SU786854A3 - Способ получени препарата на основе белковой сыворотки - Google Patents

Description

У -глобулиновую фракцию II I - I обрабатывают далее следующим образом. Осадок Р погружают в цитрат-фосфатный буфер с рН от 7,0 до 7,4, при температуре 15°С. Добавл ют 3% полиэтиленгликоль 4000 (РВУ) или 2,5% РЕ Y 6000. После реакции, продолжающейс  от 30 мин до 4 час, смесь подают на центрифугу. Получают супернатант фракцию II1-1 {осадок Р). Супернатант Sj- еще раз обрабатывают и фракционируют при рН 4,6, количество РЕ - около 5% при тем пературе -15°С), Получают фракцию HI (осадок Pg) , а также супернатант 5, который, главным образом, содержит . иммунный глобулин. Глобулин фрак ции II1-1 и III значительно обогаще иммунньоми глобулинами IgG, IgA IgM Кроме того, он содержит -антитрипсин , ,-хаптоглобин, церулоплазмин, траноферрин и хаемопексин. Фракции III-1 и W далее не обрабатывают . В качестве исходного продукта примен ют как фракцшо IV, так и фрак ции М1- I и IП. Их смешивают в установленных соотношени х , причем в общих протеинах содержитс  от 50 до 70% альбулина ил от 50 до 30% глобулина.. Также возможно путем соответствующего повышени  добавки части глобулина или фракций J М -1 и IN повысить долю глобулина igM и, IgA. Фракции IV, (И- и 1И cycneHSHp ют в растворе поваренной соли или в другом пригодном буферном растворе, вес.%: Фракци  IV30-80 Фракци  III - I 0-70 Фракци  )II0-70, причем общее количество протеинов 100%. Препарат на основе белковой сыворотки можно получать только из какой-либо одной из фракций I И - I ; III или получить специфичные плаз, мопротеины из отдельных фракций в устойчивой, растворенной форме в качестве препарата. Препарат можно получить из смеси полученных конечных продуктов фракций Itl-I, 1.1 I и IV. Вещества, смешанные в определенных соотношени х и суспензированные в пригодном буферном растворе или в растворе поваренной соли, под вергают предварительной очистке. При предварительной очистке путем адсорб ции на пригодных адсорбентах (аэрози бентонит или другие кремнийсодержащи комплексные соединени ) удал ют липи ные факторы JL - и р -глобулинов. Посл этого продукт фильтруют, диализируют и устанавливают нужную концентрацию раствора. Дл  устранени  вирусов производ т пастеризацию путем нагрева до 60 С в течение 10 часов. Однако при этих услови х возможна денатураци  протеинов сыворотки или же обрабатывают -пропиолактоном и ультрафиолетовыми лучами. Способ по сн етс  следующими примерами . Пример 1. КЗ00 л раствора . поваренной соли (дистиллированна  вода с 1,7% по весу NaCl, который получают в помощью 6,2 н. НС1 с рН 4,6) добавл ют 10 kp COHN фракции IV со следующим анализом белка и суспендируют , % г Альбумина55 Х- -Глобулина10 .д -Глобул и на8 Р -Глобулина15 у -Глобулина-12 Фракци  IV содержит около 50% твердых веществ (белок, соль) и 50% влажного остатка (, остаточный этанол) . Далее добавл ют 5 kp СОНМ фракции II(-1 (субфракци ) со следующим анализом твердых составл ющих, вес.%: Альбумина15 olw -Глобулина2 ,д -Глобулина13 ( -Глобулина17 /д -Глобулина , 53 и 5 kp COHN субфракции IN-2 со следующим анализом суспензируетс ,- вес.%: Альбумина .8 di -Глобулина3 сС -Глобулина9 р -Глобулина25 Jr-Глобулина55 Соотношение твердого вещества и влажного остатка во всех фракци х практически одинаковое. 20 kp флажной фракции суспензируют в растворе и перемешивают. При этом значение рН поддерживают досто нным и равным 4, б. Растворима  субстанци ,, имеюща с  в растворе, раствор етс . Имекеда с  нерастворима  . субстанци  дает помутнение раствора и составл ет около -12% по отношению к всему количеству твердых составл ющих . Среди нерастворимых веществ имеютс , в частности, денатурированные глобулины, включа  липопротеиды, которые на дальнейших ступен х способа не нужны. Последние удал ют путем центрифугировани . Оставша с  жидкость имеет слабую мутность и желтоватый цвет. Добавл ют 0,2 NaOH, устанавливают значение рН на 7,4. В раствор добавл ют чистую колоидную кремниевую соль до достижени  концентрации 5 вес.% и все перемешивают. Жидкость подогревают до (около 1 -в минуту ) и значение рН поддерживают посто нным. После достижени  температуры 45 С жидкость перемешивают в течение 4 часов. Во врем  процесса длительноустойчивые протеины соедин ютс  с кремниевой кислотой и образуют осадок, который удал ют центрифугированием. Жидкость, оставшуюс  после центрифугировани , осветл ют при пропускании ее через фильтр с активированным углем. После этого фильтрат становитс  прозрачньм  нтарного цвета. Далее жидкость концентрируют до 25% по отношению к исходному объему с по мощью способа диаконцентрации (миллипоры - кассетна  система, мембрана - величина пор 10.000 дальтон). После этого концентраци  белка в рас творе составл ет 3,4-4,5 вес.%. Анализ показывает, что благодар  диаконцентрационной ступени все фрак ции, составл ющие кровь с молекул рным весом, меньшим 10.000, из концен рата удал ют.К ним принадлежат фрак ции, которые нежелательны дл  консервировани , например олигопептиды с вазоактивньш действием. После этого дл  окончательного удалени  примесей, а также электролитического установлени  диализа, обработку ведут трехкратным раствором , 0,9%-ного NaCB. Диализ провод  в одинаковых аппаратах с одинаковыми мембранами, которые примен ют при концентрирювании. Последук цее концентрирование заканчивают установлением концентрации протеина 6-10%. После этого с помощью раствора NaC8 устанавливают физиологические услови  изотонии, присущие человеческой крови, и обща  концентраци  протеинов становит с  равной 5% Анализ полученных в примере 1 пр теинов показал следующие значени , мг: ( содержание в 100 мл) Протеин5.000 Альбумин2.925 .500 IgA380 IgM.285 Полученный раствор фильтруют дополнительно через стерилизующие фильтры. Благодар  мембранным фильт рам происходит стерильна  фильтраци После этого препарат готов дл  внутривенной инъекции. Пример 2. ВЗООл раствора как и в примере 1, раствор ют, kp: 7,5 COHN фракции I.V 4 COHN фракции III-I 8 COHN фракции tII Состав этих соответствует примеру 1. Фракции перемешивают с растворителем, значение рН поддержи вают 4,6. В раствор добавл ют 60 г на литр аэрозила и значение рН уста навливают равным 7,6 и смешивают п температуре 47°С в течение 4 часов, после этого раствор охлаждают до 18 и гидравлически фильтруют. Гидравли ческую фильтрацию производ т в намы ных фильтрах, тип CHF-S. в качестве фильтровального средства используют Super Cet 8%-ной концентрации на общее количество фильтрата. В качестве фильтровального средства можно примен ть также кизельгур целит 545 в 5%-ной концентрации . Пример 3. После очистки растворы раздел ют и подвергают обработке способом диаконцентрировани ,как в примере 1. Их можно при желании обрабатывать до получени  конечного концентрата по способу, описанному в примере 1,и после этого по выбору соедин ть в любой состав. Пример 4. В 200 л фосфатноцитратного буферного раствора (0,66 моль фосфат-цитрата) раствор ют 10 kp фракции III в течение 3 часов. Значение рН устанавливают 7,5 и после последующего разбавлени  в 300 л перемешивают с упом нутым буферным растворе при добавлении 100 г/л аэрозил/бентонита (2:1) в течение 4 часов при-45 с. После охлаждени  до 10°С суспензию фильтруют на наливном фильтре через фильтрат, в качестве которого примен ют кизельцелит .545, количество которого на 1 м- фильтровальной поверхности составл ет 1,0 кг, причем мощность фильтра 50 л/м час. Фильтраци  происходит как и диаконцентрирование в примерах 1-3. Раствор готового конечного концентрата содержит 5% белка. При этом средний состав следук ций , мг : Протеин5000 Альбумин Около 1SOO-2000 Глобулин3.000-3200 Ig fОколо 1.450 IgAОколо 700 IgMОколо 500 Пример 5. COHN фракции 1-1II и IV-I с концентрацией этанола 40% и со значением рН 5,8 выдел ют в ступени. Под фракцией IV-I следует понимать фракцию, идентичную фракции IV. Осадок изолируют 20 кг преципитата , как и в примере 1 погружают в 300 л растворител  и далее обрабатывают . Пример 6. Фракционирование человеческой плазмы производ т спомощью риванола (2-этокси-6,9-дигилино-ацидинилацетат ), при этом выпадают осадки II, III и IV. Эти осадки можно по предлагаемому способу обрабатывать до получени  препарата белковой сыворотки. По 10 kp каждого осадка, т.е. вместе это составл ет 30 kp, внос т в 300 л растворител , как и в примере 1. Дальнейшую обработку производ т также, как и в примере 1. Пример 7. В 200 л раствора поваренной соли (дистиллированна . вода с 1,7 вес.% NaCB, у которой величина рН при помощи 0,2 н. НС устновлена в 4,б и котора  ниже называетс  растворителем) добавл ют 6,0 kp COHN фракции IV со следующим анализом компонентов белка и суспендируют , вес,%:

Альбумина53

оС,-Глобулина 11

j

Ч -Глобулина 8

-Глобулина 14

Га1 маглобулина 14

Затем добавл ют 4,0 kp COHN подфракций IN со следукщим анализом белковых компонентов, вес.%:

Альбумина7

(JL;, -Глобулина 3

.д -Глобулина9

Р -Глобулина 26

Гаммаглобулина 56

Соотношение остаточной влажности (, остаточный этанол) и твердых веществ (белки, соли) составл ют окло 1:1.

10 kp влажной фракции суспендируют в растворителе и размешивают. При этом величину рН поддерживают посто нно 4, 6. Следующие стадии протекают, как описано в примере 1 (центрифугирование; обработка креневой кислотой, фильтрование на активном угле, концентрирование диализом ) .

На 100 мл раствора при 5.000 мг установленного содержани  протеина

получают около 37% сшьбумина, соответственно 1.850 мг, около 63% глобулинов , соответственно 3.150 мг, содержание иммунных, глобулинов, мг: IgG Около 1.450 IgA Около 700 IgM Около 500 Предлагаемый способ позвол ет получить препарат на основе белковой сыворотки с повышенным содержанием иммуноглобулина.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  препарата на основе белковой сыворотки путем фракционировани  плазмы с последующей адсорбцией, очисткой и стерилизацией, отличающийс  тем, что, с целью повышение содержани  иммуноглобулина , плазму освобождают от продуктов коагул ции, фракционируют по способу Кона, из полученной после фракционировани  фракции III выдел ют фракции III-I и 111-11, последние смешивают с фракцией. IV и суспендируют смесь в физиологическом растворе .

   Источники , прин тые во внимание при экспертизе i

   1, W.Stephan - Vox Sanguim, 442457 , 1975.