JPH0533239B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は溶血された血液の主タンパクの分離法
に係り、この方法によつて、アルブミン、ヘモグ
ロビン並びにγ−グロブリンなどのタンパク質を
工業的規模で得ることが可能となる。

血漿または血清からタンパク質を工業的規模で
分画する方法は選択的沈澱法によつている。良く
知られた方法の１つは、エタノールによる選択的
沈澱を利用するCohnの方法である。他の方法で
は別の化学試薬例えば溶媒、硫酸アンモニウム、
カプリン酸、リバノールを使用している。これら
種々の方法は、主としてアルブミンおよびγ−グ
ロブリンを得、またこれらを精製するために応用
されていた。

しかしながら、これらの方法はいくつかの欠点
を有しており、その中で選択性が制限されてお
り、その結果低い精製度を与え、精製段階中にお
けるタンパクの凝集またはポリマーの形成に起因
する変性の結果収率が低下し、かつ遠心分離操作
などにおけるようなめんどうで煩雑かつ微妙な工
業的操作を必要とし、しかも熟練した専門家を必
要とすることを挙げることができる。

さらに、これら方法が溶血々液、例えば血清タ
ンパクの最も重要な原料となる胎盤血液について
実施する場合、ヘモグロビンを除去する公知の工
程はヘモグロビンの変性をきたす。ところで、天
然ヘモグロビンの大量の起源を準備しておくこと
が望ましい。というのは、特に合成血液源として
ヘモグロビンを提供することが興味あるからであ
る。

既に、クロマトグラフイー、特にイオン交換ク
ロマトグラフイーによつて、例えばDEAEデキス
トランで被覆したシリカのマイクロビレツト（例
えばフランス特許出願第7623176号参照）などの
最近のクロマトグラフイー用担体を用いて、血漿
または溶血々液のタンパク質を精製する方法が開
示されている。

25％エタノールの存在下で、PH6.8にて、γ−
グロブリンをアルコール沈澱させて、アルブミン
からヘモグロビンを分離した後に得られる、アル
ブミン含有胎盤血液の上澄みをクロマトグラフイ
ーによつて分離し、次いで１％NaCl溶液によつ
て溶出することによつて回収する方法も既に提示
されている〔J.L.TAYOT等の“合成並びに生体
ポリマーのクロマトグラフイー
〈Chromatography of synthetic and biological
polymers〉，1978，２，95−109参照〕。同様な方
法が前記フランス特許出願明細書において提案さ
れており、そこではグロブリン塊のアルコール沈
澱工程の上澄み液が、蒸溜水で希釈してアルコー
ル濃度を減じた後に、６〜７の範囲のPHの下でク
ロマトグラフイー分離にかけられ、かくして担体
に固定されることなしにカラムを通過するアルブ
ミンをヘモグロビンから分離することができる。

しかしながら、クロマトグラフイー分離を達成
できるという利点があるにも拘わらず、これらの
溶血血液の精製方法は工業的規模で利用すること
はできなかつた。

確かに、クロマトグラフイー分離法により、胎
盤起源アルブミンを精製し得ることがわかつた
が、例えばクロロホルムなどを用いる変性沈澱に
よるヘモグロビンの実質的な除去が必要であり
（J.L.TAYOT等の“Cooperation
internationaleet derives sanguins−Talloires”，
1981，MERIEUX協会編参照）、このような方法
はヘモグロビンの不可逆的変性を生ずる。逆に、
アルブミンおよびヘモグロビンを含む胎盤起源の
上澄み液の、前記クロマトグラフイー分離操作は
工業的規模では達成し得なかつた。というのは、
特にヘモグロビンの担体への固定量がわずかであ
り、完全な溶出が困難であり、その結果繰返し繰
返し担体上に色素が蓄積されて、固定容量並びに
耐用寿命が阻害されるからである。更に、カラム
内に注入される溶液の精製は著しく困難である。
該溶液は絶えず濁度を増し、それによつて濾過は
全く難しくなる。その上、該溶液はアルブミンの
固定を著しく低下させる塩を含んでいる。

そこで、本発明はこれらの欠点を解消し、未変
性状態で、分離すべき溶血々液から、極めて高い
純度で主タンパクを分離する方法を提供すること
を目的とするものである。主タンパクは、例えば
アルブミン、ヘモグロビン並びに場合によつては
γ−グロブリン等である。

本発明のもう一つの目的は、例えば１日当たり
数トンもしくは数十トンの胎盤（これは溶血血液
数万に相当する）を処理するといつたように、
極めて大量の溶血々液を経済的に処理することを
可能とする方法を提供することにある。

本発明は、溶血々液から主タンパク質、特にア
ルブミンおよびヘモグロビンを、未変性状態で分
離する方法を目的とし、該方法においては、アル
ブミンとヘモグロビンとをクロマトグラフイー分
離する工程を含む。該方法の特徴は、溶血々液を
精製工程に付し、次いで好ましくはγ−グロブリ
ンをアルコール沈澱させる前に、イオン交換クロ
マトグラフイー担体上で該溶血々液のクロマトグ
ラフイーを行い、その後夫々別々にクロマトグラ
フイーカラムからヘモグロビンを回収し、かつ溶
出液からアルブミンを回収することにある。ま
た、前記イオン交換クロマトグラフイーを、4.8
より高くかつ6.8より低いPH、好ましくは５〜６
の範囲内のPH条件で行い、予めγ−グロブリンを
アルコール沈澱させる場合には、好ましくは６未
満のPH条件下でクロマトグラフイーを行うことも
特徴の一部である 特に好ましい方法によれば、４〜６、好ましく
は4.8〜5.4の範囲内のPH条件下で、15％未満、好
ましくは約８％程度の濃度のアルコール、好まし
くはエタノールの存在下で精製を行う。

溶血々液は一般に希釈されているので、濃縮処
理を行うが、これは好ましくは10000ダルトン程
度の分離限界を有する限界濾過装置で、好ましく
は少なくとも４回該溶血々液の濃縮を行い、更に
１回の透析濾過を行うことにより実施される。

好ましいことではないが、該溶血血液は、特に
γ−グロブリンを除去するために、予めアルコー
ル沈澱処理に付される場合があり、この場合蒸溜
水もしくは同等な液で、アルコール含有率15％を
越えないように希釈する必要がある。しかしなが
ら、このような希釈処理は大量の液の処理を必要
とし、しかもγ−グロブリンのアルコール沈澱の
場合に必要とされる添加剤がクロマトグラフイー
担体の吸着容量を減じてしまうという欠点を有す
る。

アルブミンから分離され、精製されたヘモグロ
ビンからグロブリン、特にγ−グロブリンを分離
することが望ましい場合には、このヘモグロビン
をクロマトグラフイー工程によつて得た後、約25
％のエタノールを添加し、冷却し、PHを約７に調
節して生成濾過を処理することが好ましい。従つ
て、免疫グロブリンの沈澱は、例えば遠心分離も
しくは濾過により回収し、次いで必要ならば精製
操作にかけることができる。対応する上澄み液も
しくは濾液は著しく純粋な天然物状態でヘモグロ
ビンを含んでいる。このヘモグロビンを少なくと
も同容量の蒸溜水で希釈して、後の変性を完全に
回避するのに十分な程度までエタノール濃度を減
じることが有利である。この溶液を限外濾過並び
に透析濾過して、濃厚な天然ヘモグロビンを回収
することができ、また、かくして得られる生成物
は他の精製操作もしくは他の所定の処理に付する
ことにより、人工の代用血液に転化できる。

本発明によれば、クロマトグラフイー用担体
は、例えばシリカビレツトの基質を含む、極めて
機械特性の高い担体である。

クロマトグラフイー用担体は、スフエロデツク
ス（Spherodex）と呼ばれる担体並びに例えば前
記フランス特許出願明細書またはルクセンブルグ
特許第73094号に開示された、DEAEデキストラ
ンで被覆した多孔性シリカ並びにInstitut
MERIEUXによつて調製された担体であること
が好ましい。

本発明の他の利点並びに特徴は、非限定的実施
例としての以下の記載を考察することによつて明
らかとなるであろう。

実施例 １ 溶血された胎盤血液の精製 ヒトの胎盤150Kgを、凍結状態において粉砕し、
これを水150中に分散させ、エタノール22を
加えて温度を０℃とし、かつアルコール濃度を約
８％とする。かくして得た懸濁液を激しく攪拌
し、次いで孔径50μの布を備えた容量400の圧
搾機で濾過して、胎盤組織からの血液汁を分離す
る。回収された液量は270である。これに一様
に1Nの酢酸または塩酸を加えて、０℃にて攪拌
しつつPH５〜10に調節する。２時間後に、該懸濁
液を300／時なる速度で遠心分離機に注入する。
数日後、約７〜10Kgの沈澱が分離される。上澄み
中に残された溶液は完全に透明であり、約260
の容量を占める。

２ 精製血液の濃縮および透析濾過 10000ダルトンの分離限度を有する膜を備えた
限外濾過器を使用する。例えば、ミリポアフイル
ターとして市販されている、各々５m²の２つの円
筒状スパイラルがこの操作に対し極めて適してい
る。約60まで濃縮した後、1Nソーダ溶液でPH
を約5.50に調節し、次いで脱イオン水約200で
透析濾過して一定体積にする。限外濾液の除去量
は、入口における４バールの圧力に対して約50
／時である。全操作時間は＋４℃で約８時間で
ある。最終のPHは5.25近傍であり、変化しない。
再生後、該限外濾過器は、詰まりを生ずることな
しに200回以上再使用できる。

＋４℃で15時間静置後、濃縮された血液は遠心
分離によつて除去されるユウグロブリンの沈澱を
わずかに含んでいる。遠心分離で得られる残渣は
ロツト当たり100〜300ｇである。容量120の精
製され濃縮された血液は、何の問題もなしに、孔
径0.2μのメンブランで濾過され、後の工程に移る
まで無菌状態で保存される。

３ クロマトグラフイー分離 径16cm、高さ１ｍのカラムを９Kgのスフエロデ
ツクス（Spherodex）で満たす。PH5.25の0.01M
燐酸緩衝液により、既に記載した無菌条件下でこ
れを平衡とする（TAYOT等のCooperation
Internationale et derives sanguins，1981，
MERIEUX LYON協会編）。前に得た、濃縮さ
れかつ精製された血液120を該カラムに40／
時の流量で、孔径0.2μのフイルターを介して無菌
化しつつ注入する。このカラムは次いでPH5.25の
0.01M燐酸緩衝液40で洗浄する。ヘモグロビン
および免疫グロブリンを含んでいる容量135の
濾液を、アルブミンから完全に除去する。後の工
程で使うまで、＋２℃で静置して保存する。他の
タンパク質と共に、カラムに固定されたアルブミ
ンは、20ｇ／濃度のNaCl溶液60を注入する
ことにより溶出される。約1200ｇ（平均胎盤１Kg
当たり８ｇ）のアルブミンを定量的に回収するた
めには容量50で十分である。このアルブミン溶
液は、次いで公知の他の精製処理に付され、ヒト
の治療において使用できるようにされる。

0.1NHCl溶液およびアルコールで洗浄した後、
カラムは再度使用に付すことができる。

効率を損うことなく、50サイクル以上に亘り同
じカラムでクロマトグラフイー分離を実施するこ
とが可能である。

４ γ−グロブリンとヘモグロビンとの最終的分
離 前に得た濾液（135）を、NaCl濃度８ｇ／
に調整し、PHを７に調節し、０℃に冷却する。−
20℃に冷却したエタノール45を攪拌しつつ徐々
に転化し、温度を最終的に−５℃に調節する。一
夜放置した後、得られる懸濁液を、300／時な
る供給量で遠心分離にかける。

得られたγ−グロブリンの沈澱は、複数のロツ
トについて平均で、900ｇであり、次いで公知の
他の精製処理に付して、ヒトの治療に有用な免疫
グロブリンを調製する。

得られる上澄み液は完全に透明である。これは
実質的に免疫グロブリンが除去されたヘモグロビ
ンを含む。０℃の水300で希釈して、アルコー
ル濃度を10％以下に減じる。この溶液は既にのべ
たものと同じ条件で限外濾過し、最終に透析濾過
して、他の用途に応じて溶液のイオン強度並びに
組成を調節する。かくして得られるヘモグロビン
の量は、3700ｇであり、収率は約25ｇ／Kg胎盤で
ある。

PH5.0で実施した実験では、アルブミンを保持
するカラム容量が減小することを示した。しかし
ながら、PH5.2でアルブミンは完全に保持される。
PH6.5で行つた実験ではアルブミンは完全に保持
されるが、ヘモグロビン色素による担体の汚染が
始まることがわかる。

好ましいことではないが、PH７で溶血々液をア
ルコール沈澱させて、γ−グロブリンを除去する
場合には、グロブリン画分の沈澱のおよび前およ
び／または後での、PH5.1およびアルコール濃度
８％での精製が必要とされる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アルブミンとヘモグロビンとのクロマトグラ
   フイー分離により、未変性形の、溶血々液の主タ
   ンパク質の分離方法において、 溶血々液を精製して、次いで、4.8より高くか
   つ6.8より低いPHにて、イオン交換クロマトグラ
   フイー担体により該溶血々液をクロマトグラフイ
   ー分離し、その後、夫々別々にクロマトグラフイ
   ーカラムからヘモグロビンを回収し、かつ溶出液
   からアルブミンを回収することを特徴とする上記
   分離方法。 ２ 前記クロマトグラフイー処理を、５〜６の範
   囲のPH条件下で行うことを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ３ 前記精製処理を、４〜６の範囲のPH条件下に
   て、15％以下の濃度のアルコールの存在下で行な
   うことを特徴とする特許請求の範囲第１項または
   第２項記載の方法。 ４ 前記精製を4.8〜5.4の範囲内のPHの下で行う
   ことを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方
   法。 ５ 前記精製処理を、濃度約８％のアルコールの
   存在下で行うことを特徴とする特許請求の範囲第
   ３項または第４項記載の方法。 ６ 該アルコールがエタノールであることを特徴
   とする特許請求の範囲第３〜５項のいずれか１項
   に記載の方法。 ７ 前記クロマトグラフイー処理をγ−グロブリ
   ンを完全に分離する前に行うことを特徴とする特
   許請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の
   方法。 ８ 前記精製ヘモグロビンからγ−グロブリンを
   分離することを特徴とする特許請求の範囲第７項
   記載の方法。 ９ 前記γ−グロブリンが、PH約７にて、約25％
   のアルコールによる沈澱によつて分離されること
   を特徴とする特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０ 前記クロマトグラフイー処理に対して、
   DEAEデキストランで被覆された多孔性シリカ担
   体を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１
   〜９項のいずれか１項に記載の方法。 １１ 前記クロマトグラフイー用カラムを0.01M
   燐酸緩衝液で平衡させ、これを同一の緩衝液で洗
   浄し、アルブミンの溶出を20ｇ／NaCl溶液で
   行うことを特徴とする特許請求の範囲第１〜１０
   項のいずれか１項に記載の方法。 １２ 前記クロマトグラフイー処理の前に、希薄
   溶血々液を限外濾過および透析濾過により濃縮す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１〜１１項
   のいずれか１項に記載の方法。