CN102174495A - 一种提取糜胰蛋白酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，更具体地说涉及一种提取糜胰蛋白酶的方法。本发明采用CaCl₂激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶的同时加入饱和度的(NH₄)₂SO₄，使其生成CaSO₄沉淀吸附糜胰蛋白酶，不需要先采用盐析多重结晶结合透析和乙醇及丙酮等的有机溶剂法制备成糜胰蛋白酶粗制品，再通过CM-纤维素柱层析和亲和层析等复杂步骤，进行纯化制备，而直接经过洗脱，盐析、超滤和冻干步骤即可获得白色的冻干粉末。本发明提取方法简便可行，适于工业化生产，这样既节省了成本又缩短了时间，由原来约需7～8天时间缩短到3～4天。每公斤胰脏可获得冻干糜胰蛋白酶粉4.0～4.5克，其中糜蛋白酶的比活力为360U./mg蛋白(氮)，胰蛋白酶的比活力为1380U./mg蛋白(氮)。

Description

一种提取糜胰蛋白酶的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，更具体地说涉及一种提取糜胰蛋白酶的方法。

背景技术

糜蛋白酶和胰蛋白酶都是典型的丝氨酸蛋白酶，二者的性质极为相似，不易分开，但是对蛋白质水解的专一性却各异。胰蛋白酶只作用于由碱性氨基酸L-精氨酸或赖氨酸的羧基所构成的C-末端肽键，而糜蛋白酶则选择性地水解由芳族或脂族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸)所组成的肽键。因此，它们二者具有协同水解蛋白质肽键的作用，比单独使用一种酶的效果好，适用范围更广。目前国内外对它们作了大量的研究，并已作为一种抗炎消肿的药物，应用于临床。其他用途例如：皮革工业脱去动物皮上的毛，纺织工业脱丝胶和水解酪蛋白制水解乳蛋白等。一般将它们从胰脏提取分离方法是采用盐析多重结晶结合透析和乙醇及丙酮等的有机溶剂法。先将它们制备成糜胰蛋白酶的粗制品，然后再通过CM-纤维素柱层析和亲和层析等纯化，冻干获得纯度较高的糜胰蛋白酶，但是由于其制备工艺流程复杂，技术要求高，成本昂贵，不易广泛使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提取糜胰蛋白酶的方法，采用CaCl₂激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶，在成为糜胰蛋白酶的同时加入饱和度的(NH₄)₂SO₄，使其生成CaSO₄沉淀吸附糜胰蛋白酶，以简化其生产工艺流程，缩短后续纯化的周期和降低成本。

本发明有下述顺序步骤：

a、以新鲜牛胰脏或猪胰脏或冷冻牛胰脏或冷冻猪胰脏为原料，除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用绞肉机绞碎。

b、将绞碎的胰脏移入不锈钢桶中，加入自来水，其比例为1∶4，用15％H₂SO₄溶液将其调节至PH值为3.0，在室温下不断搅拌24小时，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅰ和胰脏残渣沉淀物Ⅰ。

c、将获得的浸取液Ⅰ倒入浸取液桶内备用，将胰脏残渣沉淀物Ⅰ用1∶2的比例加入PH值为3.0的自来水进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅱ和胰脏残渣沉淀物Ⅱ。

d、将浸取液Ⅱ倒入浸取液桶内；将胰脏残渣沉淀物Ⅱ用1∶2的比例加入PH值为3.0的自来水进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅲ和胰脏残渣沉淀物Ⅲ；最后将浸取液Ⅲ倒入浸取液桶中与浸取液Ⅰ、Ⅱ合并，弃去胰脏残渣沉淀物Ⅲ。

e、在浸取液桶中，加入25％～33％饱和度的(NH₄)₂SO₄，搅拌均匀，静置2小时，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去杂蛋白沉淀，获得了清的浸取液。

f、将获得清的浸取液中再加入65％～75％饱和度的(NH₄)₂SO₄，搅拌均匀，静置8～10小时，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后弃去浸取液，获得了糜胰蛋白酶原的沉淀。

g、将获得的糜胰蛋白酶原的沉淀用PH值为3.0的去离子水溶解后，加入5％～7％CaCl₂，搅拌均匀，在4℃～5℃下，静置10小时，使Ca⁺⁺离子激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶；然后在糜胰蛋白酶溶液中加入20％饱和度的(NH₄)₂SO₄，搅拌均匀，加温至37℃，使溶液中Ca⁺⁺离子生成CaSO₄沉淀

吸附溶液中的糜胰蛋白酶，静置10小时后，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后弃去上清液，收集CaSO₄沉淀。

h、用去离子水对CaSO₄沉淀反复洗脱三次，洗脱液合并在一起，然后在洗脱液中加入65％～75％饱和度的(NH₄)₂SO₄，搅拌均匀，在4℃下静置10小时，再用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去上清液，得糜胰蛋白酶沉淀；最后用去离子水溶解后超滤，冷冻干燥，获得了白色的糜胰蛋白酶冻干粉末。

本发明的优点是：提取分离方法简便可行，适于工业化生产，在用CaCl₂激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶的同时，加入饱和度的(NH₄)₂SO₄使其生成CaSO₄沉淀吸附糜胰蛋白酶，与弹性蛋白酶和胰酶等分开，不需要先采用盐析多重结晶结合透析和乙醇及丙酮等有机溶剂法制备成糜胰蛋白酶的粗制品，再通过CM-纤维素柱层析和亲和层析等复杂步骤，而直接经过洗脱，盐析、超滤和冻干步骤即可。如果需要进一步分离糜胰蛋白酶的话，则可采用CM-纤维素将它们分离为糜蛋白酶和胰蛋白酶，这样既节省了成本又缩短了时间，由原来约需7～8天时间缩短到3～4天。每公斤胰脏可获得冻干糜胰蛋白酶粉4.0～4.5克，其中糜蛋白酶的比活力为360U./mg蛋白(氮)，胰蛋白酶的比活力为1380U./mg蛋白(氮)。

具体实施方式

实施例1

本发明有下述顺序步骤：

a、取新鲜牛胰脏为原料，除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用绞肉机绞碎。

b、取1公斤绞碎的牛胰脏移入不锈钢桶中，加入4000毫升的自来水，用15％H₂SO₄溶液将其调节至PH值为3.0，在室温下不断搅拌24小时，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅰ和胰脏残渣沉淀物Ⅰ。

c、将获得的4000毫升浸取液Ⅰ倒入浸取液桶内备用，将胰脏残渣沉淀物Ⅰ用PH值为3.0的自来水2000毫升进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅱ和胰脏残渣沉淀物Ⅱ。

d、将浸取液Ⅱ倒入浸取液桶内，将胰脏残渣沉淀物Ⅱ用PH值为3.0的自来水2000毫升进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅲ和胰脏残渣沉淀物Ⅲ，最后将浸取液Ⅲ倒入浸取液桶中与浸取液Ⅰ、Ⅱ合并，弃去胰脏残渣沉淀物Ⅲ，另作他用，以免污染环境。

e、在浸取液桶中，加入25％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即量浸取液总体积，每1升溶液加入144克固体硫酸铵，搅拌均匀，静置2小时，用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去杂蛋白沉淀，获得了清的浸取液。

f、在获得清的浸取液中加入70％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即再量清的浸取液体积，每1升溶液加入307克固体硫酸铵，搅拌均匀，静置8小时，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后弃去浸取液，获得了糜胰蛋白酶原的沉淀。

g、将获得的糜胰蛋白酶原沉淀用PH值为3.0的去离子水200毫升溶解后加入5％CaCl₂，搅拌均匀，在4℃～5℃下，静置10小时，使Ca⁺⁺离子激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶；然后在糜胰蛋白酶溶液中加入20％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即量糜胰蛋白酶溶液体积，每1升溶液中加入114克固体硫酸铵，搅拌均匀，加温至37℃，使浸取液中Ca⁺⁺离子生成CaSO₄沉淀

吸附溶液中的糜胰蛋白酶，静置10小时后，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后，弃去上清液，收集CaSO₄沉淀。

h、用去离子水200毫升对CaSO₄沉淀反复洗脱三次，将洗脱液合并在一起，然后在洗脱液中加入70％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即量洗脱液体积，每1升洗脱液中加入472克固体硫酸铵，搅拌均匀，在4℃下静置10小时，再用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去上清液，得糜胰蛋白酶沉淀；最后用去离子水溶解后超滤，冷冻干燥，获得了白色的糜胰蛋白酶冻干粉末。

实施例2

本发明有下述顺序步骤：

a、取冷冻牛胰脏为原料，除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用绞肉机绞碎。

b、将2公斤绞碎的牛胰脏移入不锈钢桶中，加入8000毫升的自来水，用15％H₂SO₄溶液将其调节至PH值为3.0，在室温下不断搅拌24小时，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅰ和牛胰脏残渣沉淀物Ⅰ。

c、将获得的8000毫升浸取液Ⅰ倒入浸取液桶内备用，将牛胰脏残渣沉淀物Ⅰ用PH值为3.0的自来水4000毫升进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅱ和牛胰脏残渣沉淀物Ⅱ。

d、将浸取液Ⅱ倒入浸取液桶内，将牛胰脏残渣沉淀物Ⅱ用PH值为3.0的自来水4000毫升进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅲ和牛胰脏残渣沉淀物Ⅲ；然后将浸取液Ⅲ倒入浸取液桶中与浸取液Ⅰ、Ⅱ合并，弃去牛胰脏残渣沉淀物Ⅲ，另作他用，以免污染环境。

e、在浸取液桶中，加入30％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即量浸取液总体积，每1升溶液加入176克固体硫酸铵，搅拌均匀，静置2小时，用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去杂蛋白沉淀，获得了清的浸取液。

f、在获得清的浸取液中加入65％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即量清的浸取液体积，每1升溶液加入235克固体硫酸铵，搅拌均匀，静置10小时，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后弃去浸取液，获得了糜胰蛋白酶原的沉淀。

g、将获得的糜胰蛋白酶原沉淀用PH值为3.0的去离子水400毫升溶解后，加入7％CaCl₂，搅拌均匀，在4℃～5℃下，静置10小时，使Ca⁺⁺离子激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶；然后在糜胰蛋白酶溶液中加入20％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即量糜胰蛋白酶溶液体积，每1升溶液中加入114克固体硫酸铵，搅拌均匀，加温至37℃，使浸取液中Ca⁺⁺离子生成CaSO₄沉淀

吸附溶液中的糜胰蛋白酶，静置10小时后，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后，弃去上清液收集CaSO₄沉淀。

h、用去离子水600毫升对CaSO₄沉淀反复洗脱三次，将洗脱液合并在一起，然后在洗脱液中加65％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即量洗脱液体积，每1升洗脱液中加入430克固体硫酸铵，搅拌均匀，在4℃下静置10小时，再用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去上清液，得糜胰蛋白酶沉淀。最后用去离子水溶解后超滤、冷冻干燥，获得了白色的糜胰蛋白酶冻干粉末。

实施例3

本发明有下述顺序步骤：

a、取新鲜牛胰脏为原料，除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用绞肉机绞碎。

b、将5公斤绞碎的牛胰脏移入不锈钢桶中，加入20000毫升的自来水，用15％H₂SO₄溶液，将其调节至PH值为3.0，在室温下不断搅拌24小时，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅰ和胰脏残渣沉淀物Ⅰ。

c、将获得的20000毫升浸取液Ⅰ倒入浸取液桶内备用，将胰脏残渣沉淀物Ⅰ用PH值为3.0的自来水10000毫升进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅱ和胰脏残渣沉淀物Ⅱ。

d、将浸取液Ⅱ倒入浸取液桶内，将胰脏残渣沉淀物Ⅱ用PH值为3.0的自来水10000毫升进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅲ和胰脏残渣沉淀物Ⅲ，最后将浸取液Ⅲ倒入浸取液桶中，弃去胰脏残渣沉淀Ⅲ，另作他用，以免污染环境。

e、在浸取液桶中，加入33％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即量浸取液总体积，每1升浸取液中加入196克固体硫酸铵，即搅拌均匀，静置2小时，用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去杂蛋白沉淀，获得了清的浸取液。

f、在获得的清的浸取液中加入75％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即量清的浸取液体积，每1升溶液加入292克固体硫酸铵，搅拌均匀，静置9小时，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后弃去浸取液，获得了糜胰蛋白酶原的沉淀。

g、将获得的糜胰蛋白酶原沉淀用PH值为3.0的去离子水1000毫升溶解后加入6％CaCl₂，搅拌均匀，在4℃～5℃下，静置10小时，使Ca⁺⁺离子激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶；然后在糜胰蛋白酶溶液中加20％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即量糜胰蛋白酶溶液体积，每1升溶液中加入114克固体硫酸铵，搅拌均匀，加温至37℃，使浸取液中Ca⁺⁺离子生成CaSO₄沉淀

吸附溶液中的糜胰蛋白酶，静置10小时后，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后，弃去上清液收集CaSO₄沉淀。

h、用去离子水1000毫升对CaSO₄沉淀反复洗脱三次，将洗脱液合并在一起，然后在洗脱液中加75％饱和度的(NH₄)₂SO₄，即量洗脱液体积，每1升洗脱液中加入516克固体硫酸铵，搅拌均匀，在4℃下静置10小时，再用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去上清液，得糜胰蛋白酶沉淀。最后用去离子水溶解后超滤、冷冻干燥，获得了白色的糜胰蛋白酶冻干粉末。

实施例4

取1公斤绞碎的新鲜猪胰脏为原料，该实施例的方法与实施例1相同，所不同的是原料为猪胰脏，最后也获得了白色的糜胰蛋白酶冻干粉末。

综上所述：最后冷冻干燥得到的糜胰蛋白酶是一种白色的冻干粉末，溶于水，水溶液澄清透明，但在室温下极易失活，冻干粉贮存在4℃左右较稳定。

上述1-4实施例中所述的硫酸铵饱和度是根据动物生物化学实验指导(动物类专业用全国高等农业院校教材)中硫酸铵饱和度的常用表中得到的。我们实际工作中就是按照硫酸铵饱和度的常用表操作的。

硫酸铵饱和度的常用表如下：

1.硫酸铵分级盐析原理：

硫酸铵分级盐析是分离纯化各种蛋白质和酶常用的方法，主要基于高浓度盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来，而蛋白质和酶本身活性不会发生变化，不同蛋白质和酶的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质和酶。因硫酸铵的溶解度大，温度影响系数小，分段效果比其他盐好，对酶稳定性好，所以应用最广。这里的盐浓度通常用饱和度来表示。

2.硫酸铵饱和度的常用表

在25℃下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每升溶液所加固体硫酸铵的克数。

调整硫酸铵溶液饱和度计算表(25℃)

表中纵轴是初浓度，横轴是终浓度，中间是1L溶液需加入的固体硫酸铵克数，

3.计算方法：

3.1加入饱和硫酸铵溶液的计算方法：

$V=V_0\frac{C2-C1}{1-C2}$

V------应加入饱和硫酸铵的体积

V₀-----蛋白质溶液的原始体积

C₁-----原来溶液的硫酸铵饱和度

C₂-----所要达到的硫酸铵饱和度

3.2加入固体硫酸铵的计算方法：

$X=\frac{G(C2-C1)}{1-\mathrm{AC}2}$

X-----将1L饱和度为C₁溶液提高到饱和度为C₂时，需要加入固体硫酸铵的重量(g)

G和A-----为常数，数值与温度有关，先已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成表，使用时不需计算可直接从表中查出。(如2的硫酸铵饱和度常用表)

3.3查找方法：

查找从初浓度到终浓度应加入的克数，再根据你的溶液体积计算。

例如：未加硫酸铵时溶液中硫酸铵饱和度为0，要使溶液中硫酸饱和度达到30％，只需从表的横轴查出30％饱和度为176g，然后按照1L溶液加176g固体硫酸铵的量添加即可；如果又要在这个基础上使溶液中硫酸铵饱和度达到75％，只需查出从表纵轴30％开始与横轴75％交叉点的值为314g，然后按照1L溶液加314g固体硫酸铵的量添加即可。

4.参考文献：

动物生物化学实验指导(动物类专业用全国高等农业院校教材)

作者：周顺伍

出版社：中国农业出版社

出版日期：2006年3月

ISBN：710907292

Claims (1)

1.一种提取糜胰蛋白酶的方法，该方法有以下顺序步骤：

a、以新鲜牛胰脏或猪胰脏或冷冻牛胰脏或冷冻猪胰脏为原料，除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用绞肉机绞碎；

b、将绞碎的胰脏移入不锈钢桶中，加入自来水，其比例为1∶4，用15％H₂SO₄溶液将其调节至PH值为3.0，在室温下不断搅拌24小时，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅰ和胰脏残渣沉淀物Ⅰ；

c、将获得的浸取液Ⅰ倒入浸取液桶内备用，将胰脏残渣沉淀物Ⅰ用1∶2的比例加入PH值为3.0的自来水进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅱ和胰脏残渣沉淀物Ⅱ；

d、将浸取液Ⅱ倒入浸取液桶内；将胰脏残渣沉淀物Ⅱ用1∶2的比例加入PH值为3.0的自来水进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得浸取液Ⅲ和胰脏残渣沉淀物Ⅲ；最后将浸取液Ⅲ倒入浸取液桶中与浸取液Ⅰ、Ⅱ合并，弃去胰脏残渣沉淀物Ⅲ；

e、在浸取液桶中，加入25％～33％饱和度的(NH₄)₂SO₄搅拌均匀，静置2小时，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去杂蛋白沉淀，获得了清的浸取液；

f、将获得清的浸取液中再加入65％～75％饱和度的(NH₄)₂SO₄，搅拌均匀，静置8～10小时，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后弃去浸取液，获得了糜胰蛋白酶原的沉淀；

g、将获得的糜胰蛋白酶原的沉淀用PH值为3.0的去离子水溶解后，加入5％～7％CaCl₂，搅拌均匀，在4℃～5℃下，静置10小时，使Ca⁺⁺离子激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶；然后在糜胰蛋白酶溶液中加入20％饱和度的(NH₄)₂SO₄，搅拌均匀，加温至37℃，使溶液中Ca⁺⁺离子生成CaSO₄沉淀

吸附溶液中的糜胰蛋白酶，静置10小时后，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后弃去上清液，收集CaSO₄沉淀；

h、用去离子水对CaSO₄沉淀反复洗脱三次，洗脱液合并在一起，然后在洗脱液中加入65％～75％饱和度的(NH₄)₂SO₄，搅拌均匀，在4℃下静置10小时，再用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去上清液，得糜胰蛋白酶沉淀；最后用去离子水溶解后超滤，冷冻干燥，获得了白色的糜胰蛋白酶冻干粉末。