JPH03128398A - 血漿蛋白の分画方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は血漿蛋白含有物、特に血漿から血漿蛋白を効率
よく各種血漿蛋白成分に分画する方法に関する。

〔従来技術〕

血漿蛋白は血漿に含まれる蛋白の総称であり、１００種
類以上の蛋白成分からなる。血漿蛋白の主な成分はアル
ブミン、グロブリン、各種血液凝固因子、フィブリノー
ゲン、フィブロネクチン、プラスミノーゲン、プロトロ
ンビン等である。血漿からこれらの血漿蛋白成分に分画
する方法としては、コーンの低温エタノール分画法、硫
安分画法、ポリエチレングリコール分画法等が知られて
いる。

ところで、従来は血漿蛋白成分中でもアルブミン、グロ
ブリンが医薬上、特に有用であったために、それらの成
分をまず分画・回収し、他のマイナー成分はその廃棄画
分から再分画・回収する方法が一般的であった０例えば
後述の従来法で示したような方法が用いられる。

しかし、この方法では、マイナー成分は回収効率が悪く
、血漿蛋白の分画方法全体としてみると必ずしも効率の
良い手段とは言えない。

〔発明が解決しようとする課題］ そこで、本発明者らは上記事情を鑑み、各種検討を重ね
た結果、特定の工程を特定の順序に従って組み合わせる
ことにより、血漿含有物、特に血漿から血漿蛋白を効率
よく分画できることを見出し、本発明を完成した。

〔課題を解決するための手段〕

即ち、本発明は血漿蛋白含有物を、以下の工程順序にて
処理する〔但し、（ｉ　ｉ）〜（ｖ）工程の順序は各々
その順序を入れ換えてもよい］ことを特徴とする血漿蛋
白の分画方法。

（ｉ）　　凍結・融解、 （ｉｉ）エタノール濃度５〜１０％での処理、（ｉｉｉ
）　　陰イオン交換体による処理、（ｉｖ）固定化リジ
ンによるアフィニティクロマトグラフィー処理、 （ｖ）　　固定化ヘパリンによるアフィニティークロマ
トグラフィー処理、 （ｖｉ）エタノール濃度１８〜３０％での処理、および （ｖｉｉ）エタノール濃度３５〜４５％での処理に関す
る。

本発明の分画方法としては、具体的には以下の工程順序
が例示される。

１、（ｉ）　　→（ｉｉ）　→（ｉｉｉ）　−＋　（ｉ
ｖ）　→（ｖ）　＝（ｖｉ）→（ｖｉ） １１１ｉ）　　→（ｉ；）→（１■）→（ｉｉｉ　）→
（ｖ）→（ｖｉ）→ｒｖｉｉ） １１１、（Ｄ　　→（ｉｉｉ）→（ｉｉ）　−＋　（ｉ
ｖ）　→（ｖ）　→（ｖｉ）→（ｖｉ ｒＶ、　（ｉ）　　→（ｉｉｉ　　→（ｉｖ）　−＋　
（ｖ）　→（ｉｉ）　−１（νｉ）→（ｖｉ Ｖ、　（Ｄ　　→（ｉｖ　　→（ｉｉｉ　）→（ｖ）→
（１１）→（ｖｉ）→（ｖｌｌ これらのうち、好ましいのは第■、■および■法であり
、特に好ましいのは第■法である。

■、出発原料 本発明の出発原料としては血漿蛋白含有物、例えば血液
、血漿、血清等（特に、血漿が好ましい）が用いられる
。

２、分画方法 以下に分画方法を説明するが、第■法以下の工程におい
て、各処理工程における処理条件は、第１工程と同様で
ある。

第１法 （ｉ）　　凍結・融解処理 血漿蛋白含有物を凍結・融解処理して上清と沈澱を分離
する。沈澱画分より血液凝固第■因子（以下第■因子と
いう）、フィブロネクチンの回収が可能である。

当該処理における処理条件は、好適には次の通りである
。

凍結条件：温度−１０〜−４０°Ｃ１特に−２０〜−３
０°Ｃ１１時間以上 融解条件：温度０〜５°Ｃ 分離条件：濾過、又は遠心−分離による（回転数１００
０〜３０００　ｒｐ翔、１０分間）、温度Ｏ〜５°Ｃ （１１）エタノール濃度５〜１０％処理（ｉ）の上清を
エタノール濃度５〜１０％、特に７〜９％で処理して上
清と沈澱とを分離する。沈澱画分よりフィブリノーゲン
、血液凝固第Ｘ［ＩＩ因子（以下第ＸｌＩｒ因子という
）の回収が可能である。

当該処理における処理条件は、好適には次の通りである
。

エタノール処理条件：温度５〜−３°Ｃ（特に２〜−３
°Ｃ）、ｐＨ６，８〜７４４．３０分間〜１５時間（特
に１〜５時間） 分離条件：遠心分離による（回転数１０００〜８０００
ｒｐＩＩｌ、１０〜３０分間）、 温度Ｏ〜５°Ｃ （ｉｉｉ）陰イオン交換体処理 （１１）の上清を陰イオン交換体で処理して非吸着画分
と吸着画分を分離する。吸着画分から溶出操作によりプ
ロトロンビン、血液凝固第■因子（以下筒■因子という
）、プロティンＣを回収可能である。陰イオン交換体と
しては、ＤＥＡＥ系（例えば、ＤＥＡＥ−アガロース、
ＤＥＡＥ−デキストラン、ＤＥＡＥ−セルロースなど）
、ＱＡＥ系（例えば、ＱＡＥ−アガロース、ＱＡＥ−デ
キストランなど）等が挙げられる。

当該処理における処理条件は、好適には次の通りである
。

接触条件：ｐＨ６〜８ 溶出条件：ｐＨ４〜８、イオン強度０．００５〜０．５
Ｍ（特に、０．０１〜０．２Ｍ）（１ｖ）固定化リジン
処理 （ｉｉｉ　）の非吸着画分を固定化リジンを用いて、ア
フィニティクロマトグラフィーによる処理を行い、吸着
画分と非吸着画分を分離する。吸着画分から溶出操作に
よりプラスミノーゲンの回収が可能である。固定化リジ
ンとしてはりジン−アガロース等が挙げられる。その製
法は５ｃｉｅｎｃｅ、八１０９５（１９７０）等に開示
されている。

当該処理における処理条件は、好適には次の通りである
。

接触条件：ｐＨ６〜８ ？容出条件：ｐＨ６〜８のＥＡＣＡ　（ε−アミノカプ
ロン酸、０．１〜０．４Ｍ）またはリジン（０，１〜０
．４Ｍ）含有液 （ν）　固定化ヘパリン処理 （ｉｖ　）の非吸着画分を固定化ヘパリンを用いてアフ
ィニティクロマトグラフィーによる処理を行い、非吸着
画分と吸着画分とを分離する。吸着画分からの溶出操作
によりアンチトロンビン−■の回収が可能である。固定
化ヘパリンとしてはヘパリンアガロース等が挙げられる
。

接触条件：ｐｔｕ；〜８（特に、ｐＨ７〜７．５）溶出
条件：ｐＨ６〜８（特に、ｐ１１７〜７．５）、イオン
強度１〜３Ｍ（特に、１．５〜２Ｍ）（ｖｉ）エタノー
ル濃度１８〜３０％処理（ｖ）の非吸着画分をエタノー
ル濃度１８〜３０％、好ましくは２０〜２５％で処理し
て上清と沈澱を分離する。沈澱画分より免疫グロブリン
の回収が可能である。

エタノール処理条件：ｐＨ４，５〜８（特に、Ｐ）１５
．２〜７）、温度Ｏ〜−７°Ｃ（特に、−５〜−６’Ｃ
Ｌ３０分間〜１５時間（特に、１〜５時間） 分離条件：コーンのエタノール分画の両分■＋■を回収
する条件と同様でよい。例えば、遠心分離（回転数５０
００〜２００００ｒｐｍ、　１０〜３０分間、温度０〜
５°Ｃ）による分離が好適である。

（ｖｉ）エタノール濃度３５〜４５％処理（ｖｉ）の上
清をエタノール濃度３５〜４５％で処理して上清と沈澱
を分離する。沈澱画分よりハプトグロビン、トランスフ
ェリンを、上清画分よりアルブミンを回収可能である。

エタノール処理条件：ｐＨ５〜７、（特に、ｐＨ５，８
〜６．３）温度０〜−７°Ｃ（特に、−６〜−５°Ｃ）
、３０分間〜１５時間（特に、１〜５時間） 分離条件：コーンのエタノール分画の画分■１＋ＩＶ、
＋アルブミンを回収する条件 と同様でよく、例えば遠心分離（回 転数５０００〜２００００ｒｐｍ、　１０〜３０分間、
温度０〜５°Ｃ）によることが好 適である。

第■法 工程（ｉ）、（ｉｉ　）、（ｖｉ）および（ｖｉ）は第
■法と同様の方法で行われる。

（ｉｖ）固定化リジン処理 （ｉｉ　）の上清を固定化リジンを用いてアフイニティ
クロマトグラフィーによる処理を行い、吸着画分と非吸
着画分を分離する。

（ｉｉｉ　）陰イオン交換体処理 （ｉｖ）の非吸着画分を陰イオン交換体で処理して、吸
着画分と非吸着画分を分離する。

（ｖ）固定化ヘパリン処理 （ｉｉｉ）の非吸着画分を固定化ヘパリンを用いてアフ
ィニティクロマトグラフイーによる処理を行い、吸着画
分と非吸着画分を分離する。

第■法 工程（ｉ）、（ｖ）、（ｖｉ）および（ｖｉ）は第■法
と同様の方法で行われる。

（ｉｉｉ　）陰イオン交換体処理 ０）の上清を陰イオン交換体で処理して、吸着両分と非
吸着画分を分離する。

（１１）エタノール濃度５〜１０％処理（ｉｉｉ　）の
非吸着画分をエタノール濃度５〜１０％で処理して、上
清と沈澱を分離する。

（１■）固定化リジン処理 （１１）の上清を固定化リジンを用いてアフィニテイク
ロマトグラフィーによる処理を行い、吸着画分と非吸着
画分を分離する。

第■法 工程（ｉｌ、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）は第１法
と同様の方法で行われる。

（ｉｉｉ　）陰イオン交換体処理 （ｉ）の上清を陰イオン交換体で処理して、吸着画分と
非吸着画分を分離する。

（ｉｉ）エタノール濃度５〜１０％処理（ｖ）の非吸着
画分をエタノールｍ　ｓ！　５〜１０％で処理して、上
清と沈澱を分離する。

（ｖｉ）エタノール濃度１８〜３０％処理（ｉｉ）の上
清をエタノール濃度１８〜３０％で処理して、上清と沈
澱を分離する。

第Ｖ法 工程（ｉ）および（■）は第１法と同様の方法で行われ
る。

（１ｖ）固定化リジン処理 （ｉ）の上清を固定化リジンを用いてアフィニティクロ
マトグラフィーによる処理を行い、吸着画分と非吸着画
分を分離する。

（山）陰イオン交換体処理 （１■）の非吸着画分を陰イオン交換体で処理して、吸
着画分と非吸着画分を分離する。

（ｖ）固定化ヘパリン処理 （ｉｉｉ　）の非吸着画分を固定化ヘパリンを用いてア
フィニティクロマトグラフィーによる処理を行い、吸着
画分と非吸着画分を分離する。

（１１）エタノール濃度５〜１０％処理（ｖ）の非吸着
画分をエタノール濃度５〜１０％で処理して、上清と沈
澱を分離する。

（ｖｉ）エタノール濃度１８〜３０％処理（ｉｉ　）の
上清をエタノール濃度１８〜３０％で処理して、上清と
沈澱を分離する。

３、精製方法 分画された血漿蛋白は公知の手法により単離、精製され
る。

（ｉ）　　第■因子、フィブロネクチン第■因子の単離
、精製法は、特開昭５９−１３４７３０号、同６３−１
０８０００号の各公報等に開示されている。

また、ポリエチレングリコール分画法（米国特許第３，
６３１，０１８号明細書）、グリシン沈澱分画法（米国
特許第３，６５２，５３０号明細書）、陰イオン交換体
処理法（特公昭５５−１２８９０号公報）等が例示され
る。

フィブロネクチンの単離、精製法は、特開昭５７１４０
７２４号、同５８−１２１２２０号、同５９−６７２２
８号の各公報等に開示されている。

（ｉｉ）フィブリノゲン、第ＸＩＬＩ因子フィブリノゲ
ンの単離、精製法は、特開昭６２−８９６２８号、同６
４−１９０２３号の各公報等に開示されている。また、
第ＸＩＩＩ因子の単離、精製法は、特開昭５６−１６６
１２１号、同５３−７２８１１号の各公報等に開示され
ている。

（ｉｉｉ）　ｉ［Ｘ因子、プロトロンビン、プロティン
Ｃ第■因子の単離、精製法は、特開昭６２−１００１９
号、同６３−４８７２０号、特願昭６３−８４４５８号
の各公報等に開示されている。

プロトロンビンの精製については、無機塩に対する吸着
性を利用する方法、陰イオン交換体を用いる方法、アフ
ィニティクロマトグラフィーを用いる方法等が、例えば
下記の刊行物によって知られている。

・Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｌｌ、、　、ｌ１４．５６
５　（１９５４）・　　Ａａ＋、　　Ｊ、　　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ、＋　　に７Σｌ、　　７３１　　（１９５３）
・生化学、牧（１２）、　８９０〜９０１　（１９６８
）・特公昭５８−５０２０２号公報 ・Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　ムｕ、　２８５７
　（１９５９）・特開昭６３−２９０８２９号公報 プロティンＣの精製方法としては、塩化バリウムによる
沈澱吸着法、硫安分画、陰イオン交換体による処理、調
製用電気泳動、プロティンＣに対する抗体カラム、夾雑
蛋白質に対する抗体カラム等が知られている。（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２Ｍ１．３５５〜３６３　
（１９７６）、同９Ｌ這、　１９１４〜１９２０　（１
９８３）、　Ｊ。

Ｎａｒａ　　Ｍｅｄ、　　八ｓｓ、、　　３５．　４４
８　〜４５４　　（１９８４）、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ
。

Ｃｈｅｍ、、２６１．　１１０９７〜１１１０５　（１
９８６）、　Ｔｈｒｏｍｂ。

ＨａｅｍｏｓＬａｓ、、　４８．１〜５　（１９８３）
、特願昭６３−５４１５９号公報〕 （ｉｖ）アンチトロンビン−■ アンチトロンビン−■の単離、精製法は、特開昭４８−
３５０１７号、特公昭５９−７６９３号、特願昭６３−
１０５７８３号、同６３−１５５７４０号の各公報等に
開示されている。

（ｖ）プラスミノゲン プラスミノゲンの単離、精製法は、５ｃｉｅｎｃｅ＋月
’０．１０９５　（１９７０）　、特開昭５５−１５３
５９２号公報、同６３−２３９３００号公報等に開示さ
れている。

（■１）免疫グロブリン 例えば、特開昭５３−４７５１５号公報、同５７−３２
２２８号、同６３−１８３５３９号公報等に記載の方法
に準ずればよい。また、加熱処理も行うことが好ましく
、例えば液状加熱としては特開昭６１−１９１６２２号
、同６３−１４６８３２号の各公報等、乾燥加熱として
は特開昭６１−７８７３０号、同６２−２２８０２４号
、同６２−２８３９３３号、同６２−２８９５２３号の
各公報等に記載の方法に準ずればよい。

（ｖｉ）ハプトグロビン 特開昭５０−７７５１６号、同６３−１７８８９号の各
公報等に開示の方法に準ずればよい。

（ｖｍ）アルブミン アルブミンの精製方法として、エタノール分画法（特公
昭３５−５２９７号、同４７−２８６９号等の各公報）
、加熱処理法（特公昭４３−１４０３号、同５１−４０
１３２号の各公報等）が例示される。

〔効　果〕

本発明の方法によれば、血漿蛋白含有物、特に血漿から
血漿蛋白を効率よく各種血漿蛋白成分に分画することが
できる。

（実験例） 下記表２に記載の本発明法と下記表３に記載の従来法に
よる各種血漿蛋白成分の回収効率を表１に示した。

〔以下余白〕

表　　　１ 表２−１（本発明法） 凍結血漿 ↓ 融解 エタノール８％（ｐＨ７） 陰イオン交換体 表中、×１は従来法と同程度の回収率、×３は従来法に
比べて３倍程度回収率が改善されたことを示す。※は従
来法では回収されず、本発明法によって回収された血漿
蛋白である。

以下に本発明法および従来法の血漿蛋白の回収工程を示
す。

（以下余白） リジンカラム ヘパリンカラム エタノール２５％（ｐＨ７） アルブミン 表２−２（本発明法） 凍結血漿 ↓ 融解 エタノール８％（ｐｌ＋７） リジンカラム 陰イオン交換体 ヘパリンカラム エタノール２５％（ｐＨ７） アルブミン 表３（従来法） 凍結血漿 ↓ 融解 陰イオン交換体 エタノール８％ エタノール２５％ エタノール４０％ アルブミン 〔実施例〕 実施例１ 表２−３（本発明法） 凍結血漿 ↓ 融解 陰イオン交換体 エタノール８％（ｐＨ７） リジンカラム に−一−−−−−−−→ン容出−−−−フ゛ラスミノヶ
゛ンヘパリンカラム １　　　　　　　　　→溶出−・−アンチトロンビンエ
タノール２０％（ｐＨ５，２） アルブミン ＨＢｓＡｇ陰性ＨＩＶ抗体陰性の正常人血液をクエン酸
ナトリウムを抗凝固剤として採取し、遠心分離により血
漿を得た。この血漿を直ちに一３０°Ｃ以下に急凍した
。このようにして凍結された血漿１０ｆｆｉを２〜１０
’Ｃの冷室で徐々に融解し、液温か１〜３°Ｃに上昇し
た後、直ちに遠心分離して不溶物（クリオ沈りを回収し
た。

上清に、予め一２０゛Ｃに冷却された５３％エタノール
を加え、終エタノール１度を８％とした。

液温は一１〜１°Ｃ，ｐｔ１７．０であった。この条件
下で２時間篩Ｗ後、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離
し、沈ｔｉ（画分Ｉ）を回収した。

予め０．０２　Ｍの塩化ナトリウムで平衡化されたセフ
ァロースＱファストフローを湿重量で１　ｋｇ充填した
１０ｃｍ径のカラムに遠心上清を４〜１０°Ｃ１２２／
時間の流速で注入し、プロトロンビン、第■囚子、プロ
ティンＣ等を吸着させた。このセファロースＱファスト
フローカラムを通過した透明な濾液をリジン−セファロ
ースカラム（１０ｃｍ径、２２）およびヘパリン−セフ
ァロースカラム（１０ｃｍ径、０．５ｆｆｉ）に順次通
過させた。リジン−セファロースカラムにはプラスミノ
ーゲンが、ヘパリン−セファロースカラムにはアンチト
ロンビン■がそれぞれ吸着された。

濾液に予め一２０°Ｃに冷却されたエタノールを加え、
終濃度２５％とした。ｐｌ＋７．０、−３°Ｃで２時間
静置後、析出した沈澱（画分ＩＴ＋ＩＩＩ）を１１００
００ｒｐで２０分間遠心分離し、上清を回収した。

この上清に一３０°Ｃに冷却されたエタノールを追Ｊ＋
１１　シ、終濃度４０％、ｐＨ５，８、−５°Ｃで２時
間静置後、１００００　ｒｐｍで２０分間遠心分離し、
沈澱（画分■）と上清を別々に回収した。

参考例 （１）　　クリオ沈澱から第■因子およびフィブロネク
チンの精製 クリオ沈澱をヘパリン１００ＩＩＪ／ｍｌを含む注射用
水にＱＪし、２０〜３０°Ｃで抽出した。得られた抽出
液に水酸化アルミニウムゲルを添加し、プロトロンビン
を吸着除去し、０．３％ＴＮＢＰ　（化学名ニトリ（ｎ
−ブチル）ホスフェート）／１％Ｔｗｅｅｎ　８０を添
加して、３０’Ｃ，６時間のウィルス不活化処理をした
。そして２Ｍグリシン分画でフィブリノゲンを沈澱して
除去し、上清を得た。この上清に１．５Ｍ塩化ナトリウ
ムを添加し、沈澱に第■因子を、上清にフィブロネクチ
ンを回収した。

第■因子はゲル濾過によりさらに高度精製した。

また、フィブロネクチンは上清を冷却し、塩化ナトリウ
ムを３Ｍとすることにより沈澱させて回収した。

（２）画分Ｉから第ｘ■因子含有フィプリノゲンの精製 両分Ｉの沈澱を０．９％塩化ナトリウム溶液で溶解し、
プロテアーゼ阻害剤として５％ＥＡＣＡを、ウィルス不
活化剤として０．３％ＴＮＢＰ／１％Ｔｗｅｅｎ　８０
を添加して、３０℃、６時間のウィルス不活化処理を行
った。そして、２Ｍグリシンを添加し、第ｘ■因子含有
フィブリノゲンを沈澱して回収した。

（３）　　セファロースＱファストフローからプロトロ
ピン、第Ｘ因子、プロティンＣの溶出前記のセファロー
スＱファストフローを２０ｍＭトリス緩衝液（ｐｉ（７
，１５）に懸濁し、１０ｃｍ径のカラムへ充填した。同
じ溶媒をカラム容積の２倍量流下させ、洗浄した。次に
ｐＨ７，１５，０，３Ｍ塩化ナトリウムをカラム容積の
２倍量流下させて第Ｘ因子を溶出させた。

さらにＰＨ７，１５，０，３５Ｍ塩化ナトリウムをカラ
ム容積の２倍量流下させてプロトロンビンを溶出させた
。

さらにｐｉ７．１５．０．４Ｍ塩化ナトリウムをカラム
容積の２倍量流下させてプロティンＣを溶出させた。

（３−１）　　プロトロンビン両分にトロンボプラスチ
ンおよび新鮮ヒト血漿を加え、トロンとンへ転換させた
。この粗トロンビン溶液にプロテアーゼ阻害剤として４
％ＥＡＣＡを、ウィルス不活化剤として０．３％ＴＮＢ
Ｐ／１％Ｔｗｅｅｎ　８０を添加し、３０°Ｃ１６時間
のウィルス不活化処理を行った。

そして、ＳＰ−セファデックスでトロンビンを吸着し、
精製した。

（３−２）　　第■因子画分を抗■マウスモノクローナ
ル抗体を結合させたゲルにアプライし、第■因子画分を
吸着した。そして未吸着画分にプロトロンビンを回収し
た。抗体ゲルに吸着した第Ｘ因子はｐＨ２，５のグリシ
ン−塩酸緩衝液で溶出し、水酸化ナトリウムでｐＨを中
性にした後、抗マウス抗体で混入している微量のマウス
１ｇＧを吸着除去した。

（３−３）　　プロティンＣの精製 ｉ）　　２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐｌ！５．０の緩衝
液で透析した。透析後、１０，０ＯＯＧで２０分間遠心
分離して上清画分を回収した。

Ｎ）陽イオン交換クロマトグラフィー 上清画分をＢａｋｅｒｂｏｎｄ　ＣＢχに添加した。開
始バッファーに２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０を
、溶出バッファーに１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ酢酸
ナトリウム、ｐｎｓ、ｏを使用した。試料添加後開始バ
ッファーで洗浄した後、溶出バッファーに切換え、バス
画分を回収した。

ｔｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー透析後渡を−
ｏｎｏ　Ｑ　ＯＲ６０／１０（またはＱ　Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅｌｌｉｇｈ　Ｐｅｒｏｒｍａｎｃｅ　６０／１０
０）に添加した。開始バッファーに２０＋Ｍ）リス塩酸
、ｐｌ＋７．１５を、？客用バッファーに１Ｍ塩化ナト
リウム、２０１トリス塩酸、ρ１１７．１５を使用した
。試料添加後、３０％〔ν／ｖ）’４出バッファー／開
始バッファーで洗浄した後、３０％→４０％溶出バッフ
ァー／開始バッファーのりニア−グラジェント溶出を行
い、活性画分を回収した。

ｉｖ）ゲル１過クロマトグラフイー 透析後液を５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２　ｐｒｅｐ　ｇｒａ
ｄｅ　６０／６００に添加した。？８離パンファーに２
０１トリス塩酸、５００１塩化ナトリウム、ｐＨ１，２
１１を樹液を使用し、活性画分を回収した。

ν）　硫酸デキストランクロマトグラフィー透析抜液を
硫酸デキストランをリガンドにしたセファロースＣ１，
４Ｂに添加した。開始バッファーには２５ｄイミダゾー
ル、ｐ１１６を、溶出バッファーには１Ｍ塩化ナトリウ
ム、２５＋ＭＭイミダゾール、ρ１１６．０を使用した
。試料添加後、０％→５０％溶出バフファー／開始バッ
ファーのリニアーグラジェント溶出を行い、活性画分を
回収した。

ｖｉ）逆相クロマトグラフィー 得られた画分を０８をリガンドとした逆相カラムに添加
した。ストック溶液Ａ（０，１％テトラフルオロ酢酸含
打蒸留水）・Ｂ（８００ａ＋ＮのアセトニトリルをＡ液
で１，０００　ｄとしたもの）を調製し、開始バッファ
ーは４００　ｒｒｒｌのＢ液にＡ液を加えて１．０００
ｍｆｆ１としくアセトニトリル最終濃度３２％）、溶出
バッファーは５００　ｍｌのＢ液にＡ液を加えて１．０
００　ｍｌとして（アセトニトリル最終濃度４０％）使
用した。開始バッフブーで洗浄後、０％→５０％溶出バ
ッファー（実際のアセトニトリル濃度は３２％→３６％
）のリニアーグラジェント溶出を行った０分画後各フラ
クション中の有１１１．’１８媒を減圧乾燥させた。

（４）　　リジン−セファロースからプラスミノゲンの
精製 プラスミノゲンを吸着したりジン−セファロースカラム
をカラム容積の２倍量の０．９％塩化ナトリウムおよび
同量の１．０　Ｍ塩化ナトリウムで順次流下させ、不純
蛋白を洗浄した。プラスミノゲンは０．２ＭＥＡＣＡ溶
液（ｐＨ７，０）　ニア溶出した。

このプラスミノゲン画分を分画分子量３００００の限外
濾過膜を用いて２００１Ｕ／ｄに濃縮した。この濃縮液
にアプロチニン（最終濃度５０Ｕ／ｌＩｒｆｆ１）を添
加し、６０゛Ｃで１０時間加熱した。

０、０５　Ｍリン酸緩衝液、０．０５　Ｍ塩化ナトリウ
ム、０．２％リジン含有の溶媒で一夜透析し、リジルタ
イプのプラスミノゲンを得た。除菌濾過後、凍結乾燥し
た。

氷晶を２５０１Ｕ／ｒａに再溶解し、ウサギへｌｌ１１
／ｋｇずつ静脈内投与し、発熱試験を行ったところ、生
物学的製剤基準に合格した。

（５）　　ヘパリン−セファロースからアンチトロンビ
ン−■の精製 アンチトロンビン−■を吸着したヘパリン−セファロー
スカラムをカラム容積の４倍世の０．４Ｍ塩化ナトリウ
ム（ｐＨ７，０）で洗浄後、２Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ
７，０）でアンチトロンビン−■を溶出した。

このアンチトロンビン−■の水溶液にクエン酸ナトリウ
ムを０．６Ｍの濃度に加え、ｐ）１７．８に調整した後
、６０°Ｃで１０時間の加熱処理を施した後、塩化ナト
リウム（最終濃度３Ｍ）およびクエン酸ナトリウム（最
終濃度２０ｍＭ）を添加し、ｐｌ＋７．５に調整した。

一方、３Ｍ塩化ナトリウム含有２０＋ｍＭクエン酸ナト
リウム緩衝液（ｐｉ（７，５）で平衡化したブチル型ポ
リビニル系担体（ブチル−トヨパール６５０、東洋曹達
■製）にアンチトロンビン−ｍ含有水溶液を接触させた
後に上記緩衝液で展開し、未吸着画分を回収をした。続
いて、０４９％塩化ナトリウム溶液に対して一夜透析を
行いつつ濃縮してアンチトロンビン−■の１　（ｗ／ｖ
％）水溶液を得、必要に応じて、濾過または遠心分離を
行って透明な液とした。

（６）画分ｎ＋ｍからＩｇＧの精製 百分■＋ｎ１１０ｋｇを６渾留水３０ｆｆｉに懸濁（ｐ
１１５、５　）、よく攪拌の後、遠心分離により澄明な
上清を回収した。この上清１１当たりソルビトールを５
００ｇ添加し、ｐＨ５，５にて６０　”Ｃ１０時間加熱
した。加熱後、冷蒸留水で３〜５倍に希釈し、ポリエチ
レングリコール４０００を終濃度が５％になるように添
加し、析出した不溶物を遠心分離により除去した。

上清のｐｌ＋を８．０に修正し、ポリエチレングリコー
ル４０００を１２％濃度に添加し析出したｒｇＧを回収
した。

（７）画分■からハプトグロビンの精製画分■３０ｋｇ
をｐｉ（ａ、２の０．０５酢酸アンモニウム緩衝液１４
ＯＮに懸濁した後、硫酸アンモニウムを３５％飽和とな
るように加え、生じた沈澱を遠心分離して除いた。この
上清をｐＨ７，５に調整した後、軽質無水珪酸〔アエロ
ジル（ジグサ社製）〕ｌ　ｋｇを加え、室温で１時間攪
拌した。その後に遠心分離して上清を回収した。上清中
にハプトグロビンは７０％回収され、溶液の濁りも完全
に除去できた。

（８）　　アルブミンの精製 コーンの低温エタノール分画法第６法に従って、精製を
行った。

ｉ）　得られた上清をエタノール４０％、ρ■４，８．
５°Ｃで処理して生じた沈澱を回収する（第Ｖ画分）。

ｉｉ）沈澱を適当な溶媒に溶解し、エタノールｌ。

％、ｐｌ＋４．５、−３°Ｃで処理して上清を回収する
。

１１１）上清をエタノール４０％、ｐＨ５，２、−５°
Ｃで処理して生じた沈澱を回収し、精製アルブミンとし
て得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 血漿蛋白含有物を、以下の工程順序にて処理する〔但し
   、（ｉｉ）〜（ｖ）工程は各々その順序は入れ換えても
   よい〕ことを特徴とする血漿蛋白の分画方法。 （ｉ）凍結・融解、 （ｉｉ）エタノール濃度５〜１０％での処理、 （ｉｉｉ）陰イオン交換体による処理、 （ｉｖ）固定化リジンによるアフィニティークロマトグ
   ラフィー処理、 （ｖ）固定化ヘパリンによるアフィニティークロマトグ
   ラフィー処理、 （ｖｉ）エタノール濃度１８〜３０％での処理、および （ｖｉｉ）エタノール濃度３５〜４５％での処理。