CA1269629A - Procede de preparation de gamma-globulines administrables par voie intraveineuse et gamma- globulines obtenues - Google Patents
Procede de preparation de gamma-globulines administrables par voie intraveineuse et gamma- globulines obtenuesInfo
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
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Abstract
Une solution de gamma-globulines, provenant par exemple du fractionnement de Cohn, est soumise à une étape de fractionnement au polyéthylène-glycol, à une étape de traitement ménagé enzymatique à la pepsine, fibrinolysine ou papaine, et à une étape d'élimination du PEG. Les préparations de gammaglobulines administrables par voie intraveineuse obtenues par le procédé sont dépourvues d'agrégats et de dimères, ainsi que de pouvoir anti-complémentaire et de kellicréine et d'activateur de prékellicréine.
Description
~ Procédé de préparation de gamma-globulines ; ~ ~ adminiskrées par voie intraveineuse et gamma-globulines obtenues
2~0 La présente invention a trait à un procédé de ~ préparation de gamma-globulines administrables par voie t~ intraveineuse ainsi qu'aux gamma-globulines obtenues par ce procédé
Il exiske actuellement sur le marché un cer-tain nombre de préparations de gamma-glohulines obtenues par ; des procédés différen-ts et qui présentent à la fois des qualités et des inconvénients liés à ces procédés.
~ Parmi les inconvénients que ces procédés s'efforcent d'atténuer le plus possible, se trouve en bonne place le pouvoir d'activation du complément qui peut entrainer des réactions allant jusqu'au choc anaphylactique.
D'une façon générale, ce pouvoir anti-complémentaire est attribué à l'ex.istence d'agrégats globuliniques qui seraient inhérents aux diférents procédés de préparat.ion et ~:
.
., ~269~
notamment aux étapes de fractionnement alcoolique.
C'est pourquoi, il a été déjà développé
différents procédés de préparation cllerchant à supprimer, ou du moins à limiter cet inconvénient.
5Un premier procédé cherche à éliminer les agrégats et consiste à effectuer une digestion à la pepsine de la préparation de gamma-globulines, de fa~on à provoquer une rupture de chaines lourdes à proximité de la jonction des fractions Fab et Fc. Voir, par exemple, le brevet F~-A-102.433.342.
Un autre procéde, qui avait été mis au point par la déposante, consiste à traiter une préparation de gamma-globulines à la plasm.ine, de façon à provoquer une digestion ménagée conservant un pourcentage important (de 30 à 50 ~0) de gamma-globuline intacte et donnant des fragments Fab et Fc. Cette préparation est active et très bien tolérée.
Ces différents procédés qui cherchent à
réduire le pouvoir anti-complémentaire présentent cependant l'inconvénient d'une dlgestion plus ou moins ~oussée des gamma-gl~bulines et consistent finalement à rechercher un compromis entre l'innocuité et l'activité de la préparation.
; On peut également citer divers procédés de préparation formant des gamma-globulines modifiées chimique-;25 ment : alkylation, réduction, sulfonation.
Le bxevet FR-A-2.301.266 préconise de ne pas I effectuer de traitement enzymatique, notamment à la pepsine, ~ des gamma-globulines et d'effectuer, à la place, un frac-I tionnement au polyéthylène-ylycol.
30Ainsi, il a été mis au point un procédé de préparation de gamma-globulines par fractionnement au I
¦ polyéthylène-glycol (P.E.G.) qui présente l'avantage d'empêcher la formation des agrrégats ou de les éliminer, tout en conservant des globulines intactes.
En outre, bien q~l'à des degrés divers, les différentes préparations déerites ci-dessus peu~ent .
1, ~lZ69Z9 présenter des facteurs de choc par actlvation du système kallicr~ine-bradyklnine, ces facteurs paralssent liés ~ une teneur r~siduelle en activateur de pr~kallicréine.
Une autre technique, qui permet d'obtenir des gamma-globullnes de bonne qualit~, consiste ~ effectuer un traitement ~
pH acide, en présence de falbles quantités de pepsine. Voir, par exemple, J.J. Nalsh : Purificatlon of normal immunoglobulin for intravenous use. DEVELOP. BIOL. STAND. 1974, 27, 31-6.
Cependant, il reste encore des agr~gats at des dim~res à un taux relativement lmportant.
On a également proposé, dans la demande de brevet ~P-A-O
120 385, publiée le 3 octobre 1984, d'éviter d'utiliser des traitements ~ la pepsine ou ~ la plasmine, que ces enzymes soient insolubilisés ou non, pour proposer une digestion aux enzymes pancréatiques accompagn~e d'un traite~ent au polyéthylène glycol concentration relativement élevée. Cependant, cette gamma-globuline n'est pas ~quilibr~e en sous-classes.
La présente invention se propose de fournir des pr~parations de gamma-globulines administrables par voie intraveineuse, ~ la fois dépourvue~ d'agrégats et de dim~res, dépourvues de pouvoir anti-compl~mentaire et d~pourvues de kallicr~ine et d'activateur de prékallicréine et avec un profil des sous-classes comparable ~ celui du Sérum Humain normal.
Un autre ob~ectif de l'invention es~ de fournir un tel proc~dé qui, appliqué aux pr~parations de gamma-globulines pr~parées par un fractionnement avec de ~aibles teneurs en PEG ou substances analogues, améliore ces préparations en diminuant notamment le pouvoir anti-complémentaire, la teneur en kallicreine 6~ 9 `l~
et en activateur de la pr~kallicr~ine, ainsi que le PEG r~slduel.
L'invention a pour objet un procédé de pr~paration de qamma-qlobulines administrables pare voie intraveineuse, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de fractionnement au poly~thy1éne-qlycol (PEG) ou substances similaires et une étapa de traitement enzymatlque ménagé, dans lequel le pH est d~pendant de la nature de l'enzyme utilisée~ celle-ci ~tant a~outée de préférence 60US forme de traces, le traltement étant conduit pour éviter une protéolyse sensible.
; L'enzyme utllisée est ehoisie dans le groupe form~ par les pepsines, $ibrinolysines (plasmine), et papaines.
Selon un aæpect, la pr~sente invention fournit un procédé de préparation de gamma-globuline administrable par voie intraveineuse, caract~risé en ce qu'il comporte une étape de fractionnement au poléthyléne-glycol IP~G) et une 6tape de traitemen~ enzymatique m~nagé évitant une protéolyse sensible à
l'aide d'une enzyme choisie dans le groupe form~ par les pepslnes, les flbrinolysines et les papaines, ladi~e ~tape de traitement enzymatique étant conduit ~ un pH adapté ~ l'enzyme utilisée.
Le matériau de d~part est une frac~ion d'ori~ine sérique riche en gamma-globulines telle que la fraction II Teehnigue 6.9 de Cohn, connue pour donner; des produits exempts d'h~pati~e, ou une $raction d'origine placentaire telle que la fraction technique 6.9 de Cohn modifiée par Taylor. Cette fraction a une pureté en IgG sup~rieure ou égale à 90%. Elle peut contenir des guantités variables en albumine qui peuvent aller jusgu'à 10%.
.~
~ ,"~
~Z6~
-4a-ler exemPle.
1 - ~
La matiére de d~part consiste en une mise en solution du précipit~ et en une clarification de cette solution, solution qui contient en g~néral de 1 ~ 4% de protéines. On procède à une ~tape de pr~aipitation par adjonction de poly~thyl~ne-glycol (PEG), de poids mol~culaire 4 000, de fac5on à
obtenir une concentration en PEG de 5%. Le pH est ajust~ 5,8 par de l'aclde ac~tique N ou HC1 0,1 N et la temp~rature maintenue entre 0 et 4C. La force ionique est trés basse, de l'ordre de 0,02.
On obtient ainsi un précipit~ qui contient les agr~gats que l'on s~pare alors de la solution par simple d~cantation, par filtration, ou par cent;ifuga~ion. Le pr~cipit~ est ~limin~.
Sur le surnageant qui en r~sulte, on effectue ensuite une nouvelle precipitation, sans nouvelle addition de PEG, à la même temp~rature, mais en augmentant la force ionigue ~ 0,05 par addition de ~aC1 de 0,05~ ~ 0,2% et de pr~ference 0,1% et en portant le pH de 7 à 8,5 et de ;: :
1~ .J
v ,,s ~69~2~
préférence 8,0.
Les gamma-globulines préclpitent alors et l'on sépare de la phase liqulde par décantat.ion ou centrifu-gation le précipité ainsi formé.
Ce précipité contient les gamma-globulines dépurvues d'agrégats de haut poids moléculaire, mais pouvant encore contenir un taux voisin de 10 ~ de protéines dimérisées. La pureté électrophorétique de ce produit est supérieure ou égale à 90 ~0. Il peut contenir de l'albumine.
L'activité anti-complémentaire est -très faible. Le taux de kallicréine et de l'activateur de prékallicréine est réduit, ; mais celles-ci peuvent encore exister à des -taux variables, suivant la teneur de la matière de départ utilisée.
2 - Traitement enzymati~ue ménagé :
Le précipité de gamma-globuline est repris dans de l'eau apyrogène de faSon à obtenir une concentration de 20 g/l en gamma-globulines. On ajoute 50 g/l de sac-charose et 0,002 g/l de pepsine, la température étant amenée et maintenue à 37~C, le pH étant réglé à 4,1 et on lncube ,~ ~ 20 pendant 24 heures.
On préfère utiliser la pepsine en solution, sous forme insolubilisée sur des supports classiques.
'incubation s'effectue pendant 10 à 96 heures, à cette température, suivant la quantité d'enzymes utilisée. Après ~ 25 traitement, le pH est neutralisé.
i ~ 3 - Traltement ultérieur :
:On effectue une ultrafiltration, de façon à
porter la concentration de la solution de gamma-globulines à
70 g/l.
~ Cette étape d'ultrafiltration est suivie d'une diaEiltration destinée à l'élimination du PEG. Cette diafiltration s'effectue par une solution de NaCl 4,5 g/l.
Le volume de solution de diafiltration à utiliser est fonc-l ; tion du taux de PEG à éliminer. Généralement, un volume 1 35 correspondant à 8 Eois celui de la solution d'IgG permet d'éliminer plus de 90 ~0 du PEG contenu init:ialement dans la '--' :
solution et de passer ainsi d'un taux de 1,5 g/l à 0,10 g/l.
On effectue alors l'ajustement de la solution obtenue à 50 g/l de protéine, 50 g/l de saccharose, 4,5 g/l de chlorure de sodium, à pH 7,0.
On répartit ensuite la substance en flacons de 0,5 - 2,5 ou 5 g de gamma-globulines, puis on effectue une lyophilisation.
2ème exemple :
La matière première de départ consiste en une mise en solution du préclpité et en une clarlfication de cette solution qui contient de 1 à 12 ~ de p~otéines et, de plus, préférentiellement 6 % à 10 ~0 de protéines.
Traitement enzxmatique ménagé :
On procède à un faible traitement par de la fibrinolysine humaine. La concentration en fibrinolysine humaine est de 0,5 à 4 unités caséinolytiques par gramme de ! protéines.
La température d'incubation est de O' à 37-C, de préférence 4C. Le p~ est de 6,0 à 8,0, de préférence 20 7,4 ; Le temps d'incubation est dépendant de la l température et de la quantité d'enzyme mise : de 2 jours à
~ ~ ; 10 jours.
i 2 - Précipitation au PEG :
On procède à une étape de précipitation de la ¦~ solution protéinique qui contient en général de 1 à 4 ~ de protéines par adjonction de polyéthylène glycol (PEG), de 1~ ; poids moléculaire 4 000, de faSon à ob-tenir une concentra-¦j j tion en PEG de 5 %. Le pH est ajusté à 5,8 par de l'acide acétique N ou HCl 0,1 N et la température maintenue entre O
l~ et 4-C. La force ionique est tres basse, de l'ordre de 0,02.
Il On obtient ainsi un précipite qui contient j des agrégats que l'on sépare alors de la solution par simple décantation, par filtration, ou par centrifugatlon. Le précipité est éliminé.
Sur le surnageant qui en résulte, on eEfectue :
:
i.
Il exiske actuellement sur le marché un cer-tain nombre de préparations de gamma-glohulines obtenues par ; des procédés différen-ts et qui présentent à la fois des qualités et des inconvénients liés à ces procédés.
~ Parmi les inconvénients que ces procédés s'efforcent d'atténuer le plus possible, se trouve en bonne place le pouvoir d'activation du complément qui peut entrainer des réactions allant jusqu'au choc anaphylactique.
D'une façon générale, ce pouvoir anti-complémentaire est attribué à l'ex.istence d'agrégats globuliniques qui seraient inhérents aux diférents procédés de préparat.ion et ~:
.
., ~269~
notamment aux étapes de fractionnement alcoolique.
C'est pourquoi, il a été déjà développé
différents procédés de préparation cllerchant à supprimer, ou du moins à limiter cet inconvénient.
5Un premier procédé cherche à éliminer les agrégats et consiste à effectuer une digestion à la pepsine de la préparation de gamma-globulines, de fa~on à provoquer une rupture de chaines lourdes à proximité de la jonction des fractions Fab et Fc. Voir, par exemple, le brevet F~-A-102.433.342.
Un autre procéde, qui avait été mis au point par la déposante, consiste à traiter une préparation de gamma-globulines à la plasm.ine, de façon à provoquer une digestion ménagée conservant un pourcentage important (de 30 à 50 ~0) de gamma-globuline intacte et donnant des fragments Fab et Fc. Cette préparation est active et très bien tolérée.
Ces différents procédés qui cherchent à
réduire le pouvoir anti-complémentaire présentent cependant l'inconvénient d'une dlgestion plus ou moins ~oussée des gamma-gl~bulines et consistent finalement à rechercher un compromis entre l'innocuité et l'activité de la préparation.
; On peut également citer divers procédés de préparation formant des gamma-globulines modifiées chimique-;25 ment : alkylation, réduction, sulfonation.
Le bxevet FR-A-2.301.266 préconise de ne pas I effectuer de traitement enzymatique, notamment à la pepsine, ~ des gamma-globulines et d'effectuer, à la place, un frac-I tionnement au polyéthylène-ylycol.
30Ainsi, il a été mis au point un procédé de préparation de gamma-globulines par fractionnement au I
¦ polyéthylène-glycol (P.E.G.) qui présente l'avantage d'empêcher la formation des agrrégats ou de les éliminer, tout en conservant des globulines intactes.
En outre, bien q~l'à des degrés divers, les différentes préparations déerites ci-dessus peu~ent .
1, ~lZ69Z9 présenter des facteurs de choc par actlvation du système kallicr~ine-bradyklnine, ces facteurs paralssent liés ~ une teneur r~siduelle en activateur de pr~kallicréine.
Une autre technique, qui permet d'obtenir des gamma-globullnes de bonne qualit~, consiste ~ effectuer un traitement ~
pH acide, en présence de falbles quantités de pepsine. Voir, par exemple, J.J. Nalsh : Purificatlon of normal immunoglobulin for intravenous use. DEVELOP. BIOL. STAND. 1974, 27, 31-6.
Cependant, il reste encore des agr~gats at des dim~res à un taux relativement lmportant.
On a également proposé, dans la demande de brevet ~P-A-O
120 385, publiée le 3 octobre 1984, d'éviter d'utiliser des traitements ~ la pepsine ou ~ la plasmine, que ces enzymes soient insolubilisés ou non, pour proposer une digestion aux enzymes pancréatiques accompagn~e d'un traite~ent au polyéthylène glycol concentration relativement élevée. Cependant, cette gamma-globuline n'est pas ~quilibr~e en sous-classes.
La présente invention se propose de fournir des pr~parations de gamma-globulines administrables par voie intraveineuse, ~ la fois dépourvue~ d'agrégats et de dim~res, dépourvues de pouvoir anti-compl~mentaire et d~pourvues de kallicr~ine et d'activateur de prékallicréine et avec un profil des sous-classes comparable ~ celui du Sérum Humain normal.
Un autre ob~ectif de l'invention es~ de fournir un tel proc~dé qui, appliqué aux pr~parations de gamma-globulines pr~parées par un fractionnement avec de ~aibles teneurs en PEG ou substances analogues, améliore ces préparations en diminuant notamment le pouvoir anti-complémentaire, la teneur en kallicreine 6~ 9 `l~
et en activateur de la pr~kallicr~ine, ainsi que le PEG r~slduel.
L'invention a pour objet un procédé de pr~paration de qamma-qlobulines administrables pare voie intraveineuse, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de fractionnement au poly~thy1éne-qlycol (PEG) ou substances similaires et une étapa de traitement enzymatlque ménagé, dans lequel le pH est d~pendant de la nature de l'enzyme utilisée~ celle-ci ~tant a~outée de préférence 60US forme de traces, le traltement étant conduit pour éviter une protéolyse sensible.
; L'enzyme utllisée est ehoisie dans le groupe form~ par les pepsines, $ibrinolysines (plasmine), et papaines.
Selon un aæpect, la pr~sente invention fournit un procédé de préparation de gamma-globuline administrable par voie intraveineuse, caract~risé en ce qu'il comporte une étape de fractionnement au poléthyléne-glycol IP~G) et une 6tape de traitemen~ enzymatique m~nagé évitant une protéolyse sensible à
l'aide d'une enzyme choisie dans le groupe form~ par les pepslnes, les flbrinolysines et les papaines, ladi~e ~tape de traitement enzymatique étant conduit ~ un pH adapté ~ l'enzyme utilisée.
Le matériau de d~part est une frac~ion d'ori~ine sérique riche en gamma-globulines telle que la fraction II Teehnigue 6.9 de Cohn, connue pour donner; des produits exempts d'h~pati~e, ou une $raction d'origine placentaire telle que la fraction technique 6.9 de Cohn modifiée par Taylor. Cette fraction a une pureté en IgG sup~rieure ou égale à 90%. Elle peut contenir des guantités variables en albumine qui peuvent aller jusgu'à 10%.
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~ ,"~
~Z6~
-4a-ler exemPle.
1 - ~
La matiére de d~part consiste en une mise en solution du précipit~ et en une clarification de cette solution, solution qui contient en g~néral de 1 ~ 4% de protéines. On procède à une ~tape de pr~aipitation par adjonction de poly~thyl~ne-glycol (PEG), de poids mol~culaire 4 000, de fac5on à
obtenir une concentration en PEG de 5%. Le pH est ajust~ 5,8 par de l'aclde ac~tique N ou HC1 0,1 N et la temp~rature maintenue entre 0 et 4C. La force ionique est trés basse, de l'ordre de 0,02.
On obtient ainsi un précipit~ qui contient les agr~gats que l'on s~pare alors de la solution par simple d~cantation, par filtration, ou par cent;ifuga~ion. Le pr~cipit~ est ~limin~.
Sur le surnageant qui en r~sulte, on effectue ensuite une nouvelle precipitation, sans nouvelle addition de PEG, à la même temp~rature, mais en augmentant la force ionigue ~ 0,05 par addition de ~aC1 de 0,05~ ~ 0,2% et de pr~ference 0,1% et en portant le pH de 7 à 8,5 et de ;: :
1~ .J
v ,,s ~69~2~
préférence 8,0.
Les gamma-globulines préclpitent alors et l'on sépare de la phase liqulde par décantat.ion ou centrifu-gation le précipité ainsi formé.
Ce précipité contient les gamma-globulines dépurvues d'agrégats de haut poids moléculaire, mais pouvant encore contenir un taux voisin de 10 ~ de protéines dimérisées. La pureté électrophorétique de ce produit est supérieure ou égale à 90 ~0. Il peut contenir de l'albumine.
L'activité anti-complémentaire est -très faible. Le taux de kallicréine et de l'activateur de prékallicréine est réduit, ; mais celles-ci peuvent encore exister à des -taux variables, suivant la teneur de la matière de départ utilisée.
2 - Traitement enzymati~ue ménagé :
Le précipité de gamma-globuline est repris dans de l'eau apyrogène de faSon à obtenir une concentration de 20 g/l en gamma-globulines. On ajoute 50 g/l de sac-charose et 0,002 g/l de pepsine, la température étant amenée et maintenue à 37~C, le pH étant réglé à 4,1 et on lncube ,~ ~ 20 pendant 24 heures.
On préfère utiliser la pepsine en solution, sous forme insolubilisée sur des supports classiques.
'incubation s'effectue pendant 10 à 96 heures, à cette température, suivant la quantité d'enzymes utilisée. Après ~ 25 traitement, le pH est neutralisé.
i ~ 3 - Traltement ultérieur :
:On effectue une ultrafiltration, de façon à
porter la concentration de la solution de gamma-globulines à
70 g/l.
~ Cette étape d'ultrafiltration est suivie d'une diaEiltration destinée à l'élimination du PEG. Cette diafiltration s'effectue par une solution de NaCl 4,5 g/l.
Le volume de solution de diafiltration à utiliser est fonc-l ; tion du taux de PEG à éliminer. Généralement, un volume 1 35 correspondant à 8 Eois celui de la solution d'IgG permet d'éliminer plus de 90 ~0 du PEG contenu init:ialement dans la '--' :
solution et de passer ainsi d'un taux de 1,5 g/l à 0,10 g/l.
On effectue alors l'ajustement de la solution obtenue à 50 g/l de protéine, 50 g/l de saccharose, 4,5 g/l de chlorure de sodium, à pH 7,0.
On répartit ensuite la substance en flacons de 0,5 - 2,5 ou 5 g de gamma-globulines, puis on effectue une lyophilisation.
2ème exemple :
La matière première de départ consiste en une mise en solution du préclpité et en une clarlfication de cette solution qui contient de 1 à 12 ~ de p~otéines et, de plus, préférentiellement 6 % à 10 ~0 de protéines.
Traitement enzxmatique ménagé :
On procède à un faible traitement par de la fibrinolysine humaine. La concentration en fibrinolysine humaine est de 0,5 à 4 unités caséinolytiques par gramme de ! protéines.
La température d'incubation est de O' à 37-C, de préférence 4C. Le p~ est de 6,0 à 8,0, de préférence 20 7,4 ; Le temps d'incubation est dépendant de la l température et de la quantité d'enzyme mise : de 2 jours à
~ ~ ; 10 jours.
i 2 - Précipitation au PEG :
On procède à une étape de précipitation de la ¦~ solution protéinique qui contient en général de 1 à 4 ~ de protéines par adjonction de polyéthylène glycol (PEG), de 1~ ; poids moléculaire 4 000, de faSon à ob-tenir une concentra-¦j j tion en PEG de 5 %. Le pH est ajusté à 5,8 par de l'acide acétique N ou HCl 0,1 N et la température maintenue entre O
l~ et 4-C. La force ionique est tres basse, de l'ordre de 0,02.
Il On obtient ainsi un précipite qui contient j des agrégats que l'on sépare alors de la solution par simple décantation, par filtration, ou par centrifugatlon. Le précipité est éliminé.
Sur le surnageant qui en résulte, on eEfectue :
:
i.
3~2~9~2~
ensuite une nouvelle précipitation, sans nouvelle addition de PEG, à la même température, mai.s en augmentant la force ionique à 0,05 par addition de NaCl de 0,05 % à 0,2 ~0 et en portant le pH de 7 à 8,5 de préférence à 8,0.
Les gamma-globulines précipitent alurs et l'on sépare de la phase liquide le précipité ainsi formé, par décantation ou centrifugation.
3 - Traitement ultérieur :
, On effectue une ultraf.iltration de façon à
porter la concentration de la solution de gamma-ylobulines à
70 g/l.
Cette étape d'ultrafiltration est suivie d'une diafiltration destinée à l'élimination du PEG. Cette diafiltration s'effectue par une solution de NaCl 4,5 g/l.
Le volume de solution de diafiltration à utiliser est fonc-tion du taux de PEG à éliminer. Généralement, un volume correspondant à 8 fois celui de la solution d'IgG permet d'éliminer plus de 90 ~0 du PEG contenu initialement dans la ¦ solution et de passer ainsi d'un taux de 1,5 g/l à 0,10 g/l.
On efEectue alors l'ajustement de la solution obtenue à 50 g/l de protéines, 50 g/l de saccharose, 4,5 g/l ~ de chlorure de sodium, à pH 7,0.
I On répartit alors ensuite la substance en flacons de 0,5 - 2,5 ou 5 g de gamma-globulines, puis on effectue une lyophilisation.
L'analyse des gamma-globulines obtenues selon l'invention montre les avantages suivants :
. Diminution du pouvoir anti-complémentaire dans les différentes techniques de détermination utilisées.
. Les sous-classes sont équilibrées.
. Absence de facteurs hypotenseurs démontrée par test tensionnel sur chien et sur rat.
. Diminution du taux de protéines dimérisées de plus de 50 ~O par rapport à la teneur initiale et obten-tion d'un taux de monomères très élevé (supérieur à 90 ~0).
. Taux de fragments inférieurs à 7 S nul ou ,...
~2~ 2~Ys très faible.
. Taux de kallicréine et d'activateur de la prékallicréine nuls (inférieurs à la limite de sensibilité
du test).
. Tau~ de PEG résiduel diminué de plus de 10 fois par rapport à la teneur d'origine.
Bien que l'invention ait été décrite à propos de formes de réalisation particulières, il est bien entendu qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut lui apporter diverses modifications sans pour cela sortir ni de son cadre ni de son esprit.
~ ' 1 ~
1,
ensuite une nouvelle précipitation, sans nouvelle addition de PEG, à la même température, mai.s en augmentant la force ionique à 0,05 par addition de NaCl de 0,05 % à 0,2 ~0 et en portant le pH de 7 à 8,5 de préférence à 8,0.
Les gamma-globulines précipitent alurs et l'on sépare de la phase liquide le précipité ainsi formé, par décantation ou centrifugation.
3 - Traitement ultérieur :
, On effectue une ultraf.iltration de façon à
porter la concentration de la solution de gamma-ylobulines à
70 g/l.
Cette étape d'ultrafiltration est suivie d'une diafiltration destinée à l'élimination du PEG. Cette diafiltration s'effectue par une solution de NaCl 4,5 g/l.
Le volume de solution de diafiltration à utiliser est fonc-tion du taux de PEG à éliminer. Généralement, un volume correspondant à 8 fois celui de la solution d'IgG permet d'éliminer plus de 90 ~0 du PEG contenu initialement dans la ¦ solution et de passer ainsi d'un taux de 1,5 g/l à 0,10 g/l.
On efEectue alors l'ajustement de la solution obtenue à 50 g/l de protéines, 50 g/l de saccharose, 4,5 g/l ~ de chlorure de sodium, à pH 7,0.
I On répartit alors ensuite la substance en flacons de 0,5 - 2,5 ou 5 g de gamma-globulines, puis on effectue une lyophilisation.
L'analyse des gamma-globulines obtenues selon l'invention montre les avantages suivants :
. Diminution du pouvoir anti-complémentaire dans les différentes techniques de détermination utilisées.
. Les sous-classes sont équilibrées.
. Absence de facteurs hypotenseurs démontrée par test tensionnel sur chien et sur rat.
. Diminution du taux de protéines dimérisées de plus de 50 ~O par rapport à la teneur initiale et obten-tion d'un taux de monomères très élevé (supérieur à 90 ~0).
. Taux de fragments inférieurs à 7 S nul ou ,...
~2~ 2~Ys très faible.
. Taux de kallicréine et d'activateur de la prékallicréine nuls (inférieurs à la limite de sensibilité
du test).
. Tau~ de PEG résiduel diminué de plus de 10 fois par rapport à la teneur d'origine.
Bien que l'invention ait été décrite à propos de formes de réalisation particulières, il est bien entendu qu'elle n'y est nullement limitée et qu'on peut lui apporter diverses modifications sans pour cela sortir ni de son cadre ni de son esprit.
~ ' 1 ~
1,
Claims (10)
DROIT EXCLUSIF DE PROPIETE OU DE PRIVELEGE EST REVENDIQUE, SONT DEFINIS COMME IL SUIT:
1. Procédé de préparation de gamma-globuline admin-istrable par voie intraveineuse, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de fractionnement au poléthyléne-glycol (PEG) et une étape de traitement enzymatique ménagé évitant une protéolyse sensible à l'aide d'une enzyme choisie dans le groupe formé par les pepsines, les fibrinolysines et les papaïnes, ladite étape de traitement enzymatique étant conduite à un pH adapté à l'enzyme utilisé.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de traitement ezymatique est effectuée en présence de traces de pepsine et à pH acide.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape de traitment enzymatique est effectuée en présence de fibrinolysine humaine à pH neutre.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, caractérisé en ce que l'étape de fractionnement s'effectue en présence d'environ 5% de PEG à pH 5,8, et température basse, de l'ordre de +2° à +4°C force ionique trés basse, de l'ordre de 0,02, suivie d'une seconde précipation à force ionique plus élevée de l'ordre de 0,05 et à pH 8,0.
3, caractérisé en ce que l'étape de fractionnement s'effectue en présence d'environ 5% de PEG à pH 5,8, et température basse, de l'ordre de +2° à +4°C force ionique trés basse, de l'ordre de 0,02, suivie d'une seconde précipation à force ionique plus élevée de l'ordre de 0,05 et à pH 8,0.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape de fractionnement s'effectue en présence d'albumine et en présence d'environ 5% de PEG à pH
5,8, et température basse de l'ordre de +2° à +4°C à force ionique trés basse, de l'ordre de 0,02, suivie d'une seconde précipitation à force ionique plus élevée de l'ordre de 0,05 et à pH 8,0.
5,8, et température basse de l'ordre de +2° à +4°C à force ionique trés basse, de l'ordre de 0,02, suivie d'une seconde précipitation à force ionique plus élevée de l'ordre de 0,05 et à pH 8,0.
6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le traitement s'effectue avec la pepsine à raison de l'ordre de 0,002 g par litre de pepsine pour une solution de 20 g par litre de gamma-globuline en présence de saccharose et à pH acide supérieur ou égal à 4.
7. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'on utilise une pepsine sous forme insolubilisée.
8. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le traitement s'effectue avec la fibrinolysine humaine à
raison de 0,5 à 4 CU/g de protéines et à un pH neutre.
raison de 0,5 à 4 CU/g de protéines et à un pH neutre.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, caractérisé en ce que l'incubation dure, suivant le taux d'enzyme, de 10 heures à 10 jours.
3, caractérisé en ce que l'incubation dure, suivant le taux d'enzyme, de 10 heures à 10 jours.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
3, caractérisé en ce que l'on procédé ensuite à une ultrafiltration pour concentrer les protéines, puis à une diafiltration pour l'élimination du PEG.
3, caractérisé en ce que l'on procédé ensuite à une ultrafiltration pour concentrer les protéines, puis à une diafiltration pour l'élimination du PEG.
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