CN117946970A - 一种高品质人血清纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高品质人血清纯化方法，包括血清的制备和白蛋白分离纯化，其中血清的制备过程中采用两次离心、两次过滤；血清白蛋白的分离纯化先用半饱和硫酸铵沉淀球蛋白，然后用盐析、层析法分离纯化，得到高品质人血清白蛋白，实现对人血清的纯化。本发明通过两次离心、两次过滤过的人血清品质高，为后期人血清白蛋白的分离纯化提供了保障。
Description
技术领域
本发明属于生物工程的技术领域，涉及一种高品质人血清纯化方法。
背景技术
人体血清指的是血液凝固后在血浆中除去纤维蛋白原，分离出的淡黄色透明液体或者说是除去了纤维蛋白原的血浆，人体血液的成分由有形成分和无形成分构成，白细胞、红细胞、血小板是有形成分，血清是血液的无形成分，血清的基本的成分是水，里面有蛋白质、脂肪、葡萄糖、无机盐、维生素等营养成分以及人体的代谢产物。血清具有维持血液正常的黏度、酸碱度、渗透压的作用，为人体提供基本的营养物质，提供激素和各种生长因子等。
人血清白蛋白是目前产量和用量均最多的蛋白质药物，其非糖基化的单链多肽包含585个氨基酸，分子量为66.5kD。在临床上人血清白蛋白可用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、意外事故或大出血所致的血液丢失，也可以作为血浆增容剂。目前人血清白蛋白的分离纯化主要采用醋酸铵沉淀法、凝胶层析法、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法等，但是分离纯化效果有待提高。
发明内容
本发明旨在提供一种高品质人血清的纯化方法，通过两次离心、两次过滤过的人血清品质高，为后期人血清白蛋白的分离纯化提供了保障。
本发明为实现其目的采用的技术方案：
一种高品质人血清纯化方法，包括血清的制备和白蛋白分离纯化，所述血清的制备包括以下步骤：
S1.一次离心：取血液，4℃，3000-4000rpm条件下离心处理20min，得上清液；
S2.二次离心：取步骤S1的上清液，4℃，8000rpm条件下离心处理3-5min，得上清液；
S3.一次过滤：取步骤S2的上清液过0.22μm过滤器，得滤液；
S4.二次过滤：取步骤S3的滤液过0.1μm过滤器，得滤液；
S5.灭活：将步骤S4所得滤液进行病毒灭活，得到高品质血清；
所述白蛋白分离纯化包括以下步骤：
A.盐析：用50％饱和度的硫酸铵溶液沉淀血清中的球蛋白，4℃，4000rpm条件下离心处理15min，得上清液；
调pH至4.5，加入饱和硫酸铵，4℃静置2h以上，然后4℃，4000rpm条件下离心处理15min，沉淀即为白蛋白初产物；
B.除盐：将步骤A得到的沉淀用柠檬酸-Na2HPO4缓冲液溶解，透析至无NH4+；
C.纯化：将步骤B脱盐后的样品，移液至DEAE-纤维素层析柱表面，待样品进入柱床后，先用0.06mol/L的醋酸铵缓冲液洗脱，摒弃该部分洗脱液，然后用0.3mol/L的醋酸铵缓冲液洗脱，收集流出的蛋白，得到纯化后的白蛋白。
进一步地，步骤B中柠檬酸-Na2HPO4缓冲液的pH值为7.4。
进一步地，步骤C的DEAE-纤维素层析柱中CDEAE-纤维素先用0.5mol/L的氢氧化钠溶液处理，然后用0.5mol/L的盐酸溶液处理，再用0.5mol/L的氢氧化钠溶液处理，最后用0.06mol/L的醋酸铵缓冲液浸泡处理，用0.06mol/L的醋酸铵缓冲液洗涤平衡。
进一步地，步骤C的洗脱速度为0.8ml/min。
本发明的有益效果是：
本发明通过两次离心、两次过滤，是前期获得血清品质相较于现有一次离心的更好，第一次离心采用4℃，3000-4000rpm条件下离心处理20min，除去血液中的红细胞和血凝块；第二次离心采用4℃，8000rpm条件下离心处理3-5min，可进一步除去红细胞，但必须严格控制为“4℃，8000rpm3-5min”，时间过长会对血清造成损伤。通过两次过滤，分别是0.22μm过滤器和0.1μm过滤器，可以去除细菌、病毒和其他微生物，过滤所得血清更好，确保制备的血清是无菌的。
本发明在血清白蛋白分离纯化过程中，先用50％饱和度的硫酸铵将球蛋白沉淀除去，然后再结合后文中0.06mol/L的醋酸铵缓冲液再次洗脱除去球蛋白，提高了最终血清白蛋白的纯度；在洗脱纯化时，控制流速为0.8ml/min，相比于现在采用的1ml/min的流速，所得白蛋白的纯度更高。
具体实施方式
实施例1
I.制备血清：
步骤一、第一次离心：取新鲜血液，操作温度为4℃，控制离心转速为3000rpm，高速离心处理20min，取上清液；
步骤二、第二次加强离心：准备上一步得到的上清液，操作温度为4℃，这一步要将离心转速提高到8000rpm，更高的离心转速可以进一步的离心出上一步中可能残留的一些不溶物、红细胞等，高速离心处理3min，高速离心的时间要控制好，3min既能达到去除残杂的效果，又不至于破坏血清，离心结束后，取上清液；
步骤三、第一次过滤：将经过两次离心得到的上清液过0.22μm过滤器，去除细菌、病毒和其他微生物，得滤液；
步骤三、第二次精细过滤：将经过0.22μm过滤器过滤的滤液再次过0.1μm过滤器，达到对细菌、病毒和其他微生物更高的去除率，得滤液；
步骤三、灭活：将经过精细过滤所得的滤液进行病毒灭活，得到高品质血清；
II.分离纯化血清白蛋白：
第一步、盐析：是一般分离纯化血清白蛋白的常用的方法，用50％饱和度的硫酸铵溶液沉淀血清中的球蛋白，在这个饱和度下，球蛋白会沉淀，但是白蛋白不会沉淀，因此需要再在4℃，4000rpm的转速下离心处理15min，沉淀即为球蛋白，而白蛋白还是留在上清液中，因此盐析获得含有白蛋白的上清液；
将盐析得到的上清液调pH至4.5，加入饱和硫酸铵，4℃静置2h以上，然后4℃，4000rpm条件下离心处理15min，沉淀即为白蛋白初产物，饱和的硫酸铵可以将白蛋白沉淀；
第二步、除盐：也是盐析后要经过的一道操作，除NH4+，将盐析得到的沉淀用柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH值为7.4)溶解，放到透析袋中进行透析，透析至无NH4+，即可；
第三步、纯化：纯化的时候采用DEAE-纤维素层析柱进行，先将CDEAE-纤维素用0.5mol/L的氢氧化钠溶液处理，然后用0.5mol/L的盐酸溶液处理，再用0.5mol/L的氢氧化钠溶液处理，将经过酸碱处理的CDEAE-纤维素最后用0.06mol/L的醋酸铵缓冲液浸泡处理，装柱后，用0.06mol/L的醋酸铵缓冲液洗涤平衡；
将脱盐后的样品，移液至DEAE-纤维素层析柱表面，待样品进入柱床后，先用0.06mol/L的醋酸铵缓冲液洗脱，摒弃该部分洗脱液，这时洗脱下来的是盐析后残留的球蛋白，然后用0.3mol/L的醋酸铵缓冲液洗脱，洗脱速度为0.8ml/min(一般控制流速为1ml/min，我们将流速稍微降低了点，降低层析速度，在纯度上是略有提高的)，收集流出的蛋白，得到纯化后的白蛋白。
取纯化后的白蛋白样品，置于57℃水浴中，保温50小时后，灯检法观察无肉眼可见异物。
取纯化后的白蛋白样品，用生理氯化钠溶液将样品蛋白质含量稀释成10g/L，依照《2010年版药典三部附录ⅤA》pH值测定法，测定其pH值为7.1。
取纯化后的白蛋白样品，对其进行无菌检查、病毒检查和热原检查，检查结果均符合规定，检测纯化后白蛋白的纯度达99.1％。
Claims (4)
1.一种高品质人血清纯化方法，包括血清的制备和白蛋白分离纯化，其特征在于，所述血清的制备包括以下步骤：
S1.一次离心：取血液，4℃，3000-4000rpm条件下离心处理20min，得上清液；
S2.二次离心：取步骤S1的上清液，4℃，8000rpm条件下离心处理3-5min，得上清液；
S3.一次过滤：取步骤S2的上清液过0.22μm过滤器，得滤液；
S4.二次过滤：取步骤S3的滤液过0.1μm过滤器，得滤液；
S5.灭活：将步骤S4所得滤液进行病毒灭活，得到高品质血清；
所述白蛋白分离纯化包括以下步骤：
A.盐析：用50％饱和度的硫酸铵溶液沉淀血清中的球蛋白，4℃，4000rpm条件下离心处理15min，得上清液；
调pH至4.5，加入饱和硫酸铵，4℃静置2h以上，然后4℃，4000rpm条件下离心处理15min，沉淀即为白蛋白初产物；
B.除盐：将步骤A得到的沉淀用柠檬酸-Na2HPO4缓冲液溶解，透析至无NH4+；
C.纯化：将步骤B脱盐后的样品，移液至DEAE-纤维素层析柱表面，待样品进入柱床后，先用0.06mol/L的醋酸铵缓冲液洗脱，摒弃该部分洗脱液，然后用0.3mol/L的醋酸铵缓冲液洗脱，收集流出的蛋白，得到纯化后的白蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种高品质人血清纯化方法，其特征在于，步骤B中柠檬酸-Na2HPO4缓冲液的pH值为7.4。
3.根据权利要求1所述的一种高品质人血清纯化方法，其特征在于，步骤C的DEAE-纤维素层析柱中CDEAE-纤维素先用0.5mol/L的氢氧化钠溶液处理，然后用0.5mol/L的盐酸溶液处理，再用0.5mol/L的氢氧化钠溶液处理，最后用0.06mol/L的醋酸铵缓冲液浸泡处理，用0.06mol/L的醋酸铵缓冲液洗涤平衡。
4.根据权利要求1所述的一种高品质人血清纯化方法，其特征在于，步骤C的洗脱速度为0.8ml/min。
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