JPH11509551A - 蛋白質を塩から分離することのできる連続静止相を用いてバッファー交換により蛋白質を巻き戻す方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 開示されるのは、還元された変性蛋白質を変性剤溶液から迅速に分離するセルロース性の巻かれた静止相を用いることにより、より高い蛋白質濃度で高い蛋白質巻き戻し収率を促進すると同時に蛋白質巻き戻しを達成するのに必要な容量を著しく減少させる迅速且つ効率的な巻き戻し法である。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質を塩から分離することのできる連続静止相を用いて バッファー交換により蛋白質を巻き戻す方法 発明の背景 本発明は、迅速なサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、還元し変性した蛋 白質を変性剤溶液から分離する蛋白質巻き戻し（又は再生、refolding）法に関 する。好ましい態様において、本発明は、セルロース性の巻かれた静止相（又は 定常相、stationary phase）を用いて高い蛋白質巻き戻し収量を促進すると同時 に、蛋白質巻き戻しを達成するのに必要とする容量を著しく減少させる、迅速且 つ効率的な方法に関する。 組み換えＤＮＡ技術は、微生物および他の宿主細胞中での外来（異種）蛋白質 の発現を可能にした。多くの場合、異種蛋白質の高い発現は、゛光屈折小体゛また は゛封入体゛と呼ばれる高分子量凝集物の形成をもたらす。このような光屈折小体 の形態である所望の蛋白質の回収は、多数の問題を提起した。まず第一に、光屈 折小体蛋白質を他の宿主細胞物質から分離することが困難である。第二に、その 結果として、所望の光屈折小体蛋白質から光屈折小体蛋白質混入物を除去するこ とが困難である。 第三に、そして最も面倒なことには、光屈折小体蛋白質は、しばしば、所望の蛋 白質と同一であるが、生物学的に活性ではない形態である。 ほとんどの場合、蛋白質の抽出には、変性剤および洗剤（例えば、塩酸グアニ ジン、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−１００）を用い なければならない。その結果できた、個々のポリペプチド鎖が変性した変性蛋白 質を含有する溶液を次いで処理して変性剤を除去するか、さもなければ変性条件 を逆にし、それにより、溶液中の蛋白質の復元（renature）およびポリペプチド 鎖の巻き戻しを可能にして、本来の生物学的形態の蛋白質を得る。薬学的に興味 のある蛋白質に用いる場合、単離した蛋白質から変性剤を完全に除去することが 困難であることから、これらの変性剤の使用は、潜在的問題を引き起こす。更に 、グアニジンのような強力な変性剤を用いる場合、復元は、不可能ではないにし ても困難である。当業界でいくつかの復元プロトコールが述べられてきた；例え ば、Ｕ．Ｓ．５，２３５，０４３（Collins等）およびＵ．Ｓ．４，７３４，３ ６２（Hung等）並びにその中で引用された参考文献参照。 微生物宿主細胞中で発現することのできる蛋白質の一例は、 分泌白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）である。ＳＬＰＩは、気腫お よび嚢胞性線維症のような、白血球が仲介する蛋白質分解を伴う疾患状態の処置 に治療上の興味がある。この蛋白質の十分な安定性および活性には、８つの分子 内ジスルフィド結合に関与する１６個のシステイン残基の適切な巻き戻しを必要 とする。 組み換えＳＬＰＩ（ｒＳＬＰＩ）は、現在、可溶化塩および還元剤を蛋白質の 巻き戻しを可能にする許容される濃度にするために、生成物の流れを０．２ｍｇ ／ｍｌの濃度に希釈することにより、復元している；Harcum等，Biotech.Lett., 15(9),943-948(1993)。この方法は、生物学的に活性なＳＬＰＩが得られるが、 多大の希釈を必要とし、大量の蛋白質を処理しようとする場合、やっかいな大処 理容量をもたらす。他の組み換え蛋白質も、類似の復元／巻き戻し法を用いる； 例えば、Protein Refolding，Georgiou and Bernardez，Eds.，ACS シンポジウ ム シリーズNo．470(1991)；Jaenicke and Rudolph，Protein Structure，T．Cr eighton，ed．(1988)の９章参照。これらの蛋白質の巻き戻しに関係する巻き戻 し処理容量を減少させ、これらの蛋白質の大量の生産をより商業的に実施可能な ものにする 方法を求める必要性が存する。 バッファー交換は、生物薬剤の生産に用いられる重要な分離技法であり、接線 流動濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーのような通常の方法が、変性剤／ 還元剤を蛋白質から分離するそれらの能力を試されてきた。接線流動濾過の利用 は、膜近くの蛋白質勾配、膜の絡まり、および蛋白質凝集をもたらす。親水性ゲ ルを用いたサイズ排除クロマトグラフィーは、これらのゲルの圧縮能力のため緩 慢で困難であり、やはり、蛋白質の実質的希釈をもたらす。それにもかかわらず 、蛋白質の凝集または変性が問題である場合、サイズ排除クロマトグラフィーは 、好ましいかもしれない；Kurnik等，Biotech．and Bioeng.，45(2)，149-157(1 995)。 新しい型のセルロース性静止相に基づくサイズ排除クロマトグラフィー法は、 ５００から６０００ｃｍ／時の移動相速度で蛋白質／塩の分離を可能にする。結 果的に、より小さい容量且つより高い蛋白質濃度で、変性した蛋白質から塩を除 去し、蛋白質を迅速且つ効率的方法で集めることが可能であり、それにより、巻 き戻し処理におけるサイズ排除クロマトグラフィーの使用が実用的なものになる 。詳しくは、このクロマトグラフィ ー法は、円筒形に巻かれクロマトグラフィーカラム内に充填された連続的な織ら れた静止相に基づく。このような静止相を、その形状から「巻かれた静止相」と 呼ぶ。 巻かれた静止相は、誘導または非誘導のいずれかであり、予備調整された、円 筒状に巻かれた織られた織物であり、織られたマトリクスを構成する繊維は、一 定のプレートの高さを保ちながら底部圧縮がなく６０００ｃｍ／時の流速に耐え ることができる。 本発明は、この迅速なサイズ排除クロマトグラフィーに続く蛋白質巻き戻しを 用いて、適切な巻き戻し環境を整えるために通常多大の希釈を必要とする、ＳＬ ＰＩのような蛋白質の巻き戻しに伴う処理容量を著しく減少させる方法を提供す る。本発明の方法の利用は、タンク容量要求、水要求量および処理時間を著しく 少なくし、蛋白質濃度を増加させ、大量の蛋白質の下流処理の実施可能度を改善 する。本発明の方法は、大容量の蛋白質の規模拡大生産を可能にし、治療用途用 の蛋白質、特に組み換えにより生産される蛋白質を調製する人々に価値ある道具 を提供する。 発明の概要 本発明は、迅速なサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、還元した変性蛋白 質を変性剤溶液から分離する、蛋白質、好ましくは組み換えにより発現した蛋白 質を巻き戻す方法に関する。好ましい態様において、本発明は、巻かれた静止相 技術（ＲＳＰＴ^TM）を用いて大容量の発酵生成物の流れの中の蛋白質から変性剤 および還元剤を分離する方法に関する。驚くべきことには、この方法で実施した 分離は、数分しかかからず、高収率の回収をもたらし、続いて短時間のインキュ ベーションを行うと、より高い蛋白質濃度で高収率の適切に巻き戻された蛋白質 を得た。更に重要なことには、この分離技法は、実質的に巻き戻し処理容量を減 少させ、サイズ排除クロマトグラフィーに続く蛋白質巻き戻しの組み合わせが、 処理量を著しく高めることを示している。 好ましい態様において、変性蛋白質と変性剤との混合物から成る発酵生成物の 流れは、分離装置を迅速に通過して変性剤／還元剤から蛋白質を部分的に分別し 、続いて蛋白質を捕獲して蛋白質巻き戻しを可能にする。好ましくは、変性蛋白 質は、組み換えにより発現した蛋白質であり、分離装置は、蛋白質と塩 のサイズの差異に基づく分離を実施することのできる巻かれた静止相である。最 も好ましくは、変性蛋白質は、組み換えＳＬＰＩであり、分離装置は、セルロー スがＤＥＡＥ誘導化物質である６０％綿／４０％ポリエステルの織られたマトリ クスから成るＲＳＰＴ^TMカラムである。 図の簡単な説明 カラムの図式である。 図２は、空孔分布曲線を表す。水に溶解した、１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ、デキ ストラン類および他の分子量プローブの１００μｌの試料を注入し、溶出液は、 脱イオン水である。流速は、１０ｍｌ／分である。 図３は、５００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ ８．０）中のＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）の２ｍｌの試料の実験的蛋白質溶出プロフ ィールである。流速は、２ｍｌ／分である。ＵＶ２８０ｎｍ、０．５ＡＵで追跡 。 図４は、試料１の２ｍｌ注入の実験的蛋白質溶出プロフィールである。流速は 、２ｍｌ／分である。ＵＶ２８０ｎｍ、０．５ＡＵで追跡。 図５は、連続して接続した２つのカラム上に注入した試料１の２ｍｌ注入の実 験的蛋白質溶出プロフィールである。流速は、１ｍｌ／分である。ＵＶ２８０ｎ ｍ、０．５ＡＵで追跡。 詳細な説明 サイズ排除クロマトグラフィーを用いて蛋白質巻き戻し処理を容易にすること のできる方法を、下記の考察で更に詳細に述べており、下記に提供した実施例に より具体的に説明している。実施例は、本発明の種々の態様を示しており、変性 剤および還元剤から組み換えＳＬＰＩを分離するＲＳＰＴ^TMの使用結果を含んで いる。結果は、分離のためのＲＳＰＴ^TMの利用が、実質的に減少した処理容量、 且つより高い蛋白質濃度で高い蛋白質巻き戻し収率をもたらすという点で驚くべ きことであった。 本発明の方法に含まれるものは、いずれかの蛋白質、好ましくは、いずれかの 宿主微生物中でＤＮＡ技術により発現した蛋白質であり、ここで、これらの蛋白 質は、変性剤から単離し復元／巻き戻しする必要がある。特に、低濃度の変性剤 を含む巻き戻し環境、従って大容量を必要とする蛋白質は、凝集物を形成するこ となく比較的高濃度の蛋白質で巻き戻すことができる。本発明に用いられるであ ろう蛋白質の例示としては、ＳＬＰＩ、 脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来成長因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子 （ＮＧＦ）、および向神経性因子−３（ＮＴ−３）が挙げられる。 通常、本発明に使用できるＳＬＰＩは、ヒトＳＬＰＩの、またはそれに密接に 関連した類似体の配列を有する。ＳＬＰＩは、体外の哺乳類細胞により産生する ことができるか、又は、天然源から単離することができる。好ましくは、ＳＬＰ Ｉは、SeelyおよびYoung，ＡＣＳシンポジウムシリーズ番号４７０の１６章,Pro teinRefolding;GeorgiouおよびBernardez,Ed.；ACS:Wash D.C.，206-216(1991) により述べられたように製造された組み換えＳＬＰＩ（ｒＳＬＰＩ）である。Se elyおよびYoungの手法は、ｒＳＬＰＩを製造するのに好ましい方法であるが、当 業界で公知のこの方法を改変および変形することもできる。 本発明のにおける使用のために考案された分離装置には、（１）変性蛋白を変 性剤／還元剤から迅速に分別し；（２）蛋白が生物学的に活性な型に復元／巻き 戻しするのを促進することのできる、いずれかの連続静止相、粒子静止相または 膜の使用を含む。本明細書で用いた「迅速な分別」とは、蛋白質が再生するのを 可能にするのに変性蛋白質の変性剤／還元剤からの 分離が十分ではあるが、変性蛋白質の巻き戻しが１０％を超える前に蛋白質を分 離装置から除去するほど十分速いと定義される。 本発明に用いるために考案された迅速なサイズ排除クロマトグラフィーは、好 ましくは、巻かれた静止相技術(ＲＳＰＴ^TM)カラムにより実施する。これらのカ ラムは、セルロース性固形吸着媒物質、特に連続静止相（これは、以前、５００ ０ｃｍ／時以上の溶出液直線速度での卓越した迅速な分離を実際に行なったこと が示されている（Yang等，Adv．Biochem．Eng.，49，148-160,1993））を、セル ラーゼ酵素で処理して固形吸着媒物質の蛋白質吸着能力を著しく改善することが できるという知見に基づいて開発された。 セルラーゼ酵素は、菌類のような適切な微生物により産生され、それらから従 来の技術を用いて得ることができるか、又は市販源から得ることができる。用い るセルラーゼ酵素は、約２０，０００から約１００，０００の分子量を有するこ とが好ましく、更に好ましくは約５０，０００以上である。 好ましい吸着媒物質は、セルロースに基づいており、粒子、繊維、または好ま しくは織られたもしくは織られていない布を 含んで成る連続相であってもよい。更には、吸着媒物質は、クロマトグラフィー の業界で周知であり用いられるイオン性または非イオン性官能基を導入するよう に誘導して吸着媒物質にカチオン交換、アニオン交換および／またはアフィニテ ィー特性を導入することができる。硫酸塩、アルキル硫酸塩、カルボキシメチル 、燐酸塩、四級塩のような他の官能基または他の有益な基を含有するセルロース を、本発明により調製することもできるが、誘導された吸着媒物質は、好ましく は、ジアルキルアミノアルキルセルロース、例えばＤＥＡＥセルロースのような アミノ−官能化物質である。これらの官能基内のアルキル基は、代表的には、１ 個から約５個の炭素原子を含有する。一つの例として、ＤＥＡＥセルロース物質 を調製するために、綿布を、ＮａＯＨとＤＥＡＥとの混合物中に数時間、例えば 約６から１０時間浸漬することができる。このような処理において、液体に対す る布の比率は、好ましくは、約１：２５から約１：５０Ｗ／Ｖの範囲であり、Ｄ ＥＡＥの濃度は、好ましくは約１Ｍまでである。 本発明によれば、固形吸着媒物質は、２つの異なる物質の繊維を含むことがで きる。例えば、吸着媒物質は、静止相の全体 の機械的性質を強化および改善するように設計された他の型の繊維と組み合わせ た誘導化セルロース繊維を含んで成る布を含むことができる。例えば、誘導化セ ルロースおよびポリエステ な合成繊維を混合して有利な静止相を得ることができる。また、静止相は、異な る誘導化剤で別々に誘導したセルロースの繊維、例えば、ＤＥＡＥ−および硫酸 塩−誘導化セルロース繊維を共に混合して作った布を含むことができる。 上記のように、本発明は、増加した蛋白質吸着能力を有する改造した吸着媒物 質を形成するのに十分な期間、セルロースに基づく吸着媒物質のセルラーゼ酵素 での加水分解を考えている。この物質を調製するための一つの様式によれば、吸 着媒物質を、セルラーゼ酵素で、約３から約８のｐＨで、更に好ましくは約４か ら約６のｐＨで、約６時間までの時間処理する。これらの処理中の温度は、用い た温度が酵素を変性または失活させない限り変えることができる。約４℃から約 ８０℃の温度が代表的であり、更に好ましくは、約２０℃から約６０℃の範囲内 に入る。現在までの作業の好ましい加水分解プロトコールは、約５から約６のｐ Ｈで約５０℃の温度で約１時間セルロース材料を セルラーゼ酵素に露出することを含んでいる。 セルロース材料を処理する酵素濃度は、例えば、約５０ＧＣＵ／ｍｌ以上まで の範囲で広く変えることもできる。更に好ましいセルラーゼ酵素濃度は、約２か ら約１０ＧＣＵ／ｍｌの範囲である。この点で、１ＧＣＵは、濾紙片がセルロー ス分解酵素により加水分解される速度に基づく酵素活性の標準化水準である１Ｆ ＰＵに相当する１ Ｇｅｎｅｃｏｒ単位として定義される。 酵素処理後、例えば、酵素を変性させる熱水に静止相を浸すことにより酵素を 失活させる。この点で、本発明の方法を行う場合、それが、機械的性質の悪い物 質を提供する、および／またはカラムの運転に有害に影響する微粉の収集をもた らすことから、セルロース相物質の分解または切断を完了する前にセルラーゼが 仲介する加水分解を終らせることが重要である。好ましい方法は、少なくとも約 ５ ｌｂｆの分解強度を有する静止相を得るように行う。 また、本発明の好ましい方法には、水または、有機もしくは無機塩基、例えば 、アンモニア、エチレンジアミン、もしくはアルカリのような膨潤化剤の溶液中 で布または他のセルロース物質を膨潤させることを含むセルロースコンディショ ニング工 程も含まれる。水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液は、これらの目的にとって好 ましい。水酸化ナトリウムのような膨潤化剤での前処理は、酵素加水分解に関し て反応性を増加させる。これは、直接的に（膨潤化を通じて）または間接的に（ 酵素の攻撃を容易にすることにより）のいずれかで、蛋白質が利用しやすい増加 した内部気孔率および表面積をもたらすと考えられる。 任意に、セルロースコンディショニング工程は、前誘導化工程も含むことがで きる。セルロース前誘導化は、例えば、ＮａＯＨと塩化２−（ジエチルアミノ） エチル（ＤＥＡＥ−Ｃｌ）のような誘導化剤との混合物に、セルロールに基づく 物質を浸漬することにより達成することができる。コンディショニングおよび／ または前誘導化後、布は、セルラーゼ酵素での更なる処理に先立ち、例えば脱イ オン水で洗浄することができる。 一旦調製したならば、本発明の静止相は、液体または他のクロマトグラフィー 技法の用途に好適な金属、プラスティック、ガラスまたは他のカラム内に充填す ることができる。例えば、本発明の改造した巻かれた連続相を充填するために、 相の端に穴あけ具か何かで穴を開け、高い引張り強度を有する物質、例 をこの穴に通すことができる。次いで、コードをカラムに通し、これを用いて相 をカラム内に引き込むことができる。 好ましいカラムは、少なくとも約０．５ｇ／ｃｃ、通常０．５から０．６ｇ／ ｃｃの範囲の充填密度を有する。同様に、好ましいカラムは、約０．４の低さ及 び約０．３以下の範囲さえの空隙率を有する。これらのＲＳＰＴ^TMカラムは、１ ９９４年６月１５日に出願された同時係属中の米国特許出願第０８／２６０，０ ２２および１９９４年６月１５日にやはり出願された０８／２６０，０２１に更 に特徴づけられており、それぞれその全体を参照により本明細書に含めるものと する。 本発明で述べたクロマトグラフィーと巻き戻しの新規な組み合わせは、温度、 蛋白質濃度、時間および変性剤／還元剤の濃度のようなパラメーターの外的制御 を可能にする。これらのパラメーターが巻き戻し効率に影響することは、当業者 等に周知である。 温度は、クロマトグラフィーカラムに外套をかけ、溶出バッファーの温度を制 御することにより調節することができる。蛋白質濃度（および変性剤／還元剤の 濃度）は、試料サイズ、カ ラムの長さ、および分離装置に注入する試料の初期濃度を調整することにより調 節することができる。巻かれた静止相のユニークな流性、即ち、溶出速度に関わ らず一定のプレート高であるという特徴は、カラムの効率に影響することなく、 且つ、他の型のゲル透過およびサイズ排除媒体に随伴する圧力降下に遭遇するこ となく、流速が必要により変化するのを可能にする。本発明は、これらの因子を 組み合わせて、希釈バッファーの代わりに、試料サイズ、静止相特性、およびカ ラムの長さの操作上のパラメーターを用いて、大きく減少した処理容量で蛋白質 巻き戻しを達成する新規な方法にする。 巻き戻し前に迅速なサイズ排除クロマトグラフィーを用いて蛋白質から変性剤 ／還元剤を分離する特定の蛋白質巻き戻し法に関して本発明を述べ具体的に説明 してきたが、本発明の範囲から離れることなく更なる態様が存在することができ ることは、当業者に明白である。 以下の実施例により、本発明の種々の態様を更に詳細に具体的に説明する。 実施例１ この実施例は、本実験に用いるＲＳＰＴ^TMカラムおよび蛋白 質試料調製物の調製について述べる。 ＲＳＰＴ^TMカラム調製 本発明において、ＲＳＰＴ^TMカラムは、円筒内に巻かれ、 カラム(E．Merck，Darmstadt,ドイツ)内に挿入された６０％綿／４０％ポリエス テルの織られたマトリクスから成った。６０／４０綿／ポリエステル混合布は、 Cotton，Inc(Raleigh，N.C.)により供給され、以下の通りに誘導化した:（１） 布は、処理のために切断し重量を量る前に少なくとも３日間６７−７３°Ｆで６ ０−７０％の相対湿度の調節部屋に保管する;（２）この布を、１８％ＮａＯＨ 中の０.５ＭのＤＥＡＥ−Ｃｌ(Sigma Chemical Corp.,セントルイス,MO)で２２ ℃で６時間前処理し、次いで、脱イオン水で繰り返しすすぐ；（３）前処理した 布の水を手で絞り出し、９ＧＣＵセルラーゼを含有する酵素溶液（５０ｍＭのク エン酸バッファー（ｐＨ４．８）９部とＣｙｔｏｌａｓｅ^TM１２３(Genencor，I nc.)）１部とを混合することにより作製した溶液）（布の重量に対する酵素溶液 の全容量は３０：１（ｍｌ：ｇ）であり、５０℃に予め加熱した）に１時間布を 浸し、次いで、脱イオン水で繰り返しすすぐ;(４) 布を５分間沸騰水の中に入れて酵素を失活させ、次いで、室温で脱イオン水中で 繰り返しすすぐ；（５）工程（２）を繰り返す。 カラム装置を図１で図解する。この型のカラムの気孔率は、２ｍｇ／ｍｌの濃 度で脱イオン水に溶解したＤ₂Ｏ、グルコース、ポリエチレングリコール、およ びデキストランプローブを用いて特徴付けした。溶出液は、脱イオン水である。 プローブは、２０ｘ１０⁶から２ｘ１０⁶の範囲の分子量を有した。得られた気孔 分布曲線を図２に示す。 ２種のＲＳＰＴ^TMカラムを実験に用いた。カラム１は、１０ｍｍ ｉ．ｄ．の ガラスのカラムに適合するように巻かれた布から成り、１０５ｍｍの床高および ８．４ｍｌの充填床容量を有した。カラム２は、１１４ｍｍの床高および９．０ ｍｌの充填床容量を有する１０ｍｍ ｉ．ｄ．カラムであった。試料調製 これらの実験に用いる精製したｒＳＬＰＩ蛋白質溶液を、上記のSeelyおよびY oungにより述べられた通りに調製した。 試料１．３Ｍのグアニジン−ＨＣｌの最終濃度が得られるように固形の グアニジン−ＨＣｌをこの蛋白質溶液に加え た。３０分後、５ｍＭの溶液になるようにジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え た。６０分後、ｐＨを８．０に調整し、ＮａＣｌを５００ｍＭになるように加え た。蛋白質濃度は、２ｍｇ／ｍｌであった。 実施例２ この実施例は、（１）ＲＳＰＴ^TMを用いてｒＳＬＰＩを変性剤および還元剤か ら分離するサイズ排除クロマトグラフィー分離、および（２）分別した蛋白質調 製物の巻き戻し分析について述べる。サイズ排除クロマトグラフィー 本目的は、他の構成成分からｒＳＬＰＩを分離し、その濃度のグアニジンを以 前公開された方法に用いてきたことから、０.３Ｍのグアニジンを含有するｒＳ ＬＰＩを得ることである。 Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｐｉｌｏｔ Ｕｎｉｔ ＬＣＣ−５００ Ｐｌｕ ｓ(Piscataway，N.J.)およびＵＶ検出器（ＩＳＣＯ Ｔｙｐｅ ６ Ｏｐｔｉｃ ａｌ Ｕｎｉｔ，Ｍｏｄｅｌ ２２８）を用いて全処理クロマトグラフィーを行 った。蛋白質を２８０ｎｍで検出し、同時に伝導率計（ＣｏｌｅＰａｒｍｅｒ， ＶＷＲ Ｍｏｄｕｌｅ １０５２）を用いて 塩のピークの出現を検出した。また、ＵＶモニターは、ＤＴＴも検出し、それに より、ＤＴＴの蛋白質からの分解の兆候を示した。検出器からのシグナルは、Ｌ ｉｎｓｅｉｓ ＣｈａｒｔＲｅｃｏｒｄｅｒ（Ｔｙｐｅ ７０４５Ａ）で同時に 記録した。伝導率計の最大目盛りの振れは、１２．９ｍｍｈｏｓに相当する。こ れは、溶出バッファー中のグアニジン−ＨＣｌの標準溶液を計器に直接注入する ことにより測定した。 １００μｌ、２．０ｍｌ、３．０ｍｌまたは４．０ｍｌの試料ループと適合す るＲｈｏｄｙｎｅ注入器を用いて試料をカラム上に注入した。クロマトグラムの 開始は、試料を初めにカラムに入れた時点として測定した。 移動相は、５００ｍＭのＮａＣｌを有する５０ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ ８．０）から成った。５００ｍＭのＮａＣｌが、ＢＳＡがＤＥＡＥセルロースに 結合するのを抑制することを示した以前の実験に基づいてバッファーと塩との組 み合わせを選んだ。従って、移動相およびｒＳＬＰＩの試料は、５００ｍＭのＮ ａＣｌを含有した。 ５００ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ８．０） に溶解した２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミ ン（ＢＳＡ）蛋白質（Sigma Chemical Corp.，St．Louis，MO）でカラムを検定 した。２ｍｌの試料の蛋白質溶出プロフィールを図３に示す。巻き戻し分析 ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ ＲＰ−８カラム(Synchrom．Inc.,Linden NJ)で分析用 クロマトグラフィーを実施した。０．２ｍｇ／ｍｌで１００μｌの試料を注入し た。バッファーＡは、水ｗ／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であり、バッ ファーＢは、アセトニトリル（１００％）ｗ／０．１％ＴＦＡである。カラムは 、室温で実験し、１％／分で１９％から３４％のアセトニトリル勾配を用いて変 性型（１７．９分で溶出）から正しく再生したｒＳＬＰＩ（１３．８分で溶出） を分離した。蛋白質の回収率は、１３．８分のピークの面積を全ピークの合計面 積で割ることにより算定した。実験ラン ラン１．実施例１で述べたように調製した２ｍｌの試料１をカラム１に 装填した。これは、合計床容量の２５％、即ちｒＳＬＰＩが利用できる８３％の 空隙率を表した。２ｍｌ／分の流速を用いた。２．５ｍｌと５ｍｌの溶出容量の 間に溶出 した蛋白質のピークを集めた。この収集は、ＢＳＡ溶出プロフィールに基づいた 。ラン１の蛋白質溶出プロフィールを図４に示す。図４のデータは、ＲＳＰＴ^TM を用いてｒＳＬＰＩを他の構成成分から効果的に分離することができることを示 す。集めた画分をすばやく混合し、次いで、２０℃で４時間インキュベートし、 続いて巻き戻し分析した。ラン１の結果を表１にまとめる。 ラン２．このランは、２．５ｍｌと５．５ｍｌの溶出容量の間に溶出し た蛋白質のピークを集めたことを除いては、ラン１と同様であった。集めた画分 を、次いで、２０℃で４時間インキュベートし、続いて巻き戻し分析した。ラン ２の結果を表１にまとめる。 ラン３．このランは、２．５ｍｌと６ｍｌの溶出容量の間に溶出した蛋 白質のピークを集めたことを除いては、ラン１と同様であった。集めた画分を、 次いで、２０℃で４時間インキュベートし、続いて巻き戻し分析した。ラン３の 結果を表１にまとめる。 ラン４−５．実施例１で述べたように調製した３ｍｌの試料１をカラム １に装填した。これは、合計床容量の３７．５ ％、即ちｒＳＬＰＩが利用できる１２５％の空隙率を表した。２ｍｌ／分の流速 を用いた。２．５ｍｌと５．５ｍｌの溶出容量の間に溶出した蛋白質のピークを 集めた。集めた画分を、次いで、２０℃で４時間インキュベートし、続いて巻き 戻し分析した。ラン４−５の結果を表１にまとめる。 ラン６−８．これらのランは、蛋白質ピークの収集が、それぞれ、２． ５−６．０、２．５−６．６および２．５−６．１ｍｌであることを除いてはラ ン４−５と同じである。集めた画分を、次いで、２０℃で４時間インキュベート し、続いて巻き戻し分析した。ラン６−８の結果を表１にまとめる。 ラン９．このランにおいて、カラム１およびカラム２を連続してつなぎ 、２ｍｌの試料１を注入した。１ｍｌ／分の流速を用いた。ラン９の蛋白質溶出 プロフィールを図５に示す。図５のデータは、カラムを連続してつなぐことによ り、より高い分割が得られることを示す。蛋白質のピークの収集は、６ｍｌの溶 出容量で開始し、１０．５ｍｌで停止した。集めた画分を、次いで、２０℃で４ 時間インキュベートし、続いて巻き戻し分析した。ラン９の結果を表１にまとめ る。 表１に示すように、最も高い収率の巻き戻し蛋白質が、２ｍｌの試料をカラム １に注入した３分後に集めた３ｍｌの画分で得られた。この画分は、１．２８ｍ ｇ／ｍｌの濃度で注入した初めのｒＳＬＰＩの９６％を含有した。これは、蛋白 質、変性剤、および還元剤の混合物を１０倍希釈することにより再生を行う上記 のSeelyおよびYoungの以前に公開された方法に対し６．４倍の蛋白質濃度の増加 を表す。４時間のインキュベーション後、４６％の蛋白質がその活性型へと巻き 戻された。この 収率は、以前公開された方法で報告された巻き戻し収率と一致する。 そして、カラムの長さを二倍にすることにより、より高い分離を有する分離物 を得ることができるが、還元剤および変性剤の濃度が部分的に最適であることか ら、巻き戻し結果は改善しなかった。しかしながら、ラン９は、以前公開された 方法に対して尚４．７倍の改良を提供する。 まとめると、表１に示した結果は、ＲＳＰＴ^TMを用いたｒＳＬＰＩの変性剤お よび還元剤からの分離が、ｒＳＬＰＩの活性型への巻き戻しを促進することを示 している。分離は、５分以下を要し、卓越した収率が得られ、更に処理される物 質の容量を著しく最小にする。従って、データは、適切な蛋白質のプールおよび 復元条件と組み合わせた迅速なサイズ排除クロマトグラフィーが、蛋白質巻き戻 し法の処理量を著しく改善することを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 シーリイ，ロバート・ジエイ アメリカ合衆国、コロラド・80538、ラブ ランド、アシユ・アベニユー・3406 (72)発明者 ラデイシユ，マイケル・アール アメリカ合衆国、インデイアナ・47906、 ウエスト・ラフアイエツト、ラビニア・ロ ード・1228

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 蛋白質を巻き戻しおよび復元し、それによって当該蛋白質がそれらの活性 型を獲得する方法であって、 （ａ）変性蛋白質と変性剤との混合物を、分離装置を通過させ、ここで当該分 離装置は、当該蛋白質を当該変性剤から迅速に分別することができ、そして （ｂ）当該蛋白質を巻き戻すことから成る前記方法。 ２． 当該分離装置が、蛋白質と塩との間のサイズの差異に基づく分離を行うこ とのできる連続静止相を含んで成る、請求項１に記載の方法。 ３． 当該連続静止相が、巻かれた静止相である、請求項２に記載の方法。 ４． 当該巻かれた静止相が、セルロースに基づく吸着媒物質を含んで成る、請 求項３に記載の方法。 ５． 当該セルロースに基づく吸着媒物質が誘導化されている、請求項４に記載 の方法。 ６． 当該巻かれた静止相が、ＤＥＡＥ誘導化６０％綿／４０％ポリエステルを 含んで成る、請求項３に記載の方法。 ７． 当該分離装置が、蛋白質と塩との間のサイズの差異に基づく分離を行うこ とのできる粒子静止相を含んで成る、請求項１に記載の方法。 ８． 当該分離装置が、サイズに基づく蛋白質の保持に基づく分離を行うことの できる膜を含んで成る、請求項１に記載の方法。 ９． 蛋白質を巻き戻しおよび復元し、それによって当該蛋白質がそれらの活性 型を獲得する方法であって、 （ａ）変性蛋白質と変性剤との混合物を、巻かれた静止相を通過させ；そして （ｂ）当該蛋白質を巻き戻すことから成る前記方法。 １０． 当該蛋白質が、ｒＳＬＰＩ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ，ＮＧＦおよびＮＴ− ３から成る群から選ばれる、請求項１または９に記載の方法。 １１． 当該蛋白質が、ｒＳＬＰＩである、請求項１０に記載の方法。 １２． ｒＳＬＰＩを巻き戻しおよび復元し、それによって当該ｒＳＬＰＩがそ の活性型を獲得する方法であって、 （ａ）変性ｒＳＬＰＩと変性剤との混合物を、巻かれた静止 相を通過させ、ここで当該巻かれた静止相は、ＤＥＡＥ誘導化６０％綿／４０％ ポリエステルを含んで成り、そして （ｂ）当該ｒＳＬＰＩを巻き戻すことから成る前記方法。