JPS60149526A - 溶血血液の未変性形の主タンパクの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は溶血された血液の主タンパクの分離法に係り、
この方法によってアルブミン、ヘモグロビン並びにＴ−
グロブリンなどのタンパク質を工業的規模で得ることが
可能となる。

血漿または血清からタンパク質を工業的規模で分画する
方法は選択的沈澱法によっている。良く知られた方法の
１つは、エタノールによる選択的沈澱を利用するＣｏｈ
ｎの方法である。他の方法では別の化学試薬例えば溶媒
、硫酸アンモニウム、カプリン酸、リバノールを使用し
ている。これら（１１！々の方法は、主としてアルブミ
ンおよびＴ−グロブリンを１号、またこれらを精製する
ために応用されていた。

しかしながら、これらの方法はいくつかの欠点を有して
おり、その中で選択性が制限されており、その結果低い
精製度を与え、精製段階中におけるタンパクの凝集また
はポリマーの形成に起因する変性の結果収率が低下し、
かつ遠心分離操作などにおけるようなめんどうで煩雑か
つ微妙な工業的操作を必要とし、しかも熟練した専門家
を必要とすることを挙げることができる。

更に、これら方法が溶血々液、例えば血清タンパクの最
も重要な原料となる胎盤血液について実施する場合、ヘ
モグロビンを除去する公知の工程はヘモグロビンの変性
をきたす。ところで、天然ヘモグロビンの大量の起源を
準備しておくことが望ましい。というのは、特に合成血
液源としてヘモグロビンを４是供することが興味あるか
らである。

既に、クロマトグラフィー、特にイオン交換クロマトグ
ラフィーによって、例えばＩ］ＩｔΔ１３デキストラン
で被覆したシリカのマイクロビレット（例えばフランス
ＩＬｙ、許出願第７ｆｉ　２：１１７（ｉ号参照〉など
の最近のクロマトグラフィー用担体を用いて、血漿また
は溶血々液のタンパク質を精製する方法が開示されてい
る。

２５％エタノールの存在下で、ｐＨ［ｉ、８にで、Ｔ−
グロブリンをアルコール沈澱させて、アルブミンからヘ
モグロビンを分離した後に得られる、アルブミン含有胎
盤血液の上澄みをクロマトグラフィーによって分離し、
次いで１％Ｎａ口溶液によって溶出することによって回
収する方法も既に提示されている〔Ｊ、１１．　’ｒ八
へ　Ｏ’ｒ等の゛合成並びに生体ポリマーのクロマトグ
ラフ４−（ＣＩ＋ｒｏｍａＬｏｇｒａｐｈｙ　ｏｆｓｙ
ｎｌ：ｌ＋ｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
ｐｏｌｙｍｅｒｓ　）　、ｌ！Ｊ７８゜２　、９５−１
０９参照〕。同様な方法が前記フランス特許出願明細書
において提案されており、そこではグロブリン塊のアル
コール沈澱工程の上澄み液が、蒸溜水で希釈してアルコ
ール濃度を減じた後に、６〜７の範囲のｐｌ＋の下でク
ロマトグラフィー分離はかけられ、かくして担体に固定
されることなしにカラムを通過するアルブミンをヘモク
ロビンから分離することが−（−きる。

しかしながら、クロマトグラフィー分離を達成できると
いう利点があるにも拘わらず、これらの溶血血液の精製
方法は工業的規模で利用することはできなかった。

確かに、クロマトグラフィー分離法により、胎盤起源ア
ルブミンを精製し得ることがわかったが、例えばクロロ
ホルムなどを用いる変性沈澱によるヘモグロビンの実質
的な除去が必要であり（，１，Ｌ、　’ｌ’八Ｙへ］Ｔ
等の’　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ　１ｎＬｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌｅｅＬ　ｄｅ口ｖｅｓ　Ｓａｎｇｕｉｎｓ−’
「ａｌｌｏｉｒｅｓ　”　、　１９８１．　ＭＩＥＲｌ
［ＬＩＸ協会編参照）、このような方法はヘモグロビン
の不可逆的変性を生ずる。逆に、アルブミンおよびヘモ
グロビンを含む胎盤起源の上澄み液の、前記クロマトグ
ラフィー分離操作は工業的規模では達成し１υなかった
。というのは、）ＩＪｌにヘモグロビン“の担体への固
定量がわずかであり、完全な溶出が困難であり、その結
果繰返し繰反し担体上に色素が蓄積されて、固定容量並
びに耐用寿命が阻害されるからである。更に、カラム内
に注入される溶液の精製は著しく困難である。該溶液は
絶えず濁度を増し、それによって濾過は全く難しくなる
。

その上、該溶液はアルブミンの固定を著しく低下させる
塩を含んでいる。

そこで、本発明はこれらの欠点を解消し、未変性状態で
、分離すべき溶血々液から、極めて高い純度で主タンパ
クを分離する方法を提供することを目的とするものであ
る。該主タンパクは、例えばアルブミン、ヘモグロビン
並びに場合によってはＴ−グロブリン等である。

本発明のもう一つの目的は、例えば１日当たり数トンも
しくは数十トンの胎盤（これは溶血血液致方ｌに相当す
る）を処理するといったように、極めて大量の溶血々液
を経済的に処理することを可能とする方法を提供するこ
とにある。

本発明は、溶血々液から主タンパク質、特にアルブミン
およびヘモグロビンを、未変性状態で分離する方法を目
的とし、該方法においては、アルブミンとヘモグロビン
とをクロマトグラフィー分離する工程を含む。該方法の
特徴は、溶血々液を精製工程に付し、次いで好ましくは
Ｔ−グロブリンをアルコール沈澱させる前に、イオン交
換クロマトグラフィー担体上で該溶血々液のクロマトグ
ラフィーを行い、その後夫々別々にクロマトグラフィー
カラムからヘモグロビンを回収し、かつ溶出液からアル
ブミンを回収することにある。また、前記イオン交換ク
ロマトグラフィーを、４．８より高くかつ６．８より低
いｐＨ、好ましくは５〜６の範囲内の１）１１条件下で
行い、予めＴ−グロブリンをアルコール沈澱させる場合
には、好ましくは６未満のｐｌ＋条件下でクロマトグラ
フィーを行うことも特徴の一部である。

特に好ましい方法によれば、４〜６、好ましくは４．８
〜５．４の範囲内の１１１１条件下で、１５％未満、好
ましくは約８％程度の濃度のアルコール、好ましくはエ
タノールの存在下で精製を行う。

溶面々液は一般に希釈され−Ｃいるので、濃縮処理を行
うが、これは好ましくは１０．０００ダルトン程度の分
ｕＥ限界を有する限外濾過装置で、好ましくは少なくと
も４回該溶血々液の濃縮を行い、更に１回の透析濾過を
行うことにより実施される。

好ましいことではないが、該溶血血液は、特にＴ−グロ
ブリンを除去するために、予めアルコール沈澱処理に付
される場合があり、この場合蒸溜水もしくは同等な液で
、アルコール含有率が１５％を越えないように希釈する
必要がある。しかしながら、このような希釈処理は大量
の液の処理を必要とし、しかもγ−グロブリンのアルコ
ール沈澱の場合に必要とされる添加剤がクロマトグラフ
ィー担体の吸着容量を減じてしまうという欠点を有する
。

アルブミンから分離され、精製されたヘモグロビンから
グロブリン、特にＴ−グロブリンを分１ｌｉ１ｔするこ
とが望ましい場合には、このヘモグロビンをクロマトグ
ラフィ一工程によって得た後、約２５％のエタノールを
添加し、冷却し、ρ１１を約７に調節して生成濾液を処
理することが好ましい。従って、免疫グロブリンの沈澱
は、例えば遠心分離もしくは濾過により回収し、次いで
必要ならば精製操作にかけることができる。対応する上
澄み液もしくは濾液は著しく純粋な天然物状態でヘモグ
ロビンを含んでいる。このヘモグロビンを少なくとも同
容量の蒸溜水で希釈して、後の変性を完全に回避するの
に十分な程度までエタノール濃度を減じることが有利で
ある。この溶液を限外濾過並びに透析濾過して、濃厚な
天然ヘモグロビンを回収することができ、また、かくし
て得られる生成物は他の精製操作もしくは他の所定の処
理にイ」ずことにより、人工の代用血液に転化できる。

本発明によれば、クロマトグラフィー用担体は、例えば
ノリカビレットのノ、（質を含む、極めて機械特・性の
高い担体である。

タロマドクラフィー用担体は、スフエロデックス（Ｓ１
＋１Ｉ６ｒ＋ｏｉｅｘ　）と呼ばれる担体並びに例えば
前記フランス特許出願明細書またはルクセンブルグ特許
第７３０９４号に開示された、ｌ］［１Ａｌｉデキスト
ランで被覆した多孔性シリカ並びに１ｎｓＬｉｔｕＬ　
Ｍ１３旧ＢＯＸによって調製された担体であることが好
ましい。

本発明の他の利点並びに特°微は、非限定的実施例とし
ての以下の記載を考察することによって明らかとなるで
あろう。

実施例 １）溶血された胎盤血液の精製 ヒトの胎盤１５０ｋｇを、凍結状態において粉砕し、こ
れを水１５０１中に分散させ、エタノール２２．１１！
を加えて温度を０℃とし、かつアルコール濃度を約８％
とする。かくして得た）ひ濁液を激しく攪拌し、次いで
孔径５０μの布を備えた容量４００Ａの圧搾機で濾過し
て、胎盤組織から血液性を分σ１Ｅする。回収された液
量は２７ＯＡである。これに一様にＩＮの酢酸または塩
酸を加えて、０℃にて攪拌しつ−）１」１１を５〜１０
に調節する。２時間後に、該懸濁液を３００　、ｅ　／
時なる速度で遠心分離機に注入する。数日後、約７〜１
０ｋｇの沈澱が分離される。上澄み中に残された溶液は
完全に透明であり、約２ｆｉＯｅの容Ｕ−１１を占める
。

２）精製血液の濃縮および透析濾過 １０、０００ダルトンの分離限界をイｊする膜ｉ１＋ｉ
ｉｊえた限外濾過器を使用する。例えば、ミリポアフィ
ルタ−として市販されている、各々５　ｓｎ’の２つの
円筒状スパイラルがこの操作に対し極めて適している。

約６０１まで濃縮した後、ＩＮソーダ溶液でｐｌ＋を約
５．５０に調ｆｉｉＩ　Ｌ／、次いで脱イオン水約２０
０１で透ＪＩＩｉ濾過して一定体積にする。限外濾液の
除去量は、人口における４バールの圧力に対して約５［
Ｈ！／時である。全操作時間は＋４℃で約８時間である
。最終の１］１１は５．２５近傍であり、変化しない。

再生後、該限外濾過器は、詰まりを生ずることなしに２
００回以上再使用できる。

−１４℃で１５時間静置後、濃縮された血液は遠心分：
４１Ｆによって除去されるユウグロブリンの沈澱をわず
かに含んでいる。遠心分離でれ１られる残渣はロット当
たり１００〜３００ｇである。容量１２０βの精製され
濃縮された血液は、何の問題もなしに、孔径０．２μの
メンプランで濾過され、後の」二程に移るまで無菌状態
で保存される。

３）クロマトグラフィー分離 径１６ｃ＋ｎ、高さ１ｍのカラムを９ｋｇのスフェロデ
ックス（ＳｐＭｒｏｄｅｘ　）で満たず。ｐＨ５，２５
の０．０ｆ　Ｍ燐酸緩ｉΦｉ液により、既に記載した無
菌条件下−にれを平衡とする（’ｌ’ＡＹＵｉ”等の［
：ｏｏｐｌｒａｌ：１ｏｎＩｎ１．ｃｒｎａＬｉｕｎａ
ｌｅ　ｅｔ　ｄ６ｒｉｖ６ｓ　ｓａｎｇｕｉｎＳ、ｌ！
Ｊｌｌｌ、ＭｌＨＩＥＸ　ＬＹＵＮｂＪ会編）。前に１
１１だ、濃縮されかつ精製された血液１２０βを該カラ
ムに４０ｇ／時の流量で、孔径０．２μのフィルターを
介して（１１閑化しつつ注入する。このカラムは次いで
ｐＨ５，２５の０．＋ｌｊＭ燐酸緩１ｉｌｉｉ液４０β
で洗浄する。ヘモグロビ／および免疫グロブリンを含ん
でいる容量１３５βの濾液を、−アルブミンから完全に
除去する。後の工程て１吏うまで、ト２℃で静置して保
存する。他のタンパク質と共に、カラムに固定されたア
ルブミンは、２［１ｇ／、ｇ濃度のＮａミロ液６Ｈを注
入する、二とにより溶出される。約１２０Ｆｌ　ｇ　Ｏ
Ｆと均胎盤１ｋｇ当たり８ｇ）の′ｒアルブミン定量的
に回収するためには容量５０βで十分である。このアル
ブミン溶液は、次いて公知の他の精製処理に付され、ヒ
トの治療において使用できるようにされる。

０、　ｌＮｌｌＣｌ溶液およびアルコールで洗浄した後
、カラムは再度使用にイー１ずことができる。

効・↑・−を損うことなく、５０ザイクル以上に亘り同
じカラ１１でクロマトグラフィー分離を実施することが
可能である。

４）ｒ−−−グロブリンとヘモグロビンとの最終的分離
前にｉ、ｊｊた濾液（［５，１りを、ＮａＣＩＪ＆度８
ｇ／Ｉ。

に調整し、■］１１を７に調節し、０℃に冷却する。

−２０’ｃに冷却したエタノール４５βを攪拌しつつ徐
々に転化し、温度を最終的に一５℃に調ｉｉ１する。

−夜装置した後、ｆＬ、）られる懸Ｃ′蜀液を、３０Ｆ
ｊｐ／時なる供給量で遠心分離にかける。

１１１られたｒ−グロブリンの沈澱は、複数のロットに
ついての）１ト均で、！ｌｔｌＯｇであり、次いで公知
の他の精製処理に付して、ヒトの治療に有用な免疫グロ
ブリンを調製する。

１１１られる−に澄み液は完全に透明−〇ある。これは
実質的に免疫グロブリンが除去されたヘモグロビン色素
む。０℃の水：１Ｏ１）、１！で希釈して、アルコール
に３度を１０％以下に減じる。この溶液は既にのべたも
のと同じ条件で限外濾過し、最後に透析濾過して、後の
用途に応じて溶液のイオン強度並びに組成を調節する。

かくして内られるヘモグロビンの量は３，７００ｇであ
り、収イ・′は約２．’＋　ｇ　／　ｋｇ胎盤である。

ｐｌ＋５．０で実施した実験では、アルブミンを保持す
るカラム容量が減小することを示した。しかしながら、
ｐＨ５，２でアルブミンは完全に保持される。

１１１１６．５で行った実験ではアルブミンは完全に保
持されるが、ヘモグロビン色素による担体の汚染が始ま
ることがわかる。

好ましいことではないが、ｐＨ７て溶血ノ？７りを゛ｒ
ルコール沈澱させて、Ｔ−グロブリンを除去する場合に
は、グロブリン画分の沈澱の前および／または後での、
１１１５．１およびアルコール濃度８％での精製が必要
とされる。

特許出願人　アンスチチュ　メリュ 代　理　人　弁理士　新居　正ノＪ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　アルブミンとヘモグロビンとのクロマトグラフ
   ィー分離により、未変性形の、溶血々液の主タンパク質
   の分離方法において、 溶血々液を精製し、次いで、４．８より高くかつ６．８
   より低い■】１１にて、イオン交換クロマトグラフィー
   担体により該溶血々液をり６マトグラフイー分離し、そ
   の後、夫々別々にクロマトグラフィーカラムからヘモグ
   ロビンを回収し、かつ溶出液からアルブミンを回収する
   ことを特徴とする上記分離方法。 （２）前記クロマトグラフィー処理を、５〜６の範囲の
   ｐＨ条件下で行うことを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 〔３〕−前記精製処理を、４〜６の範囲のｐ＋＋条件下
   にて、１５％以下の濃度のアルコールの存在下で行なう
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項記
   載の方法。 （４）前記精製を４．８〜５．４の範囲内のｐＨの下で
   行うことを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法
   。 （５）前記精製処理を、温度約８％のアルコールの存在
   下で行うことを特徴とする特許請求の範囲第３項または
   第４項記載の方法。 （６）該アルコールがエタノールであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第３〜５項のいずれか１項に記載の方
   法。 （７）　前記クロマトグラフィー処、理をＴ−グロブリ
   ンを完全に分離する前に行うことを特徴とする特許請求
   の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の方法。 （８）前記精製ヘモグロビンからｒ−グロブリンを分離
   することを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法
   。 （９）前記ｒ−グロブリンが、ｐｌ＋約７にて、約２５
   ％のアルコールによる沈澱によって分離されることをｉ
   、′ｒＣＭとする特許請求の範囲第８項記載の方法。 ０Ｑ　前記クロマトグラフィー処理に対して、Ｉ）ＵＡ
   ｌｉデキストランで被覆された多孔性シリカ担体を用い
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１〜９項のいずれ
   か１項に記載の方法。 （１１）　前記クロマトグラフィー用カラムを０，０１
   Ｍ燐酸緩衝液で平衡させ、これを同一の緩衝液で洗浄し
   、アルブミンの溶出を２０　ｇ　／　ｊｌ！　ＮａＣｌ
   溶液で行うことを特徴とする特許請求の範囲第１〜１０
   項のいずれか１項に記載の方法。 （１２）　前記クロマトグラフィー処理の前に、ん薄溶
   血々液を限外濾過および透析濾過により濃縮することを
   特徴とする特許請求の範囲第１〜１１項のいずれか１項
   に記載の方法。