KR830002718B1 - 혈장으로부터 알부민을 분리 제조하는 방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

혈장으로부터 알부민을 분리 제조하는 방법

본 발명은 인혈장을 냉에탄올 침전법으로 처리하여 얻은 콘 상철혈장Ⅱ+Ⅲ을 알콜농도, pH, 염농도(이온강도), 온도등의 조건을 조정하여 가열 처리함으로써 불순단백을 변성 침전시켜 제거하고 순수한 알보민용액만을 획득하여 이를 동결 건조공정을 거치지 않고 완제품화하는 알부민의 제조방법에 관한 것이다.

알부민은 혈액내에 존재하는 단백질로서 단백영양의 공급, 쇼크의 응급치료 및 순환혈액량의 유지등에 사용된는 물질이다.

현재까지 알려진 혈장으로부터 알부민을 분리하는 방법으로는 콘(Cohn)박사의 냉에탄올 침전법(J. Am. Chem. Soc. 68 (1946) :이하 냉침전법이라 칭함)과 이를 응용한 방법이 알려져 있다. 이 방법들은 모두가 혈장단백 고유의 물리적 성질을 이용해서 단계적으로 각 성분을 분리하는 것을 원리로 하고 있다. 즉, 유기용매의 알콜농도, pH, 염농도 및 온도등을 적절히 변화시킴으로써 각각 성분이 다른 단백의 용해도를 최대로하여 침전분리하는 것이다.

그러나, 이와같은 냉침전법으로 알부민을 분리하려면 피브리노겐, 알파, 베타 및 감마 글로블린 (D,β 및 γ-globulin)등을 제거하고 다시 정맥주사제로 정제하기 위해서 5단계의 분리공정을 거쳐야 하므로 제조공정의 소요시간이 길며(약 30일 이상), 수율은 약 70% 정도로써 알부민의 손실이 많고 뿐만 아니라 일련의 공정이 냉실작업으로 진행되어야하므로 냉실유지비가 막대하게 소요되고, 사용된 유기용매의 제거를 위해 동결건조작업을 실시하지 않으면 안도는 단점이 있었다.

한편, 이러한 냉침전법의 단점을 보완하기 위하여 가열처리에 의한 알부민 분리법(Blut, Band 30, Seite 121-124; 1975)이 개발되었는 바, 이 방법은 제 1단계로 피브리노겐과 혈액응고 제8인자(Factor Ⅷ)를 냉침전법과 유사한 조건으로 분리한 다음 상청Ⅰ을 60-75℃에서 가열처리하는 데 이 가열처리 공정으로 알파, 베타 및 감마 글로블린을 동시에 변성시켜 제거한 다음, 제2단계로서 알부민 성분이 함유된 상청액에 폴리에틸렌글리콜등 침전제를 가하여 알붑민만을 침전분리하는 방법으로서 5% 알부민액을 제조할 경우 침전된 알부민을 증류수에 용해시켜 제조하며, 20-25% 알부민액을 제조할 경우는 동결건조후 농도조정에 의해 제조하는 것이다.

이상에서 기술한 가열처리 방법은 냉침전법과 비교하여 공정을 약 20일 정도로 단축하였으며 수율도 약 90%까지 향상시켰고, 일련의 공정을 상온에서 처리할 수 있어서 제조원가의 절감효과를 가져왔으나, 아직도 20-25% 알부민액을 제조하기 위해서는 냉침전법과 마찬가지로 동결건조 공정을 행하여야하며 면역 글로블린도 가열처리과정에서 변성되어 회수할 수 없고, 특히 최종제품에 폴리에틸렌글리콜등 침전제의 성분이 잔존하고 있어 문제점으로 대두되고 있었다.

본 발명한 상술한 바와 같은 제 결점을 해결하기 위하여 인혈장을 냉침전법으로 처리하여 얻은 콘 상청 혈장 Ⅱ+Ⅲ을 알콜농도, pH, 염농도 및 온도등의 조건을 조정하여 가열처리함으로써 불순단백을 변성침전시켜 제거하고 순수한 알부민 용액만을 획득하며 이를 동결건조공정을 거치지 않고 완제품화하여 수율이 높고 순도가 좋으며 제조원가를 절감시킴과 동시에 임상학적으로도 부작용이 압ㅅ는 순수한 아부민의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명자는 이와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해

1) 인혈장으로부터 냉침전법으로 면역글로블린의 원료가 되는 분획 Ⅱ+Ⅲ과 알부민의 원료가 되는 상청 Ⅱ+Ⅲ을 분리하여 분획 Ⅱ+Ⅲ은 별도로 취하고 상청 Ⅱ+Ⅲ만을 회수한 다음

2) 상청 Ⅱ+Ⅲ을 가열처리하기전 수율을 취대로 높일 수 있는 p,Ⅱ, 염농도 및 알콜농도등의 제조건을 찾고

3)20-25% 알부민액을 제조할 경우에도 동결건조등의 공정을 거치지 않음으로써 제조원가를 절감하며, 잔존할 수 있는 침전제의 성분을 제거하여 임상학적으로 완벽한 제품을 제조하는 방법을 연구하였다. 이러한 연구결과로서 만족할 만큼 개선된 제조 방법을 얻었는 바, 이와같은 본 발명을 상세히 설명한 다음과 같다.

즉, 혈구반환 채장법으로 얻은 신선인혈장 또는 동결인혈장을 냉침전법과 디이에이-세파덱스(DEAE-Sephadex)흡착법을 이용하여 혈액응고 제8인자 및 프로트롬빈(Prothrombin)등을 분리하고, 상청액을 냉침전법에 의해 분획하여 분획 Ⅰ과 상청 Ⅰ로 분획한 다음, 다시 상청 Ⅰ만을 취하여 냉침전법에 의해 분획 Ⅱ+Ⅲ과 상청 Ⅱ+Ⅲ으로 분획한다. 여기서 분획 Ⅰ은 주성분이 피브리노겐이고 분획 Ⅱ+Ⅲ은 주성분이 감마글로블린으로서 이들의 정제과장은 본 발명의 기술적 구성과는 무관하므로 생략하고, 단지 상청 Ⅱ+Ⅲ만을 사용한다.

상청 Ⅱ+Ⅲ은 주성분인 알부민이 70-75%이며 알파, 베타, 감마글로블린 및 지질이 미량 함유되어 있으며 pH는 6.7-6.9, 알콜농도는 약 20-21%, 염농도는 약 0.12정도이다.

본 발명은 상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 상청 Ⅱ+Ⅲ의 제반 처리조건 중 염농도와 알콜농도 두 변수의 상관관계가 수율에 매우 기깊은 관계가 있음을 밝혀내고 이들 두 변수를 적절히 변화시켜 보았다. 그 결과 염농도가 0.1이상에서는 글로블린의 변성이 원활하지 못하여 최종 제품의 순도가 좋지 못하였고, 0.06이하에서는 순도는 좋았으나 수율이 저하되는 것을 알 수 있었다. 또한 알콜농도가 12% 이상에서는 글로블린의 변성은 양호하였으나 알부민의 일부도 변성되어 수율이 저하되었고, 6%이하에서는 글로블린의 변성이 원활하지 못하여 순도가 불량한 반면에 알부민의 수율은 높았다.

따라서 상기의 두 변수를 변화시켜가며 실시해 본 결과 염농도는 0.08-0.09, 알콜능도는 6-8%인 경우가 최적조건임을 밝혀냈으며 이때 pH는 6.7-6.9였다.

본 발명은 상기 조건을 만족시키기 위하여 상청 Ⅱ+Ⅲ에 구연산나트륨-포도당 완충액(Sodium Citrate-Glucose Buffer)을 가한 후 아미콘 디씨-10형(Amicon DC-10 Type)의 투석기로 투석하고 처리용량을 줄이기위해 농축 시킨 다음, 이를 본 발명에 따른 조건 즉, 염농도 0.08-0.09, 알콜농도 6-8%, pH 6.7-6.9로 조정하였다. 또한 알부민의 안정성을 유지하기 위하여 카프릴 산나트륨(Sodium Caprylate)을 0.08-0.12M되게 첨가하여 알부민을 안정화 시킨 후, 65-68℃, 가장 좋기로는 67℃여서 30-60분간 가열처리하여 알부민이외의 불순단백을 변성침전시켰다.

이 변성된 단백의 분리는 일반적으로 원심분리를 실시하고 있으나 본 발명에서는 변성 단백이 상청액내에 혼입되는 것을 완전 방치하고 시설투자비를 절감하여, 이련의 작업이 상온에서 이루어짐에 따라서 혼입이 가능한 발열성물질을 제거하기 위한 방법으로서, 가열 처리된 농축액에 하이프로슈퍼셀(Hyflosupercel:Hayashi 제품)이 0.5%되도록 첨가하여 발열성 물질을 흡착시킨 다음 스파클러 여과기(Sparcler filter Type 101)에서 여과지(filter pad ; 동양 No. 402)를 사용하여 여과시켰다. 이와 같이 여과된 여과액을 면역전기 영동법으로 검사한 결과 알부민이외의 불순단백이 전혀 존재하지 않았으며 발열성물질 시험에서도 매우 양호한 결과를 나타냈다.

또한, 여과지 및 변성단백등에 미량으로 잔존하는 알부민을 회수하기 위하여 발열성물질을 함유하지 않는 0.9% 생리식염액으로 수회 세척하고 이미 여과된 여과액(알부민성분)과 합하였다.

이와 같이 얻어진 알부민성분의 여과액에는 알콜, 염류등이 함유되어 있기 때문에 이들을 제거하고 20-25% 알부민액을 제조하기 위하여, 통상적인 종래의 방법은 동결건조 방법을 사용하여 원획분을 얻고 이를 다시 제조하고자하는 농도로 용해하고 있으나 염류의 완전제거가 용이하지 못하여 임상적으로 부작용의 원인이 되기도 하였으므로, 본 발명에서는 이러한 동결 건조방법을 배제하고 한외여과법(Ultrafiltration)으로 투석 및 농축을 반복함으로써 알콜 및 염류를 완전히 제거할 수가 있음을 밝혀냈다. 따라서 동결건조의 과정을 거치지 않고서 한외여과법으로 투석 및 농축을 반복하여 잔존하는 알콜 및 염류를 완전히 제거하여 고농도인 20-25% 알부민액을 제조하고, 또한 이 용액의 무균성을 완전히 보장하기 위하여 0.20μ멘브레인 여과지(Membrane filter)로 여과하여 세균을 완전히 제거시킨 후 무균적으로 분병하고 60℃에서 약 10시간동안 가온하여 최종 제품을 만든다.

상술한 바와 같은 본 발명의 제조과정을 거쳐 제조된 제품의 순도를 확인하기 위하여 면역전기영동법으로 검사한 결과 알부민이외의 불순단백은 전혀 검출되지 않았으며 발열성 물질 시험결화도 양호하였다.

상술한 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예1]

혈구반환채장법으로 채장된 신선한 인혈장 800l를 가지고 냉침전법에 의해 혈액응고 제8인자를 분리하고 디이에이-세파덱스흡착법에 의해 프로트롬빈복합체(prothrombin coplex)를 분리한 다음 상청액을 냉침전법에 의해 분획하여 분획 Ⅰ과 상청Ⅰ로 분리하고, 상청Ⅰ을 분획하여 면역글로불린의 원료인 분획 Ⅱ+Ⅲ과 알부민원료인 상청 Ⅱ+Ⅲ으로 분리하여 면역글로블린의 원료인 분획 Ⅱ+Ⅲ은 별도로 회수하고 알부민의 원료인 상청 Ⅱ+Ⅲ으로 분리하여 면역그로블린의 원료인 분획 Ⅱ+Ⅲ은 별도로 회수하고 알부민의 원료인 상청 Ⅱ+Ⅲ을 1065l 얻었다. 이 때 얻어진 상청 Ⅱ+Ⅲ은 총단백농도 3.2%, 단백중 알부민함량 73%였고 검사결과 pH는 6.7, 염농도는 0.12, 알콜농도는 21%였다. 또한 단백성분은 주로 알부민이나 알파 및 베타글로불린과 지질이 미량 존재하고 있었다.

이와 같은 상청 Ⅱ+Ⅲ을 가지고 본 발명의 기술적 방법으로 정제하기 위해 상온에서 pH를 6.8로 유지시키면서 구연산나트륨-포도당원충액을 가한 후 아미콘 디씨-10형으로 투석 및 농축하여 염농도가 0.08, 알콜농도가 7.0%인 농축액을 얻었다.

이 농축액에 카프릴산나트륨을 0.08M되게 첨가하여 알부민을 안정화시킨 다음 66℃에서 60분간 가열하여 알부민 이외의 불순단백을 변성시키고 용액의 pH를 4.5로 조정한 뒤, 여기에 하이프로슈퍼셀이 0.5%되도록 첨가하여 교반한 후 스파클러 여과기로 여과하여 여과액을 얻었으며 여과지 및 잔분(찌꺼기)를 발열성물질을 함유하지 않는 0.9% 생리식염액으로 수회 세척하여 흘러내린 여과액을 앞의 여과액과 합쳤다. 합쳐진 알부민 성분의 여과액을 한외여과법에 의해 투석 및 농축을 반복하여 알콜 및 염류를 제거하고 25% 알부민용액을 얻은 다음 0.20μ 멤브레인 여과지로 제균 여과한 후 60℃에서 10시간 가온하여 최종제품으로 25.1% 알부임 94.8l(수율:95.3%)를 얻었다.

이를 전기영동법에 의해 순도를 검사한 결과 순도 99%이상으로 분순단백이 검출되지 않았다.

[실시예2]

혈구반환채장법에 의해 채장한 신선돌결인혈장 600l를 가지고 실시예 1과 동일한 방법으로 알부민원료인 상청 Ⅱ+Ⅲ을 804l얻었다. 이 때 얻어진 상청 Ⅱ+Ⅲ은 총단백농도 3.29%, 단백중 알부민함량 72%였고 검사결과 pH는 6.9, 염농도는 0.11, 알콜농도는 19%였으며 알파 및 베타글로불린과 지질이 미량 존재하고 있었다.

이 상청 Ⅱ+Ⅲ을 실시예 1과 같은 방법으로 하여 염농도가 0.08, 알콜농도가 6.5%인 농축액을 얻었다.

농축액에 카프릴산나트륨을 0.08M 되게 첨가하여 알부민을 안정화시키고 67℃에서 60분간 가열처리한 후 pH를 조절하고 하이프로슈퍼셀이 0.5%되도록 첨가한 다음 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하여 5% 알부민용액 370.2l(수율 97.2%)를 얻었다.

이를 검사한 결과 분순단백은 완전히 제거되었음이 확인되었다.

[실시예 3]

혈구반환채장법에 의해 채장된 신선동결인 혈장 1100l를 가지고 실시예1과 동일한 방법으로 하여 알부민 원료인 상청 Ⅱ+Ⅲ을 1545l 얻었다. 이때 얻어진 상청 Ⅱ+Ⅲ은 총단백농도 3.0%, 단백중 알부민함량 72%였고, 검사결과 pH는 6.7,염농도는 0.12, 알콜농도는 20%였으며 역시 알파 및 메타글로불린과 지질등이 미량존재하고 주성분은 알부민이었다.

이 상청 Ⅱ+Ⅲ을 실시예 1과 동일한 방법으로하여 염농도가 0.06, 알콜농도가 7.0%인 농축액을 얻었다.

이하 실시예1과 동일한 방법으로 실시하여 25% 알부민을 최종제품으로 113.2l 얻었으나 염농도에 기인하여 수율은 90.2%로 낮았다.

이 최종제품은 면역전기영동법으로 검사한 결과 알부민이외의 불순단백성분은 전혀 나타나지 않았으며 국가검정기준에도 적합하였다.

상술한 바와 같이 본 발명은 인혈장에서 냉침전법으로 분획Ⅰ과 상청Ⅰ을 분히한 다음 상청Ⅰ을 분획 Ⅱ+Ⅲ과 상청 Ⅱ+Ⅲ으로 다시 분리하고, 알부민이 함유돈 상청 Ⅱ+Ⅲ으로부터 알부민을 제조하기 위하여, 상청 Ⅱ+Ⅲ을 농축하여 가열처리할때 염농도를 0.08-0.09, 알콜농도를 6-8%, pH를 6.7_6.9로 조정하므로써 수율을 95%이상으로 높이고 순도로 양호란 제품을 얻을 수 있으며, 냉침전법 또는 가열처리(고농도 제품에 의한 종래의 알부민제조방법에서 행한 돌결건조공정을 필요호자지 않기 때문에 동결건조장치에 소요되는 막대한 시설 투자비를 절감할 수 있고, 하이프로슈퍼셀을 첨가하여 부작용의 원인이 되는 변성된 불순단백 및 발열성물질을 제거하고 한의여과법으로 투석 및 농축하여 염류를 제거함으로써 임상적으로 부작용이 없는 순수한 알부민을 제조할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명의 제조공정은 약 5일간 소요되어 기존의 냉침전법(30일 이상 소요)이나 가열처리에 의한 방법(20일 이상 소요)보다 훨씬 단축되어 제조원가를 더욱 절감시킬 수 있는 방법인 것이다.

Claims (1)

1. 인혈장에서 냉침전법에 의해 얻은 콘 상청혈장 Ⅱ+Ⅲ으로부터 농축하고 가열처리하여 알부민을 분리 정제하는데 있어서, 노축액을 가열처리시 염농도를 0.08-0.09, 알콜농도를 6-8%, pH를 6.7-6.9로 조정하며, 동결건조공정을 거치지 않고 한의여과법으로 잔존하는 알콜 및 염류를 제거하는 것을 특징으로 하는 알부민의 분리 제조방법.