JPS62503036A - 静脈を介して投与されるガンマ−グロブリンの調製方法および該方法により得られたガンマ−グロブリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 静脈を介して投与されるガンマ−グロブリンの調製方法および該方法により得ら れたガンマ−グロブリン本発明は静脈を介して投与可能なガンマ−グロブリンの 調製方法とこの方法によって得られたガンマ−グロブリンに関するものである。

現在市場には種々の方法によって調製された多くのガンマ−グロブリンが存在し ているが、これらガンマ−グロブリンにはその製法に起因する欠点があり、しか も、品質の面で問題がある。

これらの方法が最も改良しようさ努力している欠点は、アナフィラキシ−ショッ クを引き起すような反応を伴う袖体の活性能を正しい値にすることである。一般 に、この抗？１０体活性は各々の調製方法、とくにアルコール分画段階に特有で あると思われるグτＪプリン塊が存在することにより生ずる。

そのため、この欠点を克服あるいはより少なくするための調製方法がこれまで種 々開発されてきた。

そのうちの第１の方法は上記グロブリン塊を除去しようとするもので、ガンマ− グロブリン調剤のペプシン分解により、Ｆａｂ部分とＦｃ部分の結合部位近傍の Ｉ］釦を破断させる。この方法に関しては例えば、フランス国特許第２．４３３ ．３４２号を参照のこと。

もうひとつの方法は本出願人が発明したものである。この方法は、ガンマ−グロ ブリン調剤のプラスミン処理により、無傷のガンマ−グロブリンの比率を高＜（ ３０から５０％）維持したままＦａｂ部分とＦｃ部分を作り出すように条件管理 下で分解を起させるものである。この調剤は活性であり、広く用いられている。

しかし、抗補体活性を減少させるために開発されたこれら方法はガンマ−グロブ リンを大なり小なり過度に分解させる欠点があるため、最終的には上記調剤は、 活性と無毒性の妥１＜ｉ点を見つけて調製している。

また、アルキル化、還元、スルホン化等により化学的に変化したガンマ−グロブ リンのＪ、！Ｉ　Ｍ法も種々知られている。

フランス国特許第２．３０１．２６ｆ；号では、ガンマ−グロブリンに対しては 酵素処理、１）にペプシン処理を行うのでは１．［＜、その代りにポリエチレン グリコールで分画することが提案されている。

そのようなわけで、ポリエチレングリ：Ｊ−ル（ＰＥＧ）分画法によるガンマ− グロブリンの調製方法が完成された。この方法には、Ｊｌ［傷のグロブリンを残 したままで、グロブリン塊の形成を阻止するか、あるいはグロブリン塊を除去す ることができるという利点がある。

さらに、」ユ記の各３Ｍ剤はカリクレイン−ブラジキニン系の活性化によるショ ック因子を程度の差はあれ有するであろう。

この因子はブレカリクレン活性因子の残留含有量に関係しているものと思われる 。

高品質のガンマ−グロブリンを得るための別の方法は、少量のペプシンの存在下 に酸性ｒｏｌ＋で処理する方法である。゛この方法に関しては、ジエイ、ジェイ 、ワルシュ（Ｊ、　Ｊ、　Ｗａ　ｌ５ｈ）の「静脈用免疫グロブリンの精製法」 ディベロップメント　オブ　バイオロジカル　タンダート（Ｄｌ）νＥＬＯＩ＋ 、　ＢＩＯＬ、　５ＴＡＮＤ、＞１９７４年、第２７巻、３１〜６ページを参照 されたい。しかし、この方法を用いてもグロブリン塊と２量体とがかなり高５↑ ｌで残また、ヨーロッパ特許出願第０．１２０．３８５号は、ペプシンやプラス ミンが不溶化されるされないに関係なく、これら酵素による処理は行わず、その 代わりに膵臓酵素分解と比較的高濃度のポリエチレングリコール処理とを組合せ ることを提案している。しかし、このガンマ−グロブリンはザブクラスが平衡に ならない。

本発明は、静脈を介して投与可能な、グロブリン塊と２量体が無く、抗補体活性 が無く且゛つカリクレインとプレカリクレイン活性因子が無く、しかもヒトの正 常な血清のサブクラスに似た形状のザブクラスを有するガンマ−グロブリン調剤 を提供するものである。

本発明の別の目的は、ＰＥＧまたはその類似物を少量用いた分画によって調製さ れたガンマ−グロブリン調剤に適用された場合に、抗補体活性を小さくし、カリ クレインおよびプレカリクレイン活性化因子の含有率と残留ＰＥＧとを減らして 上記調剤を改良する方法を提供することにある。

本発明が対象とする静脈を介して投与可能なガンマ−グロブリンの調製方法の特 徴は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその類似物質を用いる分画段階 と条件管理下での酵素処理段階とを含み、この酵素処理段階でのｐ＋＋は使用す る酵素の種類により変化させ、この酵素は好ましくは微量添加して、上記酵素処 理段階ではタンパク質加水分解がほとんど起らないようにする点にある。

使用される酵素は、ペプシン、フィブリノリジン（プラスミン）′Ｊ６よびパパ インの中から選択される。

出発原Ｆｌは、ガンマ−グロブリンに富んだ血清から得られたフラクションであ る。例えば、肝炎を生じさせないとして公知のコーン（Ｃｏｈｎ）法６．９のフ ラクション■またはティラー（Ｔａｙｌｅｒ）の改良したコーン法６．９のフラ クションがある。このフラクションはＩｇＧの純度が９０％以上である。このフ ラクションはアルブミンを含むことがあり、その量は多い場合には１０％に達す ることもある。

１、ＰＥＧを用いた沈降処理 出発原祠料は上記フラクションの沈殿を溶液にし、この溶液を清澄化させたもの で、この溶液は１から４％のタンパク質を含んでいる。この溶液に対して分子ｆ ｆｔ４０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を加えて沈降処理を行い、Ｐ ＥＧ濃度を５％にする。ｐｌ＋は酢酸または０．ＩＮのＨＣＩを加えて５．８に 調節し、温度はＯから４℃の間に維持する。イオン強度は極めて低く、０．０２ 程度である。

こうしてグロブリン塊を含む沈殿物を得る。この沈殿物を単純なデカンテーショ ン、濾過または遠心分離によって溶液から分離して除く。

次に、得られた」二澄みに対して新たにＰＥＧを加えることなく同一温度で再度 沈降分離を行うが、イオン強度は０．０５から０．２％、好ましくは０．１％の ＮａＣ］を加えて０．０５まで高め、ｐｌ＋は７から８．５、好ましくは８．０ にする。

この処理により沈降したガンマ−グロブリンをデカンテーションまたは遠心分離 によって液相から分離する。

この沈降物は高分子量のグロブリン塊が除去されたガンマ−グロブリンを含むが 、２量化されたタンパク質もまだ約１０％の比率で含んでいる可能性がある。電 気泳動法によると、この生成物の純度は９０％以上である。この生成物はアルブ ミンを含んでいる可能性がある。抗補体活性は極めて弱い。カリクレインおよび プレカリクレイン活性因子の含有率は減っているが、まだ少しは残存している。

その比率は使用した出発材ネ旧ことれだけ含有されていたかによって異なる。

２、条件管理下での酵素処理 」１記のガンマ−グロブリン沈殿を再度パイロジエンフリーな水に溶かしてガン マークｔコブリン濃度を２０ｇ／ｌにする。

５０ｇ／βのサッカロースと０．００２ｇ　／　１のペプシンを添加し、２！Ｍ 度を」−げて３７℃に維持し、ｐＨを４．１に調ｉｉ：ｉ　ｉ、、、２４時間イ ンキュベーションする。

」１記ペプシンは、通常の担体」二に不溶化された形で溶液にして用いるのが好 ましい。上記インキュベーションは使用した酵素の量に応じて上記温度で１０か ら９６時間の間行われる。

処理後、ｐ＋＋を中性化する。

３、その後の処理 限外濾過を行ってガンマ−グロブリン溶液の濃度を７０ｇ／Ａとする。

この限外濾過処理の次に分離濾過　（ｄ　ｉａｆ　ｉ　Ｉ　Ｌｒａｔ　１ｏｎ） を行っＣＰＥＧを除去する。この分離濾過は、４．５ｇ／βのＮａＣｌ溶液を用 いて行う。使用する分離濾過溶液の量は除去すべきＰ　Ｅ　Ｇの含有率によって 決まる。て般に、ＩｇＧ溶液の容積の８倍の容積の分離濾過溶液を用いると溶液 中に最初に含まれているＰＥＧの９０％以上が除去できて、ＰＥＧ濃度が！、５ ｇ／ｊ２から０．１０ｇ／Ａに下がる。

次いで、胃られた溶液をタンパク質が５０ｇ／１２．サッカロースが５０ｇ／１ ２、塩化ナト！Ｊ　ウムカ４．５ｇ／　ｎ　テ、ｐＨが７．０となるように調節 する。

次いでこの溶液をガンマ−グロブリンが０．５〜２．５または５ｇ含まれるよう に各ビンに分け、凍結乾燥する。

第２実施例 出発原材１１Ｅｌは」１記フラクションの沈殿を溶液にし、この溶液を清澄化さ せたもので、この溶液はタンパク質を１〜１２％、さらに好、；−Ｌ　＜は６〜 １０％含む。

１、条件管理下での酵素処理 ヒトのフィブリノリジンを用いて軽く処理する。このヒトのフィブリノリジンの 濃度はタンパク質１ｇ当り０．５から４力ゼイン分解単位である。

インキュベーションの温度は０から３７℃、好ましくは４℃で、ｐＨ１は６．０ から８．０、好ましくは７．４である。

インキュベーション時間は使用酵素の量と上記温度に依存し、２日から１０日で ある。

２、ＰＥＧを用いた沈降処理 沈降段階ではタンパク質を一般に１から４％含む上記タンパク質溶液に分子ｆｆ １４０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を加えてＰ　Ｅ　Ｇ濃度を５％ とする。ｐｌ＋は酢酸または０．ＩＮのＨＣＩを加えて５．８に：Ｊｌ！］節し 、温度は０から４℃の間に維持する。イオン強度は極めて低く、０．０２程度で ある。

こうし、てグロブリン塊を含む沈殿が得られる。この沈殿は次いで単純なデカン テーション、濾過または遠心分離によって溶液から分離して除去する。

得られた上澄みに対しては同一温度でＰＥＧを追加せずに再度沈降分離を行うが 、イオン強度は０．０５％から０．２％のＮａＣ１を加えることによって０．０ ５に高め、ｐＨは７．５から８．５、好ましくは８．０にする。

この処理によりガンマ−グロブリンは沈降する。得られた沈殿をデカンテーショ ンまたは遠心分離で液相から分離する。

３、その後の処理 限外喧過を行ってガンマ−グロブリン溶液の濃度を７０ｇ／Ｒにする。

この限夕（濾過段階の次に分離直通を行ってＰＥＧを除去する。この分離濾過に は４．５ｇ／ｐのＮａＣｌ溶液を用いる。使用する分離濾過溶液の容量は除去す るＰＥＧの含有率によって決まる。一般に、ＩｇＧ溶液の容量の８倍の容量の分 離濾過溶液を用いると、溶液中に当初含まれていたＰＥＧの９０％以上を除去し て、ＰＥＧ濃度を１．５ｇ／Ｅから０．１０ｇ／ｊ２にするス５０ｇ／β、塩化 ナトリウム４．５ｇ／Ｃρｌ＋＝７．０に調整する。

次いで、この溶液を０．５〜２．５または５ｇのガンマ−グロブリンが含まれる ように各ビンに分け、凍結乾燥する。

本発明によって得られたガンマ−グロブリンの分析から以下のことが示される： ■）使用した種々の測定法すべてにおいて抗補体活性の減少が検出される、 ２）サブクラスが平衡になる、 ３）犬およびラットでの血圧試験によって低血圧因子が存在しないことが示され る、 ４）２量化したタンパク質の含有率が初期含有量に対して５０％以上減少して、 モノマーの比率が極めて高くなる（９０％を超える）、 ５）７８未満の部分の比率はゼロあるいは極めて小さい、６）カリクレインおよ びブｔノカリクレイン活性因子の含有量はゼロになる（測定検出限界より少なく なる）、７）残留ＰＥＧの比率は初期含有量に対して１０倍以上も減少する。

以上、本発明を特殊な実施例の形で説明したが、本発明は・これらに限定される ものではなく本発明の範囲と精神から逸脱しない種々の変形を含むものであるこ とは容易に理解できよう。

国　際　謀　審　輯　牛 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＺＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥ？ ＯＲＴ　０ＮＩＩＪＴＥＰＪ９ＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ 、　ＰＣＴ／ＦＲ８６１００１８４（ＳＡ　１３４０１３）ＥＰ−Ａ−０１２０ ８３５０３／１０／８４　ＪＰ−Ａ−６０００１１３６０７１０Ｘ／８５

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．静脈を介して投与可能なガンマーグロブリンの調製方法であって、ポリエチ レングリコール（ＰＥＧ）またはその類似物を用いた分画段階と、ペプシン、フ ィブリノリジンおよびパパインの中から選択された酵素を用いることによりタン パク質加水分解を抑制するという条件管理下での酵素処理段階とを含むことを特 徴とする方法。
2. ２．上記酵素処理段階での処理は、微量のペプシンの存在下に酸性ｐＨで行うこ とを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．上記酵素処理段階での処理は、ヒトのフィブリノリジンの存在下に中性ｐＨ で行うことを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．上記分画段階では、まず第１回目の沈降を、約５％のＰＥＧの存在下に、ｐ Ｈを５〜６、特に５．８とし、低温、特に＋２℃〜＋４℃で、イオン強度を極め て低い０．０２程度にして行った後、第２回目の沈降を、イオン強度を上記より 高い０．０５程度とし、ｐＨを７から８．５程度、特に８．０で行うことを特徴 とする請求の範囲第１〜３項いずれか一項に記載の方法。
5. ５．上記分画段階での処理をアルブミンの存在下に行うことを特徴とする請求の 範囲第１〜４項いずれか一項に記載の方法。
6. ６．上記酵素処理は、サッカロースの存在下にｐＨが４以上の酸性で、ペプシン を２０ｇ／ｌのガンマーグロブリン溶液に対して０．００２ｇ／ｌ程度のペプシ ンの割合で用いて行うことを特徴とする請求の範囲第２、４、５項いずれか一項 に記載の方法。
7. ７．不溶化された形態のペプシンを用いることを特徴とする請求の範囲第２、４ 、６項いずれか一項に記載の方法。
8. ８．上記酵素処理は、タンパク質を０．５から４ＣＵ（カゼイン分解単位）／ｇ の比率で含むヒトのフィブリノリジンを用いて中性ｐＨで行うことを特徴とする 請求の範囲第３〜７項いずれか一項に記載の方法。
9. ９．酸素の含有量に応じて１０時間から１０日間インキュベーションを続けるこ とを特徴とする請求の範囲第６〜８項いずれか一項記載の方法。
10. １０．上記段階の次に限外濾過を行いタンパク質を濃縮し、次いで分離濾過を行 いＰＥＧを除去することを特徴とする請求の範囲第１〜９項いずれか一項に記載 の方法。
11. １１．請求の範囲第１〜１０項いずれか一項に記載の方法によって得られる、静 脈を介して投与可能なガンマーグロブリン調剤。