SE447204B - Forfarande for att framstella ett intravenost applicerbart serumeggvite-preparat - Google Patents

Description

l0 447 204 2 Som regel tillhandahålles serumäggvitepreparat i form av vatten- lösning av stabila proteiner, varvid lösningen har en elektrolyt- halt, som kroppen kan fördra. Den totala proteinhalten uppgår vanligtvis till 5 vikts-% (dvs 5.000 mg per 100 ml).

Genom litteraturen är ett förfarande känt för framställning av ett intravenöst applicerbart serumäggvitepreparat, som utvinnes medelst ett flertal förfaringssteg direkt ur humanblod.

(W. venous Therapy; XXIV th Sc. Meeting of the Blood Research ; (p. 442 _.. 457)). är även beskrivet i DE-B l,792,555 med samma upphovsman.

Stephan; "Hepatitis-Free and Stable Human Serum for Intra- Institute, Vox Sanguin., V. Förfarandet Detta förut kända förfarande kännetecknas av följande steg: a) Utvinning av naturligt serum från blodgivarblod sedan fasta beståndsdelar (blodkroppar, blodplättar) avlägsnats och ut- vinning av ett serum med en proteinkoncentration av ca 7,5 % och ett pH av 7,2 till 7,8; b) För att avlägsna lätt denaturerande liproproteiner till- ' 2491/380 per 100 ml serum. (Aerosil : DEGUSSA för en kolloi- vid 45°C under fyra tim- ”sättes 2,0 g Aerosil skyddat varumärke tillhörande firman dal kiselsyra). Suspensionen omröres 'mar och avkyles, varefter sedimentet avcentrifugeras. Lipo- vid den kolloidala ki- selsyran och avlägsnats från blodserumet; proteinerna har fastnat kvantitativt c) Lösningen filtreras igenom ett finfilter för att avlägsna ännu förhandenvarande suspeneionspartiklar; d) Lösningen steriliseras genom att vid 500 försättas med 0,3 g 13-propiolakton per 100 ml (pH 8,0) och bestrålas med UV-ljus. 447 204 3 Det utvunna serumet har följande sammansättning (beräknat på .000 mg i 100 ml lösning): Substans 25133 Funktion Albumin 3.060 För onkotomyändamål, transport av näringsämnen, vitaminer, hor- moner, läkemedel lgG 820 Antikroppar mot virus och bak- terier IgA 185 Slemhinneskyddande antikroppar IgM 75 Antikroppar mot bakterier och toxiner Prealbumin 17 Tyroxinbindning 1-Antitrypsin 162 Inhibitorer för proteolytiska enzymer 2-Makroglobulin 141 Haptoglobin 110 Bindning och transport av fritt hemoglobin Hemopexin 75 Bindning och transport av fritt hemín Transferrin 195 Transport av Fe++ Coeruloplasmin 14 Transport av CU++ i form av pe- roxidas Kolinesteras 3,0 E/ml Spjälkning av succinylkolin Av tabellen framgår dessutom, vilka funktioner de olika bestånds- delarna av serumäggvitepreparatet har.

Det enligt förut känt förfarande framställda preparatet är kom- mersiellt tillgängligt. Det kan användas utan komplikationer.

För preparering och användning är det dock en nackdel, att pre- paratet p g a det högvärdiga utgångsmaterialet - humanblod - är mycket dyrbart och inte står till förfogande i tillräcklig mängd. Därtill kommer, att halten av de särskilt verksamma anti- kropparna IgG, IgA, IgM är relativt låg i motsvarighet till fö- rekomsten av dessa ämnen i humanblod. l0 447 204 4 Det förefinns sålunda behov av ett förfarande för framställning av ett intravenöst applicerbart serumäggvitepreparat, vid vil- ket råmaterialen är mindre dyrbara och sällsynta.

Syftet med uppfinningen är därför att åstadkomma ett förfarande för framställning av ett serumäggvítepreparat, vid vilket speci- fikt halten skall ökas, lin, som är av särskilt verksamma antikroppar IgG, IgA och IgM vilken halt kommer till uttryck i halten gammaglobu- relativt låg i människoblod. Förfarandet skall möj- liggöra att för framställning av värdefulla serumäggviteprepa- rat använda utgângsmaterial, som hittills vidareförädlats i otillräcklig grad eller inte alls. Vidare avser förfarandet att särskilt höja halten av verksamma antikroppar eller andra proteiner i serumet, utan att framställningskostnaderna i vä- sentlig grad ökas. förfarandet grundar sig på att som utgångsmaterial använda fraktioner av humanblodplasma, som erhålles ur humanserum efter genomförande av ett eller flera fraktionssteg enligt CÜHN i syf- te att anrika respektive isolera enstaka blodproteinbestândsde- lar, varvid dessa senare väsentligen erhålles i sin nativa form och utgângsmaterialets fraktioner därjämte genom blandníngs- kontroll, stabilisering, rening och koncentration respektive ut- spädning har samma halt av albuminer och globuliner som blod- serum. Därvid kännetecknas uppfinningen framför allt av, att a) de eedimenterade CÛHN-fraktionerna IV, III-l och III-2, vilka tillsammans ingår med en proteinhalt av 100 vikts-%, löses i en vattenhaltig koksalt- eller buffertlösníng i följande proportioner: -80 vikts-% 0-70 " 0-70 " fraktion IV " Ill-l " III-2 b) den del av blandningen, som tenderar att denaturera, sär- skilt lípoproteiner, fälls ut genom adsorptíon på adsorber- medel med specifik affinitet, varefter de anrikade adsor- bermedlen avlägsnas. 447 204 Serumäggviteprepareringen enligt uppfinningen sker således icke längre direkt från nativt serum, utan andra vid blodfraktionering uppkommande mellanfraktioneringsprodukter användes.

Det erhållna serumäggvitepreparatet kan uppvisa ett förhållande mellan globulíner och albuminer, som praktiskt taget motsvarar förhållandet i nativt blodserum, Det är emellertid även möjligt att genom höjning av den ingående mängden av fraktionerna III-1 och III-2 öka halten av globuliner i form av IgM och lgA. Genom förfarandet enligt uppfinningen är det möjligt att framställa ett serumäggvitepreparat, som har ökade halter av verksamma anti- kroppar eller andra proteiner utan att väsentligen belasta fram- ställningskostnaderna för preparatet.

Det skall framhållas, att uppfinningen inte avser ett serumägg- vitepreparat med viss sammansättning utan ett förfarande för framställning av ett sådant serumäggvitepreparat, varvid man an- vänder sig av tidigare icke använda eller otillräckligt behandla- de respektive utnyttjade fraktioner erhållna vid fraktionering enligt COHN-förfarandet. Ingen av de ovannämnda skrifterna be- skriver ett förfarande, som grundar sig på en sådan användning av de ovannämnda CÛHN-fraktionerna. Ej heller nämner någon av skrifterna möjligheten av att slå ihop olika CÛHN-fraktioner och gemensamt underkasta dessa en reningsprocess och slutbehandling.

GB-A l,2D7,477 beskriver ett förfarande för fraktionering av äggviteämnen. Särskilt beskrives ett reningsförfarande för den erhållna produkten genom behandling med väteperoxid för att avlägsna hemopigment och termolabila globuliner. Det erhållna äggvitepreparatet innehåller över 70 % albumin räknat på den to- tala äggvitemëngden. Detta är en högre albuminhalt, än vad som föreligger i nativt blodserum. Skriften anger inte något sätt att höja globulinhalten genom blandning av olika fraktioner.

GB-A 1,436,529 beskriver en modifikation av COHN-förfarandet.

(Se närmare spalt 1, raderna 21-26). Man utgår här från CÛHN- fraktion IV-4, som är en underfraktion av COHN-fraktion IV.

Denna behandlas med fibrinogen och trikalciumfosfat, och därefter 447 204 6 med en sampolymer av etylenoxid och polyoxypropen, varvid kvar- varande koaguleringsfaktorer och lipider avskiljes genom fällning.

Den erhållna slutprodukten har ungefär samma proportioner mellan albumin samt GÅ- och 13-globulin som i CÛHN-fraktion IV enligt nedanstående exempel l i föreliggande patentbeskrivning.

GB-A l,436,529 åstadkommer ingen höjning av serumäggviteprepara- tets globulinandel genom inblandning av andra CÛHN-fraktioner.

Vidare sker reningen av serumäggvitepreparatet genom fällning och inte genom adsorption.

AT-A 329,758 hänför sig till behandlingen av en underfraktíon CUHN-fraktion IV-l erhâllen vid ett modifierat COHN-förfarande.

Fraktionen IV-l innehåller höga halter lipo- och glykoproteiner och går normalt till avfall. Ur denna orena produkt framställer man ett serumäggvitepreparat med 95 % albumin genom bl a fäll- ning med organiska syror vid 50-65°C. Man erhåller ingen produkt _ med hög halt av globulin och ökar inte globulinhalten genom in- álandning av c0HN-reaktionerna 111-1 sen 111-2.

Av det ovanstånde framgår, att det över huvud taget icke är ti- digare känt att blanda olika fraktioner från blodplasmasepare- ring för att erhålla en produkt med förhöjd halt av globuliner och antikroppar.

Enligt uppfinningen utgår man från fraktionering av blodplasma enligt det ovan nämnda COHN-förfarandet. I det bilagda flyt- schemat har de olika förfaringsstegen angivits. Därvid avses med “% etanol" alltid volym-% vid 2500. Utgångsplasman erhålles från blodgívarblod. Därvid utrör man 500 ml humanblod i 50 ml 4-procentig natriumcitratlösning, varefter de fasta bestånds- delarna i blodet avskiljes från plasman. Plasman från ett fler- tal blodgivare får bilda en pool.

I flytdiagrammets steg e avlägsnas råfibrinogenet från plasman, till vilken man sätter 53,5 procentig kall etanol, tills en kon- centration ev 8 % tillförts. Temperaturen hålles vid -2,5 - -3,008. Precipitatet P 1 - fibrinogen - avlägsnas genom centrí- fugering. Moderluten S 1 bearbetas vidare. 447 204 7 Steget b omfattar åter igen tillsats av 53,3 procentíg etanol till den ovanför stående moderluten S 1, tills man när en kon- centration av 18-25 % etanol i vätskan. Temperaturen hållas vid -500 och pH justeras till 5,8. Precipitatet P 2 utfälles och betecknas som fraktion ll/III eller som gammaglobulinfraktion.

Denna fällning innehåller immunglobulinerna och andra fysiolo- giskt viktiga proteiner. Precipitatet P Z avlägsnas genom cen- trífugering vid -5°C. Den ovanför stående moderluten S 2 vidare- behandlas.

Steg c omfattar vidarebehandlingen av 5 2. Etanolkoncentrationen justeras till 40 %. pH till -7°C respektive pH 5,8. Genom centrifugering utvinnes Liksom vid steg b justeras temperatur och precipitatet P-3, även betecknat fraktion IV. Denna fraktion innehåller CL- och Û-globulinerna. Den ovanför stående vätskan, moderlut S 3, vidarebehandlas därefter. Betingelserna, som här- vid gäller, är temperatur = -7°C, pH = 4,8, och etanolkoncen- tration 40 %. som på förut känt sätt renas och steriliseras. Den ovanför stå- Därvid utfälles precipitatet P 4, s k råalbumín, ende vätskan, moderlut 5 4, slås bort.

Gammaglobulinfraktionen II/III vidarebehandlas i följande steg: Fällningen P Z uppslutes i en citratfosfatbuffert vid pH 7,0- 7,4. Temperaturen uppgår till l5°C. % polyetylenglykol (PEG) 4.000 respektive 2,5 % PEG 6.000 tillsättes.

Den i praktiken använda PEG består av en blandning av icke- flyktiga polyetylenglykoler, som är lösliga i vatten såväl som i organiska vätskor och som har en molekylvikt inom området 4.000-20.000. En blandning av dylika polyetylenglykoler med en genomsnittlig molekylvikt av 4.000 betecknas som PEG 4.000.

Efter grundlig omröring och en reaktíonstid av l/2-4 timmar centrifugeras blandningen. Därvid bildas moderlut S 5 och frak- tion II-l (precipitat P 5). Moderlut S 5 behandlas än en gång under modifierade betingelser (pH 4,6; PEG 4.000 till ca 5,5 %; T = l5°C)_samt fraktioneras. Därvid uppstår III-2 (precipitat 447 204 8 P 6) samt moderlut S 6, vilken huvudsakligen innehåller immun- globulinet IgG. Globulínerna i fraktionerna III-1 och III-2 är väsentligt anrikade med immunglobulinerna IgG, IgA och IgM. Vi- dare föreligger i anrikad form aâ-antitrypsin,¿X2-haptoglobin, coeruloplasmin, transferrin och hemopexin.

Fraktionerna III-l och III-2 bearbetas som regel inte ytterliga- re. De står till förfogande i stora mängder, eftersom albuminet utvinnes ur blodet i första hand och gammaglobulinerna endast spelar en underordnad roll.

Som utgångsprodukter för förfarandet enligt uppfinningen använ- des särskilt fraktionerna IV samt III-l och Ill-2 från det be- skrivna fraktioneringsförfarandet (precipitat P 3, P 5, P 6).

Dessa blandas i fastställda proportioner, varvid på totalprote- inet räknat ett förhållande av 50-70 % albumin på 50-30 % glo- buliner injusteras. Därvid är det möjligt att i nämnda förhål- lande åstadkomma samma värden, som föreligger vid nativt serum- äggvita.

Emellertid är det även möjligt att genom motsvarande höjning av tillsatserna av globuliningrediensen respektive ingredienser från fraktionerna III-l och III-2 specifikt öka halten av glo- buliner i form av IgM och IgA.

Enligt en föredragen utföringsform utgår man från, att fraktio- nerna IV, III-l och III-2 (sedimenter) suspenderas i följande proportioner i en koksaltlösning respektive lämplig buffert- lösning: fraktion IV " III-l 20-30 “ " III-2 20-30 " vardera beräknade på en total proteinhalt av l00 %. 40-60 vikts-% De i ett bestämt förhållande blandade och i en lämplig buffert- eller saltlösning suspenderade ämnena underkastas en förrening, 447 204 9 varvid IK- och ß-globulinområdets lipidfaktorer avlägsnas ge- nom adsorption på ett lämpligt adsorbermaterial (Aerosil , bentonit eller andra kiselsyrehaltiga komplexföreningar).

Därpå renfiltreras och dialyseras produkten, och lösningen kon- centreras. Någon särskild sterilisering är i allmänhet inte er- forderlig. Likväl kan en sådan utföras på förut känt sätt. För att utrota virus har man exempelvis använt två förfaranden: a) Pasteurisering genom upphettning under 10 timmar till 60°C; Detta förfarande har den nackdelen, att talrika serumpro- teiner denaturerar under dessa betingelser; b) Kombination av /3-propiolakton-behandling och UV-bestrål- ning (förfarande enligt Loßrippo; Fed. Proceedings 15, S. 518, 1959); Denna metod medger sterilisering av serum och plasma under skonsamma betingelser, varvid dock lager- stabiliteten icke ökas.

I allt väsentligt underkastas enligt uppfinningen blandningen av utgångskomponenterna efter justering till en viss protein- halt och ett visst förhållande mellan proteinerna en liknande procedur, som är förut känd för serum (DE-B l,792,555). Därvid det överraskande möjligt att därmed utvinna ett serumäggvite- preparat, som i sin verkan överträffar förut kända preparat, bl a beroende på sin förhöjda halt av immunglobulinerna IgM respektive IgA.

Givetvis är det möjligt att fria de olika fraktionerna var för sig från de för denaturering benägna ingredienserna och att där- på blanda, koncentrera och stabilisera de renade substanserna.

Arbetet med adsorbermaterialen försiggår företrädesvis i en koncentration av 200-500 mg kiselsyra per g totalprotein och vid en temperatur upp till 5006. Substanserna blandas intimt och därpå frånskiljes det lipoproteinerna uppbärande adsorbenset.

Såsom framhållits, åstadkommas dessa resultat vid temperaturer mellan 20 och su°c och vid pH-umèàdet 6,543. 447 204 Till förtydligande av förfarandet anges följande utförings- exempel: Exempel l Till 300 liter koksaltlösníng (aqua destillata med 1,7 vikts-% NaCl som justeras till pH 4,6 med 0,2 n HC1) - i det följande benämnt lösningsmedel - tillsättes och suspen- deras 10 kg CÛHN-fraktion IV med följande analys på äggvite- ingredienserna: 55 8 12 % ö? albumin dl-globulin EE EQ ä? Q R , | s 'af _11 Fraktion IV innehåller omkring 5 % fasta ämnen (äggvita, sal- ter) och 50 % fuktåterstod (H20; restetanol).

Vidare tillfogas 5 kg av CÛHN-fraktion III-l (subfraktion) med följande analys på de festa beståndsdelarna (vikts-%): albumin 2 ul-globulin 13 q2_ Il 17 24 /3 -" 53 % J -" Bi' EE ö? och suspenderas med 5 kg CDHN-subfraktion III-2 med följande analys: m EE albumin u 2 1-globulin l °<2-' ß -Il ap_ll \0 EQE 55 % ER w '15 2D 447 204 ll Förhållandet mellan fasta ämnen och fuktåterstod är vid alla fraktionerna praktiskt taget lika.

Nämnda 20 kg "fukthaltiga" fraktioner suspenderas och utröres i lösningsmedlet. Därvid hålles pH konstant vid 4,6. I frak- tionerna förhandenvarande lösliga ämnen upptages i lösnings- medlet. Dlösliga beståndsdelar, som därjämte finns för handen, bildar grumling. De olösliga ämnena uppgår till omkring 12 vikts~% räknat på totalhalten fasta ämnen. Bland de olösli- ga substanserna ingår i synnerhet denaturerade globuliner, däribland lipoproteíner, för vilka inget ytterligare behov föreligger enligt förfarandet. De avlägsnas därför medelst ett centrifugeringssteg.

Den ovanför stående vätskan har en svag grumling och gulaktig färg.

Genom att tillsätta 0,2 n NaÛH justeras pH till 7,4. Till lös- ningen sättes ren, kolloidal kiselsyra till en koncentration av 5 vikts-%, varefter omröring sker. Vätskan uppvärmes till 45°C (ca lo per min.) och pH hålles konstant. När en ändtem- peratur av 450C uppnåtts, omröres vätskan i fyra timmar. Under dessa processteg fäster de lagringsinstabila proteínerna på kiselsyran och bildar en fällning, som avlägsnas genom centri- fugering.

Den efter centrifugeringen ovanför stående vätskan underkastas klarfiltrering på ett aktivkolfilter (fabrikat Seitz AKS-fil- ter). Filtratet utgör då en klar, bärnstensgul vätska. Med hjälp av ett diakoncentrationsförfarande (Millipore-Kassett- system, membranporstorlek lD.DDD Dalton) koncentreras vätskan till ca 25 % lösningen en total äggvitekoncentration av ca 3,4-4,5 vikts-%. av sin begynnelsevolym. Efter detta steg visar En analys visar, att genom diakoncentrationssteget avlägsnas väsentligen alla blod-beståndsdelar med en molekylvikt, som understiger 10.000 ur koneentratet. Till dessa hör särskilt sådana, som inte är önskvärda i konserverad äggvita, t ex oligo-peptider med vaso-aktiv verkan. ' 447 204 12 Koncentratet underkastas därefter i och för slutgiltigt avlägs- nande av de förutnämnda "föroreníngarna" samt för elektrolytjus- tering en dialys gentemot den trefaldíga volymen av en 0,9 vikts- procentig NaCl-lösning. Dialysen utföres med samma apparatur och med samma membraner, som användes vid koncentrationen.

Ett ytterligare koncentrationssteg följer, efter vilket en total- koncentration för proteinerna av 6-10 % föreligger. Med hjälp av en Naßl-lösning sker därefter en justering till, vad som fysiolo- gískt erfordras i isotoniskt hänseende för överensstämmelse med humanblod och den totala proteinkoncentrationen bringas till vikts-%.

Analysen av de utvunna proteinerna enligt exempel l visar föl- jande värden: Tabell 2 (beräknat på 100 ml) albumin 2.925 mg lgß 1.500 " IgA 380 " IgM 285 " Den justerade lösningen klarfiltreras ytterligare på ett steri- líseringsfilter (EKS II; Seitz, Kreuznach). Sterilfiltreringen sker genom membranfilter.

Efter tappning är preparatet nu färdigt för intravenös applika- tion.

Exempel 2 Som i exempel l löses i 300 liter lösningsmedel följande: 7,5 kg CUHN-fraktion IV 4 " och " " III-l ,5 " " " III-2.

Claims (6)

1. 0 15 20 25 30 35 447 204 13 Sammansättningen av dessa fraktioner är densamma som enligt exempel l. Fraktionerna utröres med lösningsmedlet, varvid pH hålles vid 4,6. Per liter lösning tillsättes 60 g Aerosifæ 2491/380 och pH jus- teras till 7,6. Blandningen omröres vid 47°C under fyra timmar och avkyles därpå till 1800, varefter den underkastas svämfil- trering, som utföres med ett upprättstående svämfilter, typ CHF-S från firma Schenk, Filterbau, Schwâb. Gmünd. Som fil- trermedel användes Hyflo Super Cel i en koncentration av 8 vikts~% beräknat på fíltermängden. Som filtrermedel kan även kiselgur Celite 545 i 5-procentig koncentration användas. P A T E N T K R A V l. Förferande för att framställa ett intravenöst epplicerbart, pyrogenfritt, lagringsstabilt serumäggvitepreparat, varvid man utgår från humanblodplasma, som befrias från koaguleringsfak- torer och uppdelas i fraktioner genom behandling enligt COHN- förfarandet, och varvid preparatet koncentreras, stabiliseras, renas och toppas på förvaringskärl, a t t k ä n n e t e c k n a t d ä r a v , a) de sedimenterade COHN-fraktíonerna IV, III-l och III-2, vilka tillsammans ingår med en proteinhalt av 100 vikts-%, löses i en vattenheltig koksalt- eller buffertlösning i följande proportioner: fraktion IV " III-l " III-2 30-en vikcs-% o-70 H 0-10 " b) den del av blandningen, som tenderar att denaturera, sär- skilt lipoproteiner, fälls ut genom adsorption på adsor- bermedel med specifik affinítet, varefter de anrikade ad- sorbermedlen avlägsnas. 10 15 20 25 447 204

2. Förfarande d ä r a v , proportioner: fraktion IV

3. Förfarande d ä r a v , a t t 14 enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k n a t a t t COHN-Fraktionerna föreligger i följande au-en vikta-% 20-so H 20-30 " III-l III-2 enligt patentkravet l, Ü ä n n e t e c k n a t som adsorptionsmedel används kiselsyrehal- tiga föreningar, företrädesvis kolloidala kiselsyror med en koncentration av 200-500 mg kiselsyra/g totalprotein, vilka blandas intensivt vid temperaturer upp till 50°C och därefter frânskiljas.

4. Förfarande t a c k n a t rer mellan 20

5. Förfarande k ä n n e t e att pH-område

6._Förfarande k ä n n e t e enligt något av patentkraven 1-3, k ä n n e - d ä r a v , a t t man arbetar vid temperatu- uah sn°c. enligt ett eller c k n a t av 6,5-8. flera av patentkraven 1-4 d ä r a v , a t t man arbetar inom enligt ett eller flera av föregående patentkrav, c k n a t d ä r a v , a t t blandningstiden är i storleksordningen fyra timmar.