Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia preparatu bialka surowicy do podawania do¬ zylnego, pozbawionego substancji wywolujacych go¬ raczke, odpornego na skladowanie, zawierajacego w wodnym izotonicznym roztworze rozpuszczone proteiny, droga frakcjonowania, oczyszczania i sta¬ bilizowania plazmy krwi pozbawionej czynników krzepniecia.Preparaty bialka surowicy stanowia wartosciowe pochodne krwi. Zawarta w nich albumina dziala jako proteina transportowa. Preparaty zawieraja ponadto dalsze funkcjonalne proteiny, takie jak transferyna, celuloplazmina, «i-antytrypsyna, a zwlaszcza immunoglobulina. Duze znaczenie maja przeciwciala zawarte w y-globulinie. Dzieki wywo¬ lywanej przez nie biernej immunizacji nadaja sie one do celów profilaktycznych i wzmacniaja orga¬ nizm oslabiony uplywem krwi.Preparat bialka surowicy nadajacy sie do poda- 20 wania dozylnego czlowiekowi powinien spelniac dwa podstawowe warunki: 1) preparat musi byc pro¬ duktem odpornym na skladowanie, 2) przenosniki infekcji (wirusy lub bakterie) powinny byc zobo¬ jetnione w sposób niezawodny. Odnosi sie to zwla- 35 szcza do przenosników wirusowego zapalenia wa¬ troby.Preparaty bialka surowicy stosuje sie na ogól jako wodne roztwory trwalej proteiny w roztwo¬ rze zawierajacym elektrolit tolerowany przez orga- 30 nizm. Calkowita zawartosc protein wynosi zwykle 5»/o wagowych, to jest 5 000 mg na 100 ml. N Znany jest sposób wytwarzania preparatu bialka surowicy do podawania dozylnego polegajacy na uzyskiwaniu tego preparatu w kilku etapach bez¬ posrednio z krwi ludzkiej (W. Stephan, Hepatitis- -Free and Stable Human Serum for Intravenous Therapy, XXIV-th Sc. Meeting of the Blood Rese¬ arch Institute, Vox Sanguin, tom 20, str. 442—457).Znany sposób przebiega poprzez nastepujace eta¬ py: a) Uzyskanie naturalnej surowicy z krwi krwio¬ dawcy po usunieciu stalych skladników (cialka krwi, plytki krwi) i uzyskanie surowicy o steze¬ niu protein okolo 7,5% i wartosci pH = 7,2—7,8. b) W celu usuniecia lipoprotein latwo ulegaja¬ cych denaturacji dodaje sie na 100 ml surowicy 2,0 g Aerosilu 2491/380 (Aerosil: chroniony znak to¬ warowy firmy Degussa dla koloidalnego kwasu krzemowego). Zawiesine miesza sie w temperatu¬ rze 45°C w ciagu 4 godzin, chlodzi i osad odwi¬ rowuje. Liipoproteiny wiaza sie ilosciowo z Aero- silem i zostaja usuniete z surowicy krwi. c) Saczenie roztworu przez drobny filtr w ce¬ lu usuniecia obecnych jeszcze unoszacych sie cza¬ steczek. d) Sterylizacja roztworu w temperaturze 5°C Z£ pomoca 0,3 g na 100 ml ^propiolaktonu (pH = 8,0) i napromieniowanie promieniami ultrafiole¬ towymi. 124 730124 730 Uzyskana surowica wykazuje nastepujacy sklad (w przeliczeniu na 5000 mg zawartych w 100 ml): 1 *•"-'¦ .-.«, StuBstsmcja albumina IgGr IgA IgH prealbu- 1 mina 1 cti-antytryp- 1 syna 1 «i-makro- globulina hapto- globulina hemo- peksyna transferyna ceruloplaz- mina cholineste- raza u..* . ..Sklad 3060 i • 820 185 75 ,17 162 141 110 75 195 ¦ 14 1 3,0 E/ml Funkcja dzialanie onkotyczne, transport substancji odzywczych, witamin, hormonów, leków przeciwciala przeciw wirusom i bakteriom przeciwciala chroniace sluzówke przeciwciala przeciw bakteriom i toksynom wiazanie tyroksyny j 1 inhibitory enzymów [ proteolitycznych wiazanie i transport wolnej hemoglobiny wiazanie i transport wolnej heminy transport Fe++ transport Cu++ jako peroksydazy rozszczepianie sukcy- nylocholiny Z powyzszej tablicy wynikaja ponadto funkcje poszczególnych skladników w preparacie bialka su¬ rowicy.Preparait otrzymywiny wedlug znanych metod Jest dostepny w handlu. Mozna go stosowac bez komplikacji.Wada jego jednakze z punktu widzenia sporza¬ dzania i stosowania jest to, ze ze wzgledu na wy- sokowartosciowy material wyjsciowy — ludzka krew — preparat ten jest bardzo drogi i nie moze byc dostepny w wystarczajacym stopniu. Dodat¬ kowa wada jest to, ze zawartosc szczególnie akty¬ wnych przeciwcial IgG, IgA, IgM jest wzglednie niska w porównaniu z zawartoscia tych substancji w ludzkiej krwi.Celem wynalazku bylo znalezienie sposobu wy¬ twarzania preparatu bialka surowicy do podawa¬ nia dozylnego, w którym material wyjsciowy nie bylby tak drogi i trudno dostepny.Sposób wedlug wynalazku umozliwia stosowanie do sporzadzania wartosciowych preparatów bialka surowicy substancji wyjsciowych, które dotychczas nie byly poddawane obróbce lub tez byly wykorzy¬ stywane w niedostateczny sposób. Ponadto sposo¬ bem wedlug wynalazku mozna bez zwiekszania kosztów specyficznie podwyzszyc zawartosc aktyw¬ nych przeciwcial i innych protein w surowicy.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze: a) plazme traktuje sie w temperaturze —2,5°C do —3°C 8*/# objetosciowymi etanolu i osad stanowia¬ cy fibrynogen usuwa sie, b) supernatant (ciecz znad osadu) okreslony jako SI w temperaturze —5°C i przy wartosci pH 5,8 traktuje s|e 18—23Vo objetosciowymi etanolu, uzyskujac osad P2 i su¬ pernatant S2, który c) w temperaturze —7°C i war¬ tosci pH 5,8 traktuje sie 40% objetosciowymi eta- ^5 nolu, uzyskujac osad P3, d) osad P2 roztwarza sie w buforze o wartosci pH 7,0—7,4 w temperaturze 15°C i dodaje 3% glikol polietylenowy, uzyskujac osad P5 i supernatant S5, który e) roztwarza sie w buforze o wartosci pH 4,6 w temperaturze 15°C 10 i dodaje okolo 5,5P/ft glikol polietylenowy, przy czym powstaje supernatant S6 i osad P6, po czym f) osady P3, P5 i P6 wprowadza sie w stosunku 30— 80Vo wagowych P3, 0—70«/q wagowych P5, 0—70°/o wagowych P6 do chemicznie i fizjologicznie do¬ puszczalnego cieklego nosnika, przy czym ogólna zawartosc protein wynosi lO0°/t, zawartosc albu¬ min 50—70*/o, a zawartosc globulin 50—30ty* w za¬ wiesinie substancji stalych, a skladniki mieszani¬ ny sklonne do dematuracji, zwlaszcza lipoproteiny, adsorbuje sie na adsorbentach o specyficznej zdol¬ nosci adsorpcyjnej, po czym wzbogacone adsorben¬ ty usuwa sie.W przedstawionym na rysunku schemacie poda¬ ne sa poszczególne etapy sposobu. Pod pojeciem „•/o etanolu" nalezy rozumiec procenty objetoscio¬ we mierzone w temperaturze 25°C. Wyjsciowa plaz¬ me uzyskuje sie z krwi krwiodawców, przy czym z plazmy najpierw oddziela sie stale skladniki krwi.Metodyka etapów frakcjonowania znana jest ja¬ ko metodyka Cohna (Cohn, E.J. i inni; J. Amer.Chem. Soc. 72 (1950), 456—474; Cohn, E. J. i inni; J. Amer. Chem. Soc. 68 (1946), 459—475; opisy pa¬ tentowe St. Zjedn. Am. nr 2 390 074 i nr 2 469 193).Poszczególne frakcje okresla sie w sposób przy¬ jety przez Cohna. Jednakze w sposób odmienny od metody Cohna okreslone frakcje po frakcjonowa¬ nym rozdzielaniu laczy sie ponownie. Osady za¬ wieraja przy tym we wzglednie duzych ilosciach skladniki sklonne do denaturacji, zwlaszcza lipo- 10 proteiny, w zwiazku z czym dotychczas frakcje te najczesciej odrzucano. W sposobie wedlug wyna¬ lazku natomiast usuwa sie jedynie skladniki sklon¬ ne do denaturacji, a same frakcje przerabia dalej.W etapie a) sposobu wedlug wynalazku usuwa sie z plazmy surowy fibrynogen, dodajac 53,3*/» zimny etanol az do uzyskania, stezenia etanolu 8°/*. Temperature utrzymuje sie w granicach —2,5°C do —3,0°C. Osad PI stanowiacy fibrynogen usuwa sie przez odwirowanie. Supernatant (ciecz znad osadu) SI poddaje sie dalszej obróbce.W etapie b) ponownie dodaje sie 53,3% etanol do supernatantu Si az do uzyskania stezenia 18— 23«/o etanolu w ciec2y. Utrzymuje sie temperature —5°C, a wartosc pH nastawia na 5,8. Wytraca sie osad P2, (który okresla sie jako frakcje II/III lub jako frakcje y-globulinowa. Osad ten zawiera im- munoglobuliny i inne fizjologicznie wazne proteiny.Osad P2 usuwa sie przez odwirowanie w tempe¬ raturze —5°C. Supernatant S2 poddaje sie dal¬ szej obróbce.Etap c) obejmuje dalsza obróbke S2. Stezenie etanolu nastawia sie na 40°/o. Podobnie jak w eta¬ pie b) nasrtawia sie temperature na —7°C, a war¬ tosc pH na 5,8. Droga odwirowania uzyskuje sie osad P3, rwany równiez frakcja IV. Osad ten za- 15 20 26 30 35 45 51) 555 124 730 6 wiera a- i /^-globuliny. Ciecz znad osadu, czyli supernatant S3 poddaje sie dalszej obróbce, utrzy¬ mujac temperature —7°C, wartosc pH = 4,8 i ste¬ zenie etanolu 40e/o. Wytraca sie przy tym osad P4, tak zwana surowa albumina, który oczyszcza sie i sterylizuje w znany sposób. Ciecz znad osadu, czyli supernatant S4, odrzuca sie.Frakcje y-globulinowa II/III poddaje sie dalszej obróbce w nastepujacy sposób: Osad P2 roztwarza sie w buforze cytryniano-fo- sforanowyrn przy wartosci pH 7,0—7,4. Temperatu¬ ra wynosi 15°C. Dodaje sie 3% glikol polietyleno¬ wy 4.000 wzglednie 2,5% glikol polietylenowy 6.000.Stosowany w praktyce glikol polietylenowy skla¬ da sie z mieszaniny nielotnych glikoli polietyleno¬ wych, rozpuszczalnych zarówno w wodzie, jak i w cieczach organicznych, przy czym ich ciezar czaste¬ czkowy zawiera sie w granicach 4.000—20.000. Mie¬ szanina takich glikoli polietylenowych o srednim ciezarze czasteczkowym 4.000 okreslana jest jako PEG 4,000. , Po dokladnym wymieszaniu i czasie reakcji 1/2— 4 godziny mieszanine odwirowuje sie. lozyskuje sie supernatant S5 i frakcje Jllrr^ (osad P5). Super¬ natant S5 w zmienionych wacun^ach (pH r= 4,6, PEG 4,000 do okolo 5,5%, temperatura 15PC) po¬ nownie traktuje sie i frakcjonuje. Uzyskuje sie frakcje III-2 (osad P6) oraz supernatant S6, który zasadniczo zawiera immunoglobuline IgG. Globu¬ liny frakcji III-I i III-2 sa wzbogacone immuno- globulinami IgG, IgA i IgM. Ponadto obecne sa cu-antytrypsyna, as-haptoglobina, ceruloplazmina, transferyna i hemopeksyna w wzbogaconej posta¬ ci.Frakcji III-I i IH-2 na ogól nie poddaje sie dalszej obróbce. Sa one dostepne w duzych ilos¬ ciach, poniewaz w pierwszym rzedzie z krwi uzy¬ skuje sie albumine, a y-globuliny odgrywaja tylko podrzedna role.W sposobie wedlug wynalazku jako material wyj¬ sciowy stosuje sie frakcje IV oraz III-I i III-2 opi¬ sanego procesu frakcjonowania (osad P3, P5 i P6).Przez odpowiednie podwyzszanie dodatków sklad- | ndka globulinowego wzglednie skladnika frakcji III-I i III-2, mozna uzyskac specyficzne podwyz¬ szenie udzialu globulin postaci IgM i IgA.Osady zawieszone w okreslonym stosunku w odpowiednim roztworze buforowym lub roztworze soli poddaje sie wstepnemu oczyszczaniu. W etapie wstepnego oczyszczania usuwa sie czynniki lipi- dowe zakresu a- i ^-globuliny droga adsorpcji na odpowiednich adsorbentach (Aerosil, Bentonit lulb inne zwiazki kompleksowe zawierajace kwas krze¬ mowy).Nastepnie produkt przesacza sie, dializuje i roz¬ twór zateza. Specjalna sterylizacja na ogól nie jest konieczna, mozna ja jednak przeprowadzic. Na przyklad do usuniecia wirusów stosuje sie kom¬ binacje traktowania ^-propiolaktonem i promienio¬ wania nadfioletowego (metoda wedlug Logrippo, Fed. Proceedings 15, str. 518, 1959). Metoda ta po¬ zwala na sterylizowanie surowicy i plazmy w wa¬ runkach oszczedzajacych, przy czym jednak odpor¬ nosc na skladowanie nie ulega podwyzszeniu.Obróbke za pomoca adsorbentów prowadzi sie ko rzystnie w stezeniu 200—500 mg kwasu krzemo¬ wego na gram calkowitej ilosci protein i w tem¬ peraturze do 50°C. Substancje miesza sie doklad¬ nie, po czym adsorbent obciazony liproproteinami 5 oddziela sie.Jak juz podano, najlepsze wyniki osiaga sie w temperaturze 20—50°C, wzglednie przy wartosciach pH 6,5—S.Sposób wedlug wynalazku jest blizej wyjasnio¬ ny w nastepujacych przykladach.Przyklad I. Porcje 500 ml ludzkiej krwi zbie¬ ra sie w 50 ml 4% roztworu cytrynianu sodu. Z plazmy usuwa sie surowy fibrynogen przez doda- l5 nie 53,3% zimnego etanolu az do uzyskania ste¬ zenia etanolu 8%, utrzymujac temperature w gra¬ nicach —2,5°C do —3,0°C, a osad stanowiacy fibry¬ nogen usuwa sie przez odwirowanie. Do super- natantu S;l dodaje sie 53,3% etanol do uzyskania „ stezenia 18—23% etanolu w cieczy. Utrzymuje sie temperature —5°C, a wartosc pH nastawia na 5,8. Wytraca sie osad P2, który usuwa sie przez odwirowanie w temperaturze —5°C. Supernatant S2 poddaje sie dalszej obróbce, przy czym stezenie tt etanolu nastawia sie na 40%, temperature na —7°C, a wartosc pH na 5,8. Droga odwirowania uzyskuje sie osad P3.Do 300 litrów roztworu soli kuchennej (woda destylowana z 1,7% wagowych NaCl, wartosc pH M nastawiona na 4,6 za pomoca 0,2 n HC1) wpro¬ wadza sie 10 kp osadu P3 o nastepujacym skla¬ dzie skladników bialkowych i sporzadza zawiesine: 55 15% ^-globuliny, 12°/© y-globuliny. 85 Osad P3 zawiera okolo 50% skladników stalych ("bialka, sole) i 50% wilgotnej pozostalosci (fcO, resztkowy etanol).Datej dodaje sie 5 kp frakcji III-I Cohna (sub- frakcja) o nastepujacym skladzie skladników (pro¬ centy wagowe): 15% albuminy, 2% ai-globuljny, 13% a2-globuliny, 17% ^-globuliny i 53% y-globuliny, a takze 5 kp subfrakcji III-2 Cohna o nastepujacym skladzie i sporzadza zawiesine: 8% albuminy, 3% «i-globuliny, 9% a2-globuliny, 25% jff-globuliny i 55% -globuliny. Stosunek skladników stalych i wil¬ gotnych pozostalosci jest we wszystkich frakcjach praktycznie jednakowy. 20 kp „wilgotnych" frakcji zawiesza sie w roz¬ puszczalniku i imiesza, utrzymujac stala wartosc pH = 4,6. Obecne we frakcjach rozpuszczalne sub¬ stancje ekstrahuje sie rozpuszczalnikiem. Wyste¬ pujace obok nich skladniki nierozpuszczalne wytwa¬ rzaja zmetnienie. Ilosc substancji nierozpuszczal- BC nych wynosi okolo 12% wagowych w przelicze- 55 niu na calkowita zawartosc substancji stalych.Wsród substancji nierozpuszczalnych wystepuja zwlaszcza denaturowane globuliny, wlacznie z li- poproteinami, których nie uzywa sie w dalszym postepowaniu. Usuwa sie je wiec za pomoca odwi¬ rowania.Ciecz znad osadu wykazuje lekkie zmetnienie i zóltawe zabarwienie.Przez dodanie 0,2 n NaOH wartosc pH nastawia w sie na 7,4. Do roztworu wprowadza sie czysty, ko- /124 7: 7 loidalny kwas krzemowy do stezenia 5°/o wagowych i miesza sie. Ciecz ogrzewa sie do temperatury 45°C (okolo 1° na minute) i utrzymuje stala war¬ tosc pH. Po uzyskaniu temperatury koncowej 45°C mieszanine miesza sie w ciagu 4 godzin. W czasie 3 tego procesu proteiny nieodporne na skladowanie wiaza sie z kwasem krzemowym i tworza osad, który usuwa sie przez odwirowanie.Ciecz po odwirowaniu poddaje sie saczeniu do stanu klarownosci przez filtr z wegla aktywnego io (produkt Seitz AKS-Filter). Przesacz stanowi kla¬ rowna ciecz o barwie bursztynowozóltej. Ciecz te zateza sie metoda diakoncentracji (uklad kaseto¬ wy Millipore, wielkosc porów membrany 10.1000 Daltonj do okolo 25*/o objetosci wyjsciowej. Po i» tym etapie roztwór wykazuje calkowite stezenie bialka okolo 3,4—4,5°/o wagowych. / Analiza wykazuje, ze wskutek etapu diaikoncen- tracji usuniete zostaly na ogól z koncentratu wszy¬ stkie skladniki krwi o ciezarze czasteczkowym niz- » szym niz 10.000. Do substancji tych naleza zwla¬ szcza produkty niepozadane w konserwowanym bialku, na przyklad oligopeptydy oddzialywujace na naczynia.Koncentrat poddaje sie nastepnie dializie w ce- M ( lu ostatecznego usuniecia tak zwanych „zanieczy¬ szczen" oraz w celu nastawienia elektrolitu, przy czyni stosuje sie trzykrotna objetosc 0,9ty$ wago¬ wych roztworu NaCl. Dialize prowadzi sie w tych samych aparatach i przy uzyciu tych samych mem- 80 bram, które stosowane byly w etapie zatezania.Nastepnie prowadzi sie dalszy etap zatezania, w wyniku którego otrzymuje sie lacznie stezenie pro¬ tein wynoszace 6—10%. Nastepnie za pomoca roz¬ tworu NaCl nastawia sie fizjologiczne warunki izo- 35 tonii zgodnie z ludzka krwia i calkowite stezenie protein doprowadza do 5°/o wagowych.Analiza protein uzyskanych wedlug przykladu I wykazuje nastepujace wartosci (w przeliczeniu na 100' ml): proteina 5.000 mg, albumina 2.925 mg, *o IgG 1.5Ó0 mg, IgA 380 mg, IgM 285 mg.Roztwór przesacza sie dodatkowo przez filtr bio¬ logiczny (EKS II,' Seitz, Kreuznach). Poprzez filtr membranowy nastepuje saczenie sterylne.Preparat jest obecnie gotowy do podawania do- « zylnego.Przyklad II. W 300 litrach rozpuszczalnika jak w przykladzie I rozpuszcza sie 7,5 kp osadu P3, 4 kp frakcji III-I i 8,5 kp frakcji III-2. Sklad * tych frakcji odpowiada skladowi z przykladu I.Frakcje miesza sie z rozpuszczalnikiem i utrzy¬ muje wartosc pH = 4,6. Do roztworu dodaje sie 60 g na litr Aerosilu 24917380 i nastawia wartosc pH na 7,6. Mieszanine miesza sie w temperaturze 47°C w ciagu 4 godzin, po czym chlodzi do tempe¬ ratury 18°C,i poddaje saczeniu z przeplukiwaniem.Saczenie prowadzi sie na pionowo ustawionym fil¬ trze z pomocnicza warstwa filtrujaca, Typ CRF-S firmy Schenk, Filterbau, Schwab Gmiind/Jako sro¬ dek filtrujacy stosuje sie Hyfle Super Cel w ste¬ zeniu 8°/o wagowych w przeliczeniu na mase fil¬ tru. Jako srodek filtrujacy mozna równiez stoso¬ wac ziemie okrzemkowa Celite 545 w stezeniu 5Vo.Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania preparatu bialka surowicy do podawania dozylnego, pozbawionego substancji wywolujacych goraczke, odpornego na skladowanie, zawierajacego w wodnym izótonioznym roztworze rozpuszczone proteiny, droga frakcjonowania, oczy¬ szczania i stabilizowania pl&zmy krwi pozbawionej czynników krzepniecia, znamienny tym, ze plazme traktuje si$ w temperaturze —2,5°C do —3°C, &•/§ objetosciowymi etanolu i osad stanowiacy fibryno- gen usuwa sie, supernatant (ciecz znad osadu) okre¬ slony jako SI w temperaturze —5°C i przy wartos¬ ci pH 5,8 traktuje sie 18—23*/« objetosciowymi eta¬ nolu, uzyskujac osad P2 i supernatant S2, który w temperaturze —7°C i wartosci pH 5,8 traktuje sie 40% objetosciowymi etanolu, uzyskujac osad P3, a osad P2 roztwarza sie w buforze o wartosci pH 7,0—7,4 w temperaturze 15°C i dodaje 3°/o gli¬ kol polietylenowy, uzyskujac osad P5 i supenna- tant S5, który roztwarza sie w buforze o wartosci pH 4,6 w temperaturze 15°C i dodaje okolo 5,5*/* glikol polietylenowy, przy czym powstaje super¬ natant S6 i osad P6, po czym osady P3, P5 i P6 wprowadza sie w stosunku 30—^80% wagowych P3, 0—70P/o wagowych P5, 0—70°/» wagowych P6 do che¬ micznie i fizjologicznie dopuszczalnego cieklego nos¬ nika, przy czym ogólna zawartosc protein wynosi I00*/o, zawartosc albumin 50—70°/o, a zawartosc glo¬ bulin 50—30*/o w zawiesinie substancji stalych, a skladniki mieszaniny sklonne do denaturacji, zwla¬ szcza lipoproteiny adsorbuje sie na adsorbentach o specyficznej zdolnosci adsorpcyjnej, po czym wzbo¬ gacone adsorbenty usuwa sie. t124730 T = PH Et. 3°C = 7.2 = 8% [ PLAZMA OSADY ISgpernat.iS4H OSADY iSupernat. S5 t=15*C PEG=5.5 Frakcjam-1 P5l 1 ISupernat. SoH lFrakc.IH-2 P"6l-) Dalsza obrób] kajmmuno globulina Rozpuszcza nie, oczy¬ szczanie, saczenie. steryl,, rozcienczanie Preparat bialka surowicy PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL