JPS6269998A - 不溶性封入体からの蛋白質の精製および活性化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、問題の蛋白質の表現を指示するように組換え
ＤＮＡ表現ベクターによって形質転換された微生物中に
、不溶性、生物学的に不活性の封入体として生産される
蛋白質を精製し、活性化する方法に関するものである。

組換えＤＮＡ技術は、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ
）　Ｄ　ＮＡを担うベクターを、その異種ＤＮＡが表現
されるような方法で微生物に挿入することを可能にする
；すなわちベクターは、異種ＤＮＡ配列の一部によって
規定される蛋白質を微生物が生産するように指示する遺
伝指令を含む。トランスフォーマットｉ生物を発酵槽内
で増殖させ、それらを異種ＤＮＡが表現されるような条
件にさらすことによって、貴重な蛋白質が比較的低コス
トで大量に生産される。

残念なことに、トランスフォーマット微生物中に生産さ
れる多くの異種蛋白質は宿主細胞の環境では、それら本
来の三次元的配座には折りた＼まれない。表現された蛋
白質のこの正しくない折りた−み方のために、いくつか
の不都合な結果があられれる。先づ第一に不適当に折り
た＼まれだ蛋白質は、宿主細胞中では不溶性の凝集体を
形成する傾向を有する。これらの不溶性凝集体はその細
胞内に“封入体”として確認され、時には「Ｒ体（ｒｅ
ｆｒａｃｔｉｌｅ　ｂｏｄｉｅｓ）Ｊおよび／または［
蛋白質顆粒ｊとも呼ばれる。封入体の生成は一部には蛋
白数のオリゴマー化、すなわち分子間共有ジズルフィソ
ド結合の形成によっておきる。不適当にた＼まれた蛋白
質は不溶性であるのみならず、生物学的に不活性である
。宿主細胞に表現された時不溶性で生物学的に不活性な
封入体を形成する異種蛋白質の例として、ウシ成長ホル
モン、ブタ成長ホルモンおよびソマトメジンのような、
動物成長ホルモンおよび成長因子が挙げられる。

有用な蛋白質を生産するためには、不適当に折りた＼ま
れた封入体蛋白質を、それらが可溶性で生物学的に活性
になり得る本来の配座に変えることが必要である。さら
にその蛋白質を精製して、混入した細胞層や、宿主細胞
が生産したその他の蛋白質を除去しなければならない。

封入体蛋白質を、それら本来の可溶性の立体配置に変え
るために多数の方法が提案された。残念なことにこれら
の方法は、例えばイオン交換クロマトグラフィーのよう
な蛋白質精製法とは相客れないことが多い。

精製の条件は、蛋白質を溶液中に保持することを狙害す
る傾向があり、再凝集および沈澱による蛋白質のかなり
の損失をひきおこすことが多い。封入体から蛋白質を、
純粋な、可溶性の、生物学的に活性な形で回収するため
に提案された方法の大部分では、微生物により生産され
た蛋白質の収量は非常に低いものであった。

米国特許第４．５１１，５０３号は、トランスフォーマ
ット微生物の封入体から蛋白質を回収する典型的方法を
開示する。封入体蛋白質を強い変性剤で処理する、その
変性剤は不適当に折りた＼まれた蛋白質分子をのばし、
可溶性にする。その後変性剤を、例えば透析によって除
去し、その蛋白質を本来の配座に再び折りた−む。この
種の方法において最も一般的に用いられる強い変性剤は
グアニジン塩酸である。

米国特許第４．５１１，５０２号もこれと同様の方法を
開示する、ここでは可溶性になった蛋白質と変性剤との
溶液を、分子篩を通過させるかまたは高速度で遠心分離
して、高分子成分を除去する。

米国特許第４，５１８，５２６号も同様な方法を開示す
る。この方法では、トランスフォーマット培養細切を十
分なイオン強度の緩衝溶液で処理して宿主細胞蛋白質の
大部分を可溶性にするが、他方、異種蛋白質は不溶性の
ま−である。それから細胞を溶解し、可溶性になった宿
主細胞蛋白質を含む上澄液を除去し、不溶性の封入体を
強い変性剤で可溶性にする。

封入体蛋白質を、可溶性の、その本来の配座に変えるた
めの変性／復元方法を開示したその他の公告としては、
ＰＣＴ公告−０８３１０４４１８，欧州特許出願公告筒
０．１２３．９２８号、欧州特許出願公告筒０゜１２Ｌ
７７５号、欧州特許出願公告第０．１１６．７７８号お
よび欧州特許出願公告筒０．１１４，５０７号がある。

既述のように、提案の変性／復元方法の大部分は変性剤
としてグアニジン塩酸を用いている。グアニジン塩酸は
、封入体蛋白質を可溶性にするすぐれた能力が特徴であ
るが、その使用には若干の問題がある。グアニジン塩酸
を除去するために変性剤を含まない緩衝液に対して透析
すると、可溶性蛋白質のかなりの量が、明らかに再び不
適当に折りた＼まれることによって、再凝集する。その
上、グアニジン−可溶性−蛋白質をイオン交換クロマト
グラフィーのような方法によって精製する時には、再凝
集によって蛋白質のかなりの損失がおきる。（イオン交
換クロマドグフライ−は最終産物に必要な純度を得るた
めに必要なのである。）カラムの汚れおよび詰まりが非
常に短時間でおき、カラムの有効寿命を著しく制限しが
ちである。典型的には、ウシ成長ホルモン封入体をグア
ニジンで可溶性にし、その後イオン交換クロマトグラフ
ィーを行うと、生産物回収率はたった４−１２％である
ことを我々は見出した。

グアニジン塩酸の使用に関するもう一つの重要な問題（
市販製品の見地から特に重要な問題である）は、それが
高価であることである。封入体蛋白質を可溶性にする能
力においてはグアニジン塩酸に匹敵し、グアニジンはど
高コストでない可溶化剤を使用するのが非常に好ましい
。米国特許第４．５１Ｌ５０３号は変性剤としてドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）のような洗）ｐ剤を使用す
ることを示唆した。しかしながらそれを使用した例証も
ないし、その洗浄剤を蛋白質から除去して、蛋白質を精
製する方法も提案されていない。

ＳＤＳのような洗浄剤は非常に有効な変性剤である。そ
の上ＳＤＳはグアニジン塩酸よりずっと安い試薬である
。したがって、封入体蛋白質の回収にそれを使用できれ
ば、それは市場製品経済の観点から魅力的である。しか
しながらグアニジン塩酸と比較して、ＳＤＳは変性蛋白
質によりしっかりと結合し、それを蛋白質から完全に除
去することは容易ではない。

カップ（０，Ｈ，Ｋａｐｐ）およびビノグラドフ（Ｓ、
％ＩＩ。

Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ）は、イオン遅滞樹脂ＡＧ１１Ａ
８でのクロマトグラフィーによって、ＳＤＳを数種類の
蛋白質から除去できることを証明した（Ａｎａｌ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、。

９１；２３０−２３３　（１９７８）　）。この方法で
処理した蛋白質１モルには、０．１〜１．４モルのＳＤ
Ｓが残っていると言われた。ウニバー（Ｋ、Ｗｅｂｅｒ
）およびフタ−（Ｄ、Ｊ、Ｋｕｔｅｒ）は、尿素中での
インキュベーションと、その後の陰イオンクロマトグラ
フィーによって、ＳＤＳを除去することができることを
示した（Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、、２４６　：４５０４
−４５０９　（１９７１）　）−しかしこのどちらの例
においても、出発蛋白質は純粋な、生物学的に活性な形
のものであった。不溶性の細胞内封入体から、蛋白質を
純粋な生物学的に活性な形で効率的に回収する方法は示
唆されていない。

本発明は、トランスフォーマット微生物において不溶性
の生物学的不活性の封入体蛋白質として生産される蛋白
質を回収するための効率的、経済的方法を提供する。発
明の方法は、蛋白質の可溶性な本来の配座への変換およ
びこれに伴う°蛋白質精製のためのものである。発明の
方法においては、グアニジン塩酸のようなより高価な変
性剤よりもむしろＳＤＳのような洗浄剤が変性剤として
用いられる。全く驚くべきことに、我々は、蛍白質を精
製し活性化する本発明の方法を用いた時の蛋白質の損失
が、グアニジン塩酸法の場合よりかなり少いことを見出
した。本発明の方法により、変性剤としてＳＤＳを用い
ると、回収率は、封入体に存在する蛋白質の量を基にし
て約３０％に達した。

この収量は、変性剤としてグアニジン塩酸を用いる先行
技術で得られる収量より有意に高い。本発明の方法によ
って得られる蛋白質生産物は可溶性で、はぼ均質で、Ｓ
ＤＳをほとんど含まない。

より詳細に述べると、本発明は、トランスフォーマット
微生物中に不溶性の、生物学的に不活性な封入体として
生産される蛋白質を精製し活性化する方法であって、 （ａｌ　　封入体をドデシル硫酸ナトリウムの緩衝溶液
に抽出して蛋白質を可溶性にする段階、（ｂｌ　　蛋白
質溶液をイオン遅延樹脂で、クロマトグラフィーにかけ
、ドデシル硫酸ナトリウムの残りを蛋白質から除去する
段階、 （ｃ）　　段階市）からの蛋白質溶液を陰イオン交換樹
脂でクロマトグラフィーにかける段階、から成る方法を
提供する。

本発明の好ましい実施例においては、蛋白質を含むドデ
シル硫酸ナトリウム溶液を処理し、イオン遅滞樹脂によ
るクロマトグラフィーの前にかなりの量のドデシル硫酸
ナトリウムを除去する。緩衝溶液に対する透析または溶
液の凍結により、ドデシル硫酸ナトリウムの一部を除去
することができる。

本発明の方法は、トランスフォーマン＋−ｉ生物、すな
わち異種蛋白質を規定する遺伝子の表現を指示する組換
えＤＮＡベクターで形質転換された微生物において、不
溶性の生物学的に不活性な封入体の形で生産される蛋白
質を精製し、活性化するために用いられる。概して、本
発明の方法によって精製され活性化され得る蛋白質は、
処理条件（後に詳述する）下において塩基性である、負
に帯電した蛋白質である。本発明の特殊の実施例におい
て、精製され、活性化される蛋白質は、ウシ成長ホルモ
ン（ｂＧ）ｌ）　、またはブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）
のような動物成長ホルモンである。

ここで言う一般的には蛋白質（たとえばホルモンおよび
酵素）またはｂＧＩｔおよびｐＧＩｉのような特定の蛋
白質とは、天然蛋白質の全アミノ酸配列を含む分子に限
定されるものでないことは当然である。むしろ、欠失し
た配列の種々の部分を有する蛋白質断片、および分子の
生物学的活性を破壊しない、天然配列中の種々の置換ま
たは変形を有する蛋白質またはその断片を含むことも意
味している。

ｂＧＨおよびｐＧｌｌを規定する遺伝子を表現ベクター
上へクローン化し、これを用いてＥ、ｃｏｌｉ宿主細胞
を形質転換した。欧州特許出願公告第０．１０３，３９
５号は、λＰＬプロモーターーオペレーターのコントロ
ール下でΔ９　（Ｓｅｔ）ｂＧＩＩ（９Ｎ−末端アミノ
酸が少なく、Ｎ−末端に付加的セリン残基を有するｂＧ
Ｈ）を規定し、バクテリオファージｔｓｕに由来するＳ
ｈｉｎｅ−Ｄａｌ−ｇａｒｎｏ領域を有する第一プラス
ミドを含む、。

Ｅ、　ｃｏｌｉのトランスフォーマット株の構造を記載
する。トランスフォーマットは、Ｃ１８５７温度感受性
リプレッサー蛋白質の生産を規定する第ニブラスミド、
　ｐｃ１８５７をも含む。リプレッサー蛋白質は温度を
４２℃に上げることによって不活性化することができ、
それによってΔ９　（Ｓｅｔ）ｂＧｌｌを表現させる。

この型のトランスフォーマット株、Ｅ、ｃｏｌｉＨＢ　
１０１（ＰＬ　−ｍｕ−Δ９　（Ｓｅｔ）　ｂＧｌｌお
よびｐｃ　１８５７）は、Ｅ、ｃｏｌｉ、ＩＭＣＮｏ、
１　と命名され、アメリカ培養コレクション（ロックジ
イル。マリーランド）に受付番号５３０３０で保存され
ている。

Δ７ｐＧＨ（その最初の７Ｎ−末端アミノ酸が足りない
ブタ成長ホルモン）の生産を規定する同様なトランス−
フォーマント株の構造が欧州特許出願公告第０．１０４
．９２０号に記載されている。この型のトランスフォー
マット株、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｌＩｎｌ０Ｉ（ＰＬ　−ｍｕ
−Δ７ｐＧＨおよびｐｃ１８５７）はＥ、ｃｏｌｉ＋　
ＩＭＣＮｏ、２と命名されてアメリカ培養コレクション
（ロックヴイル。

マリ−ランド）に、受付番号５３０３１で保存されてい
る。

Ｅ、ｃｏｌｉ、　ＩＭＣＮｏ、　１およびＥ、ｃｃ＋ｌ
ｉ、　ＩＭｃ　Ｎｏ、　２は、それぞれΔ９　（Ｓｅｔ
）　ｂＧＩＩおよびΔ７ｐＧＩＩの増殖生産体である。

どちらの場合にも、表現された蛋白質は、顕微鏡で見る
ことのできる不溶性の、生物学的に不活性な封入体の形
で細胞内Ｑこ引きこもっている。

トランスフォーマット細胞が発酵槽内で増殖し、問題の
蛋白質が表現されて、封入体として細胞内に蓄積された
後、一般的にはトランスフォーマット細胞を機械的、化
学的、または酵素的に溶解し、細胞内に閉じ込められて
いる封入体を分離させる。

本発明の方法を使用する前に、遠心分離および緩衝液に
よる洗浄によって封入体を細胞物質の残りから分離し、
湿った封入体ペーストをつくることができる。

封入体をＳＤＳの緩衝溶液に抽出し、蛋白質を溶解性に
する。緩衝溶液中の５ＤＳＯ量はその蛋白質を溶かすに
十分な量である。緩衝溶液が約０．１％〜５．０％のＳ
ＤＳを含むのが好ましく、約１％含むのが最も好ましい
。高ｐＨの緩衝液、すなわち約ｐＨ８，５〜ｐ）！１１
までがその蛋白質ｆ溶解した形に保つのに最も適してい
ることが判明した。適した緩衝溶液は、０．０２Ｍ〜０
．１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ、　　炭酸塩−重炭
酸塩、または硼酸塩緩衝液である。所望ならば、回収プ
ロセスにおける分子間ジズルフインド結合の生成を阻止
するのに十分な量の還元剤（例えば２−メルカプトエタ
ノール）もＳＤＳ溶液に加えることができる。しかしな
がら、還元剤の使用により、可溶性の、生物学的に活性
な蛋白質の収量が有意に増加することは見出されなかっ
た。ＳＤＳ溶液中における封入体の解離は一般に、約４
〜１８時間の期間に互っておきる。

ひとたび封入体蛋白質がＳＤＳ溶液に溶解し、解離する
ようになったならば、イオン遅滞樹脂でクロマトグラフ
ィーを行う前に十分量のＳＤＳをその溶液から除去する
ことが好ましい。十分量のＳＤＳの除去は、ＳＤＳを含
有しない緩衝液に対して透析するかまたはＳＤＳ含有溶
液の温度を低下させることによって行うことができる。

あらかじめＳＤＳを除去する段階を行わずに、ＳＤＳ含
有溶液を直接イオン遅滞樹脂上に移すこともできるが、
それは実際的でない、なぜならばイオン遅滞樹脂のみを
使って全てのＳＤＳを除去することは非現実的な大きい
イオン遅滞樹脂カラムを必要とするか、市場製品の観点
から許容できない程低いスループットを伴うからである
。イオン遅滞クロマトグラフィーに先立つ予備的段階で
除去されるＳＤＳの量は、主として蛋白質濃度に依存し
て変化する。一般には、最初存在するＳＤＳの約４０％
〜約７０％が除去される。

こ＼に用いる“透析”という語は、ＳＤＳイオンを半透
過膜を通して選択的に運搬し、所望蛋白質分子はその膜
の他側に残すという方法でＳＤＳを蛋白質溶液から除去
する技術を言う。種々の型の装置を使う公知の透析法の
いづれを利用してもよい。例えば、中空ファイバー限外
ろ過システムを用いてＳＤＳを溶液から透析してもよい
。これらのシステムにおいては、低イオン強度のＳＯ３
不含有緩衝溶液が、半透過性中空ファイバーの束のまわ
りを循環する。透析に用いる低イオン強度−緩衝溶液の
例としては０．０２〜０．１　Ｍエタノールアミン緩衝
液、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ＨＣＯ３−／Ｃ０５−−
）または硼酸ナトリウム緩衝液がある。約０．０２Ｍ以
下の緩衝溶液は溶解度の問題をおこすことがあり、約０
．１Ｍ以上の緩衝液は（役に立つとはいえ）不必要であ
る。ファイバーを通って流れる、蛋白質溶液中の小さい
分子は、膜状ファイバー壁を通過することができ、蛋白
質溶液のイオン強度を減らす。透析ろ過およびサック透
析を含む（しかしこれらに限られない）その他の既知の
透析技術も、蛋白質溶液からＳＤＳを除去するために用
いられる。

上記のように、ＳＤＳを含む蛋白質溶液の凍結を利用し
て蛋白質からＳＤＳの一部を除去することができる。溶
解した封入体蛋白質を含む溶液は一般には、低イオン強
度の緩衝液である、例えば０．０２〜０．１Ｍ炭酸塩−
重炭酸塩緩衝液または硼酸塩緩衝液。その緩衝溶液を、
凍結温度と約２℃との間の温度に、約４時間冷やすこと
によってＳＤＳの一部を蛋白質から除去することができ
る、この場合ＳＤＳは溶液から沈澱し、ろ過または遠沈
により除去することができる。

透析または凍結段階はかなりの量のＳＤＳを蛋白質溶液
から除去する。しかしＳＤＳの若干部分は蛋白質にしっ
かり結合して残る。ＳＤＳを蛋白質から完全に除去する
ために、蛋白質溶液をイオン遅滞樹脂でクロマトグラフ
ィーにかける。イオン遅滞樹脂は、陰イオン−および陽
イオン交換部位を両方含む樹脂で、イオン物質の流れを
選択的に遅らすことができる。そのため、それは弱いイ
オンである蛋白質分子を、よりゆっくりと樹脂を通過す
るＳＤＳイオンから分離することができる。

本発明の方法に使用する好ましいイオン遅滞樹脂は、ビ
オ−ラッドラボラド　リーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。リソチモンド、カリホルニャ、
から市販される、ＡＧ１１Ａ８として知られる樹脂であ
る。

それは樹脂ＡＧＩＸ８（スチレン−ジビニルベンゼン共
重合体に第四級アンモニウム基がついている）のアクリ
ル酸を重合することによって製造され、したがって強い
塩基性に帯電した陽イオン、φＣＩ（２Ｎ＋（ｃ１ｈ）
３と、弱い酸性陰イオン、ＲＣＨ２ＣＯＯ−とを含む。

イオン遅滞樹脂は一般にはカラムに充填した形で用いら
れる。注入液と流出液とで、ｐｌ＋および導電率が一敗
するまで、緩衝溶液（蛋白質なし）をカラムを通過させ
ることによってカラムを平衡化する。それからＳＤＳを
含む蛋白質溶液をカラムに注入する。種々の溶出液を用
いて蛋白質をカラムから溶出することができたが、０．
０２〜０．１Ｍエタノールアミンの緩衝溶液を用いてカ
ラムから溶出するのが好ましく、約０．０５Ｍエタノー
ルアミンがより一層好ましい。ＳＤＳより速くカラムを
通過する蛋白質は、初期溶出液中に集まる。ＡＧ１１Ａ
８カラムは、何倍量もの１．０　Ｍ　Ｎ８４Ｃ１で洗い
、その後何倍量もの脱イオン化水で洗うことにより、ま
たは単に大量の水で洗うことによって再生することがで
きる。

イオン遅滞樹脂からの溶出液は、天然の立体配置に折り
た＼まれたＳＤＳ不含有蛋白質を含む。

イオン遅滞樹脂からの溶出液を陰イオン交換樹脂に注ぐ
、この樹脂も一般にはカラムに詰めた形である。適当な
陰イオン交換樹脂を単に例として挙げると、ＤＥ−５２
，ＤＥ−５３，ＤＥＡＥ−セファローズＣＬ−６Ｂ。

セルフインＡＭ、　ＱＡＥ−セファデックス、Ｑ−セフ
ァローズ、　ＱＡＥ−セルローズ、　ＤＥＡＥ−）リス
アクリルがある。陰イオン交換樹脂は、デキストラン、
アガロース、またはセルローズのような多糖支持体にく
っついた、またはポリアクリレート支持体にくっついた
、第四級アンモニウムイオンのような陽イオン群をもつ
置換基を、かなりの程度に含む。

そのような好ましい樹脂の例はＤＥ−５３である。最近
開発され、蛋白質精製カラムに有用であることがわかっ
た。トリスアクリル（ＬＫＢインスツルメントから市販
される）のような樹脂を用いることもできる。陰イオン
交換カラム溶出液中の蛋白質は、もし所望ならば、限外
ろ過のような既知の技術を用いて濃縮することができる
。

精製した蛋白質を、好ましくはｐ）１８．５かそれ以上
で、塩濃度０〜０．１モルの緩衝食塩溶液を用いて陰イ
オン交換カラムから溶出することができる。

本発明の方法における各段階後、すなわちＳＯ８への抽
出、透析または凍結、イオン遅滞樹脂でのクロマトグラ
フィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー後に、も
し望ましいか必要であることがわかった場合は、蛋白質
含有溶液を遠沈して、生成する沈澱物を除去することが
できる。沈澱物はすてるか、再循環させる。

次の実施例は本発明の実施をさらに詳しく説明するため
のものであり本発明の範囲を決して限定するものではな
い。

Δ７ｐＧ旧生産条件下で培養したＥ、ｃｏｌｉ、　ＩＭ
ＣＮｏ。

２　（ＡＴＣＣ５３０３１）から封入体を得た。発酵槽
の細胞を、発酵槽ビールから遠沈により収穫し、０，１
Ｍ燐酸緩衝液、　ｐｔ１７．８．　１０ｍＭ　ＥＤＴ＾
に懸濁し、マントン−ガラリン（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕ
ｌｉｎ）ホモジナイザーを何回も通すことにより溶解し
た。粗月入体を遠沈により収穫し、この同じ緩衝液で２
回洗った。

これらの封入体２４ｇを０．１Ｍエタノールアミン−Ｍ
ＣＩ、　ｐＨ９，０，１％ＳＤＳに抽出した、このため
には室温で１晩振とうした。生成した抽出液を４８時間
にわたり、２０ｍＭエタノールアミン−ＨＣｌ。

ｐＨ９，０，１６リソトルに対して２回透析した。残っ
た不溶性物質は１５．０００　Ｘ　ｇで３０分間遠沈す
ることにより除去した。澄明になった抽出液を、５０ｍ
Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ　ｐＨ９，８，中で平衡に
したへＧ１１Ａ８イオン遅滞樹脂を詰めた１０１０Ｘ３
０カラムでクロマトグラフィーにかけた。そのカラムを
この同し緩衝液で、線流速０．３　ｃ＋＋＋／ｍｉｎで
展開した。それからフラクション含有蛋白質を、５０ｍ
Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ、　ｐＨ９，０，で平衡に
した０Ｈ−５３セルローズの４．４Ｍ２５ｃｍカラムで
クロマトグラフィーにかけた。抽出液を注入した後、カ
ラムを２カラム量のこの緩衝液で洗い、不純物を空間容
積中に溶出した。それから緩衝液にＮａＣ１を最終濃度
０．１　Ｍになるように加えた、それはΔ７　ｐ　Ｇ　
Ｉｔを溶出させた。

純粋なΔ７ｐＧＨを含むフラクションを限外ろ過膜（１
０，０００ダルトン遮断）上で、窒素圧によって１０倍
に濃縮し、０．２５ｍＭ重炭酸ナトリウム、　０．２１
ｍＭ炭酸ナトリウム、　ｐＨ９，７＋に対して徹底的に
透析し２、さらに３分の１に濃縮し、凍結乾燥した。最
終産物（９９２ｍｇ）はほとんど純粋なΔ７ｐＧＨであ
った。

最初の発酵槽の滴定値を基にした全体的数■は２０．０
％であった。

Δ７ｐＧＩＩ−生産条件下で培養した［ｉ、ｃｏｌｉ、
　ＩＭＣＮｏ。

２（ＡＴＣＣ５３０３１）から封入体を得た。細胞を発
酵槽ビールから遠沈によって得、０．Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ
−１１ｃＩ、　ｐＨ７，８，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　
５％スクロース、に再懸濁した。リゾチーム２００ｍｇ
／ｌを加え、２８℃で４０分間培養した。この時点で細
胞を再び遠沈した。

これを、１０ｍＭ　ＥＤＴ八および０．５ｍＭ還元グル
タチオンを含む０．１　Ｍ燐酸緩衝液、　ｐＨ７，８，
に再懸濁し、４２２〜５６２にｇ／ｃｕｔ　（６０００
−８０００ｐｓｉ）でマントン−ガラリン　ホモジナイ
ザーを２度通すことにより溶解した。プロテアーゼを阻
害するために、弗化フェニルメチルスルホニルを０．５
ｍＭまで加え、粗封入体を遠沈した。ペレットを、０．
１Ｍ）リス−ＨＣｌ。

ｐＨ７，８，２Ｍ尿素、１％トライトンＸ−１００，０
，５ｍＭジチオエリトリトール（ＤＴＥ）に再懸濁させ
、その後遠沈することにより３回洗った。残るペレット
を０．１Ｍ１−リス−〇ＣＩ、　ｐＨ７，８，０，５ｍ
Ｍ　ＤＴＥでさらに２回洗った。

このペレット０．５ｇを１００倍量（５０ｍｌ）の”Ｃ
ｏｒｎｅｌｌ　ｂｕｆｆｅｒ　ｍ１ｎｕｓ　ＮａＣ１″
（’ＣＢ’　２５ｍＭ重炭酸ナトリウム、２１ｍＭ炭酸
ナトリウム、　ｐＨ９，８）。

１％ｗ／ｖ　ＳＤＳ、　１０ｍＭ　ＤＴＥ、　　１ｍＭ
　ＥＤＴＡ中に抽出した、このためには窒素でおおい４
時間振とうした。

この抽出液をＣＢ１５ｍＭ　ＤＴＥ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ
で４００ｍ１に希釈し、１０倍量のＣ１）１５ｍＭ　　
２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）／１ｍＭ　Ｆ！Ｄ
ＴＡに対し透析した。透析した抽出液をＣＢ１５ｍＭ　
ＢＭＥ／１ｍＭ　ＥＤＴ八で平衡にしたＡＧＩＩＡ８イ
オン遅滞樹脂の２．５　Ｘ３５　ａｎカラムへ移し、流
速１００ｍｌ／ｈｒでクロマトグラフィーを行った。

蛋白質含有溶出液を、同じ緩衝液で平衡にしたＤＥＡＥ
−）リスアクリルの４．４　Ｘｌ　５　Ｃ１ｎカラムで
１８０ｍｌ／ｈｒの流速でクロマトグラフィーにかけた
。単一ピークがカラムの空間容積中に溶出するのが見ら
れ、９５％以上の純粋なΔ７ｐＧＨを含んでいた。該当
するフラクションを合一し、限外ろ過膜（５０００ダル
トン遮断）で３倍にｃｉ縮し、１％ＣＢ（０，２５ｍＭ
重炭酸ナトリウム、０．２１ｍＭ炭酸ナトリウム）に対
して強く透析し、凍結乾燥した。最終産物（２６，５ｍ
ｇ蛋白質）は最初の抽出液中の蛋白質のｔ＝　１を基に
して１４．５％の回収率を示した。

実施例■に概略示した同じ方法で、Δ７ｐＧＩ＋−生産
条件下で培養したＥ、ｃｏｌｉ、　ＩＭＣＮｏ、　２（
八ＴＣＣ５３０３１）から封入体を得た。封入体１ｇを
１００倍量（１００ｍｌ）のＣＢ／１％ＳＯ３／２０ｍ
Ｍ　ＢＭＥ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に抽出した、その場合
窒素でお−って３時間振とうした。抽出液を２×４０容
量のＣＢ１５Ｍ　ＥＤＴＡに対して透析し、ＣＢ１５ｍ
Ｍ　ＢＭＥ／１ｍＭ　ＥＤＴＡで４００ｍ１に希釈した
。それからＡＧＩＩ＾８樹脂４．４　Ｘ３０　ｃｍカラ
ムで、２５０ｍｌ／ｈｒ、　ＣＢ１５ｍＭ　ＢＭＩｉ／
１ｍＭ　ＥＤＴＡでクロマトグラフィーにかけた。蛋白
質を含むフラクションを合一し、ＤＥＡＥ−）リスアク
リルの４．４×３０ｃｍカラムで、１５０ｍｌ／ｈｒ、
この同じ緩衝液でクロマトグラフィーにかけた。空間フ
ラクションに蛋白質が溶出しなくなった時、ＮａＣ１を
最終濃度０．２Ｍになるように加え、高度に純粋なΔ７
／ｐＧｔｌを含む単一ピークを溶出せしめた。ｐＧＨを
含むフラクションを合一し、１％ＣＢに対して徹底的に
透析し、４５．７　Ｋｇ／ｃｕｔ　（６５ｐｓｉ）下で
限外ろ過膜（５０００ダルトン遮断）上で１５倍に濃縮
し、凍結乾燥した。生成した産物は、ゲル電気泳動分析
によると９５％以上の純度であるΔ７ｐＧＨを２７ｍｇ
含んでいた。最初の抽出液の総蛋白質含量を基にした全
体的収率は２１％であった。

実施例Ｉに概略示した同じ方法で、Δ７ｐＧＨ生産条件
下で培養したＥ、ｃｏｌｉ、　ＩＭＣＮｏ、　２（ＡＴ
ＣＣ５３０３１）から封入体を得た。これら封入体３ｇ
を１００倍量のＣＢ／１．８％ＳＤＳ／２０ｍＭ　ＤＴ
Ｅ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に、３．５時間振とうすること
により抽出した。この抽出液を２×１６容量のＣＢ１５
ｍＭ　ＢＭＥ／１ｍＭ　ＥＤＴＡに対して透析し、同じ
緩衝液で平衡にしたＡＧ１１Ａ８の４．４×２４０カラ
ムでクロマトグラフィーにかけた。そのカラムをこの緩
衝液で、線流れ速度０．３　ａｍ／ｗｉｎで展開した。

蛋白質を含むフラクションを合一し、５０ｍＭエタノー
ルアミン−ＨＣｌ、　ｐＨ９，０に対して強く透析し、
同し緩衝液でＤＢ−５３の４．４Ｘ２０ｃｍカラムでク
ロマトグラフ一−にかけた。通過してきたフラクション
には蛋白質は溶出しなかったが、０．１Ｍ　ＮａＣ＋を
緩衝液に加えるとΔ７ｐＧ１１の溶出がおきた。該当す
るフラクションを合一し、５０００ダルトン遮断膜上の
振動Ｌ７でいるセル中で５ｍＭ）リス−〇ＣＩ、　　ｐ
ｌ＋７．４．に対して透析ろ過し、大体１０倍に濃縮し
、凍結乾燥した。最終産物は、ゲル分析によって９０％
以上の純度のΔ７ｐＧＨである粉末２９ｍｇであった。

封入体の最初のΔ７ｐＧ１１含量を基にした全体的収率
は５．８％であった。

Ａ９　（Ｓｅｔ）ｂＧ［ｌ−生産条件下で培養したＥ、
ｃｏｌｉ。

ＩＭＣＮｏ、　１（＾ＴＣＣ５３０３０）から封入体を
得た。発酵槽ビールから収穫した生きている細胞（８３
０，６ｇ細胞ペースト）を−８５°Ｃで一時的に貯蔵し
、その後融解し、リゾチームで処理し、ホモジナイズし
、遠沈し、Ｏ，１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７，８，１０ｍＭ　
ＥＤＴＡに再）懸濁した。その後細胞を、マントン−ガ
ラリンホモジナイザーを４２２　Ｋｇ／ａＩｄ（６００
０ｐｓｉ）圧で３回通すことによって溶解した。遠沈（
１４，０００Ｘ　ｇ。

２０分）後、封入体３５７．５ｇが回収された。これを
５００ｍ１　１００ｍＭ）リス−ＩＩｃ１．　ｐＨ１７
，５，０，５ｍＭジチオトレイトール、　０．５ｍＭ　
ＰＭＳＦに再懸濁し、−８５°Ｃに貯蔵した。この物質
の約３分の１　　（１３１，５ｇ）を溶解し、精製／活
性化プロセスに用いた。この粗封入体を１０倍量の０．
２Ｍ　ＮａＨｚＰＯｎ＋　　１０ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ
７，８，で１回洗い、遠沈して１０９．３ｇのペレット
を得た。洗った封入体を６０秒間のホモジナイゼーショ
ンにより、６５６０ｍ１のＯ，１Ｍエタノールアミンｌ
ｌＣｌ、　ｐＨ９，０，１％ＳＯ５に溶解した、−晩振
とう後、この抽出液を１０倍量の２０ｍＭエタノールア
ミン−ＨＣｌ、　ｐＨ９，０，に対してｄｉａｆｉｔｅ
ｒした。これによりＳＤＳ？ａ度は４．８ｍｇ／ｍｌに
まで低下した。

抽出液を８０００ｒｐａ＋で３０分間遠沈して粒子を除
去し、２０ｍＭエタノールアミン−〇ＣＩ、　ｐＨ９，
０，で１：１に希釈し、１５１ｉｔｅｒ　ＡＧ１１Ａ８
カラムでクロマトグラフィーを行った。ＡＧｌＩＡＢカ
ラムから集めたΔ（Ｓｅｔ）ｂＧｔ！プールを、５０酵
エタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ９，Ｏ中で平衡にした
１、８５リットルＤＥ−５２カラムで、１６ｍｌ／ｍｉ
ｎの速度でクロマトグラフィーを行った。通過フラクシ
ョンには、Ａ２１１０によって示されるかなりの量の蛋
白質があった。これに、５０ｍＭエタノールアミンＨＣ
Ｉ、　ｐＨ９，０によるカラム容量の洗浄液を加えると
１８リツトルになった。

溶出液では、まだＡＺＳ。がゼロではなかったから、さ
らに８リツトルのサンプルを集めた。その後０．１およ
び１．０Ｍ　ＮａＣ１の各々で約２カラム容量の洗浄を
行った。これらは別々に集めた。通過フラクションは、
５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析によると、９５％以上の純度のＡ
９　（Ｓｅｔ）ｂＧＨを含んでいた。クーマシーブルー
染料結合分析による蛋白質測定で、合一した溶出液には
−３，２ｇの蛋白質があることがわかった。

ＮａＣｌ洗浄液もＡ９（Ｓｅｒ）ｂＧＨを含んでいた。

しかしそれはほとんど完全に共有結合により凝集してい
た。ＤＥ−５２カラムからの叶−５２溶出液は１８リツ
トルをアミコンＤＣ２限外ろ過装置で４．５倍に濃縮し
た。その後、再循環の間に注入した空気が起泡および沈
澱を生じた。

沈澱物をワットマンｉＪｏ、２ろ祇によるろ過により除
去し、ＹＭ−１０膜で最終的に約２リツトルに濃縮した
。その後その蛋白質溶液を１％　Ｃｏｒｎｅｌｌｂｕｆ
ｆｅｒ　　ｍ１ｎｕｓ　ＮａＣ１”　３６リソトルに対
して３回透析しくサック透析）、凍結乾燥して２．８ｇ
の生産物を得た。

ＤＥ−５２から洗い流した付加的試料８リツトルを分析
するとは＼純粋なΔ９　（Ｓｅｔ）ｂＧｌｌを形成して
いるように見えた。振動セルで１．３リツトルに濃縮後
、ブラッドフォード分析（Ｂｒａｄｆｏｒｄ　ａｓｓａ
ｙ）により１．２５ｇの蛋白質の存在が判明した。

発酵槽の最初の滴定値に基づくと、ＤＥ−５２カラムか
らの通過フラクション１３１ｉｔｅｒおよび洗浄フラク
ション８リツトル中に純粋で可溶性の形で回収されたΔ
９　（Ｓｅｒ）ｂＧｌｌを合わせたものは、約３０％の
オーダーの全体的収率を示す。

大施開旦 Δ９　（Ｓｅｔ）ｂＧＩｌのｌ！ｌ製および活性化Ｅ、
ｃｏｌｉ、　ＩＭＣＮｏ、１（ＡＴＣＣ５３０３０）か
ら得た封入体を、１％ＳＤＳを含む１００容量のＣＢ中
で１晩振とうすることにより抽出した。生成した抽出液
を４時間、０°Ｃに冷やした。沈澱したＳＤＳおよび残
りの不溶性封入体物質を遠沈により除去する。

澄明になった抽出液を、室温に戻した後、ＣＢで平衡に
したＡＧ１１４８充填カラムで線流れ速度０．３ｃｍ／
ｍｉｎでクロマトグラフィーにかけた。蛋白質を含むフ
ラクションを合一し、濃ＨＣｌでｐＨ９，０に調節した
ＣＢ中で平衡にしたＤＥＡＥ−セファローズ・ファース
トフローのカラムに注入した。カラムをＯ９ｌにＮａＣ
１を含むＣＢで展開する。Δ９　（Ｓｅｒ）　ｂＧＨを
含むフラクションを合一し、ＰＭ−１０限外ろ過膜で大
体５倍に濃縮し、５ｍＭ１−リス−）ＩＣＩ、ｐｌ＋７
．４に透析し、凍結乾燥して最終産物を得た。

定 実施例Ｉから■までに得た最終的蛋白質溶液の各々を分
析し、存在するかも知れない残留ＳＤＳの量を測定した
。最終産物のＳＤＳ含を量を、ＣＯ中に１０ｍｇ／ｍｌ
　の濃度で溶解した溶液を調製することによって工周べ
た。この？容液の１００μｍ部分を、１％アクリジンオ
レンジ・０．５Ｍ　ＮａＨ３Ｏ４４液１００μｌ　と混
合した。３ｍｌのトルエンを加え、試験管に蓋をし、３
分間烈しく振動した。臨床用遠心分離器で５分間遠沈す
ることにより水相と有機相を分離した。上層（トルエン
）をガラスキュベントにとり、４９９ｎｍにおける吸光
度を測定した。濃度既知のＳＤＳ溶液系列（Ｏ〜１５０
μｇ／ｍｌの範囲）のＳＤＳ溶液系列でこの操作を行う
ことにより作成した標準曲線から、ＳＤＳ？）３度を出
した。どの実施例においても、Ｓ　Ｄ　Ｓ　濃度はこの
アソセーの定量的下限（約１０μｇ／ｍｌ）より低かっ
た。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）トランスフォーマット微生物中に、不溶性で生物
   学的に不活性な封入体として生産される蛋白質を精製お
   よび活性化する方法であって、（ａ）封入体をドデシル
   硫酸ナトリウムの緩衝溶液に抽出して蛋白質を可溶化す
   る段階と、（ｂ）その蛋白質溶液をイオン遅滞樹脂でク
   ロマトグラフィーにかけ、ドデシル硫酸ナトリウムを蛋
   白質から除去する段階と、 （ｃ）段階（ｂ）からの蛋白質溶液を陰イオン交換樹脂
   でクロマトグラフィーにかける段階 とから成る方法。
2. （２）蛋白質溶液をイオン遅滞樹脂でクロマトグラフィ
   ーにかける前に、その蛋白質溶液からドデシル硫酸ナト
   リウムの一部を除去する段階をさらに含む、特許請求の
   範囲第１項記載の方法。
3. （３）イオン遅滞−クロマトグラフィーを行う前に、蛋
   白質溶液をＳＤＳ緩衝溶液に対して透析することによっ
   てＳＤＳを部分的に除去する、特許請求の範囲第２項記
   載の方法。
4. （４）イオン遅滞樹脂でクロマトグラフィーを行う前に
   、ＳＤＳの約４０％〜約７０％を除去する、特許請求の
   範囲第３項記載の方法。
5. （５）イオン遅滞クロマトグラフィーを行う前に蛋白質
   溶液をその溶液の凍結温度と約５℃との間の温度に冷や
   すことによってＳＤＳを除去する、特許請求の範囲第２
   項記載の方法。
6. （６）イオン遅滞樹脂によるクロマトグラフィーの前に
   約４０％〜約７０％のＳＤＳを除去する、特許請求の範
   囲第５項記載の方法。
7. （７）蛋白質が動物成長ホルモンである、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
8. （８）動物成長ホルモンがウシ成長ホルモンまたはその
   断片または同族体である、特許請求の範囲第７項記載の
   方法。
9. （９）動物成長ホルモンが、ブタ成長ホルモンまたはそ
   の断片または同族体である、特許請求の範囲第７項記載
   の方法。
10. （１０）封入体を、約０．１％〜５．０％のドデシル硫
    酸ナトリウムを含む緩衝溶液に抽出する、特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
11. （１１）封入体を、約１％ドデシル硫酸ナトリウムを含
    む緩衝溶液に抽出する、特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
12. （１２）ドデシル硫酸ナトリウム溶液のｐＨが約８．５
    〜１１である、特許請求の範囲第１項記載の方法。
13. （１３）イオン遅滞樹脂がＡＧ１１Ａ８である、特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
14. （１４）陰イオン交換樹脂がＤＥ−５３である、特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
15. （１５）蛋白質がΔ９（Ｓｅｒ）ｂＧＨである、特許請
    求の範囲第８項記載の方法。
16. （１６）蛋白質がΔ７ｐＧＨである、特許請求の範囲第
    ９項記載の方法。