WO1998042829A1 - Verfahren zur reinigung und kristallisierung von proteasom - Google Patents

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WO1998042829A1
WO1998042829A1 PCT/EP1998/001653 EP9801653W WO9842829A1 WO 1998042829 A1 WO1998042829 A1 WO 1998042829A1 EP 9801653 W EP9801653 W EP 9801653W WO 9842829 A1 WO9842829 A1 WO 9842829A1
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proteasome
subunits
preparation
fractions
eukaryotic
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Michael Groll
Robert Huber
Lars Ditzel
Richard Engh
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/25—Threonine endopeptidases (3.4.25)
    • C12Y304/25001—Proteasome endopeptidase complex (3.4.25.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast

Definitions

  • the invention relates to a method for obtaining a purified eucaryotic crystallizable proteasome preparation and the proteasome preparation obtainable by the method. Furthermore, the invention relates to a purified eukaryotic proteasome preparation in crystallized form. With the help of the crystal data from this proteasome preparation, new proteasome inhibitors can be identified and obtained, in particular with the aid of computer-aided ModeHing programs.
  • the proteasome is the central enzyme in protein degradation both in the cytosol and in the cell nucleus. It is involved in many biological processes, including removing abnormal, misfolded or misassembled proteins, responding to stress (by processing or breaking down transcription regulators), cell cycle control (by breaking down cyclines), cell differentiation and metabolic adaptation (by destroying Transcription factors or metabolic enzymes) and the cellular immune response (by generating antigenic peptides presented by MHC class I molecules).
  • the 26S proteasome is needed for these cellular functions, which are based on the degradation of proteins that require ubiquitin and ATP.
  • the nucleus and proteolytic chamber are formed by the 2OS proteasome.
  • the 2OS proteasome from the archaebacterium Thermoplasma aeidophilu was analyzed by X-ray crystallography at a resolution of 0.34 nm. It has a cylindrical shape with a length of 14.8 nm and a maximum or minimum diameter of 11.3 nm or 7.5 nm. It consists of 28 subunits that are in a particle as 4 homoheptamers Rings al ßl ßloil with D7 symmetry are arranged (Löwe et al., (1995), Science 268, 533-539). In the T.
  • T. acidophilum proteasome the N-terminal threonine residue of the ⁇ subunits is the binding site of inhibitory peptide aldehydes and essential for 5 the hydrolytic activity.
  • Stock et al. ((1996), Curent Opinion in Biotechnology, 7: 376-385) describe the structure and function of T. acidophilum proteasomes. A transfer of T. acidophilum data to eukaryotic proteasomes is not possible because the homology of the proteasomes between these species is too low.
  • Eukaryotic proteasomes are considerably more complex than the archaebacterial proteasome.
  • the 2OS proteasome from Saccharomyces cerevisiae is made up of a total of seven different ⁇ -type 5 and seven different / 3-type subunits, which have already been cloned and sequenced, cf. z. B. Heinemeyer et al. (1994), Biochemistry 33, 12229-12237).
  • the eukaryotic 20S proteasomes e.g. B. from yeast and from 20 mammals, are very closely related in terms of the amino acid sequences of subunits and their coarse structure recognizable by electron microscopy.
  • ⁇ -type subunits of the mammalian 2OS proteasome form an orderly and well-defined structure (Kopp et al. (1995), J. Mol. Biol. 25 248, 264-272).
  • LMP2, LMP7 and MECL1 three additional non-essential subunits of the 20S proteasome, called LMP2, LMP7 and MECL1
  • LMP2, LMP7 and MECL1 can replace constitutive components after induction with the cytokine interferon ⁇ .
  • Their expression or deletion deliberately changes the peptidase specificity of the proteasome and the expression level of MHC class I molecules on the cell surface.
  • Nucleotide and amino acid sequences of proteasome units are described, for example, in Japanese applications JP-A-04 077 497, JP-A-04 077 498, JP-A-04 117 283, JP-A-05 317 059, JP-A- 07 255 476, JP-A-08 116 972, JP-A-08 205 871 and JP-A-08 217 796 and in Japanese Patent 40 51 896.
  • Inhibitors for the proteasome are, for example, in JP-A-05 000 968, WO 92/20 804, WO 94/17 816, WO 95/24 914, WO 95/25 533, WO 96/13 266, WO 96/32 105 (lactacystin analogs) and US-A-55 80 854 (peptide aldehyde inhibitors).
  • WO 91/13904 describes the identification and characterization of a chymotrypsin-like protease, which is present as a multicatalytic protease, and its use for the treatment of Alzheimer's disease.
  • the use of substrates specific for chymotypsin activity for testing or screening inhibitors as described herein leads exclusively to the identification of inhibitors which are specific for chymotrypsin-like activity.
  • the object on which the invention is based was therefore to provide a process which enables the crystallization of eukaryotic proteasome preparations, so that the development of new inhibitors is simplified with the aid of the crystal structure.
  • the object of the invention is achieved by a method for obtaining a purified eukaryotic proteasome preparation, comprising the steps:
  • step (c) chromatographic separation into fractions on an ion exchange medium, e.g. B. Q-Sepharose, (d) testing the fractions obtained in step (c) and collecting the active fractions,
  • an ion exchange medium e.g. B. Q-Sepharose
  • step (f) testing the fractions obtained in step (e) and collecting the active fractions, (g) concentrating the pooled fractions,
  • step (h) chromatographic separation over a gel filtration medium in a molecular weight range from 5 kD to 5 MD, e.g. B. Superose and (i) testing the fractions obtained in step (h) and collecting the active fractions.
  • Any eukaryotic cells can be used as starting material for the method according to the invention, e.g. B. animal cells, plant cells or fungal cells such as yeast cells.
  • yeast cells e.g. B. Saccharomyces cerevisiae.
  • the fractions are usually tested during the enrichment process by determining the proteolytic activity typical of proteasomes.
  • known chromogenic peptides can be used as substrates.
  • the fractions are preferably tested in such a way that two parallel determinations of the proteolytic activity are carried out, one in the absence and the other in the presence of a proteasome inhibitor, e.g. B. Lactacystin is performed. This type of testing allows a clear differentiation between the proteasomes containing Fractions from other fractions with proteolytic activity.
  • the implementation of the enrichment comprises three chromatographic separation steps (c), (e) and (h), of which at least one can be carried out in an FPLC system, eg. B. Step (h).
  • the process according to the invention gives a purified proteasome preparation which is present in a sufficient amount and purity, so that subsequent crystallization is made possible.
  • Another object of the present invention is thus a purified eukaryotic proteasome preparation which can be obtained by the method according to the invention.
  • Yet another object of the present invention is a purified eukaryotic proteasome preparation in a crystallizable form.
  • Yet another object of the present invention is a purified crystallized eukaryotic proteasome preparation.
  • the crystallized proteasome preparation can also contain a proteasome inhibitor.
  • suitable known proteasome inhibitors are lactacystin or analogues thereof or tripeptide aldehydes such as calpain inhibitor.
  • the eukaryotic proteasome preparation according to the invention comprises a 2OS proteasome, ie a complex of 28 subunits, each containing 2 molecules of seven different o-type subunits and seven different / 3-type subunits.
  • the complex can also contain metal ions, e.g. B. magnesium, solvent molecules, e.g. B. water, and other polypeptide components.
  • the purified eukaryotic proteasome preparation according to the invention can be used to identify and obtain new products.
  • teasome inhibitors are used.
  • data from the crystal structure of crystallized eukaryotic proteasome preparations are used.
  • the identification and extraction of new proteasome inhibitors is preferably carried out in a computer-aided modeling program.
  • the inhibitor design can be carried out by visual inspection of graphic representations of the structure, in particular (a) by determining the volumes accessible to ligands at active sites, e.g. b. with the help of the programs
  • ligands can be attached by automated ligand fragment docking or adaptation procedures, e.g. B. with the help of the programs DOCK, LUDI, LEAPFROG etc.
  • the crystal data of the 3-type proteasome subunits in particular the proteasome subunits jß5 / PRE2, / 31 / PRE3 or / and / 32 / PUP1 or homologous subunits from other eukaryotic proteasomes and neighboring subunits thereof, are particularly preferred for this purpose, e.g. B. 34 / C11 or / and / 37 / PRE4 used.
  • the crystal structure data according to the invention of the yeast proteasome can be carried out with known amino acid sequences of the human proteasome Homology modeling can be modified. Such homology modeling can be carried out using molecular graphics programs such as 0, INSIGHT, FR0D0, etc.
  • the present invention encompasses homology modeling of the homologous active sites of the active monomers in general and in particular for the purpose of inhibitor design.
  • FIG. 1 shows the homology of the amino acid sequences of the yeast proteasome and the human proteasome in the relevant areas.
  • FIG. 1 shows the homology between the amino acid sequences from yeast and human coding for the active subunits of the proteasome; the ßl / PRE3, S2 / PUP1, ß5 / PRE2 subfamilies are shown in yellow, green and blue; the residues of the S1 pocket, which influence the specificity changes of the PRE3 subfamily after substitution of the human subunit Y by LMP2 after cytokine induction, are drawn in brown;
  • FIG. 2 shows the topology of the 28 subunits of the 2OS
  • Figure 3 shows the C ⁇ chain positions of the subunits iS7 / PRE4, jS6 / C5,? 1 '/ PRE3, 32' / PTJPl and / 33 '/ PUP3, in which the -cis and jß-trans-ß- interactions through contacts of Insertion segments are highlighted,
  • Figure 5 is a schematic of the proposed chemical steps of autolysis and substrate hydrolysis.
  • ßl / PRE3 is shown in gray with the residues contacting Pl in red; ⁇ 2 / PUPl is shown in green and the inhibitor in blue (a); ß2 / PUPl (b), ß5 / PRE2 (c) with analog coloring;
  • Figure 7 shows the lower half of the ß-ß chamber.
  • the main chain with red circles for the carbonyl oxygen is indicated for the C-terminal sections of the helices H2 of the seven ß-type subunits that define the ß ring area.
  • the intermediately processed and unprocessed propeptides of the subunits ß6 / C5, ß7 / PRE4, ß3 / PUPl and ß4 / Cll (green) and the calpain inhibitor (yellow) bound to ßl / PRE3, ß2 / PUPl and ß5 / PRE2 are shown.
  • Two magnesium ions, which are located near the ß-ring surface, are drawn as silver circles; and FIG.
  • FIG. 8 shows a surface view of the proteasome molecule, cut along the cylinder axis.
  • Three of the six calpain inhibitor molecules bound to ßl / PRE3, ß2 / PUPl and ß5 / PRE2 are shown in red as space-filling models.
  • the sealed ⁇ openings at both ends of the particle, a few narrow side windows and the sharply cut inner ß-ring faces can be seen. 0
  • yeast cells from Saccharomyces cerevisiae were washed twice with ice-cold water and added to cells in a weight ratio in buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM NaN 3 ) Buffer of 2: 3 suspended.
  • the cells were disintegrated for 10 min in a mill (Biomatik, Germany) with glass balls (diameter: 0.5 mm; volume ratio of glass balls to cell suspension: 3: 2). The cell disruption was monitored microscopically.
  • the crude extract was centrifuged for 10 min at 10,000 x g 25 in a Sorvall RC 2B centrifuge. The supernatant was centrifuged again at 134,000 x g for 45 min in a Ti-55.2 rotor (Beckmann). The lipids from the top layer were carefully removed and the remaining yellow solutions were combined. The protein concentrations were about 30 50 mg / ml.
  • the CL activity of all active fractions was measured again in the presence of lactacystin and the fractions with reduced activity were collected.
  • the combined fractions were diluted three times with water and applied to a hydroxyapatite column (3 x 10 cm) equilibrated with 60 mM potassium phosphate, pH 7.5.
  • the column was washed with 60 mM potassium phosphate pH 7.5 and eluted with a gradient of 60-300 mM potassium phosphate.
  • the flow rate was 60 ml / h. 12 ml fractions were collected.
  • CL, PGPH and TL activity was measured in all fractions and the active fractions were pooled.
  • the combined fractions were concentrated twenty times by ultrafiltration using an AMICON YM30 membrane and the concentrate was applied to a Superose 6 column (1 ⁇ 30 cm) equilibrated with buffer A. Elution was carried out at a flow rate of 18 ml / h in buffer A. The proteasome eluted after 37 min. In this way, 50 mg of crystallizable protein could be obtained from 500 g of yeast cells.
  • the crystals were grown in droplets at 24 ° C.
  • the protein concentration used for crystallization was 40 mg / ml in 10 mM Tris / HCl (pH 7.5) and 1 mM EDTA.
  • the drops consisted of 4 ⁇ l of the protein solution and 2 ⁇ l of a reservoir solution which contained 40 mM magnesium acetate, 0.1 M morpholinoethanesulfonic acid (pH 6.5) and 12% 2,4-methylpentanediol.
  • the crystals containing the lactacystin inhibitor were prepared by immersing them in a 1mM lactacystin solution for 6 hours.
  • the crystals containing the inhibitor acetyl-leu-leu-norleucine were produced by immersion in a 5 mM calpain solution for 6 h.
  • the crystallographic data are given in Table 1.
  • the crystals were very well ordered and showed only a slight anisotropy. A resolution of 0.24 nm was thus possible.
  • the acetyl-leu-leu-norleucinal-inhibited crystals 5 had a somewhat reduced order.
  • the anisotropy of the diffraction was corrected using the structure factor amplitudes found with those as calculated from a model with isotropic temperature factors 0 using XPLOR (Bruenger, 1992).
  • the crystals were immersed in an anti-freeze buffer (30% MPD, 28 mM magnesium acetate, 0.1 M morpholinoethanesulfonic acid, pH 6.9) 5 and frozen in a stream of 90 ° K cold nitrogen gas.
  • the diffraction data were obtained with a 300 mm Mar research imaging plate at a distance of 275 mm (LACT) or 280 mm (CAL) collected.
  • a rotation function calculated at 0.5 nm resolution showed two peaks related to the crystal symmetry, which indicated the presence of local diadic molecular axes at bei 86 ° ⁇ 90 ° and ⁇ 94 ° ⁇ 90 °. Their correlation values were half the value of a crystallographic diad as would be expected for an almost ideal molecular double symmetry.
  • the T. acidophilum model was used for 5 Patterson search calculations using AMoRe (Navaza (1994), Acta Cryst. A50, 157-163) at a resolution of 0.35 nm. If one took into account the D7 symmetry of the investigation model, these showed a single solution with a correlation value of 0.32 and an R-factor 0 of 56% compared to the next highest peak of 0.28 and 57%.
  • the T. acidophilum model was reduced to polyalanine with only a few conserved residues that remained in the ⁇ -type 5 subunit. This model gave an R-factor of 57.7% and was used to calculate a 2F 0 -F C map at 0.24 nm with X-PLOR (Bruenger (1992), X-PLOR version 3.1. A System for X-Ray Crystallography and NMR) used. Electronic density was measured in real space using MAIN (Turk (1992), PhD
  • the finished model took into account the inhibitor molecules lactacystin and acetyl-leu-leu-norleucinal, 18 magnesium ions, and 1,800 water molecules, respectively.
  • the R values are satisfactory and the standard geometry of the bonds and angles is excellent.
  • the local molecular diadic symmetry is well conserved, which is also shown by the very low value R baCk 13 % in the final stage of the analysis.
  • the 3% increase in R value for data with a resolution of 0.28 nm compared to 0.24 nm is a result of the anisotropic crystal order, which affects the data quality, and the limited inclusion of ordered solvent molecules.
  • the 14 genes cloned from yeast, which code for components of the 2 OS proteasome, can be divided into seven o-type and seven ⁇ -type subunits.
  • the / 3-type subunits are synthesized as precursors, which are processed into the mature forms present in the assembled proteasome.
  • the mature 3-type polypeptides 32 / PUP1, ⁇ 5 / PRE2 and 31 / PRE3 are obtained from their proforms by cleavage between Gly-1 and Thrl with release of the active site Thrl, while / 37 / PRE4 between Asn-9 and Thr-8 and / 36 / C5 between His-10 and Gin- 9 and split as bile processing intermediates are available.
  • / 34 / C11 and 33 / PUP3 are not processed and begin with Met (-l) or Met (- 9).
  • the subunits PUP1, PRE2 and PRE3 are said to be completely processed, the subunits PRE4 and C5 to be partially processed and the subunits C1 and PUP3 to be unprocessed.
  • the electron density for the main chains is defined as follows in the ⁇ -type subunits: ⁇ 2 / Y7: Thr5-Leu236, o; 3 / Y13: Gly4-Gly237, ⁇ 4 / PRE6: Tyr8-Gln244, ⁇ 5 / PUP2: ArglO - Glu243 (7 residues of the insertion are not defined - Glyl2 to Arg 126), c6 / PRE5: Phe4 - Ile233, ⁇ 7 / Cl: Gly5 - Asn241, o; l / C7: Gly6 - Asp240.
  • the electron density is defined as follows: 33 / PUP3: Ser-8-Asp 193,, ß6 / C5: Gln-9-Asp 193, ßA / Cll: Met-1-Glnl92, S7 / PRE4 : Thr-8-Ile211, / 32 / PUP1: Thrl-Cys221, 31 / PRE3: Thrl-Leul96, / 35 / PRE2: Thrl-Gly211.
  • All seven a- and / 3-type polypeptides have a characteristic ⁇ -sandwich structure. It is formed from two five-stranded antiparallel / S-sheet structures with the helical layers above them, formed from the helices H3, H4, H5 and the helices H1 and H2 underneath. However, they differ in the kinks, which vary in length by one or two amino acid residues, in long insertions which connect secondary structural elements, and in the N-terminal regions and in particular in the C-terminal regions.
  • ⁇ 2 / Y7 has a long insertion loop between strands S9 and S10, which is made up of a short ⁇ -helix and a / 3-strand.
  • ⁇ l / C7 has one Extension of the Helix H3 by two kinks through the insertion at G180.
  • the subunits ⁇ l / C7, ⁇ 3 / Y13, o; 4 / PRE6, ⁇ 5 / PUP2 and al / Cl have longer C-terminal helices H5, which protrude from the particle surface into the solution.
  • the highly charged, mostly acidic C-terminal segments are unstructured.
  • / 37 / PRE4 has a clear kink between the helices Hl and H2 and an additional cü helix with 2 kinks at rest 145.
  • ß6 / C5 has an insertion of 17 residues between H3 and H4 with a complex fold and a short helix.
  • ß2 / PUPl has a very long C-terminal extension, which is heavily disordered in its last 11 residues.
  • the subunits ß3 / PUP3 and ß6 / C5 have short C-termini, so that the helices H5 do not exist and the strands S10 are extended to enlarge the ß-sheet.
  • Helix H5 exists in / 34 / C11, but is 2 kinks shorter than in T. acidophilum.
  • Each of the seven o; -type subunits has two neighbors within the heptameric ring, which have o; -cis interactions, and one or two neighboring ß-type subunits in the other ring with ⁇ ; -trans- / Alternating effects.
  • the centrally located ß-type subunits have one or two neighboring ß-type subunits in the other ß ring with ß-trans-ß interactions.
  • the general architecture of the quaternary structure is the same in the proteasome of T. acidophilum and yeast (Fig. 2): The N-terminal Loop segment, helix HO (residues 20 to 30), loop L, the loop connecting H2 and S5 and the strand S7 mediate ⁇ -cis interactions.
  • the ⁇ -cis contacts which appear to be less close, include the loop L, the N end of the helix Hl, the strand S7 and the kink connecting the strand S8 and the helix H3. These contacts come from the D7-symmetrical precursor and can also be found in the T. acidophilum proteasome. Despite the conserved architecture, these contacts are specific to the respective subunits due to their specific amino acid sequences.
  • ß-trans- ⁇ -Contacts are made by the Helix HI-Loop Helix H2 motifs, which interact with the same motifs from two neighboring ⁇ subunits. This basic contact motif was also seen in the T. acidophilum structure (see Figure 4a in Löwe et al. (1995), Science 268, 3479-3486), but the insertion at residue 66 of ß7 / PRE4 favors its association with c6 / PRE5 and al / Cl.
  • the long insertion in a2 / Yl at residue 210 between strands S9 and S10 binds to ⁇ 2 / PUPl and couples this pair.
  • Specific ß-trans-ß interactions are formed by the C-terminal arm of ß7 / PRE4, which is embedded between ß2 '/ P Pl and ßl' / PRE3.
  • the C-terminal segment of ß5 / PRE2 interacts with ß3 '/ PUP3 and ß4' / Cll in a similar way ( Figure 3).
  • the long insertion of ⁇ 6 / C5 at residue 145 contacts subunit ⁇ 3 '/ PTJP3 and the C-terminal arm of ⁇ 2' / PUPl.
  • magnesium Y8 bridges the main chain carboxylate of Aspl93 from ß6 / C5 with the loop 162 to 167 of ß2 '/ PUPl.
  • the magnesium Y9 bridges the subunit ß3 / PUP3 via Aspl93 with ß5 '/ PRE3.
  • these carboxylate groups are ligands for other magnesium ions, which are located in loops 165 of ⁇ 4 / PUP3 (magnesium W6) or ⁇ 6 / C5 (magnesium W4) and which can play a role in the stabilization of the subunit structure.
  • the aspartate residues are completely hidden and their side chains are involved in charge-charge interactions with Arg 19 from ß2 '/ PUPl or Arg 19 from ß5' / PRE2, which further strengthens the ß-trans-ß contacts.
  • the ß-type subunits ßl / PRE3 and ß4 / Cll are located on the only molecular diad 5 of the yeast proteasome and are very similar to the dominant ß-trans-ß contact on residues 133-137 of the helix H3 of T. acidophilum.
  • Thr 1 Close to Thr 1 are the residues Serl29, Serl69 and 5 Aspl66, which are necessary for the structural integrity of this site, but could also be involved in the catalysis. Mutagenesis has shown that Aspl66 in the protea som of T. acidophilum is essential (Seemüller et al. (1996), Nature 382, 468-470). These residues are invariant in the active subunits PUP1, PRE2 and PRE3.
  • ThrlN has hydrogen bonds to Serl680 and O ⁇ and Serl290 v .
  • ThrlO 7 has a hydrogen bond to Lys33 r .
  • Aspl7 has hydrogen bonds via O ⁇ l to Argl9N and Glyl70N and via 0 02 to Thr / Ser2N and Lys33N f .
  • Lys33N r has three hydrogen bonds to Aspl70 ⁇ 2 , Argl90 and ThrlO ⁇ .
  • ThrlN can form a hydrogen bond to ThrO 7 and is probably neutral, a state favored by a nearby positively charged lysine residue. Such a charge distribution would also be expected based on the respective standard pKa values. ThrlN is therefore most likely the proton acceptor when ThrlO 7 is involved in an electrophilic center. This is confirmed by the structure of the lactacystin complex, which has an ester between lactacystin and Thrl as a result of a ß-Lacton ring opening after a nucleophilic attack by ThrlO 1 .
  • ThrlN is in the right position to serve as a proton shuttle from ThrlO ⁇ to lactacystin-06 '.
  • An analogous reaction sequence is proposed for the hydrolysis of the C-terminal fluorophore of fluorogenic substrates, the proton transfer taking place in the amide nitrogen of the leaving group.
  • the acyl enzyme generated is deacylated by the water NUK, as shown in sections DE of FIG. 5. Alternatively or in parallel, NUK could attack the peptide bond directly, bypassing intermediate I. 4.4 Inhibitor binding
  • S3 / PUP1, ßl / PRE3 and ß5 / PRE2 bound the inhibitor acetyl-leu-leu-norleucinal to ThrlO ⁇ , presumably as a hemiacetal. It adopts a ⁇ -conformation and fills the gap between strands which contain residues 20 and 21 and 47 (assigned to loop L in Figure 3 in Löwe et al., 1995, supra), to which it is bound via hydrogen bonds is, which creates an anti-parallel ß-sheet structure.
  • the norleucine side chain extends into a pocket (the S1 pocket) that is open at the side to a tunnel that leads to the particle surface.
  • the leucine side chain at P2 is not in contact with protein and the leucine side chain at P3 is in contact with the neighboring ⁇ -subunit.
  • the S1 specificity pocket is mainly formed by residues 20, 31, 35 49, 53, ie Ala20, Val31, Ile35, Met45, Ala49, Gln53 (K) in ß5 / PRE2 (Fig. 6c), Thr20, Thr31, Thr35, Arg45, Ala49, Gln53 in ⁇ 1 / PRE3 (Fig. 6a), Ser20, Cys31, His35, Gly45, Ala49, Glu53 in ⁇ 2 PUPl (Fig. 6b).
  • the rest 45 form the bottom of the bag and appear to largely determine its character.
  • Adjacent subunits in the ⁇ rings further contribute to the S1 pockets and modulate their character: ⁇ 2 / PUPl in the case of ⁇ 1 / PRE3 with Hisll4, Hisll6, Serll ⁇ , Aspl20; ß3 / PUP3 in the case of ß2 / PUPl with the residues Aspll4, Aspl20 and Cisll8 and ß6 / C5 in the case of ß5 / PRE2 with Serll ⁇ , Aspll4, Glul20 and Glul22.
  • Lactacystin is covalently bound to ß5 / PRE2. This is consistent with the observed chemical modification of subunit X of the mammalian proteasome (Fenteany et al., (1995), Science 268, 726-730) the homologue of PRE2. Its dimethyl side chain at C10 extends into S1 like a valine or leucine side chain, but less deep than Calpain's norleucine side chain. Lactacystin forms several hydrogen bonds with atoms of the main protein chain LactN-Gly470, Lact04 '-Gly47N, Lact09' -Thr21N, Lact06 '-ThrlN.
  • ß5 / PRE2 has a methionine residue at position 45 in contact with the branched side chain of lactacystin in the complex.
  • the norleucine side chain from Calpain pushes the methionine side chain up to 0.27 nm towards Ile35, which rotates out of the way. These concerted movements make the Sl bag more spacious. This is consistent with the observation that lactacystin inhibits chymotryptic activity against chromogenic substrates.
  • ß5 / PRE2 chymotryptic activity is reduced in proteasomes with a ß5 / PRE2 mutant that cannot be processed from their proform (Chen & Hochstrasser (1996), Cell 86 961-972) and by a mutation in ß5 / PRE2, where a Substitution of Ala49 by Val in the SI pocket limits the size (Heinemeyer et al. (1993), J. Biol. Chem. 268, 5115-5120).
  • ßl / PRE3 has an arginine residue in position 45 on the bottom of the SI bag, which is well suited for glutamate Pl residues. It is most likely the subunit associated with the proteasome peptidylglutamyl peptide hydrolysis activity (PGPH).
  • ß2 / PUPl has a glycine as residue 45 and consequently a spacious SI pocket, delimited at the bottom by His35 and Glu53.
  • ß5 / PRE2 contains both chymotryptic and tryptic activity while ßl / PRE3 contains PGPH activity, but both pockets are adaptable in size (PRE2) and polarity (PRE3).
  • ß2 / PUPl 5 is suitable for very large PI residues with a basic character. Mutation analyzes have shown that substitutions in ß4 / Cll and ß7 / PRE4 influence the chymotrypsin-like or PGPH activity (Heinemeyer et al. (1993), supra; Hilt & Wolf (1996), TIBS 21, 96-102; Hilt et al . (1993), J. Biol. Chem.
  • the 15 beard Thrl site interferes with the deletion of the 15 C-terminal residues of ß7 / PRE4, which form extensive contacts with ßl / PRE3 (FIG. 3).
  • ⁇ -type subunits Five ⁇ -type subunits are synthesized with propeptides of different lengths up to 75 amino acids, which are split off during maturation.
  • ß2 / PUPl, ß5 / PRE2 and ßl / PRE3 show an autolysis between Gly-1 - Thrl. This is a process that requires the presence of Thrl, Gly-1 and Lys33.
  • ThrlO ⁇ as the nucleophile attacking the preceding peptide bond (Schmidtke et al. (1996), EMBOJ. 15, 6887-6898).
  • the water NUK is assigned a central role. It is ideally positioned to act as a base for removal of a proton of ThrlO ⁇ and to drive nucleophilic addition to the carbonyl carbon of Gly-1 35.
  • Gly-10 is directed towards the positively charged Lys33N f and from Gly47N, which form an oxygen anion hole in analogy to serine proteases, in order to distribute the resulting negative charge when the tetrahedral adduct is formed.
  • a rearrangement to the ester can take place after the proton transfer from water NUK to ThrlN and cleavage of the peptide bond.
  • the nearby residues Serl290 ⁇ and Serl690 ⁇ support this reaction. Both hydroxyl groups are linked via hydrogen bonds to Aspl66, which is invariant in the active subunits.
  • NUK is also likely to be involved in ester hydrolysis as an attacking nucleophile, which is eventually incorporated into the product (Fig. 5, sections a to c).
  • the Gly-1 residue appears to be essential since a side chain at position -1 would interfere with the protein backbone at position 168 and would force a configuration that is unsuitable for autolysis.
  • the subunits become active when Thrl is released. If the catalytic site is not intact, as in the subunits ß3 / PUP3, ß6 / C5 and ß4 / CH, which lack Thrl, in ß7 / PRE4, in which Lys33 is replaced by Arg, and in constructed variants of LMP2, In the mammalian homologue of ⁇ 1 / PRE3 (Schmidtke et al. (1996), supra) and PRE2 (Chen & Hochstrasser (1996), supra), autolysis does not occur at rest 1.
  • ß7 / PRE4 has both essential residues Gly-1 and Thrl, but in a configuration that is very different from that found in the active subunits, since the Thrl side chain is pushed away by the larger Arg33, which replaces the lysine residue ( Figure 4b).
  • the detection of defects in the catalytic activity and in the processing proves the structural lability of the Thrl site, which can be disturbed by mutations from neighboring residues of the same or neighboring subunits.
  • an inactive mutant in in the vicinity of active subunits can become active itself, which is in line with observations that T. acidophilum species, which have a defect in the processing, are processed upon coexpression with wild-type protein (Seemül-1er et al. (1996) , supra).
  • the propeptides play an essential role in the assembly of eukaryotic proteasomes, which can be due to direct or indirect effects through participation in interactions between subunits and / or through stabilization of the structure of subunits.
  • the observed structures of the processing intermediates of ß7 / PRE4 (M) and ß6 / C5 and the unprocessed propeptide ß3 / PUP3 indicate that both effects occur because the propeptides are firmly bound to the rest of the protein and interact with other subunits, e.g. . B. Propeptide ß7 / PRE4 with ßl / PRE3 for residues 92 and 115 and propeptide ß6 / C5 with ß7 / PRE4 for 91 and 116.
  • the hydrolytic activity of the proteasome is associated with Thrl and the ß-ring surfaces in the interior of the ß-cavity defining the hydrolytic chamber.
  • the substrate must penetrate the particle and the product must be released.
  • two inlet openings with a diameter of approximately 1.3 nm are open at the ends of the cylindrical particles, which are delimited by an annular surface of kink-forming segments Tyrl26-Gly-Gly-Val of the seven identical Q; subunits.
  • N-terminal residues 1 to 12 are disordered in this protein.
  • openings are mainly between the tooth-like Helix Hl-Knick-Helix H2 motifs of the c-ß interface (see Figure 4a in Löwe et al. (1995), supra) and lead to the N-terminal threonine residues of the active center. They are covered with polar and charged amino acid side chains that can move to create openings about 1 nm in diameter and possibly allow the passage of unfolded, stretched polypeptide chains.
  • the 19S particle which causes the ATP and Ubitiquin dependence of proteolysis by the proteasome, is attached to the particle around the 26S
  • proteasome regulator PA28 is bound to ⁇ -type subunits (Kania et al. (1996), Euro. J. Biochem. 236, 510-516). It accelerates peptide cleavage and improves antigen processing. Both regulatory factors could open the inlets in a controlled manner in vivo.
  • the 2OS proteasome produces peptide products with a narrow length distribution, predominantly octa- or nonapeptides, a size range that is optimal for the binding of MHC class I molecules (York & Rock (1996), Annu. Rev. Immunol. 14, 369- 396).
  • MHC class I molecules York & Rock (1996), Annu. Rev. Immunol. 14, 369- 396.
  • peptides generated by 2OS proteasomes from intact proteins are presented by MHC class I molecules (Dick et al. (1994) Immunol. 152, 3884-3894; Niedermann et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8572-8577).
  • proteasome inhibitors inhibit the MHC class I presentation of protein antigens (Rock et al. (1994), Cell 78, 761-771) and that the number of MHC class I molecules present on the cell surface is regulated by the inducible proteasome units ß5i / LMP7 and ßli / LMP2, as has been shown in mice with targeted deletions of the genes coding for these proteins (Fehling et al. (1994 ) Science 265, 1234-1237). After IFN- ⁇ stimulation, LMP2 and LMP7 replace the constitutively expressed subunits.
  • MHC class I peptides usually have basic or hydrophobic C-terminal residues (see the review article by Engelhard (1994), Curr. Opin. Immunol. 6, 13-23).
  • the LMP2 / 7 substitution presumably changes the distribution of peptides so that a larger proportion of the peptides preferred by MHC class I molecules is generated.
  • LMP2 replaces Y, the human homologue of ßl / PRE3, LMP7 replaces X, the homologue of ß5 / PRE2. All members of this subfamily show a high degree of sequence identity, but ßli / LMP2 has two striking differences compared to ßl / PRE3 in the SI pocket: Thr31 ⁇ Phe and Arg45 ⁇ Leu.
  • the subunits ß7 / PRE4 and ß6 / C5 are partially processed at residues -8 and -9. This creates octa or nonapeptide products that are not from the Enzyme to be released. Both peptides have similar conformations with a thickening that divides two sections with an elongated conformation, which is similar to the conformation of MHC class I-bound peptides.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen einer aufgereinigten eukaryontischen kristallisierbaren Proteasomen-Präparation und die durch das Verfahren erhältliche Proteasomen-Präparation. Weiterhin betrifft die Erfindung eine aufgereinigte eukaryontische Proteasomen-Präparation in kristallisierter Form. Mit Hilfe der Kristalldaten aus dieser Proteasomen-Präparation können neue Proteasomen-Inhibitoren, insbesondere mit Hilfe von computergestützten Modelling-Programmen identifiziert und gewonnen werden.

Description

VERFAHREN ZUR REINIGUNG UND KRISTALLISIERUNG VON PROTEASOM
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen einer aufgereinigten eukaryontisehen kristallisierbaren Proteasomen-Präparation und die durch das Verfahren erhältliche Proteasomen- Präparation. Weiterhin betrifft die Erfindung eine aufgereinigte eukaryontisehen Proteasomen-Präparation in kristallisierter Form. Mit Hilfe der Kristalldaten aus dieser Proteasomen-Präparation können neue Proteasomen-Inhibitoren, insbesondere mit Hilfe von computergestützten ModeHing-Programmen identifiziert und gewonnen werden.
Das Proteasom ist das zentrale Enzym beim Proteinabbau sowohl im Cytosol als auch im Zellkern. Es ist an vielen biologischen Prozessen beteiligt, einschließlich der Entfernung abnormaler, fehlgefalteter oder falsch assemblierter Proteine, der Reaktion auf Stress (durch Prozessierung oder Abbau von Transkriptionsregulatoren) , der Zellzykluskontrolle (durch Abbau von Zyklinen) , der Zelldifferenzierung und metabolischen Adaption (durch Zerstörung von Transkriptionsfaktoren oder metaboli- sehen Enzymen) und der zellulären Immunreaktion (durch Erzeugung antigener Peptide, die von MHC Klasse I Molekülen präsentiert werden) . Für diese zellulären Funktionen, die auf einem Ubiquitin und ATP erfordernden Abbau von Proteinen beruhen, wird das 26S Proteasom benötigt, dessen Kern und proteo- lytisehe Kammer durch das 2OS Proteasom gebildet werden.
Das 2OS Proteasom aus dem Archaebakterium Thermoplasma aeido- philu wurde durch Röntgenstrukturkristallographie bei einer Auflösung von 0,34 nm analysiert. Es hat eine zylindrische Form mit einer Länge von 14,8 nm und einem maximalen bzw. minimalen Durchmesser von 11,3 nm bzw. 7,5 nm. Es besteht aus 28 Untereinheiten, die in einem Partikel als 4 homoheptamere Ringe al ßl ßloil mit D7 Symmetrie angeordnet sind (Löwe et al . , (1995), Science 268, 533-539). Im T. acidophilum Proteasom ist der N-terminale Threoninrest der ^-Untereinheiten die Bindestelle von inhibitorischen Peptidaldehyden und essentiell für 5 die hydrolytische Aktivität. Auch Stock et al . ((1996), Cur- rent Opinion in Biotechnology, 7: 376-385) beschreiben die Struktur und Funktion von T. acidophilum Proteasomen. Eine Übertragung von T. acidophilum-Daten auf eukaryontische Proteasomen ist nicht möglich, da die Homologie der Proteasomen o zwischen diesen Spezies zu gering ist.
Eukaryontische Proteasomen sind erheblich komplexer als das archaebakterielle Proteasom. So ist das 2OS Proteasom aus Sac- charomyces cerevisiae aus insgesamt sieben verschiedenen α-Typ 5 und sieben verschiedenen /3-Typ-Untereinheiten aufgebaut, die bereits kloniert und sequenziert wurden, vgl. z. B. Heinemeyer et al. (1994), Biochemistry 33, 12229-12237).
Die eukaryontisehen 20S Proteasomen, z. B. aus Hefe und aus 20 Säugern, sind hinsichtlich der Aminosäuresequenzen von Untereinheiten und ihrer durch Elektronenmikroskopie erkennbaren Grobstruktur sehr nahe verwandt. Die α-Typ und |ß-Typ Untereinheiten des Säuger 2OS Proteasoms bilden eine geordnete und wohldefinierte Struktur (Kopp et al . (1995), J. Mol. Biol . 25 248, 264-272). In Säugerzellen können drei zusätzliche nicht essentielle Untereinheiten des 20S Proteasoms, die als LMP2 , LMP7 und MECL1 bezeichnet werden, konstititutive Komponenten nach Induktion mit dem Cytokin Interferon γ ersetzen. Ihre Expression oder gezielte Deletion ändert die Peptidasespezifi- o tat des Proteasoms und die Expressionsstärke von MHC Klasse I Molekülen an der Zelloberfläche.
Hilt, Heinemeyer und Wolf ((1993), Enzyme Protein 47: 189-201) beschreiben den Aufbau von 2OS und 26S Hefeproteasomen sowie 35 die proteolytisehe Aktivität von ß-Typ-Untereinheiten. Ferner werden die unterschiedlichen Funktionsweisen von 2OS und 26S Proteasomen hinsichtlich des Stoffwechsels und der Differen- zierung einer Zelle diskutiert. Kristallographische Daten von eukaryontischen Proteasomen werden nicht beschrieben.
In der Veröffentlichung Rivett et al . (1994), Methods Enzymol . 244, 331-350) und den darin enthaltenen Zitaten sind bisher zur Aufreinigung von Proteasomen verwendete Ausgangsmaterialien, z. B. Gewebe und Zellen von Säugern, wie Maus, Ratte, Mensch oder Rind, anderen Tieren, Pflanzen und Hefe aufgelistet .
Auch in der Patentliteratur finden sich zahlreiche Dokumente, die Proteasomen betreffen. So wird beispielsweise die Herstellung von eukaryontischen Proteasomen in EP-A-03 45 750, JP-A- 05 292 964 und JP-A-06 022 759 beschrieben. Die dort offenbar- ten Proteasomen-Praparationen besitzen jedoch keine ausreichende Reinheit, um eine Kristallisierung zu ermöglichen.
Morimoto et al . ((1995), J. Biochem. 117, 471-474), Hwang et al. ((1994), Mol. Cells, Vol. 4, 273-275) und Perkins et al . ((1994), Journal of Struktural Biology 113, 124-134) beschreiben die Kristallisierung von eukaryontischen Proteasomen. Aufgrund der geringen Reinheit der Proteasomen-Pr parationen werden lediglich Auflösungen von 0,44 nm, > ca. 5,0 nm bzw. 1,5 nm erreicht, so daß eine Strukturbestimmung oder ein Mole- cular Modelling mit diesen Proteasomen-Praparationen nicht möglich ist.
Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von Proteasomenunterein- heiten werden beispielsweise in den japanischen Anmeldungen JP-A-04 077 497, JP-A-04 077 498, JP-A-04 117 283, JP-A-05 317 059, JP-A-07 255 476, JP-A-08 116 972, JP-A-08 205 871 und JP- A-08 217 796 sowie im japanischen Patent 40 51 896 beschrieben.
Inhibitoren für das Proteasom sind beispielsweise in JP-A-05 000 968, WO 92/20 804, WO 94/17 816, WO 95/24 914, WO 95/25 533, WO 96/13 266, WO 96/32 105 (Lactacystinanaloga) und US-A- 55 80 854 (Peptidaldehydinhibitoren) beschrieben.
Klafky et al . ((1995), Neuroscience Letters 201, 29-32) unter- suchen die Wirkung des Proteasominhibitors Calpain Inhibtor 1 auf die Sekretion von ß-Amyloid-Peptid, das durch Spaltung des ß-Amyloid-Precursor-Proteins (APP) entsteht, und das als ein Auslöser der Alzheimer Krankheit diskutiert wird. Proteasom- Strukturdaten sind in dieser Publikation nicht enthalten.
Fenteany et al . ((1995), Science, Vol. 268, 726-731) beschreiben den Streptomyces Metaboliten Lactacystin als Zellzyklusin- hibitor und Induktor für Neuritenauswachsen einer Maus Neuro- blastomazellinie . Als spezifisches zelluläres Ziel dieses Inhibitors wurde das 2OS Proteasom mittels Tritzium-markiertem Lactacystin identifiziert. Eine kristallisierbare Protesaomen- Präparation wird nicht beschrieben.
WO 91/13904 beschreibt die Identizifierung und Charakterisie- rung einer Chymotrypsin-ähnlichen Protease, die als multikata- lytische Protease vorliegt sowie deren Verwendung zur Behandlung der Alzheimer Krankheit. Die Verwendung von für Chymo- trypsin-Aktivität-spezifischen Substraten zum Testen oder Sceenen von Inhibitoren wie hierin beschrieben, führt ausschließlich zur Identifizierung von Inhibitoren, die spezifisch für eine Chymotrypsin-ähnliche Aktivität sind.
Somit wird ersichtlich, daß ein großes Bedürfnis nach weiteren Erkenntnissen über Proteasomen, insbesondere hinsichtlich deren genauen Struktur besteht, um die Herstellung von neuen Proteasomeninhibitoren auf rationale Weise zu ermöglichen. Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren bereitzustellen, das die Kristallisierung euka- ryontischer Proteasomenpräparationen ermöglicht, so daß mit Hilfe der Kristallstruktur die Entwicklung neuer Inhibitoren vereinfacht wird. Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Gewinnen einer aufgereinigten eukaryontischen Proteasomen- präparation, umfassend die Schritte:
(a) Herstellung eines Rohextrakts durch Aufschluß von eukaryontischen Zellen,
(b) Abtrennung unlöslicher Bestandteile aus dem Rohextrakt,
(c) chromatographische Auftrennung in Fraktionen über ein Ionenaustauschermedium, z. B. Q- Sepharose, (d) Testen der in Schritt (c) erhaltenen Fraktionen und Sammeln der aktiven Fraktionen,
(e) chromatographische Auftrennung über Hydroxyapatit ,
(f) Testen der in Schritt (e) erhaltenen Fraktionen und Sammeln der aktiven Fraktionen, (g) Konzentrierung der vereinigten Fraktionen,
(h) chromatographische Auftrennung über ein Gelfiltrationsmedium in einem Molekulargewichtsbereich von 5 kD bis 5 MD, z. B. Superose und (i) Testen der in Schritt (h) erhaltenen Fraktionen und Sammeln der aktiven Fraktionen.
Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren können beliebige eukaryontische Zellen eingesetzt werden, z. B. Tierzellen, Pflanzenzellen oder Pilzzellen wie etwa Hefezellen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Hefezellen, z. B. Saccharomyces cerevisiae.
Das Testen der Fraktionen während des Anreicherungsprozesses erfolgt üblicherweise durch Bestimmung der für Proteasomen typischen proteolytischen Aktivität. Als Substrate können hierbei beispielsweise bekannte chromogene Peptide eingesetzt werden. Vorzugsweise erfolgt das Testen der Fraktionen derart, daß man jeweils zwei parallele Bestimmungen der proteolytischen Aktivität durchführt, wobei die eine in Abwesenheit und die andere in Gegenwart eines Proteasomeninhibitors, z. B. Lactacystin, durchgeführt wird. Diese Art des Testens erlaubt eine eindeutige Unterscheidung der Proteasomen enthaltenden Fraktionen von anderen Fraktionen mit proteolytischer Aktivität.
Die Durchführung der Anreicherung umfaßt drei chromatogra- phische Trennschritte (c) , (e) und (h) , von denen mindestens einer in einem FPLC-System durchgeführt werden kann, z. B. Schritt (h) .
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine aufgereinigte Proteasomen-Präparation erhalten, die in einer ausreichenden Menge und Reinheit vorliegt, so daß eine nachfolgende Kristallisierung ermöglicht wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine aufgereinigte eukaryontische Proteasomenpraparation, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist. Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine aufgereinigte eukaryontische Proteasomen-Präparation in kristallisierbarer Form. Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine aufgereinigte kristallisierte eukaryontische Proteasomen-Präparation.
Die kristallisierte Proteasomen-Präparation kann auch einen Proteasomen- Inhibitor enthalten. Beispiele für geeignete be- kannt Proteasomen-Inhibitoren sind Lactacystin oder Analoga davon bzw. Tripeptid-Aldehyde wie Calpaininhibitor .
Die erfindungsgemäße eukaryontische Proteasomen-Präparation umfaßt ein 2OS Proteasom, d. h. einen Komplex aus 28 Unterein- heiten, der jeweils 2 Moleküle von sieben verschiedenen o;-Typ- Untereinheiten und sieben verschiedenen /3-Typ-Untereinheiten enthält. Darüber hinaus kann der Komplex noch Metallionen, z. B. Magnesium, Lösungsmittelmoleküle, z. B. Wasser, und andere Polypeptidkomponenten enthalten.
Die erfindungsgemäße aufgereinigte eukaryontische Proteasomenpraparation kann zur Identifizierung und Gewinnung neuer Pro- teasomen- Inhibitoren eingesetzt werden. Dabei werden insbesondere Daten aus der Kristallstruktur von kristallisierten eukaryontischen Proteasomen-Praparationen eingesetzt. Die Identifizierung und Gewinnung neuer Proteasomen-Inhibitoren erfolgt vorzugsweise in einem computergestützten Modellingprogramm.
Beispielsweise kann das Inhibitordesign durch visuelle Inspektion graphischer Darstellungen der Struktur erfolgen und zwar insbesondere (a) durch Bestimmung der für Liganden zugänglichen Volumina an aktiven Stellen, z. b. mit Hilfe der Programme
INSIGHT, SYBYL, QUANTA, FRODO, 0 etc.,
(b) durch Bestimmung von idealen Ligandeneigenschaften hin- sichtlich Hydrophobizität oder Wasserstoffbrückenbindungen, z. B. mit Hilfe der Programme LUDI, GRID etc. oder/und
(c) durch Bestimmung der elektronischen Eigenschaften von für Liganden zugänglichen Oberflächen an den aktiven Stellen, z. B. mit Hilfe des Programms GRASP etc.
Alternativ oder zusätzlich können Liganden durch automatisierte Ligandenfragment-Andock- oder Anpassprozeduren, z. B. mit Hilfe der Programme DOCK, LUDI, LEAPFROG etc. ermittelt werden .
Besonders bevorzugt werden für diesen Zweck die Kristalldaten der Proteasomuntereinheiten vom 3-Typ, insbesondere der Pro- teasom-Untereinheiten jß5/PRE2, /31/PRE3 oder/und /32/PUP1 bzw. homologer Untereinheiten aus anderen eukaryontischen Proteasomen sowie benachbarte Untereinheiten davon, z. B. 34/C11 oder/und /37/PRE4 verwendet.
Für das Design von Inhibitoren des humanen Proteasoms können die erfindungsgemäßen Kristallstrukturdaten des Hefeproteasoms mit bekannten Aminosäuresequenzen des humanen Proteasoms durch Homologiemodelling modifiziert werden. Ein solches Homologie- modelling kann durch molekulare Grafikprogramme wie etwa 0, INSIGHT, FR0D0, etc. durchgeführt werden. Insbesondere erfaßt die vorliegende Erfindung ein Homologiemodelling der homologen aktiven Stellen der aktiven Monomere im allgemeinen und insbesondere zum Zwecke des Inhibitordesigns. In Figur 1 ist die Homologie der Aminosäuresequenzen des Hefeproteasoms und des humanen Proteasoms in den relevanten Bereichen gezeigt .
Weiterhin soll die Erfindung durch nachfolgenden Beispiele und Figuren erläutert werden. Es zeigen:
Figur 1 die Homologie zwischen den für die aktiven Untereinheiten des Proteasoms kodierenden A ino- säuresequenzen aus Hefe und Mensch; die ßl/PRE3, S2/PUP1, ß5/PRE2 Subfamilien sind gelb, grün bzw. blau dargestellt; die Reste der Sl-Tasche, welche die Spezifitätsänderungen der PRE3 Subfamilie nach Substitution der humanen Untereinheit Y durch LMP2 nach Cytokininduktion beeinflussen, sind braun gezeichnet;
Figur 2 die Topologie der 28 Untereinheiten des 2OS
Proteasoms, gezeichnet als Kugeln,
Figur 3 die Cα-Kettenpositionen der Untereinheiten iS7/PRE4, jS6/C5, ?1'/PRE3, 32'/PTJPl und /33'/PUP3, in denen die -cis und jß-trans-ß- Wechselwirkungen durch Kontakte von Insertions- Segmenten hervorgehoben sind,
Figur 4a bis b Elektronendichtekarten (Konturiert ab 1 σ) in ähnlichen Orientierungen um THR1 mit zwei F0-Fc-
Coeffizienten nach zweifacher Mittlung; die roten Modellteile wurden über die Phasengebung weggelassen. ß5/PRE2 mit dem kovalent gebundenem Lactacystin (LACT) und dem Wassermolekül NUK (a) und ß7/Pre4 mit einem Teil eines Pro- peptids (b) ,
Figur 5 ein Schema der vorgeschlagenen chemischen Schritte von Autolyse und Substrathydrolyse.
Erzeugung eines Prozessierungsintermediats durch Hydrolyse an der "sauren" ß-Ringflache (A) . Erzeugung der vollständig prozessierten aktiven Untereinheit über ein Acyl -Enzym (B) und dessen Hydrolyse (C) . Michaelis-Komplex eines Substratpolypeptids (D) . Spaltung an der ß-Ringfläche und Bildung mit Peptidspaltung assoziierten Acyl -Enzyms (E) . Acyl -Enzym-Hydrolyse und Freisetzung des Octapeptidprodukts (F) .
Figur 6a bis c die Bindung des Calpaininhibitors und die Sl
Taschen, ßl/PRE3 ist in Grau mit den Pl kontaktierenden Resten in Rot dargestellt; ß2/PUPl ist in Grün und der Inhibitor in Blau (a) dargestellt; ß2/PUPl (b) , ß5/PRE2 (c) mit analogen Farbgebungen;
Figur 7 die untere Hälfte der ß-ß-Kammer. Die Hauptkette mit roten Kreisen für die Carbonyl- sauerstoffe ist für die C-terminalen Abschnitte der Helices H2 der sieben ß-Typ Untereinheiten, die die ß-Ringfläche definieren, angegeben. Die intermediär prozessierten und die unpro- zessierten Propeptide der Untereinheiten ß6/C5, ß7/PRE4, ß3/PUPl und ß4/Cll (grün) und der Cal- paininhibitor (gelb) gebunden an ßl/PRE3, ß2/PUPl und ß5/PRE2 sind gezeigt. Zwei Magnesiumionen, die nahe der ß-Ringfläche loka- lisiert sind, sind als silberne Kreise gezeichnet ; und Figur 8 eine Oberflächenansicht des Proteasomenmole- küls, geschnitten längs der Zylinderachse. Drei der sechs Calpaininhibitormoleküle, gebunden an ßl/PRE3, ß2/PUPl und ß5/PRE2 sind als raumfüllende Modelle in rot dargestellt. Die abgedichteten α-Öffnungen an beiden Enden des Partikels, einige wenige schmale Seitenfenster und die scharf abgeschnittenen inneren ß-Ring- flachen sind zu erkennen. 0
Beispiele
Beispiel 1 Proteinpräparation und Charakterisierung
5 Hefezellen von Saccharomyces cerevisiae (Hefe-Mayr, München, Deutschland) wurden zweimal mit eiskaltem Wasser gewaschen und in Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM NaN3) in einem Gewichtsverhältnis Zellen zu Puffer von 2:3 suspendiert. Die Zellen wurden für 10 Min in einer Mühle (Biomatik, 0 Deutschland) mit Glaskugeln (Durchmesser: 0,5 mm; Volumenverhältnis Glaskugeln zu Zellsuspension: 3:2) desintegriert. Das Aufbrechen der Zellen wurde mikroskopisch überwacht.
Nach Filtration wurde der Rohextrakt für 10 min bei 10.000 x g 25 in einer Sorvall RC 2B Zentrifuge abzentrifugiert. Der Überstand wurde erneut 45 min bei 134.000 x g in einem Ti-55,2 Rotor (Beckmann) zentrifugiert . Die Lipide aus der obersten Schicht wurden sorgfältig entfernt und die verbleibenden gelben Lösungen vereinigt. Die Proteinkonzentrationen waren etwa 30 50 mg/ml.
Unmittelbar nach der Zentrifugation wurde der Extrakt auf eine Q-Sepharosesäule (5 x 20 cm) aufgebracht, die mit 280 mM NaCl in Puffer A äquilibriert war. Die Säule wurde mit 280 mM NaCl 35 in Puffer A gewaschen, die Proteine wurden mit einem Gradienten von 280 bis 800 mM NaCl eluiert . Die Durchflußrate war 120 ml/h und es wurden 12 ml Fraktionen gesammelt. Das Protea- som wurde bei 400 - 450 mM NaCl eluiert . In allen Fraktionen wurden Chymotrypsin-artige (CL) , Peptidylglutamyl-Peptid-hy- drolase (PGPH) und Trypsin-artige (TL) enzymatische Aktivitäten gemessen.
Um das 20S Proteasom zu erhalten, wurde von allen aktiven Fraktionen in Gegenwart von Lactacystin erneut die CL-Aktivi- tät gemessen und die Fraktionen mit verringerten Aktivität wurden gesammelt. Die vereinigten Fraktionen wurden dreifach mit Wasser verdünnt und auf eine Hydroxyapatitsäule (3 x 10 cm) aufgetragen, die mit 60 mM Kaliumphosphat, pH 7,5 äquilibriert war. Die Säule wurde mit 60 mM Kaliumphosphat pH 7,5 gewaschen und mit einem Gradienten von 60-300 mM Kaliumphosphat eluiert wird. Die Durchflußrate war 60 ml/h. Es wur- den 12 ml Fraktionen gesammelt. Die CL- , PGPH- und TL- Aktivität wurde in allen Fraktionen gemessen und die aktiven Fraktionen wurden vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen wurden zwanzigfach durch Ultrafil- tration unter Verwendung einer AMICON YM30 Membran konzentriert und das Konzentrat wurde auf eine Superose 6 Säule (1 x 30 cm) äquilibriert mit Puffer A aufgetragen. Die Elution wurde mit einer Durchflußrate von 18 ml/h in Puffer A durchgeführt. Das Proteasom eluierte nach 37 min. Aus 500 g Hefezellen konnten auf diese Weise 50 mg kristallisierbares Protein erhalten werden.
Alle präparativen Schritte mit Ausnahme der FPLC wurden bei 4°C ausgeführt. Die chromogenen Peptidsubstrate wurden in Dimethylsulfoxid bei einer Konzentration von 1 mM gelöst. Die proteolytisehe Aktivität gegen diese Substrate wurde gemäß
Achtstetter et al . (1994), J. Biol . Chem. 259, 13344-13348, bestimmt. Die chromogenen Peptidsubstrate wurden von Bachern
(Bubendorf, Schweiz) bezogen. Q-Sepharose und Hydroxyapatit stammten von Sigma und BioRad. Die FPLC Vorrichtung, die Mo- noQ- und Superose 6 Säule stammten von Pharmacia (Freiburg, Deutschland) , alle anderen Chemikalien wurden in der höchst möglichen Reinheit von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen.
Beispiel 2 Kristallisierung
Die Kristalle wurden in Hängetropfen bei 24 °C gezüchtet . Die Proteinkonzentration, die zur Kristallisation verwendet wurde, war 40 mg/ml in 10 mM Tris/HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA. Die Tropfen bestanden aus 4 μl der Proteinlösung und 2 μl einer Reservoirlösung, die 40 mM Magnesiumacetat , 0,1 M Morpholino- ethansulfonsäure (pH 6,5) und 12 % 2 , 4-Methylpentandiol enthielt. Die den Inhibitor Lactacystin enthaltenden Kristalle wurden durch Eintauchen in eine 1 mM Lactacystinlösung für 6 h hergestellt. Die den Inhibitor Acetyl-Leu-Leu-Norleucin (Cal- 5 pain Inhibitor I, Boehringer Mannheim) enthaltenden Kristalle wurden durch Eintauchen in eine 5 mM Calpainlösung für 6 h hergestellt. Die kristallographischen Daten sind in Tabelle 1 angegeben .
o Beispiel 3 Kristallographie
Die Kristalle waren sehr gut geordnet und zeigten nur eine leichte Anisotropie. Somit wurde eine Auflösung von 0,24 nm möglich. Die Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal-inhibierten Kristalle 5 hatten eine etwas verringerte Ordnung.
Die Anisotropie der Diffraktion wurde unter Verwendung der gefundenen Strukturfaktoramplituden mit solchen korrigiert, wie sie aus einem Modell mit isotropen Temperaturfaktoren 0 unter Verwendung von XPLOR (Bruenger, 1992) berechnet wurden. Die Datensätze wurden bei der BW6-Beamline am DESY Hamburg mit einer Synchrotronstrahlung von λ = 0,11 nm erhalten. Die Kristalle wurden in einen Gefrierschutzpuffer (30 % MPD, 28 mM Magnesiumacetat, 0,1 M Morpholinoethansulfonsäure, pH 6,9) 5 eingetaucht und in einem Strom von 90 °K kaltem Stickstoffgas gefroren. Die Diffraktionsdaten wurden mit einer 300 mm Mar Forschungs-Imagingplatte in einer Entfernung von 275 mm (LACT) oder 280 mm (CAL) gesammelt. Die Bestimmung von Röntgeninten- sitäten erfolgte mit dem MOSFLM Computerprogramm Version 5.3 und die Datenreduktion wurde mit CCP4 durchgeführt (Leslie (1992), Acta Cryst . D50, 760-763; Joint CCP4 and ESF-EACMB, s Newslett. Protein Crystallogr. (Daresburg Laboratory Warington UK 26; Collaborative Computational Project Number 4 (1994).
Eine bei 0,5 nm Auflösung berechnete Rotationsfunktion zeigte zwei mit der Kristallsymmetrie in Beziehung stehende Peaks, o die auf das Vorhandensein von lokalen diadischen Molekülachsen bei ψ 86° φ 90° und ψ 94° φ 90° hinwiesen. Ihre Korrelationswerte waren die Hälfte des Wertes einer kristallographi- schen Diade, wie sie für eine fast ideale molekulare zweifache Symmetrie zu erwarten war. Das T. acidophilum Modell wurde für 5 die Patterson Suchkalkulationen unter Verwendung von AMoRe (Navaza (1994), Acta Cryst. A50, 157-163) bei einer Auflösung von 0,35 nm eingesetzt. Diese zeigten, wenn man die D7 Symmetrie des Untersuchungsmodells in Betracht zog, eine einzige Lösung mit einem Korrelationswert von 0,32 und einem R-Faktor 0 von 56 % verglichen mit dem nächsthöchsten Peak von 0,28 und 57 %.
Das T. acidophilum Modell wurde auf Polyalanin reduziert mit nur einigen wenigen konservierten Resten, die in der α-Typ 5 Untereinheit verblieben. Dieses Modell ergab einen R-Faktor von 57,7 % und wurde zur Berechnung einer 2F0-FC Karte bei 0,24 nm mit X-PLOR (Bruenger (1992), X-PLOR Version 3.1. A System for X-Ray Crystallography and NMR) verwendet. Die elektronische Dichte wurde im Realraum mit MAIN (Turk (1992) , Disser-
30 tation, Technische Universität München) unter Verwendung der lokalen Zweifachachse im gegenwärtigen Modell (^=85,1, φ=90,8, κ=180,l) gemittelt, rücktransformiert, und eine neue Dichte wurde mit 2F0-FC Koeffizienten berechnet. Nach 10 Abgleichungs- zyklen war die Qualität der Karte gut (Rback=27,3 %) . Die ein-
35 zelnen Untereinheiten wurden entsprechend ihrer charakteristischen Insertionen, Deletionen und Aminosäuresequenzen identifiziert und wurden in die Karte auf einer ESV-30 Graphiksystem Arbeitsstation (Evans &• Sutherland, Salt Lake City, Utah) unter Verwendung von FRODO (Jones (1978), J. Appl . Cryst. 11, 268-272) eingebaut. Eine kristallographische Verfeinerung erfolgte mit X-PLOR (Bruenger, 1992) mit energetisch und zwei- fach nicht-kristallographischen Symmetriebeschränkungen unter Verwendung der von Engh und Huber (1991), Acta Cryst. A 47, 392 - 400, beschriebenen Parameter. Zusätzlich wurde zur Korrektur für eine anisotrope Kristallordnung ein Streuungsbeitrag für das Lösungsmittel berechnet und während der Verfeine- rung in die Berechnung des Modells einbezogen.
Das fertige Modell berücksichtigte die Inhibitormoleküle Lactacystin und Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal , 18 Magnesiumionen, bzw. 1.800 Wassermoleküle. Die R-Werte sind zufriedenstellend und die Standardgeometrie der Bindungen und Winkel hervorragend. Die lokale molekulare diadische Symmetrie ist gut konserviert, was auch durch den sehr geringen Wert RbaCk 13 % in der Endstufe der Analyse gezeigt wird. Der Anstieg im R-Wert um 3 % für Daten mit einer Auflösung von 0,28 nm gegenüber 0,24 nm ist eine Folge der anisotropen Kristallordnung, welche die Datenqualität beeinträchtigt, und der beschränkten Einbeziehung geordneter Lösungsmittelmoleküle.
Beispiel 4 Charakterisierung der Struktur 4.1 Struktur von Untereinheiten
Die 14 aus Hefe klonierten Gene, die für Komponenten des 2 OS Proteasoms kodieren, können in sieben o;-Typ und sieben ß-Typ- Untereinheiten eingeteilt werden.
Die /3-Typ Untereinheiten werden als Prekursoren synthetisiert, die zu den im assemblierten Proteasom vorliegenden reifen Formen prozessiert werden. Die reifen 3-Typ Polypeptide 32/PUP1, ß5/PRE2 und 31/PRE3 werden aus ihren Proformen durch Spaltung zwischen Gly-1 und Thrl unter Freisetzung der aktiven Stelle Thrl erhalten, während /37/PRE4 zwischen Asn-9 und Thr-8 und /36/C5 zwischen His-10 und Gin- 9 gespalten werden und als sta- bile Prozessierungsintermediate vorliegen. /34/C11 und 33/PUP3 werden nicht prozessiert und beginnen mit Met(-l) bzw. Met(- 9) . Die Untereinheiten PUP1, PRE2 und PRE3 werden als vollständig prozessiert, die Untereinheiten PRE4 und C5 als teil- weise prozessiert und die Untereinheiten Cll und PUP3 als unprozessiert bezeichnet.
Alle 14 Untereinheiten liegen in der kristallinen molekularen Struktur an eindeutigen Positionen vor. Sie sind fast voll- ständig definiert durch die Elektronendichte abgesehen von einigen Kettentermini und langen Insertionssegmenten.
Die Elektronendichte für die Hauptketten ist in den α-Typ-Un- tereinheiten wie folgt definiert: α2/Y7: Thr5-Leu236, o;3/Y13 : Gly4-Gly237, α4/PRE6: Tyr8- Gln244, α5/PUP2 : ArglO- Glu243 (7 Reste der Insertion sind nicht definiert - Glyl2 bis Arg 126) , c6/PRE5: Phe4 - Ile233, α7/Cl : Gly5 - Asn241, o;l/C7 : Gly6 - Asp240.
In den 3-Typ-Untereinheiten ist die Elektronendichte wie folgt definiert: 33/PUP3 : Ser-8-Asp 193, ,ß6/C5: Gln-9-Asp 193, ßA/ Cll: Met-1-Glnl92, S7/PRE4 : Thr-8-Ile211 , /32/PUP1: Thrl- Cys221, 31/PRE3: Thrl-Leul96, /35/PRE2 : Thrl-Gly211.
Alle sieben a- und /3-Typ-Polypeptide haben eine charakteristische ß-Sandwich-Struktur . Sie ist gebildet aus zwei fünf- strängigen antiparallelen /S-Faltblattstrukturen mit den dar- überliegenden helicalen Schichten aus den Helices H3 , H4 , H5 und den darunterliegenden Helices Hl und H2 gebildet ist. Sie unterscheiden sich aber in den Knicken, die um eine oder zwei Aminosäurereste in der Länge variieren, in langen Insertionen, die Sekundärstrukturelemente verbinden, sowie in den N-termi- nalen und insbesondere in den C-terminalen Regionen.
Bei den α-Typ-Untereinheiten hat α2/Y7 eine lange Insertions- schleife zwischen den Strängen S9 und S10, die aus einer kurzen α-Helix und einem /3-Strang aufgebaut ist. αl/C7 weist eine Verlängerung der Helix H3 um zwei Knicke durch die Insertion bei G180 auf. Die Untereinheiten αl/C7, α3/Y13, o;4/PRE6, α5/PUP2 und al/Cl haben längere C-terminale Helices H5 , die aus der Teilchenoberfläche in die Lösung hervorstehen. Die hoch geladenen, meist sauren C-terminalen Segmente sind unstrukturiert .
Bei den /δ-Typ-Untereinheiten mit langen Insertionen hat /37/PRE4 einen deutlichen Knick zwischen den Helices Hl und H2 und eine zusätzliche cü-Helix mit 2 Knicken bei Rest 145. ß6/C5 hat eine Insertion von 17 Resten zwischen H3 und H4 mit einer komplexen Faltung und einer kurzen Helix. ß2/PUPl hat eine sehr lange C-terminale Extension, die in ihren letzten 11 Resten stark ungeordnet ist. Die Untereinheiten ß3/PUP3 und ß6/C5 haben kurze C-Termini, so daß die Helices H5 nicht existieren, und die Stränge S10 verlängert sind, um das ß-Falt- blatt zu vergrößern. In /34/C11 existiert die Helix H5 , ist aber um 2 Knicke kürzer als bei T. acidophilum.
Viele dieser Untereinheit-spezifischen Knicke, Insertionen und N- und C-Termini sind an Kontakten zwischen Untereinheiten beteiligt, wie im folgenden diskutiert wird.
4.2 Der (C7, Y7 , Y13 , PRE6 , PUP2 , PRE5 , Cl ; PRE3 , PUP1 , PUP3, Cll. PRE2, C5 , PRE4) .Komplex
Jede der sieben o;-Typ-Untereinheiten hat zwei Nachbarn innerhalb des heptameren Rings, die o;-cis-Wechselwirkungen aufweisen, und eine oder zwei in Nachbarschaft liegende ß-Typ-Unter- einheiten im anderen Ring mit α;-trans-/S- echselWirkungen. Die zentral lokalisierten ß-Typ-Untereinheiten haben zusätzlich zu den jß-cis und ß-trans-α;-Wechselwirkungen eine oder zwei in Nachbarschaft liegende ß-Typ Untereinheiten im anderen ß-Ring mit ß-trans-ß-Wechselwirkungen.
Die generelle Architektur der Quartärstruktur ist im Proteasom von T. acidophilum und Hefe gleich (Fig. 2): Das N-terminale Schleifensegment, Helix HO (Reste 20 bis 30) , Schleife L, die H2 und S5 verbindende Schleife und der Strang S7 vermitteln α- cis-Wechselwirkungen. Die ß-cis-Kontakte, die weniger eng zu sein scheinen, umfassen die Schleife L, das N-Ende der Helix Hl, den Strang S7 und den den Strang S8 und die Helix H3 verbindenden Knick. Diese Kontakte stammen aus dem D7-symmetrischen Vorläufer und finden sich auch im T. acidophilum Proteasom. Trotz der konservierten Architektur sind diese Kontakte aufgrund ihrer spezifischen Aminosäuresequenzen für die jewei- ligen Untereinheiten spezifisch.
Es gibt viele zusätzliche Kontakte, die in T. acidophilum fehlen, und durch Sequenzen und Sequenzinsertionen bewirkt werden, die für Hefe und Eukaryonten im allgemeinen charakteri- stisch sind. Innerhalb der ce-Ringe werden enge α-cis-Kontakte durch die verschlungenen N-Termini der Untereinheiten al/Cl , cx2/Yl , QJ3/Y13 und al/Cl im Zentrum des heptameren Rings hergestellt. Das in allen Untereinheiten konservierte Tyr8 spielt eine zentrale Rolle. Innerhalb der ß-Ringe existiert ein sehr spezifischer Kontakt zwischen ß2/PUPl und ß3/PUP3, der durch den langen C-terminalen Arm von PUP1 vermittelt wird, der PUP3 umfaßt und fast den übernächsten Nachbarn ß4/Cll berührt, ß- trans-α-Kontakte erfolgen durch die Helix Hl-Schleife-Helix H2 Motive, welche mit den gleichen Motiven von zwei benachbarten α-Untereinheiten wechselwirken. Dieses grundlegende Kontaktmotiv war auch in der T. acidophilum Struktur zu sehen (siehe Figur 4a bei Löwe et al . (1995) , Science 268, 3479-3486), aber die Insertion bei Rest 66 von ß7/PRE4 begünstigt dessen Assoziierung mit c6/PRE5 und al/Cl . In ähnlicher Weise bindet die lange Insertion in a2/Yl bei Rest 210 zwischen den Strängen S9 und S10 an ß2/PUPl und koppelt dieses Paar. Spezifische ß- trans-ß-Wechselwirkungen werden durch den C-terminalen Arm von ß7/PRE4 gebildet, der zwischen ß2'/P Pl und ßl'/PRE3 eingelagert ist. Das C-terminale Segment von ß5/PRE2 wechselwirkt mit ß3'/PUP3 und ß4'/Cll auf ähnliche Weise (Figur 3). Die lange Insertion von ß6/C5 am Rest 145 kontaktiert Untereinheit ß3'/PTJP3 und den C-terminalen Arm von ß2'/PUPl. Sehr spezifische ß-trans-ß-Wechselwirkungen werden durch Magnesiumionen vermittelt: Magnesium Y8 verbrückt das Hauptket- tencarboxylat von Aspl93 aus ß6/C5 mit der Schleife 162 bis 167 von ß2'/PUPl. Auf gleiche Weise verbrückt das Magnesium Y9 die Untereinheit ß3/PUP3 über Aspl93 mit ß5'/PRE3. Darüber hinaus sind diese Carboxylatgruppen Liganden für andere Magnesiumionen, die in den Schleifen 165 von ß4/PUP3 (Magnesium W6) bzw. ß6/C5 (Magnesium W4) lokalisiert sind und die eine Rolle in der Stabilisierung der Untereinheitenstruktur spielen kön- nen. Die Aspartatreste sind vollständig verdeckt und ihre Seitenketten an Ladung-Ladung-Wechselwirkungen mit Arg 19 von ß2'/PUPl bzw. Arg 19 von ß5'/PRE2 beteiligt, wodurch die ß- trans-ß-Kontakte weiter verstärkt werden. Die ß-Typ Untereinheiten ßl/PRE3 und ß4/Cll liegen an der einzigen Moleküldiade 5 des Hefeproteasoms und sind sehr ähnlich dem dominanten ß- trans-ß-Kontakt an den Resten 133-137 der Helix H3 von T. acidophilum.
18 Magnesiumpositionen wurden im Proteasommolekül identifi- o ziert, von denen 12 auf den Innenwänden der ß-ß-Kammer lokalisiert sind und die im Folgenden diskutierte saure Natur dieses Kompartments belegen. Es ist erkennbar, daß die Vielzahl spezifischer Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten deren spezifische und eindeutige Positionen innerhalb des Proteasoms 5 bestimmt.
4.3 Die N-terminale Threoninposition
Im T. acidophilum Proteasom wurde durch Struktur- und Muta- 0 tionsuntersuchungen ein katalytisches System mit Thrl, Glul7 und Lys33 definiert (Löwe et al . (1995), supra und Seemüller et al. (1995), Science 268, 579-582).
Nahe an Thr 1 befinden sich die Reste Serl29, Serl69 und 5 Aspl66, die für die strukturelle Integrität dieser Stelle erforderlich sind, aber auch an der Katalyse beteiligt sein könnten. Durch Mutagenese wurde gezeigt, daß Aspl66 im Protea- som von T. acidophilum essentiell ist (Seemüller et al . (1996), Nature 382, 468-470). Diese Reste sind in den aktiven Untereinheiten PUP1, PRE2 und PRE3 invariant.
Zusätzlich wurde ein vollständig gebundenes Lösungsmittelmolekül NUK in allen drei Untereinheiten nahe bei ThrlOΥ und N, Serl290γ und N und Gly47N gefunden, wie exemplarisch für die Untereinheit ß5/PRE2 im Lactacystin-Komplex (Figur 4) gezeigt ist. Dies wurde bei einer geringeren Auflösung im Modell von T. acidophilum nicht erkannt. ThrlN hat Wasserstoffbrücken zu Serl680 und Oγ und Serl290v. ThrlO7 hat eine Wasserstoffbrücke zu Lys33r. Aspl7 hat Wasserstoffbrücken über Oδl zu Argl9N und Glyl70N und über 002 zu Thr/Ser2N und Lys33Nf. Auf ähnliche Weise hat Lys33Nr drei Wasserstoffbrücken zu Aspl70δ2, Argl90 und ThrlOγ.
Das Muster von Wasserstoffbrücken läßt vermuten, daß sowohl Aspl7 als auch Lys33 geladen sind. ThrlN kann eine Wasserstoffbrücke zu ThrO7 ausbilden und ist vermutlich neutral, ein Zustand der durch einen nahegelegenen positiv geladenen Lysin- rest begünstigt wird. Eine solche Ladungsverteilung wäre auch aufgrund der jeweiligen Standard-pKa-Werte zu erwarten. ThrlN ist daher höchswahrscheinlich der Protonenakzeptor, wenn ThrlO7 an einem elektrophilem Zentrum beteiligt ist. Dies wird durch die Struktur des Lactacystinkomplexes bestätigt, der einen Ester zwischen Lactacystin und Thrl als Ergebnis einer ß-Lac- ton-Ringöffnung nach einem nukleophilen Angriff durch ThrlO1 aufweist. ThrlN ist genau an der Position, um als Protonenshuttle von ThrlOΥ zum Lactacystin-06 ' zu dienen. Eine analoge Reaktionssequenz wird für die Hydrolyse des C-terminalen Fluo- rophoren von fluorogenen Substraten vorgeschlagen, wobei der Protonentransfer im Amidstickstoff der Abgangsgruppe erfolgt. Das erzeugte Acyl-Enzy wird, wie in den Abschnitten D-E von Figur 5 gezeigt, durch das Wasser NUK deacyliert. Alternativ oder parallel könnte ein direkter Angriff von NUK auf die Peptidbindung erfolgen, wobei das Intermediat I umgangen wird. 4.4 Inhibitorbindung
S3/PUP1, ßl/PRE3 und ß5/PRE2 haben den Inhibitor Acetyl-Leu- Leu-Norleucinal kovalent an ThrlOγ vermutlich als Hemiacetal gebunden. Er nimmt eine ß-Konformation an und füllt die Lücke zwischen Strängen, welche die Reste 20 und 21 bzw. 47 enthalten (der Schleife L in Figur 3 bei Löwe et al . , 1995, supra, zugeordnet), an die er über Wasserstoffbrücken gebunden ist, wodurch eine antiparallele ß-Faltblattstruktur erzeugt wird. Die Norleucinseitenkette reicht in eine Tasche (die Sl Tasche) hinein, die seitlich zu einem Tunnel hin offen ist, der zur Partikeloberfläche führt. Die Leucinseitenkette bei P2 ist nicht in Kontakt mit Protein und die Leucinseitenkette bei P3 ist in Kontakt mit der benachbarten ß-Untereinheit . Die Sl- Spezifitätstasche wird hauptsächlich durch die Reste 20, 31, 35 49, 53 gebildet, d. h. Ala20, Val31, Ile35, Met45, Ala49, Gln53 (K) in ß5/PRE2 (Fig. 6c), Thr20, Thr31, Thr35, Arg45, Ala49, Gln53 in ßl/PRE3 (Fig. 6a), Ser20, Cys31, His35, Gly45, Ala49, Glu53 in ß2 PUPl(Fig. 6b) . Der Rest 45 formt den Boden der Tasche und scheint weitgehend ihren Charakter zu bestimmen. Benachbarte Untereinheiten in den ß-Ringen tragen weiter zu den Sl -Taschen bei und modulieren deren Charakter: ß2/PUPl im Falle von ßl/PRE3 mit Hisll4, Hisll6, Serllδ, Aspl20; ß3/PUP3 im Falle von ß2/PUPl mit den Resten Aspll4, Aspl20 und Cisll8 und ß6/C5 im Falle von ß5/PRE2 mit Serllδ, Aspll4, Glul20 und Glul22.
Lactacystin ist kovalent an ß5/PRE2 gebunden. Dies steht im Einklang mit der beobachteten chemischen Modifizierung von Untereinheit X des Säugerproteasoms (Fenteany et al . , (1995), Science 268, 726-730) dem Homolog von PRE2. Seine Dimethylsei- tenkette bei C10 reicht wie eine Valin- oder Leucinseitenkette in Sl hinein, aber weniger tief als die Norleucinseitenkette von Calpain. Lactacystin bildet mehrere Wasserstoffbrücken mit Atomen der Proteinhauptkette LactN-Gly470, Lact04 ' -Gly47N, Lact09' -Thr21N, Lact06 ' -ThrlN. Da diese zuletzt genannten Wechselwirkungen auch in ß2/PUPl und ßl/PRE3 auftreten könn- ten, die keine kovalenten Komplexe mit Lactacystin bilden, scheint die Sl Seitengruppe, die in der hydrophoben Sl Tasche von ß5/PRE2 bindet, die Ausbildung einer kovalenten Bindung und deren Stabilisierung zu dirigieren, somit ist diese Sei- tengruppe ein wichtiger Ansatzpunkt zur Entwicklung von Inhibitoren.
4.5. Spezifität
ß5/PRE2 hat einen Methioninrest an Postion 45 in Kontakt mit der verzweigten Seitenkette von Lactacystin im Komplex. Im Calpain- Inhibitorkomplex drückt die Norleucinseitenkette von Calpain die Methioninseitenkette um bis 0,27 nm in Richtung auf Ile35, das aus dem Weg rotiert. Diese konzertierten Bewegungen machen die Sl Tasche geräumiger. Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, daß Lactacystin die chymotryptische Aktivität gegenüber chromogenen Substraten hemmt. Auf ähnliche Weise wird die chymotryptische Aktivität in Proteasomen mit einer ß5/PRE2 Mutante, die nicht aus ihrer Proform prozessiert werden kann (Chen & Hochstrasser (1996) , Cell 86 961-972) und durch eine Mutation in ß5/PRE2 verringert, wo eine Substitution von Ala49 durch Val in der Sl Tasche die Größe beschränkt (Heinemeyer et al . (1993), J. Biol . Chem. 268, 5115-5120). ßl/PRE3 hat einen Argininrest in Position 45 am Boden der Sl Tasche, die gut für Glutamat Pl Reste geeignet ist. Sie ist am wahrscheinlichsten die mit der Peptidylglutamyl-Peptid-Hydro- lyseaktivität (PGPH) des Proteasoms assoziierte Untereinheit. Jedoch auch die Norleucinseitenkette besetzt diese basische Tasche im Calpaininihitorkomplex. Es wurde eine hoher zusätz- licher Dichtepeak beobachtet, der mit der Guanidiniumseiten- kette assoziiert ist und als Chlorid- oder Carbonation interpretiert werden kann, welches eine nicht ausgeglichene positive Ladung kompensiert. ß2/PUPl hat als Rest 45 ein Glycin und folglich eine geräumige, am Boden durch His35 und Glu53 begrenzte Sl Tasche. Wir folgern, daß ß5/PRE2 sowohl die chymotryptische als auch die tryptische Aktivität enthält, während ßl/PRE3 die PGPH- Aktivität enthält, aber beide Taschen sind hinsichtlich der Größe (PRE2) und der Polarität (PRE3) anpassungsfähig. ß2/PUPl 5 ist für sehr große Pl Reste mit basischem Charakter geeignet. Mutationsanalysen haben gezeigt, daß Substitutionen in ß4/Cll und ß7/PRE4 die chymotrypsinartige bzw. die PGPH Aktivität beeinflussen (Heinemeyer et al . (1993), supra; Hilt & Wolf (1996), TIBS 21, 96-102; Hilt et al . (1993), J. Biol . Chem.
10 268, 3479-3486). Diese Untereinheiten sind inaktiv, aber in Nachbarschaft zu den Untereinheiten ß5/PRE2 und ßl/PRE3 aus beiden Ringen gelegten (Figur 4) . Der Austausch von Serl36 durch das voluminöse Phe in ß4/Cll stört den ß-trans-ß-Kontakt an Helix H3 zwischen ß4/Cll und ß5/PRE2 und kann die benach-
15 barte Thrl Stelle stören, wie auch vermutlich die Deletion der 15 C-terminalen Reste von ß7/PRE4, die extensive Kontakte mit ßl/PRE3 bilden (Fig. 3) .
4.6 Propeptide und Prozessierung
20
Fünf ß-Typ-Untereinheiten werden mit Propeptiden unterschiedlicher Längen bis zu 75 Aminosäuren synthetisiert, die während der Reifung abgespalten werden. ß2/PUPl, ß5/PRE2 und ßl/PRE3 zeigen eine Autolyse zwischen Gly-1 - Thrl. Dies ist ein Pro- 25 zeß, für den das Vorhandensein von Thrl, Gly-1 und Lys33 erforderlich ist. Wir hatten bereits eine Autolyse innerhalb der Untereinheit vorgeschlagen, wobei ThrlOγ als Nukleophil die vorangehende Peptidbindung angreift (Schmidtke et al . (1996), EMBOJ. 15, 6887-6898) .
30
Gemäß der Kristallstruktur wird dem Wasser NUK eine zentrale Rolle zugeordnet. Es ist idealerweise so positioniert, um als Base bei der Entfernung eine Protons von ThrlOγ zu wirken und die nukleophile Addition an den Carbonylkohlenstoff von Gly-1 35 anzutreiben. Es gibt keine Informationen über die Position und Orientierung der Gly-1-Thrl-Peptidgruppe in den vollständig prozessierten Untereinheiten, aber wir können sie von teil- weise prozessierten oder unprozessierten Untereinheiten ß3/PUP3, ß6/C5 und ß7/PRE4 ableiten, welche ähnliche Orientierungen zeigen. Gly-10 ist in diesen Untereinheiten in Richtung des positiv geladenen Lys33Nf und von Gly47N gerichtet, die ein Sauerstoffanionenloch in Analogie zu Serinproteasen bilden, um die entstehende negative Ladung zu verteilen, wenn das tetraedrische Addukt gebildet wird. Eine Umlagerung zum Ester kann nach dem Protonentransfer vom Wasser NUK zu ThrlN und Spaltung der Peptidbindung erfolgen. Die nahegelegenen Reste Serl290Υund Serl690γ unerstutzen diese Reaktion. Beide Hydroxylgruppen sind über Wasserstoffbrücken an Aspl66 gebunden, welches in den aktiven Untereinheiten invariant ist. NUK ist wahrscheinlich ebenfalls bei der Esterhydrolyse als angreifendes Nukleophil beteiligt, welches schließlich in das Produkt eingebaut wird (Fig. 5, Abschnitte a bis c) . Der Gly-1 Rest scheint essentiell zu sein, da eine Seitenkette an Position -1 mit dem Proteinrückgrat bei Position 168 interferieren und eine Konfiguration erzwingen würde, die für eine Autolyse ungeeignet ist .
Mit Freisetzung von Thrl werden die Untereinheiten aktiv. Wenn die katalytische Stelle nicht intakt ist, wie in den Untereinheiten ß3/PUP3, ß6/C5 und ß4/CH, denen Thrl fehlt, in ß7/PRE4, bei dem Lys33 durch Arg ersetzt ist, und in konstru- ierten Varianten von LMP2 , dem Säugerhomolog von ßl/PRE3 (Schmidtke et al . (1996), supra) und von PRE2 (Chen & Hochstrasser (1996) , supra) tritt eine Autolyse bei Rest 1 nicht auf. ß7/PRE4 besitzt beide essentiellen Reste Gly-1 und Thrl, aber in einer Konfiguration, die sich stark von derjenigen unterscheidet, die in den aktiven Untereinheiten gefunden wird, da die Thrl Seitenkette durch das größere Arg33 weggedrückt wird, welches den Lysinrest ersetzt (Figur 4b) . Das Auffinden von Defekten in der katalytischen Aktivität und in der Prozessierung belegt die strukturelle Labilität der Thrl- Stelle, die durch Mutationen von benachbarten Resten der gleichen oder benachbarten Untereinheiten gestört werden kann. Andererseits ist es auch möglich, daß eine inaktive Mutante in der Umgebung aktiver Untereinheiten selbst aktiv werden kann, was im Einklang mit Beobachtungen steht, daß T. acidophilum Spezies, die einen Defekt in der Prozessierung aufweisen, bei Koexpression mit Wild-Typ-Protein prozessiert werden (Seemül- 1er et al . (1996) , supra) .
Die Propeptide spielen eine essentielle Rolle bei der Assemblierung eukaryontischer Proteasomen, was auf direkte oder indirekte Effekte durch Teilnahme an Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten und/oder durch Stabilisierung der Struktur von Untereinheiten zurückzuführen sein kann. Die beobachteten Strukturen der Prozessierungsintermediate von ß7/PRE4 (M) und ß6/C5 und des unprozessierten Propeptids ß3/PUP3 geben Hinweise darauf, daß beide Effekte auftreten, da die Propeptide fest an den Rest des Proteins gebunden sind und mit anderen Untereinheiten wechselwirken, z. B. Propeptid ß7/PRE4 mit ßl/PRE3 bei den Resten 92 und 115 und Propeptid ß6/C5 mit ß7/PRE4 bei 91 und 116.
4.7 Eintritt in das und Austritt aus dem Proteasompartikel
Die hydrolytische Aktivität des Proteasoms ist mit Thrl und der ß-Ringflachen im Inneren des die hydrolytische Kammer definierenden ß-Hohlraums assoziiert. Das Substrat muß in das Partikel eindringen und das Produkt muß freigesetzt werden. Beim Proteasom von T.acedophilum sind zwei Eintrittsöffnungen mit einem Durchmesser von etwa 1,3 nm an den Enden der zylindrischen Teilchen offen, die durch eine Ringfläche von Knickbildenden Segmenten Tyrl26-Gly-Gly-Val der sieben identischen Q;-Untereinheiten begrenzt sind. Die N-terminalen Reste 1 bis 12 sind in diesem Protein ungeordnet.
Im Gegensatz dazu ist die hydrolytische Kammer des 20S Proteasoms der Hefe fast unzugänglich. Die N-Termini der Unterein- heiten al/Cl , a2/Yl , o;3/Y13, α6/PRE5 und α7/Cl reichen in die Öffnung hinein und füllen sie vollständig mit mehreren Schichten von eng miteinander verwobenen Seitenketten aus (Figur 8) . Es gibt somit keinen Zugang in das Innere des Partikels von den Zylinderenden ohne erhebliche Umlagerung. Es gibt einige enge Seitenfenster, insbesondere an der Grenzfläche zwischen den a- und ß-Ringen, die durchlässiger sind als im T.acidophi- lum Proteasom, da kleinere Seitenketten dort vorliegen. Diese Öffnungen befinden sich hauptsächlich zwischen den zahnartigen Helix Hl-Knick-Helix H2-Motiven der c-ß-Grenzflache (siehe Figur 4a bei Löwe et al . (1995), supra) und führen zu den N- terminalen Threoninresten des aktiven Zentrums. Sie sind mit polaren und geladenen Aminosäureseitenketten bedeckt, die sich bewegen können, um Öffnungen mit etwa 1 nm Durchmesser zu erzeugen und möglicherweise die Passage von ungefalteten gestreckten Polypeptidketten erlauben. Das 19S Partikel, welches die ATP- und Ubitiquin-Abhängigkeit der Proteolyse durch das Proteasom bewirkt, ist an die Partikel angeheftet um das 26S
Proteasom zu bilden. Die Assoziierung führt zu einer starken
Aktivierung der Peptidhydrolyse (Hoffman und Rechsteiner
(1994), J. Biol. Chem. 269, 1690-16895). Auf ähnliche Weise ist der Proteasomregulator PA28 an α-Typ Untereinheiten gebun- den (Kania et al . (1996), Euro. J. Biochem. 236, 510-516). Er beschleunigt die Peptidspaltung und verbessert die Antigen- prozessierung. Beide regulatorischen Faktoren könnten die Eingangsöffnungen auf kontrollierte Weise in vivo öffnen.
4.8 Erzeugung von MHC Klasse I Peptiden
Das 2OS Proteasom erzeugt Peptidprodukte mit einer engen Längenverteilung, überwiegend Octa- oder Nonapeptide, ein Größenbereich, der optimal für die Bindung von MHC Klasse I Molekü- len ist (York & Rock (1996), Annu. Rev. Immunol . 14, 369-396). In vitro Untersuchungen haben gezeigt, daß durch 2OS Proteasomen aus intakten Proteinen erzeugte Peptide durch MHC Klasse I Moleküle präsentiert werden (Dick et al . (1994) Immunol. 152, 3884-3894; Niedermann et al . (1996), Proc . Natl. Acad. Sei. USA 93, 8572-8577) . In einem in vivo Experiment wurde gezeigt, daß Proteasomeninhibitoren die MHC Klasse I Präsentation von Proteinantigenen hemmen (Rock et al . (1994), Cell 78, 761-771) und daß die Anzahl der an der Zelloberfläche vorliegenden MHC Klasse I Moleküle durch die induzierbaren Proteasomenunterein- heiten ß5i/LMP7 und ßli/LMP2 reguliert wird, wie in Mäusen mit zielgerichteten Deletionen der für diese Proteine codierenden Gene gezeigt wurde (Fehling et al . (1994) Science 265, 1234- 1237) . LMP2 und LMP7 ersetzen nach IFN-γ Stimulierung die kon- stitutiv exprimierten Untereinheiten.
MHC Klasse I Peptide haben üblicherweise basische oder hydro- phobe C-terminale Reste (siehe den Übersichtsartikel von Engelhard (1994), Curr. Opin. Immunol. 6, 13-23). Die LMP2/7 Substition ändert vermutlich die Verteilung von Peptiden, so daß ein größerer Anteil der von MHC Klasse I Molekülen bevorzugten Peptiden erzeugt wird. LMP2 ersetzt Y, das humane Homo- löge von ßl/PRE3, LMP7 ersetzt X, das Homologe von ß5/PRE2. Alle Mitglieder dieser Unterfamilie zeigen einen hohen Grad an Sequenzidentität, aber ßli/LMP2 hat zwei auffällige Unterschiede gegenüber ßl/PRE3 in der Sl Tasche: Thr31 → Phe und Arg45 → Leu. Durch den Austausch von Arg gegen Leu wird die Tasche unpolar und durch den Austausch von Thr gegen Phe enger, so daß die PGPH-Aktivität verringert und die chymotryptische Aktivität erhöht werden sollte, wenn ßli/LMP2 das Säugerhomolog für ßl/PRE3 ersetzt. Dies wird in der Tat beobachtet (Gaczynska et al . (1993), Nature 365, 264-267; Driscoll et al . (1993), Nature 365, 262-264) wenn LMPs durch eine Behandlung mit IFN-γ induziert werden. Die gegenteilige Wirkung findet man in Zelllinien, denen die LMP2 und LMP7 Gene fehlen und in Mutantenmäusen mit einer Disruption des LMP2 Gens (Van Kaer et al . (1994), Immunity 1, 533-541) . Ein Erset- zen der Säugerhomologen von ß5/PRE2 und ß2/PUPl durch LMP7 bzw. MECL1 beeinflußt nicht direkt die Sl Taschen und ihre Effekte können nicht von einer Änderung der Spezifität bei Pl stammen, wie man sie für LPM2 findet.
Im Hefe 2OS Protesom werden die Untereinheiten ß7/PRE4 bzw. ß6/C5 an den Resten -8 und -9 teilweise prozessiert. Dabei entstehen Octa- oder Nonapeptidprodukte, die nicht aus dem Enzym freigesetzt werden. Beide Peptide haben ähnliche Konformationen mit einer Verdickung, die zwei Abschnitte mit langgestreckter Konformation unterteilt, was der Konformation von MHC Klasse I-gebundenen Peptiden ähnelt. Durch Vergleich des Propeptids von ß6/C5 mit einem viralen Peptidnonamer im Komplex mit seinem MHC Klasse I Rezeptor (Madden et al . (1992) , Nature 321-325) wird die Ähnlichkeit mit rms Abweichungen für alle Atome von 0,23 nm und für die Cα-Atome von 0,13 nm quantifiziert und läßt vermuten, daß bevorzugte lokale Kon- formationen eine Rolle bei der Erzeugung (durch das Proteasom) und Präsentation (durch MHC Klasse I Moleküle) von immundominanten Peptidepitopen spielen.

Claims

Ansprüche
Verfahren zum Gewinnen einer aufgereinigten eukaryontischen Proteasomenpraparation, umfassend die Schritte:
Herstellung eines Rohextrakts durch Aufschluß von eukaryontischen Zellen,
Abtrennung unlöslicher Bestandteile aus dem Rohextrakt, chromatographische Auftrennung in Fraktionen über ein Ionenaustauschermedium,
Testen der in Schritt (c) erhaltenen Fraktionen und Sammeln der aktiven Fraktionen, chromatographische Auftrennung über Hydroxyapatit , Testen der in Schritt (e) erhaltenen Fraktionen und Sammeln der aktiven Fraktionen, Konzentrierung der vereinigten Fraktionen, chromatographische Auftrennung über ein Gelfiltrationsmedium und (i) Testen der in Schritt (h) erhaltenen Fraktionen und Sammeln der aktiven Fraktionen.
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man Hefezellen verwendet.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Testen der Fraktionen in Schritt (d) , (f) oder/und (i) jeweils zwei Bestimmungen der proteolyti- schen Aktivität umfaßt, wobei eine in Abwesenheit und die andere in Gegenwart eines Proteasomeninhibitors durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3 , dadurch gekennzeichnet, daß man Lactacystin als Proteasomeninhibitor verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der chromatographischen Trennschritte in einem FPLC-System durchgeführt wird.
5
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin umfassend das Kristallisieren der aufgereinigten Protesomenpräparation.
o 7. Aufgereinigte eukaryontische Proteasomenpraparation, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
8. Aufgereinigte eukaryontische Proteasomenpraparation in 15 kristallisierbarer Form.
9. Aufgereinigte kristallisierte eukaryontische Proteasomenpraparation.
20 10. Präparation nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Kristall einen Proteasomeninhibitor enthält.
11. Präparation nach Anspruch 10, 25 dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ein Tripeptid-Aldehyd oder Lactacystin ist .
12. Präparation nach einem der Ansprüche 7 bis 11, 30 dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Proteasom aus einer Hefe umfaßt .
13. Präparation nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
35 daß sie ein Proteasom aus Saccharomyces cerevisiae umfaßt.
14. Präparation nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Komplex aus 28 Untereinheiten umfaßt, der jeweils 2 Moleküle von 7 verschiedenen α-Typ-Unterein- heiten und 7 verschiedenen ß-Typ-Untereinheiten enthält.
15. Verwendung der aufgereinigten eukaryontischen Proteasomenpraparation nach einem der Ansprüche 7 bis 14 zur Identifizierung und Gewinnung neuer Proteasomeninhibito- ren.
16. Verwendung von Daten aus der Kristallstruktur von kristallisierten eukaryontischen Proteasomenpräparationen nach einem der Ansprüche 9 bis 14 zur Identifizierung und Gewinnung neuer Proteasomeninhibitoren.
17. Verwendung von Kristallstrukturdaten aus dem Bereich der Proteasomentaschen Sl der Untereinheiten ßl/PRE2, ß2/PUP2 oder/und ß5/PRE2 zur Identifizierung und Gewinnung neuer Proteasomeninhibitoren .
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 17 in einem computergestützten Modellingprogramm.
19. Verwendung nach Anspruch 18, umfassend einen Schritt des Homologiemodelling, indem die Kristallstrukturdaten eines Hefeproteasoms mit Aminosäuresequenzen aus dem humanen Proteasom modifiziert werden.
20. Neuer Proteasomeninhibitor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine zur Proteasomentasche Sl der Untereinheiten ßl/PRE3, ß2/PUP2 oder/und ß5/PRE2 komplementäre dreidi- mensionale Struktur aufweist.
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