaulicht nur das D-Substrat; Tafel B veranschaulicht nur das L-Substrat; Tafel C veranschaulicht D-Substrat plus D-Enzym; Tafel D veranschaulicht D-Substrat plus L-Enzym; Tafel veranschaulicht L-Substrat und L-Enzym; Tafel F veranschaulicht L-Substrat plus D-Enzym.

8. Diskussion der Beispiele 4 bis 7

Das HIV-1-Protease-Enzym existiert als eine homodimere Struktur. Es ist ein hochspezifisches Enzym, und diese Spezifität und seine katalytische Aktivität hängt von der genauen 3-D-Struktur, die zwischen dem gefalteten Dimer und den sechs Resten des Substratmoleküls gebildet wird, ab.
Bei den beobachteten reziproken Spezifitäten gilt deshalb, daß die gefalteten Formen der D- und L-Enzymmoleküle Spiegelbild voneinander in allen Elementen der 3-D-Struktur sind, welche für ihre enzymatische Aktivität verantwortlich sind. Dies ist konsistent mit ihren beobachteten CD- Spektren.
Die 3-D-Struktur eines gefalteten Enzymmoleküls enthält zahlreiche chirale Elemente in der sekundären und supersekundären Struktur, in der tertiären Struktur und in der quaternären Struktur, wie in Fig. 3 veranschaulicht. Da der einzige Unterschied zwischen den synthetischen D- und L-Polypeptidketten die Stereochemie des α-Kohlenstoffatoms (und der C-β-Atome von Ile und Thr) der Aminosäuren ist, wird beschlossen, daß die Stereochemie des Grundgerüstes alle Aspekte der höheren Struktur in diesem Protein bestimmt.
Die Beobachtungen der reziproken chiralen Spezifität in der enzymatischen Aktivität der hierin beschriebenen D- und L-HIV-1-Proteasen dient dazu, die chirale Natur der biochemischen Wechselwirkungen von Proteinen zu verallgemeinern und zu betonen. Die großen Mengen an D- und L-Enzym-Enantiomorphen mit hoher Reinheit, die unter Verwendung der chemischen Ligationsmethode hergestellt wurden, werden eine gründliche experimentelle Evaluierung der Verwendung von D-, L-Proteinen in der Röntgenstrahl-Kristallographie ermöglichen.

SEQUENZ-AUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:
(A) The Scripps Research Institute
(B) STRASSE: 10666 North Torrey Pines Road
(C) STADT: La Jolla
(D) BUNDESSTAAT: CA
(E) STAAT: USA
(F) POSTLEITZAHL: 92037
(G) TELEPHON: 619-554-2937
(H) TELEFAX: 619-554-6312
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: D-ENZYM-ZUSAMMENSETZUNGEN UND VERFAHREN IHRER VERWENDUNG
(iii) ANZAHL AN SEQUENZEN: 3
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUM-TYP: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(v) VORLIEGENDES ANMELDEDATUM:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHUNGSDATUM: 7. Juni 1993
(vi) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 07/894 817
(B) EINREICHUNGSDATUM: 8. Juni 1992

(2) INFORMATION ZUR SEQ. ID-NR.: 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(v) FRAGMENT-TYP: internal
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 1
(D) ANDERE INFORMATION: /Markierung- N-Acetyl/Anmerkung - "Eine N-Acetylgruppe ist am Amino- Terminus des Peptids lokalisiert"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 3
D) ANDERE INFORMATION: /Markierung- Nle/Anmerkung - "Die modifizierte Aminosäure Nle ist an dieser Position vorliegend"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 4
(D) ANDERE INFORMATION: /Markierung- Nle/Anmerkung - "Die modifizierte Aminosäure Nle ist an dieser Position vorliegend"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: (3^4)
(D) ANDERE INFORMATION: /Markierung-psiCH&sub2;NH/Anmerkung - "Die schneidbare Peptid-Bindung zwischen diesen Aminosäuren wurde durch ein reduziertes Analog, psi CH&sub2;NH, ersetzt"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 6
(D) ANDERE INFORMATION: /Markierung- Amid/Anmerkung - "Ein Amid ist an dem Carboxyende des Peptids lokalisiert"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ. ID-NR. 1:

(2) INFORMATION ZUR SEQ. ID-NR. 2:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(v) FRAGMENT-TYP: internal
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 1
(D) ANDERE INFORMATION: /Anmerkung "Eine 2-Aminobenzoylgruppe ist an das Aminoende des Peptids lokalisiert"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 3
(D) ANDERE INFORMATION: /Markierung- Nle/Anmerkung - "Die modifizierte Aminosäure Nle ist an dieser Position vorliegend"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 4
(D) ANDERE INFORMATION: /Markierung- Phe-pNO&sub2;/Anmerkung - "Die modifizierte Aminosäure Phe-pNO&sub2; ist an dieser Position vorliegend"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 6
(D) ANDERE INFORMATION: /Markierung- Amid/Anmerkung - "Das Amid ist an dem Carboxyende des Peptids lokalisiert"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ. ID-NR. 2:

(2) INFORMATION ZUR SEQ. ID-NR. 3:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(v) FRAGMENT-TYP: internal
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 1
(D) ANDERE INFORMATION: /Markierung- Ac/Anmerkung "Eine Acetyl-, Ac-, Gruppe ist an dem Aminoende des Peptids lokalisiert"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 3
(D) ANDERE INFORMATION: /Markierung- Nle/Anmerkung - "Eine modifizierte Aminosäure Nle ist an dieser Position lokalisiert"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 4
(D) ANDERE INFORMATION: /Markierung- Nle/Anmerkung - "Eine modifizierte Aminosäure Nle ist an dieser Position lokalisiert"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Stelle
(B) LOKATION: 6
(D) ANDERE INFORMATION: /Markierung- Amid/Anmerkung - "Das Amid ist an dem Carboxyende des Peptids lokalisiert"
(xi) SEQUENZ-BESCHREIBUNG: SEQ. ID-NR. 3:

Claims

1. Synthetisches D-Enzym, umfassend eine Sequenz von Aminosäureresten, welche einem synthetischen L-Enzym entspricht, wobei das D-Enzym in der Laie ist, eine enzymatische Reaktion zu katalysieren, wobei die Sequenz von Aminosäureresten, neben achiralen Säureresten, aus D-Aminosäuren besteht.

2. Synthetisches D-Enzym von Anspruch 1, wobei das Enzym eine achirale Substratspezifität besitzt.

3. Synthetisches D-Enzym von Anspruch 2, wobei das Enzym Superoxiddismutase oder Carboanhydrase ist.

4. Synthetisches D-Enzym von Anspruch 1, wobei das Enzym eine chirale Substratspezifität aufweist und die chirale Substratspezifität des synthetischen D-Enzyms das Gegenteil der chiralen Spezifität des synthetischen L-Enzyms ist.

5. Synthetisches D-Enzym von Anspruch 4, wobei das Enzym aus der aus HIV-1-Protease, D-[Aba67,95,167,195]-HIV-1-Protease (HIV-1 PR) und und D-[Aba67,95(CO-S)&sup5;¹&supmin;&sup5;²]&sub2;-HIV-1- Proteaseanalog bestehenden Gruppe gewählt ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines chiral reinen chemischen Stoffes, das folgendes umfaßt:

a) Umsetzen eines ersten Stereoisomeren mit einem synthetischen D-Enzym von Anspruch 4, welches das erste Stereoisomer spezifisch in ein chirales Reaktionsprodukt umwandelt, in einer wäßrigen Mischung, wobei das Umsetzen während einer Zeitdauer und unter Reaktionsbedingungen stattfindet, die ausreichen, um das Reaktionsprodukt zu bilden, wobei das D-Enzym eine Sequenz von Aminosäureresten umfaßt, die ein Enzym bestimmt, das fähig zum Katalysieren der besagten Reaktion ist, und die Sequenz von Aminosäureresten, neben achiralen Aminosäureresten, aus D-Aminosäuren besteht; und

b) Isolieren des chiralen Reaktionsproduktes aus der Mischung, wodurch des chiral reine chemische Stoff gebildet wird.

7. Verfahren von Anspruch 6, wobei die wäßrige Mischung ein racemisches Gemisch mit mindestens einem ersten und einem zweiten Stereoisomer umfaßt.

8. Verfahren zur Herstellung eines chiral reinen chemischen Stoffes, das folgendes umfaßt:

a) Umsetzen eines racemischen Gemisches, das mindestens ein erstes und ein zweites Stereoisomer aufweist, mit einem synthetischen D-Enzym von Anspruch 4, welches das erste Stereoisomer spezifisch in ein Reaktionsprodukt umwandelt, in einer wäßrigen Mischung, wobei das Umsetzen während einer Zeitdauer und unter Reaktionsbedingungen stattfindet, die ausreichen, um im wesentlichen das gesamte erste Stereoisomer in das Reaktionsprodukt umzuwandeln, wobei das D-Enzym eine Sequenz von Aminosäureresten umfaßt, die ein Enzym bestimmt, das fähig zum Katalysieren der Reaktion ist, und die Sequenz von Aminosäureresten, neben achiralen Aminosäureresten, aus D-Aminosäuren besteht; und

b) Isolieren des zweiten Stereoisomeren aus der Mischung, wodurch der chiral reine chemische Stoff gebildet wird.

9. Verfahren zum Katalysieren einer Reaktion, die ein achirales Substrat beteiligt, das die folgenden Schritte umfaßt:

Schritt A: Vorsehen eines synthetischen D-Enzyms von Anspruch 2 mit einer Spezifität für das achirale Substrat; dann

Schritt B: Kontaktieren des achiralen Substrats mit dem synthetischen D-Enzym von Schritt A, um die das achirale Substrat beteiligende Reaktion zu katalysieren.

10. Verfahren zum Katalysieren einer wie Anspruch 9 beschriebenen Reaktion, wobei:

im Schritt A: das synthetische D-Enzym D-Superoxiddismutase ist und das achirale Substrat ein Superoxidradikal ist; und

im Schritt B: die D-Superoxiddismutase des Schrittes A mit einem Superoxidradikal kontaktiert wird, um das Superoxidradikal in molekularen Sauerstoff und Wasserstoffperoxid umzuwandeln.

11. Kristall, umfassend cokristallisierte D- und L-Enantiomere eines synthetischen Enzyms, das fähig ist, eine enzymatische Reaktion zu katalysieren, wobei das D-Enantiomer eine Aminosäuresequenz umfaßt, die neben achiralen Aminosäureresten aus D-Aminosäuren besteht.

12. Verfahren der strukturellen Analyse eines L-Enzyms, umfassend die folgenden Schritte:

Schritt A: Vorsehen eines wie in Anspruch 11 beanspruchten Kristalls, dann

Schritt B: Aussetzen des Kristalls von Schritt A an Röntgenstrahlen zur Erzeugung eines Röntgenstrahlmusters; und dann

Schritt C: Analysieren des in Schritt B erzeugten Röntgenstrahlmusters hinsichtlich Strukturinformation, betreffend das synthetische L-Enzym.

13. Verfahren zum Screenen einer Bibliothek für Arzneistoffkandidaten, die Aktivität in bezug auf ein synthetisches L-Enzyms aufweisen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

Schritt A: Vorsehen eines synthetischen D-Enzyms, wobei das synthetische D-Enzym ein Enantiomer des synthetischen L-Enzyms ist; wobei das D-Enzym eine Aminosäurerestesequenz umfaßt, die neben achiralen Aminosäureresten aus D- Aminosäuren besteht; dann

Schritt B: Screenen der Bibliothek, um ein oder mehrere Elemente der Bibliothek zu identifizieren, welche Aktivität im Zusammenhang mit dem synthetischen D-Enzym aufweisen; und dann

Schritt C: Identifizieren von Arzneistoffkandidaten in Hinsicht auf das synthetische L-Enzym unter Verwendung eines oder mehrerer Elemente der Bibliothek, die im Schritt B identifiziert wurden.

14. Verfahren, wie beschrieben in Anspruch 13, wobei das L-Enzym einen Rezeptor oder eine Bindungsstelle einschließt.

15. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die Enzymaktivität modulieren, umfassend:

(a) Kontaktieren mindestens einer Verbindung aus einer chemischen Bibliothek mit einem synthetischen D-Enzym, das eine Sequenz von Aminosäureresten umfaßt, die neben achiralen Aminosäureresten aus D-Aminosäuren besteht, und

(b) Bestimmen der Fähigkeit der Verbindung, die Aktivität des synthetischen D-Enzyms zu modulieren;

wobei von der Verbindung vor dem Kontaktieren nicht bekannt ist, daß sie die Aktivität des D-Enzyms inhibiert.

16. Verfahren von Anspruch 15, wobei die chemische Bibliothek chirale Verbindungen umfaßt.

17. Verfahren von Anspruch 16, wobei die chemische Bibliothek ferner Verbindungen mit zufälliger Chiralität umfaßt.

18. Verfahren von Anspruch 16, wobei die chemische Bibliothek ferner Naturprodukt- Verbindungen umfaßt.

19. Verfahren von Anspruch 16, wobei das D-Enzym eine D-Form eines L-Enzyms ist.

20. Verfahren von Anspruch 19, wobei das D-Enzym eine Länge von 80 bis 500 Aminosäuren besitzt.

21. Verfahren von Anspruch 20, wobei das D-Enzym eine Substrat-Bindungsregion besitzt, welche derjenigen auf dem L-Enzym entspricht.

22. Verfahren von Anspruch 20, wobei das D-Enzym die D-Form eines L-Enzyms ist, welches eine Reaktion katalysiert, die aus der Hydrolyse von Estern, Bildung von Estern, Umesterung, Transaminierungen, Hydrolyse von Amiden, Bildung von Amiden, Hydrolyse von Aminosäure-Hydantoinen und Hydrolyse von Nitrilen umfassenden Gruppe gewählt ist.

23. Verfahren von Anspruch 22, wobei das D-Enzym die D-Form von einer L-HIV-Protease ist.

24. Verfahren von Anspruch 20, wobei das D-Enzym die D-Form eines L-Enzyms ist, welches aus der Cytochrom-C-Peroxidase, Glutathion-Peroxidase, Katalase, Superoxiddismutase, Trypsin, Chymotrypsin, Thermolysin, Rennin, Pepsin, Papain, Carboxypeptidase A, Penicillin-Acylase, Cephalosporin-Acylase, Acetylcholin-Esterase, Cholesterin-Esterase, Carboxylesterase, Hydrolasen, Lyasen, Säuger-Pankreas-Lipase und Peptidasen umfassenden Gruppe gewählt ist.

25. Verfahren von Anspruch 20, wobei die Fähigkeit der Verbindung, die Aktivität des D- Enzyms zu modulieren, die Inhibition der Aktivität des D-Enzyms umfaßt.

26. Verfahren von Anspruch 20, wobei die Verbindung aus der aus Aminosäuren, Alkoholen, Carbonsäuren, Estern und Aminen bestehenden Gruppe gewählt ist.

527. Verfahren von Anspruch 20, wobei die Verbindung ein Cofaktor für das D-Enzym ist.

28. Verfahren von Anspruch 20, wobei die Verbindung ein Substrat für das D-Enzym ist.

29. Verfahren von Anspruch 20, wobei die Verbindung ein Inhibitor des D-Enzyms ist.

30. Verfahren von Anspruch 20, ferner umfassend einen zusätzlichen Schritt des Bestimmens der Inhibition der Aktivität des L-Enzyms durch ein Enantiomer, wobei das Enantiomer ein Enantiomer der Verbindung ist.

1531. Verfahren von Anspruch 20, ferner umfassend die zusätzlichen Schritte des Wiederholens der Schritte (a) und (b).

32. Verfahren zur Bestimmung, ob eine Probe eine Verbindung enthält. umfassend:

(a) Kontaktieren der Probe mit einem D-Enzym, das eine Sequenz von Aminosäureresten umfaßt, die neben achiralen Aminosäuresequenzen aus D-Aminosäuren besteht, und fähig ist, eine enzymatische Reaktion zu katalysieren, und

(b) Bestimmen der Aktivität des D-Enzyms in Gegenwart der Probe;

wobei die Aktivität des D-Enzyms mit der Gegenwart der Verbindung in Zusammenhang steht.

33. Verfahren von Anspruch 32, wobei die Verbindung ein Substrat für das D-Enzym ist.

34. Verfahren von Anspruch 33, wobei das D-Enzym aus der Cytochrom-C-Peroxidase, Glutathion-Peroxidase, Katalase, Superoxiddismutase, Trypsin, Chymotrypsin, Thermolysin, Rennin, Pepsin, Papain, Carboxypeptidase A, Penicillin-Acylase, Cephalosporin- Acylase, Acetylcholin-Esterase, Cholesterin-Esterase, Carboxylesterase, Hydrolasen, Lyasen, Säuger-Pankreas-Lipase und Peptidasen umfassenden Gruppe gewählt ist.

35. Verfahren von Anspruch 33, wobei das D-Enzym 80 bis 500 Aminosäuren besitzt.

36. D-Enzym, wie beansprucht in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, zur Anwendung bei einer Therapie.

37. Verwendung eines D-Enzyms, wie beansprucht in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Erkrankungen und Zuständen, die mittels des entsprechenden L-Enzyms behandelbar sind.

38. Verwendung, wie beansprucht in Anspruch 37, wobei die Erkrankung oder der Zustand eine entzündliche Störung oder eine post-ischämische Verletzung ist, und das D-Enzym eine D-Superoxiddismutase, D-Katalase oder D-Glutathion-Peroxidase ist.

39. Verwendung, wie beansprucht in Anspruch 37, wobei es sich bei der Erkrankung oder dem Zustand um eine virale Infektion, Alloxandiabetes, Krebsmetastase, durch freie Sauerstoffradikale verursachten Gewebeschaden, Entzündungskrankheiten (z. B. Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Tendinitis, Tendovaginitis, Bursitis, Epicondylitis und Perarthritis), post-ischämische Verletzung, Peyronie-Krankheit, Dupuytren-Erkrankung, Atemnot- Syndrom, Organtransport, Organtransplantation, toxische Sekundäreffekte bei Strahlen- und Chemo-Antikrebstherapie, Arzneimittel-induzierte Nephritis handelt, und das D- Enzym eine D-Superoxiddismutase ist.

40. Therapeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutische Menge eines D-Enzyms, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, in Verbindung mit einem physiologisch annehmbaren Träger.